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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in einer Probe durch Amplifizieren einer Nukleinsäure, die an das zu bestimmende Antigen gebunden wird
Die Detektion von spezifischen Antigenen ist vor allem in niedrigen Konzentrationsbereichen schwierig Oft müssen aber die zu detektierenden Antigene gerade in niedrigen Konzentrations- bereichen oder Mengen bestimmt werden, um wichtige Aussagen, beispielsweise zu Krankheits- bilder, biologischen Kontaminationen, physiologischen Werten von ausgewählten Proteinen, etc , zu erhalten
Antigene werden üblicherweise durch Antikörpertests, beispielsweise mittels ELtSA,
bestimmt Dabei wird das zu bestimmende Antigen durch Bindung an einen für das Antigen spezifischen Antikörper detektiert Das Ausmass an gebundenem Antikörper/Antigen wird dann üblicherweise durch eine bewährte Nachweismethode, wie z B Radioaktivität, Fluoreszenz, Färbungsreaktion, etc., vorzugsweise unter Verwendung von sekundären Antikörpern, bestimmt.
Jedoch haben sogar die empfindlichsten ELISA-Tests, z. B. solche, die mit radioaktiven Nach- weismethoden durchgefuhrt werden, eine Nachweisgrenze, die in manchen Fallen um Zehnerpo- tenzen zu hoch ist, um ein brauchbares Ergebnis zu liefern Weiters gibt es Proteine oder Pathogene, die mit herkömmlichen Antikörper/Antigen-Bestimmungsmethoden aufgrund der spe- zifischen Natur des Antigens nicht oder nur unbefriedigend bestimmt werden können.
Ein Beispiel für ein derartiges Pathogen ist das für Scrapie verantwortliche Antigen Scrapie wurde zum ersten Mal vor etwa 250 Jahren in Schafen entdeckt In den letzten Jahren wurden mit Scrapie verwandte Krankheiten auch bei anderen Tieren und auch im Menschen als übertragbare spongiforme Enzephalopathie (TSE, transmissible spongiform encephalopathies) beschrieben. Als Ursache dieser Krankheiten werden Prionen angenommen Prionen-Erkrankungen sind mit her- kömmlichen Antigen/Antikörpertests nicht befriedigend diagnostizierbar.
Ein Prionenprotein ist entweder nicht infektiös, man spncht dann von einem PrPc, oder aber
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Prionenprotein PrPsc wird. Üblicherweise wird zur Unterscheidung des Prionen-Proteins vom infek- tiösen Prionenprotein ein Proteinase-K-Verdau mit einem anschliessenden Westem Blot durchgeführt, wobei sich das infektiöse Prionenprotein PrPsc als teilweise resistent gegenüber dem
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infektiöse Prionenprotein erkennen, oder die spezifisch das infektiöse Prionenprotein erkennen.
Die Prionen verursachen meist progressive Erkrankungen des Zentralnervensystems (spongi- forme Enzephalopathien), beispielsweise Scrapie im Schaf, Kuru, RSE im Rind sowie die Creutz- feld-Jakob-Krankheit (CJD), das Gerstmann-Sträussler-Syndrom (GSS) und die fatale familiäre Insomnia (FFI) Die Prionen zeichnen sich durch besondere physikochemische und biologische Eigenschaften gegenüber Viren und Bakterien aus : Resistenz gegenüber Inaktivierung durch Formaldehyd, Nukleasen, Hitze, UV- und ionisierende Strahlen, und sind nicht als Virion oder Zelle im Elektronenmikroskop erkennbar.
Sie sind insensitiv gegenüber Interferonen, zeigen keine Inter- ferenz mit Viren und ausserdem konnte bisher keine Nukleinsäure nachgewiesen werden
In Grossbritannien trat in letzter Zeit vermehrt eine Variante von CJD mit neuen neuropatholo- gischen Merkmalen auf (nvCJD). Es konnte gezeigt werden, dass diese nvCJD durch Übertragung
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verursacht wurde Daher wird oftmals gefordert, biologische Materialien, die zur Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen herangezogen werden, wie z B. Körpersäfte, Blut, Plasma, Plasmafraktionen und Serum, Gewebe und Zellkulturen, auf Prionen zu untersuchen.
Dieser Untersuchung der biologischen Materialien und dem anschliessenden Ausschluss konta- minierter Materialien kommt daher immer mehr an Bedeutung zu, da Pnonen sich als uberaus resistent gegenüber herkömmlichen Inaktivierungsverfahren, wie z B. Hitzebehandlung oder Behandlung mit UV, erwiesen haben
Herkömmliche Prionentests, wie z.B Western Blot unter Verwendung von spezifischen Anti- körpern, haben eine ungenügende Sensitivität, um Prionenprotein effektiv bestimmen zu können.
In der WO 97 37 227 ist ein immunhistochemischer Test zur Bestimmung von Pnonen in Geweben
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Gewebeteilen das veränderte Prionenprotein (PrP) bestimmt werden Diese Methode ist aller-
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dings wenig zuverlässig und insbesondere für die Untersuchung von Blut und Blutprodukten ungeeignet.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur in-vitro-Amplifikation spezifischer einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA-Fragmente. Durch eine wiederholte Hitzedenaturie- rung der DNA-Doppelstränge, Anhybridisieren der Primer und Verlängerung durch DNA-Polyme- rase kommt es zu einer enormen Anreicherung eines doppelsträngigen DNA-Fragments Nach 20 Zyklen erhält man ausgehend von einem DNA-Molekül infolge einer exponentiellen Kettenreaktion ca. 1 Million Kopien (siehe EP 0 200 362 und EP 0 201 184) Mittels dieser Methode können aller- dings nur Nukleinsäuren detektiert werden, für Proteine ist dieses Verfahren ungeeignet.
Ein verbessertes Verfahren wird in der EP 0 714 988 beschrieben. Dabei wird der zu bestimmenden Probe ein Standard zugesetzt, um die mittels PCR bestimmte DNA auch quantifizieren zu können
In Sano et al (Science 258 (1992), 120-122) ist eine Kombination von ELISA mit PCR als Immuno-PCR beschrieben. Dabei wird ein Verbindungsmolekül (Linker) mit bispezifischer Bindungsaffinität für DNA und Antikörper, z.B ein chimäres MoleKul aus Streptavidin für biotinylierte DNA und Protein A für Immunglobulin G, benutzt, um ein bestimmtes DNA-Molekül (Marker) unspezifisch an einen Antigen-Antikörper-Komplex zu binden, so dass ein Antigen- Antikörper-Linker-DNA-Komplex entsteht.
Der gebundene DNA-Marker kann nun mittels entsprechender Primer in einer PCR amplifiziert werden Der Nachweis des PCR-Produkts zeigt die Präsenz der Antigene an.
Die markierten DNA-Antikörper-Komplexe werden in situ im Reaktionsgemisch zusammen- gesetzt, dadurch kann es zu verschiedener Stöchiometrie in der Zusammensetzung und Bindung der DNA kommen Zusätzliche Schritte für die Zugabe von biotinylierten Reagenzien und Bindungsproteinen sowie zahlreiche Waschschritte sind erforderlich, um überschüssige Reagen- zien zu entfernen Durch die vielen Verfahrensschritte wird dieses Verfahren kompliziert und
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komplexe Gemische von verschiedenen Antigenen nicht geeignet.
Hendrickson et al. (Nucl. Acids Res. 23 (3) 522-529) beschreiben daher einen verbesserten Immunassay zur gleichzeitigen Bestimmung von verschiedenen Analyten Dabei wurden die Antikörper und die DNA, in diesem Fall ein einzelsträngiges Oligonukleotid, separat aktiviert und in einer spontanen Reaktion direkt aneinander gekoppelt. Von Hendrickson et al wird die gleichzeitige Detektion von drei unterschiedlichen Analyten mittels Immuno-PCR beschrieben.
Die DNA-markierten Antikörper, die an das entsprechende Antigen gebunden sind, werden mittels PCR amplifiziert und bestimmt.
Bei diesen Immuno-PCR-Methoden besteht jedoch - wie allgemein bei der PCR an sich - stets das Risiko von fälschlicherweise negativen Resultaten, d h mit der Detektionsreaktion kann ein spezifisches Antigen nicht nachgewiesen werden, obwohl dieses spezifische Antigen tatsächlich in der Probe enthalten ist. Dies kann vor allem beim Nachweis von Pathogenen in Proben, welche zur Weiterverarbeitung zu Arzneimitteln, die an Menschen verabreicht werden sollen, eingesetzt werden, fatale Folgen haben : dadurch könnten Proben aufgrund von fälschlicherweise negativen Resultaten zur Weiterverarbeitung ausgewählt werden, obwohl diese Proben Pathogene enthalten
Um die damit verbundene Gefahr der Verwendung von möglicherweise infektiösen Ausgangs-
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bestrebt, falsch-negative Resultate zu eliminieren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein zuverlässiges und sensitives Verfahren zur Bestimmung von Antigenen zur Verfügung zu stellen, mit welchem vor allem falsch-negative Ergebnisse von vornherein ausgeschlossen werden konnen
Die erfindungsgemässe Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen durch Amplifizieren einer Nukleinsäure (Ziel-Nukleinsäure), die an einem für die Antigene spezifi- schen Liganden gebunden ist, gelöst, welches sich dadurch auszeichnet,
dass die Bestimmung in Anwesenheit mindestens eines internen Standards durchgeführt wird
Mit dem erfindungsgemässen Verfahren können Antigen-Bestimmungen mittels Immun-Amplifi- kationsreaktionen auf elegante Weise überwacht und kontrolliert werden Vor allem aber können
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werden Weiters ist durch die Verwendung von internen Standards auch der Erhalt einer quan-
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titativen Vergleichsgrösse für die Antigenbestimmung in der Probe moglich, vor allem, wenn mehr als ein Standard verwendet wird Im Routinebetrieb wird es aber in der Regel nicht erforderlich sein, mehr als einen Standard zu verwenden, insbesondere, wenn mit der Verwendung eines Standards lediglich falsch-negative Ergebnisse ausgeschlossen werden sollen.
Bevorzugterweise wird erfindungsgemäss eine an einem Liganden gebundene Nukleinsäure als Standard eingesetzt (Standard-Nukleinsäure) Dabei kommen besonders bevorzugt Standard- Nukleinsäuren zum Einsatz, die sich von der Nukleinsäure, mit welcher das (Ziel-)Antigen bestimmt wird (Ziel-Nukleinsäure), zumindest in einem detektierbaren Merkmal unterscheidet
Erfindungsgemäss werden dann sowohl die Standard-Nukleinsäure als auch die Ziel-Nuklein- säure amplifiziert und die amplifizierten Nukleinsäuren untersucht.
Beispiele für (Gen-)Amplifikationsverfahren sind neben der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
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sequence based amplification (NASBA).
Um die Proben besser charakterisieren zu können, wird beim #Taqman Assay" die Polymerase-
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(Holland et al., Proc. Natl. Acad Sci , 88 (1991), 7276-7280).
Die Standard-Nukleinsäure kann vorzugsweise eine Länge von mindestens 70 Nukleinsäuren aufweisen Bevorzugt wird eine Lange von > 100 bis mehrere hundert Nukleinsäuren gewählt.
Die Ziel-Nukleinsäure ist an den Liganden, spezifisch für das zu bestimmende Antigen, gebun- den Als Liganden werden bevorzugt Antikörper, die spezifisch für das zu bestimmende Antigen sind, verwendet Es können aber auch Affinitäts-Liganden eingesetzt werden, wie z. B. Peptide, die spezifisch an das Antigen binden Die Standard-Nukleinsäure unterscheidet sich üblicherweise in wenigstens einem detektierbarem Merkmal von der Ziel-Nukleinsäure, wird aber vorzugsweise mit Hilfe der gleichen Mitteln, wie Pnmer, amplifiziert Als bevorzugt haben sich Standard-Nuklein- säuren erwiesen, die eine andere Grösse als die zu bestimmende Nukleinsäure oder eine unike
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ausgewertet werden kann.
Bevorzugte Standards unterscheiden sich von der zu bestimmenden Nukleinsäure in 1% bis 20% ihrer Länge bzw durch mindestens 3, maximal 50 Nukleotide, wobei eine Standard-Nukleinsäure, die länger ist als die Ziel-Nukleinsäure als "plus" ("+")-Standard bezeichnet wird, und eine Standard-Nukleinsäure, die kleiner ist als die Ziel-Nukleinsäure als "minus" ("-") -Standard bezeichnet wird Die genaue Sequenz der Standard-Nukleinsäure sollte natürlich bekannt sein.
Sowohl die Nukleinsäure für den internen Standard als auch die Nukleinsäure, die an den Liganden, spezifisch für das zu bestimmende Antigen, gebunden wird, kann entweder als doppel- strängige oder als einzelsträngige Nukleinsäure eingesetzt werden Bevorzugterweise wird einzel- strängige DNA mit einer endständigen Aminogruppe zum chemischen Crosslinking mit dem spezifi- schen Liganden gewählt Bevorzugt werden hierbei Nukleinsäuren mit einer Länge von 70 - 120 Basenpaaren verwendet.
Der interne Standard kann auch als Verbund der Standard-Nukleinsäure mit einem Liganden, spezifisch für ein Standard-Antigen, zur Verfügung gestellt werden Der interne Standard kann nun entweder unmittelbar an dem spezifischen Liganden gebunden werden oder aber auch mittels eines Verbindungsmoleküls (Linker), welches auf der einen Seite eine DNA-Bindungsstelle aufweist, beispielsweise Streptavidin, und auf der anderen Seite einen spezifische ) Liganden, der gegen ein Antigen (Standard-Antigen) gerichtet ist, die Verbindung zwischen dem spezifischen Liganden und der DNA hergestellt werden In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DNA unmittelbar durch chemische Bindung an den Liganden gebunden,
beispielsweise mittels Affinitäts- bindung oder kovalenter Bindung
Als Liganden für den internen Standard und/oder für das zu bestimmende Antigen können Peptide oder monospezifische Antikörper, sowohl monoklonale oder polyklonale, aber auch chimä- re, rekombinante beziehungsweise humanisierte Antikörper verwendet werden. Die Liganden, die an die Standard-Nukleinsäure gebunden sind, können auch spezifisch gegen das zu bestimmende Antigen gerichtet sein, um kompetitiv mit den Ziel-Liganden spezifisch für das zu bestimmenden Antigen zu wirken.
Dabei können auch polyspezifische Antikörper eingesetzt werden, die das
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bevorzugterweise Antikörper, die zur Bestimmung von modifizierten Proteinen und Prionen-
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proteinen geeignet sind Gleichfalls können für andere Zwecke auch Liganden spezifisch für die zu bestimmenden Antigene ausgewählt werden, z. B aus der Gruppe von viralen, bakteriellen oder Humanproteinen Bevorzugterweise werden bei der Bestimmung von Prionen spezifische Antikör- per für ein Prionenprotein verwendet.
Die bei der Amplifizierung verwendeten Primer können vorzugsweise Marker enthalten, welche die Nachweisgrenze zur Bestimmung der amplifizierten Nukleinsäure noch weiter erhöhen, bei- spielsweise fluoreszierende oder radioaktive Gruppen oder chemische Gruppen, die mit affinen Proteinen und nachgeschalteten Detektionsreaktionen detektiert werden können (z B Biotin- Avidin, DIG-Markierung etc.), wobei Primer mit fluoreszierenden Gruppen besonders bevorzugt sind.
Die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren kann auf unterschiedlichste Weise erfolgen, meist jedoch ist ein Schritt vorzusehen, bei welchem die amplifizierte Standard-Nukleinsäure von der amplifizierten Ziel-Nukleinsäure getrennt wird, und die getrennten Nukleinsäuren separat bestimmt werden. Vorzugsweise besteht dieser Trennungsschritt in einer Gelelektrophorese oder
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Ziel-Nukleinsäure zur bekannten Menge einer Standard-Nukleinsäure kann zusätzlich die Quantifi- zierung des Antigens ermöglicht werden.
Zu den Antigenen, die mittels dem erfindungsgemässen Verfahren bestimmt werden können, gehören Antigene aus biologischen Proben von Säugetieren, wie Körperflussigkeiten, z B Plasma, Blut, Blutzellen und Serum, Gewebe, aber auch Antigene aus eukaryontischen Zellkulturen.
Bevorzugt werden erfindungsgemäss Antigene von Pathogenen oder auch Marker-Antigene für Pathogene bestimmt Zu diesen Antigenen zählen virale Antigene, bakterielle Antigene und insbe- sondere Antigene, für die bislang keine Routine-Nachweismethode zur Verfugung stand, wie beispielsweise modifizierte (z. B konformationsgeänderte) Proteine, wie Prionen, die im Zusam- menhang mit infektiösen Krankheiten des Zentralnervensystems, wie CJD und BSE, oder anderen
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änderungen erhalten werden Diese Konformationsänderung an Proteinen, wie gegebenenfalls
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hervorgerufen werden, welche dann z.B durch radioaktive Marker detektierbar sind, Eine derartige Konformationsanderung von modifizierten Prionenmolekülen wurde bereits von Kocisko et al (Nature 370 (1994), 471-474) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden ein oder mehrere der Antigene von Human- pathogenen, wie HIV, Hepatitisviren, darunter HAV, HBV, HCV, HGV und Parvoviren, bestimmt.
Die zu bestimmenden Antigene können in einer gereinigten proteinhältigen Präparation, z. B. einer Plasmafraktion, einer Praparation eines gereinigten Plasmaproteins, bzw. einem biologischen Arzneimittel, bestimmt werden. Sie können aber auch in Plasmapools oder anderen komplexen Gemischen bzw. in den genannten biologischen Proben zuverlässig bestimmt werden. Eine Qualitätssicherung wie in der W096/35437 beschrieben, kann auch mit dem erfindungsgemässen Verfahren entsprechend adaptiert durchgeführt werden.
Der entsprechende interne Standard kann vor der Probenaufbereitung zugesetzt werden, während allen Zwischenstufen oder erst unmittelbar vor der Amplifikationsreaktion. In einer bevor- zugten Ausführungsform wird der Standard von Anfang an als ungebundene Nukleinsäure bzw als gebundene Nukleinsäure nach der immunkomplexbnaung zugesetzt WEiters könnenauch zwei (oder mehrere) verschiedene Nukleinsäuren als interner Standard zugesetzt werden. Bevorzugt wird der interne Standard in einer Konzentration von knapp oberhalb der Nachweisgrenze eingesetzt Die in der EP-0 714 988-A beschriebenen Ausführungsformen können hierbei ohne weiteres für die vorliegende Erfindung adaptiert werden
Das Antigen, das vom internen Standard gebunden (erkannt) wird, kann zu der zu bestim- menden Probe zugegeben werden (z.
B. dem Antigen-Bestimmungs-Ansatz), oder aber auch bereits in der Probe in natürlicher Weise (a priori) vorliegen
In Routinetests kann die Interpretation der mit dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Resultate üblicherweise folgendermassen erfolgen i) keine Detektion des internen Standards (z B. keine sichtbare Bande) : die Bestimmung hat
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negative Resultate ausgeschlossen werden
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ii) nur der interne Standard ist detektierbar (z B nur die Standard-Bande ist sichtbar) die Bestimmung inklusive der Amplifikationsreaktion (z B die PCR) hat funktioniert, die Probe Ist negativ, iii) Standard- und Proben-Nukleinsäure sind detektierbar (z B. beide Banden sind sichtbar) :
positive Probe
Geeignete Reaktionsgefässe für die Immuno-PCR sollten vorzugsweise eine gute Proteinbin- dungskapazität zur Immobilisierung der Proteine besitzen Andererseits mussen die Gefasse für die PCR auch thermostabil sein Für eine grosse Anzahl von Proben sind nicht einzelne Reaktions- gefässe, sondern Mikrotiterplatten zu bevorzugen. Polystyrol ist das am besten geeignet matorial hinsichtlich Proteinbindung, jedoch werden bis jetzt keine derartigen PCR-tauglichen Platten kommerziell vertrieben. Als Ersatz können aber erfindungsgemäss beispielsweise Polycarbonat- platten verwendet werden.
Denkbar Ist auch der Einsatz von chemisch modifizierten Materialien zur kovalenten Bindung von Proteinen oder bereits mit Antikörpern beschichtete Materialien
Die Beschichtung der Platten erfolgt bevorzugt über Nacht bei 4 C, es sind auch höhere
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beispielsweise PBS (in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) verwendet werden, aber auch jeder andere gängige Puffer, wie z B Polycarbonatpuffer.
Die Blockierung kann beispielsweise mit PBS/1% BSA (bovines Serumalbumin) durchgeführt werden Als Ersatz kann auch jedes andere geeignete Reagens, wie z B Milchpulver oder vorgefertigte Blocking-Reagenzlen, verwendet werden.
Die Inkubation mit dem Ligand/DNA-Komplex findet bevorzugt eine halbe Stunde bei Raum- temperatur statt, jedoch sind auch andere Zeitdauern (bevorzugt 5 min- 2 Stunden) und andere Temperaturen (bevorzugt 4 - 37 C) möglich
Die optimalen Reaktionsbedingungen für die PCR sind in Beispiel 1 beschrieben Es sind selbstverständlich eine Vielzahl von Veränderungen möglich (insbesondere Veränderung der
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kationssysteme, Primerstrateglen, etc ) Die optimalen Bedingungen können, falls z.
B. das in den Beispielen verwendete Protokoll sich nicht als optimal darstellt, fur die einzelnen zu bestimmenden Antigene vom Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet ohne weiteres ermittelt werden
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungs- gemässen Verfahrens zur Uberprufung und Qualitätssicherung von biologischen Präparaten.
Die Sicherheit, insbesondere die Virussicherheit von stabilen Blutprodukten hängt im Prinzip vom Ausmass der Kontamination von Pathogenen, insbesondere von der Viruskontamination des Ausgangsmaterials, von der Abreicherungskapazität des Verfahrens und von den spezifischen Virusinaktivierungsstufen im Rahmen des Herstellungsprozesses, ab Ein wichtiges Kritenum der Qualitätssicherung ist daher, positives Ausgangsmaterial von der Verarbeitung zu pharmazeu- tischen Arzneimitteln auszuschliessen.
Durch die hohe Empfindlichkeit und die besonders niedrige Nachweisgrenze des erfindungs- gemässen Verfahrens können somit neue Qualitätskriterien bei biologischen Produkten festgestellt werden, welche durch einen äusserst geringen definierten bzw fehlenden Gehalt an kontaminie- renden Antigenen definiert sind
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Reagens zur Verwendung nach dem erfmdungs- gemassen Verfahren, welches a) einen Reaktanten, der an einem Liganden gebunden ist, welcher spezifisch für das zu bestimmende Antigen ist, und b) einen Reaktanten als interner Standard, welcher sich vom Reaktanten aus a) in der Reaktionsweise unterscheidet, enthält
Als unterschiedliche Reaktionsweise kommen beispielsweise unterschiedliche Reaktions- geschwindigkeiten, Spezifität für andere Reaktanten, in Betracht.
Als Reaktanten können Nuklein- säuren oder Enzyme verwendet werden, um beispielsweise eine kontrollierte Enzymreaktion zu erhalten In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuren als Reaktanten verwendet, die sich in einem detektierbaren Merkmal, z B in der Länge, unterscheiden
Insbesondere, wenn das erfindungsgemasse Reagens bei der Detektion von modifizierten
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spezifisch ist für das modifizierte Protein, vor.
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Gemäss einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemässen Reagens ist die Standard-Nukleinsäure an einem Liganden gebunden, insbesbndere an einem Liganden, der bereits an ein Standard-Antigen gebunden ist Dabei kann das Standard-Antigen gleich dem zu bestimmenden Antigen sein (kompetitive Immunreaktion)
Vorzugsweise ist die Standard-Nukleinsäure im erfindungsgemässen Reagens an einen Liganden gebunden, der spezifisch ist für ein von dem zu bestimmenden Antigen (Ziel-Antigen) unterschiedliches Antigen.
Die Liganden/DNA-Komplexe können nach der Herstellung bei -20 C oder 4 C in einem geeigneten Puffer, bevorzugt PBS, gelagert werden Sie sind dann mehrere Monate stabil. Diese Präparation entspricht einer handelsfähigen Form. Die optimale Konzentration, mit der die Komplexe verwendet werden, liegt bei ca. 10 000 bis ca 1 000 000 Kopien pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte Bevorzugterweise werden weniger als 1 Million Kopien eingesetzt, um unspezi- fische Bindungen in den Vertiefungen zu vermeiden Für die Herstellung des erfindungsgemässen Reagens können übliche Formulierungsreagenzien, wie beispielsweise Albumin als Trägerprotein, Tenside, usw.
verwendet werden
Schliesslich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Quantifizierung von Antigenen, insbesondere zur Quantifizierung von Pathogenen in Saugetier-Proben oder von Humanpathogenen in biologischen Arzneimitteln.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichnungsfigur, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt ist, näher erläutert
Es zeigt:
Fig 1 die schematische Darstellung der IMMUNO-PCR mit internem Standard.
Gemäss Fig 1 wird eine Mikrotiterplatte mit einem Antikörper spezifisch für ein Standard- Antigen und einem Antikörper spezifisch für das zu bestimmende Antigen beschichtet Von diesen Antikörpern wird das Standard-Antigen und das zu bestimmende Antigen gebunden Danach
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spezifischen Antikörper für das Standardantigen, kovalent gebunden an ein Oligonukleotid (=interne Standard-Nukleinsäure, IPOS 1) und einem Antikörper spezifisch für das zu bestim- mende Antigen, kovalent gebunden an ein in der Länge unterschiedliches Oligonukleotid
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resultierenden unterschiedlich langen Amplifikationsprodukte mittels Gelelektrophorese detektiert
Beispiel 1 - Zugabe eines DNA-Standards zur PCR
Während die meisten ELISAs im Prinzip sehr zuverlässig sind, kann es bei der PCR durchaus vorkommen,
dass die Reaktion durch inhibitorische Substanzen gestört wird- Dies kann zu einer falsch-negativen PCR führen. Bei dem vorliegenden Experiment wurde der PCR-Teil der Immuno- PCR erfindungsgemäss durch Zugabe einer Standard-Nukleinsäure, die sich in der Länge von der Nukleinsäure des auf ein Antigen spezifischen Antikörper/Nukleinsäure-Konjugats unterscheidet, auf falsch-negative Reaktionen überprüft
In diesem Beispiel wird als Antigen ein zellulares (nicht infektiöses) Prionenprotein (PrP) verwendet Dieses Prionenprotein liegt nicht in gereinigter Form vor, sondern befindet sich in einem Homogenat, welches aus einem Mäusehirn gewonnen wird Zu diesem Zweck wurde das Hirn in einem Puffer (0,1 g/ml), der aus einer 0,32 M Rohrzuckerlösung, 0,5% Desoxycholat und 0,5% NP-40 besteht,
in einem Dounce homogenisiert Nach einem Zentrifugationsschritt (15 min bei 4500 Upm) wurde das Pellet verworfen und dann die Proteinmenge im Überstand bestimmt
Nach Bestimmung der Protein-Konzentration wurden verschiedene Mengen des Homogenats in 2 gleichen Ansätzen (2x unbeschichtet, 2x 8 g, 2x 800 ng) in Polycarbonatplatten (96 Vertie-
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50 l bei 4 C inkubiert. Nach dieser Beschichtung wurden die entsprechenden Vertiefungen 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 50 l einer PBS/1% BSA-Lösung blockiert. Anschliessend wurde eine halbe Stunde mit ca 104 Kopien des Prionantikörper/DNA-Komplexes (Ziel-Nukleinsäure, 6H4-IP01; s. Tabelle 1) in 50 l PBS/0,1% inkubiert Es wurde 6 x mit 100 l PBS gewaschen und dann die PCR-Lösung direkt zu den entsprechenden Vertiefungen dazugegeben.
Die PCR-Lösung (50 l) enthielt 1 E der Polymerase AmpliTaq GoldTM (Perkin Eimer, Norwalk, CT, USA), 10 mM
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Mineralöl überschichtet und zunächst 14 min bei 94 C zur Aktivierung der Polymerase inkubiert.
Dann wurde 40 Zyklen nach folgendem Profil in einem PTC0200-Thermocycler (MJ Research) amplifiziert 30 s bei 94 C, 30 s bei 55 C, 60 s bei 72 C mit einem abschliessenden Elongations- schritt bei 72 C für 60 s Zu den Proben, die auf falsch-negative Resultate überprüft wurden, wurden zu einem Ansatz ca 100 und zum anderen ca 1000 Kopien der internen Standard- Nukleinsäure IPOS1 (s Tabelle 2) dazugegeben
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Agarosegel aufgetragen In der Tabelle 2 wird das Ergebnis des Versuchs dargestellt Es zeigt sich, dass in den Vertiefungen, in denen sich kein Homogenat befindet, nur der Standard IPOS1 zu sehen ist, d h. es befindet sich kein spezifisches Antigen in dieser Probe Die Reaktion war jedoch auf keinen Fall falsch-negativ Durch die Zugabe von verschiedenen Mengen von IPOS1 kann man auch eine Kompetition mit der Ziel-Nukleinsäure IPO1 erkennen, d. h.
1000 Kopien ergeben eine stärkere Bande als 100 Kopien. Der Standard sollte aus diesem Grund nur knapp über der Nach- weisgrenze eingesetzt werden, um ein Wegkompetitieren des spezifischen Signals zu verhindern.
Bei grösseren Mengen von spezifischem Antigen könnte es durchaus vorkommen, dass nur die IP01-Bande zu erkennen ist Dies ist durchaus im Sinne der Erfindung, da vorrangig falsch- negative Reaktionen verhindert werden sollen.
Tabelle 1. Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide und Primer.
IPOS1 5'-AGAACCCACT GCTTACTGGC CTTATCGAAA
TTAATACGAC TCACTATAGG GAGACCCAAG CTTGGTACCG
AGCTCGGATG TGCCTTCTAG TTGCCAGCC-3'
IPO1 5' -AGAACCCACT GCTTACTGGC CTTATCGAAA
TTAATACGAC TTGGTACCG AGCTCGGATG TGCCTTCTAG
TTGCCAGCC -3'
IP1 5'-AGAACCCACT GCTTACTGGC-3'
IP2 5' -GGCTGGCAAC TAGAAGGCAC -3'
Die Vertiefungen e'ner Mikrotiterplatte wurden mit Himhomogenat beschichtet, blockiert und mit 6H4-IP01 inkubiert Nach 6-maligen Waschen wurde nach Zugabe von internem DNA-Standard amplifiziert Die negative Kontrolle der PCR-Reaktion war negativ, die positiven
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Bei den Proben 1-6 wurden 1000 Kopien der Standard-Nukleinsäure IPOS1, bei den Proben 7-12 wurden 100 Kopien IPOS1 dazugegeben Beschichtet wurde entweder mit 8 oder 0,8 g Homogenat.
Tabelle 2 Kontrollierte Bestimmung von Prionantigenin einem Mäusehirnhomogenat
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<tb> Banden
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<tb> Probe <SEP> Homogenat <SEP> IPOS1 <SEP> IPO1 <SEP> IPOS1
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<tb> in <SEP> g <SEP> zugegebene <SEP> Kopien
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<tb> 1- <SEP> 1000- <SEP> ++
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<tb> 2- <SEP> 1000- <SEP> ++
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<tb> 3 <SEP> 8 <SEP> 1000 <SEP> + <SEP> ++
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<tb> 4 <SEP> 8 <SEP> 1000 <SEP> + <SEP> ++
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<tb> 5 <SEP> 0,8 <SEP> 1000 <SEP> + <SEP> ++
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<tb> 6 <SEP> 0,
8 <SEP> 1000 <SEP> + <SEP> ++
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<tb> 7- <SEP> 100- <SEP> +
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<tb> 8- <SEP> 100- <SEP> +
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<tb> 9 <SEP> 8 <SEP> 100 <SEP> + <SEP> +
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<tb> 10 <SEP> 8 <SEP> 100 <SEP> + <SEP> +
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<tb> 11 <SEP> 0,8 <SEP> 100 <SEP> + <SEP> +
<tb>
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Erklärung der Zeichen :
= Bande, ++ = starke Bande, - = keine Bande
Zugabe des Markerantigens
Wenn die gesamte Immuno-PCR auf falsch-negative Reaktionen überprüft werden soll, wird nicht zur PCR eine Standard-Nukleinsäure dazugegeben, sondern es wird am Anfang des Expe- riments als interner Standard ein Markerantigen in einer Menge, die gerade noch bestimmt werden kann, gleichzeitig mit dem spezifischen Antigen auf die entsprechenden Vertiefungen einer Mikro- titerplatte gegeben und über Nacht bei 4 C inkubiert Damit ist gewährleistet, dass alle störenden Einflusse, die zu einer falsch-negativen Reaktion (dazu gehört zum Beispiel auch das versehent- liche Nichtbeschichten einer Vertiefung) führen könnten, mitkontrolliert werden.
Bei der Inkubation mit dem spezifischen Antikörper/DNA-Komplexes wird dann mit einem entsprechenden Standard- Antikörper/DNA-Komplex gleichzeitig inkubiert und im Anschluss mit dem gleichen Primerpaar amplifiziert.
Falls die Immuno-PCR auf einem sogenannten Sandwich-ELISA basiert, müssen die Vertiefun- gen der Mikrotiterplatte dementsprechend mit einem Antikörper für das zu detektierende Antigen und einem Antikörper für das Standard-Antigen beschichtet werden
Es kann auch vorkommen, dass das Standard-Antigen natürlich vorkommt, wie beispielsweise bestimmte Proteine (z. B. Protein C) bei der Verwendung von biologischen Flüssigkeiten, wie z B.
Plasma
B e i s p i e 2. Herstellung und Verwendung der Antikorper/DNA-Komplexe
Die Herstellung eines Antikörper/DNA-Konjugates durch kovalente Bindung eines Oligo- nukleotides an einem monoklonalen anti-Prionen-Antikörper erfolgte entsprechend Hendricksson et al Als Ausgangsmaterial zur Herstellung des Konjugates wurde ein amiho-modifiziertes Reporter- Oligonukleotid (IP01, hergestellt von Fa Metabion, Martinsried, Deutschland) sowie der mono-
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Schritt 1: Herstellung der Acetylthioacetyl-derivatisierten DNA
Die Herstellung der Acetylthioacetyl-derivatisierten DNA erfolgt durch Reaktion mit Succinimidyl-S-Acetylthioacetat (SATA-Reagens/Pierce, Rockford, IL, USA)
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0,5 g/ml) jeweils 2,3 l eines Natrium-carbonat-Puffers (300 mM, pH 9,0) sowie einer Lösung von 115 mM SATA in DMF gegeben und über 30 Minuten bei Raumtemperatur und leichtem Schütteln inkubiert.
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dreidimensional vernetztem Dextran (Sephadex G-25 superfinel Pharmacia, Uppsala, Schweden)) unter Verwendung eines FPLC-Systems (Fa Pharmacia) umgepuffert Als Elutionspuffer wurde ein 100 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5 verwendet.
Schritt 2: Herstellung des Maleimid-modifizierten Antikörpers
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6H4-Antikörpers (Konzentration- 2 mg/ml) gegeben Diese Lösung wurde in einer Slide-A-Lyzer
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Nacht bei einer Temperatur von +4 C gegen 100 mM Natnumphosphat-Puffers, pH 7,0 dialysiert
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cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC/Fa.
Pierce) gegeben (Konzentrationen: 2,75 mM Sulfo- SMCC, 100 mM Natriumphosphat, 1,5 % DMF, pH 7,0) Nach Inkubation über 30 Minuten bei Raumtemperatur und unter leichtem Schuttein wurde wie unter Schritt 1 beschrieben uber eine
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Zur Herstellung des Antikörper/DNA-Konjugates wurden die unter Schritt 1 und Schritt 2 hergestellten Derivate vereinigt (jeweils ca 1,5 ml Lösung der Acetylthioacetyl-derivatisierter DNA bzw. des Maleimid-modifizierten Antikörpers)
Nach Start der Kupplungsreaktion durch Zugabe von 2 l einer 1 M wässrigen Hydroxylamin- hydrochlorid-Losung, pH 7,0, enthaltend 50 mM EDTA, wurde über 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss und leichtem Schütteln inkubiert Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 l einer 10 mM Lösung von N-Ethylmaleimid (Fa.
Pierce) in DMF abgestoppt. Das Reaktions-
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gemisch wurde mit Hilfe eines Centricon 3-Konzentrators (Amicon, Beverly, MA, USA) durch Zentrifugation bei 7000 x g aufkonzentnert
Das aufkonzentrierte Reaktionsgemisch (ca 5001) wurde anschliessend durch Gelfiltration mit Hilfe des Pharmacia FPLC-Systems nachgereinigt (Pharmacia, Uppsala, Schweden)
Chromatographische Bedingungen
Saule XK 16mm/120mm, gefüllt mit einem Gelfiltrationsmatenal aus dreidimensional mit N,N'-Methylen-bis(acrylamid) vemetztem Dextran (Sephacryl 300 HR (Fa Pharmacia))
Elutionspuffer. 200 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0
Flussrate:
0,5 ml/min
Detektion- 280 nm Fraktionsgrosse 0,25 ml
Die Fraktionen im Elutionsmaximum wurden gesammelt und für die Immuno-PCR in verschie- denen Verdünnungen eingesetzt.