DE68903558T2

DE68903558T2 - Verfahren zur inaktivierung von viren.

Info

Publication number: DE68903558T2
Application number: DE8989122657T
Authority: DE
Inventors: John L Lundblad; Richard L Seng
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1988-12-20
Filing date: 1989-12-08
Publication date: 1993-04-01
Anticipated expiration: 2009-12-09
Also published as: JP2601551B2; ATE82510T1; US4939176A; AU618157B2; ES2052872T3; AU4698789A; EP0374625A2; JPH02273175A; GR3006561T3; DE68903558D1; EP0374625A3; EP0374625B1; CA1340211C

Description

Diese Offenbarung betrifft im allgemeinen ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren und insbesondere zur Inaktivierung von Viren in biologisch aktiven therapeutischen Proteinprodukten.
Die Sicherheit pharmazeutischer Produkte ist immer ein Problem, insbesondere in Fällen, wo virale Kontaminierung auftreten kann (z. B. in Produkten, die aus Blut oder Zellkultursystemen zur Produktion biologisch-aktiver Proteine gewonnen werden).
Leider sind auch die Produkte selbst, bei denen Viren gefunden werden, im allgemeinen labil und ziemlich empfindlich gegenüber vielen bekannten und üblichen Inaktivierungsverfahren von Viren. In einigen Fällen schützen die Bemühungen zum Schutz der Proteine auch den Virus.
Es sind verschiedene Versuche unternommen worden, diese Situation zu verbessern. Z. B. ist es bekannt, daß biologisch-aktive Proteine durch gewisse kontrollierte Hitzebehandlungen oder speziell ausgewählte chemische Mittel inaktiviert werden können. Es sind mehrere Hitzebehandlungsverfahren entwickelt worden, Viren ohne negativen Einfluß auf die biologische Aktivität des Proteins oder einer wesentlichen Verringerung seiner Menge zu inaktivieren. Siehe z. B. US-Patent 4,440,679 von Fernandez und Lundblad (carbohydrate stabilizers for pasteurization of the very labile coagulation protein known as Factor VIII) und US-Patent 4,762,714 von Mitra und Mozen (zeigt die virale Inaktivierung bei einem Immunglobulinprodukt durch kontrollierte pH-Temperatur- und Zeitbedingungen). Siehe ebenfalls US-Patent 4,456,590 von Reubenstein, das zeigt, daß Faktor VIII Pasteurisierungsbedingungen unterworfen werden kann (mindestens 60ºC über 10 Stunden (falls er zuerst lyophilisiert wird, und US-Patent 4,495,278 von Thomas (ähnliche Hitzebehandlung von lyophilisiertem Faktor IX)).
Es sind auch verschiedene chemische Verfahren eingesetzt worden, Viren zu aktivieren. Siehe z. B. US 4,534,972 von Lembach (Verwendung von Kupfer, Phenanthrolin und verwandten Verbindungen) und US 4,481,189 von Horowitz (Verwendung von Tri-n-butylphosphat und verwandten Verbindungen).
Es wurden Carbonsäuren, wie Caprylsäure, bei der Herstellung von Plasmaprodukten (Präzipitation von Globulinen) und sogar für die Inaktivierung von lipidbeschichteten Viren verwendet, jedoch nicht in Gegenwart von therapeutisch biologisch-aktiven Proteinen (siehe J. A. Sands et al, Anti Microbial Agents and Chemotherapy, Jan. 1979, Seiten 134-136). Carbonsäuren (Natriumcaprylat) wurde ebenfalls in Kombination mit Hitze und Aminosäuren zur Inaktivierung von Viren bei Faktor VIII eingesetzt (siehe US 4,446,134 von Nation et al.). Siehe ebenfalls die sequentielle Verwendung von Fettsäuren zur Inaktivierung von Viren in Plasmaderivaten, wie von Horowitz et al, Vox. Sang. 54:14-20 (1988) offenbart.
Die Präzipitation der Hauptmenge der Plasmaproteine mit Caprylsäure ohne Beeinflussung von IgG, Ceruloplasmin und IgA wurde beschrieben (Steinbuch, M. and Audran, R., Arch. Biochem. Biophys., 134, 279-294 [1969]). Menschliche, Pferde-, Vogel- und Kaninchenseren oder - Plasmen wurden mit 0,06 M Acetatpuffer auf ca. 1,7 % Protein verdünnt, auf einen pH von 4,8 bei 20ºC und auf eine Caprylsäurekonzenration von 0,174 M (2,5 Gew.%) eingestellt. Die Beachtung der Puffermolarität (0,06 M) und des pH-Werts (pH 4,8 ± 0,05) ist für das hoch gereinigte IgG kritisch.
Das Präzipitationsverfahren von Steinbuch, M., oben wurde auf verbrauchte Medium von Hybridoma-Kulturen und Ascites-Flüssigkeit von Mäusen, unter Verwendung von Caprylsäure bei einer Konzentration von 0,066 M (0,68 Gew %.) zur Gewinnung von IgG angewandt (Russo, C., Callegaro, L., Lanza, E., Ferrone, S., J. Immunol Methods, 65, 269-271 [1983]). Dasselbe Verfahren wurde bei verdünnten humanem Plasma, das auf eine Carpylsäurekonzentration von 0,15 M oder 2,15 Gew.% eingestellt wurde, angewandt (Habeeb, A.F.S.A. and Francis, E.R., Prep. Biochem., 14(1), 1-17 [1984]). IgA, das aus der kalten Cohn-Ethanol-Fraktion III durch die DEAE-Zelluloseadsorption und -Elution isoliert wurde, wurde weiter durch Caprylsäure-Präzipitation zur Entfernung von alpha-2-Makroglobulin gereinigt (Pejaudier, L., Audran, R. and Steinbuch, M., Vox Sang., 23, 165-175 [1972]). Die Parameter für die Präzipitation waren 1,5 bis 2,0 % Protein, eingestellt auf 0,9 % Natriumchlorid, pH 5 und Caprylsäurezusatz bei Raumtemperatur auf 0,078 M oder 1,12 Gew.%. Das präzipitierte alpha-2-Makroglobulin wurde durch Zentrifugation entfernt.
Caprylsäure wurde verwendet, um die meisten Proteine und andere Lipoproteine als Immunoglobuline, die in der kalten Ethanol-Cohn-Fraktion III vorliegen, zu präzipitieren (Steinbuch, M., Audran, R., Pejaudier, L., Blatrix, C., Prep. Biochem., 3(4), 363-373 1973]). Eine Suspension von Fraktion III mit ca. 2,5 % Protein wurde auf 0,05 M Acetat pH 4,8 eingestellt und auf Raumtemperatur gebracht. Caprylsäure wurde in einer Konzentration von 0,174 M oder 2,5 Gew.% zugegeben. Das erhaltene Präzipitat wurde verworfen. Der Überstand war mit IgG, IgM und IgA angereichert. Es ist zu bemerken, daß in allen Fällen, wo Caprylsäure als Präzipizationsmittel eingesetzt wurde, es in einer Menge vorliegt, die bemerkenswert überhalb einer maximalen Löslichkeit in Wasser bei idealen pH-Bedingungen, Temperatur und Erhältlichkeit von Caprylsäure vorliegt (wie im Folgenden erörtert). Solche Mengen, im allgemeinen ca. 0,86 bis 2,5 Gew.% sind notwendig, um eine ausreichende Menge der relativ unlöslichen Caprylsäure in einer unlöslichen Form (einer Emulsion) bereit zu stellen, die als Präzipitationsmittel geeignet ist.
Trotz der obigen zahlreichen Veröffentlichungen war uns kein verfahren bekannt, welches Caprylsäure in einer geringeren als der Präzipitationskonzentration und allein verwendet, um im wesentlichen alle Lipid-beschichteten Viren ohne negative Beeinflussung der biologischen Aktivität oder der gewinnbaren Menge der therapeutischen Proteine zu inaktivieren. Wir haben gefunden, daß durch sorgfältige Kontrolle der Verwendungsbedingungen Caprylsäure eingesetzt werden kann, Viren mit Lipidhülle in einem biologisch-aktiven therapeutischen Produkt ohne negativen Affekt auf die Aktivität des Produktes zu inaktivieren. Einzelheiten unserer Erkenntnisse werden im folgenden gezeigt.
Die Vorteile unseres Verfahrens beruhen auf der präzisen Kontrolle der Menge von nicht-ionisierter Caprylsäure, die nach der folgenden Dissoziationreaktion erzeugt wird: Caprylsäure ionisierte Form
Unser Verfahren zur Inaktivierung von im wesentlichen allen Viren mit Lipidhülle im empfindlichen biologischaktiven proteinösen therapeutischen Produkten umfaßt den Schritt des in Kontaktbringens des Produkts mit Caprylsäure, unter Bedingungen bezüglich der Konzentration, des pH und der Ionenstärke, die ausreicht, die Menge nicht ionisierter Caprylsäure zu kontrollieren und immer noch die Inaktivierung der Viren ohne negativen Effekt auf die Ausbeute, biologische Aktivität und therapeutische Wirksamkeit des Produktes sicher zu stellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Inaktivierungsverfahren die selektive Verwendung einer Caprylatsalzkonzentration und pH-Wert- Einstellung zur Kontrolle der erzeugten Caprylsäuremenge ohne negativen Einfluß auf die Stabilität oder Menge des spezielle Proteins, das inaktiviert wird. Unerwünschter Proteinverlust wird durch Einstellung von Bedingungen vermieden, welche nicht zu einer Bildung von mehr als 0,068 oder ca. 0,07 % Caprylsäure, der maximalen Löslichkeit, führen.
Caprylsäurekonzentrationen, die ca. 0,07 % (Basis-Gew.) können zu einer Emulsion der Caprylsäure und des Proteins führen und resultieren daher in einen unerwünschten Proteinverlust. Andererseits muß die Menge an Caprylsäure ausreichend sein (mindestens 0,001 %), die Inaktivierung von Viren mit Lipidhülle innerhalb einer vernüftigen Zeit sicher zu stellen. Überraschenderweise wird die Inaktivierung des Virus beinahe sofort bei niedrigeren pH-Werten (6,5 oder weniger) erreicht, wenn die Caprylsäure in 0,07 bis 0,001 % vorliegt. Bei höheren pH- Werten, wo das Caprylat dominiert, ist eine höhere Konzentration und eine längere Zeit erforderlich, dieselbe logarrhythmische Verringerung des Virus zu erzielen. Daher beträgt in einer bevorzugten Ausführungsform die Caprylsäurekonzentration, die für diese Erfindung einsetzbar ist, 0,07 bis 0,001 Gew.%.
Der Hauptvorteil der Erfindung ist seine Vielseitigkeit. Bei niedrigen Konzentrationen kann die Erfindung bei einem niedrigen pH-Wert eingesetzt werden, um sofort bestimmte Viren zu inaktivieren. Das Verfahren erlaubt ebenfalls die Inaktivierung, falls notwendig, bei höheren pH-Werten in höheren Konzentrationen und längerer Zeit. Dies erlaubt die Inaktivierung beim stabilsten pH-Wert des Proteins auszuwählen, so daß das Protein nicht verändert oder während der Virusinaktivierung zerstört wird. Daher liegt in bevorzugten Fällen die Caprylsäurekonzentration im Bereich von 0,07 bis 0,001 Gew.% in Wasser, was durch Kontrolle sowohl des pH- Werts und der Menge des Caprylats in ionisierter Form (d. h., z. B. Natriumcaprylat) eingestellt wird, wie im folgenden in Einzelheiten erläutert.
Caprylsäure hat vorteilhafterweise eine niedrige Toxizität beim Menschen und wird gegenwärtig als Stabilisator für Albumin oder Plasmaproteinfraktion (PPF) verwendet, die in großen Mengen menschlichen Patienten infusiert werden. Ein anderer Vorteil der Erfindung ist, daß es die Zugänglichkeit von Virus-freien therapeutisch aktiven Proteinen, wie IgM/IgG, sicherstellt, die aus Cohn-Fraktion III-Paste gereinigt werden, die als Quelle von Plasmavieren bekannt ist. Ein hauptsächlicher Vorteil liegt darin, daß es ein Verfahren ist, welches, wenn es sorgfältig kontrolliert wird, nicht schädlich für Proteine ist und daher für jedes Protein anwendbar ist, das bei irgendeinem pH-Bereich zwischen 4,0 und 8,0 stabil ist.
Die Figur zeit eine graphische Darstellung der Caprylsäurekonzentration, des pH-Werts und der viralen Inaktivierungszeit einer gegebenen Lösung.
Nach üblichem Standard biochemischer Konventionen, wie hierin verwendet, bezeichnet das Suffix "at" (z. B. Caprylat) eine Mischung der Säure und mit ihrer ionisierten Form, wie nach der Dissoziationsgleichung: Caprylsäure ionisierte Form
Der pKa der Caprylsäure ist 4,89 (CRC Handbook of Chemistry and Physics, 56th Edition). Die Henderson Hasselbach-Gleichung:
pR = pKa + log [ionisierte Form]/[Säure]
gibt die Konzentration der Säure und ihrer ionisierten Form bei verschiedenen pH-Bereichen wieder. Daher kann man leicht eine gegebene Konzentration von Caprylsäure durch sorgfältige pH-Kontrolle und Konzentration des Caprylats einstellen. Z. B. falls die Caprylsäurekonzentration konstant bei 0,07 % (0,0035 M) gehalten wird und die ionisierte Form (z. B. Natriumcaprylat) zwischen 0,06 % bei pH 4,0 und 2,0 % bei pH 8 variiert, wird eine Caprylsäuremenge, wie in Fig. 1 gezeigt, eingestellt. Wie hierin verwendet, bezeichnet Caprylsäure die nicht-ionisierte Form der Säure (ebenfalls als Oktansäure bezeichnet).
Wir haben gefunden, daß es relativ einfach ist, eine praktische und bevorzugte Konzentration von Caprylsäure einzustellen. Dies kann durch Variation der Konzentration von Natriumcaprylat zwischen 0,1 % bei pH 4,8 und 20 % bei ca. pH 9,0 erfolgen, was zu einer sofortigen Inaktivierung von Viren mit Lipidhülle führt. Besonders bevorzugt wird die Totalkonzentration von Caprylat zwischen 0,1 % bei pH 4,8 gehalten und steigt linear auf 2,0 % bei pH 6,5 unter einer sofortigen Virusinaktivierung an. Beispielsweise kann das Caprylat bei 2 % zwischen pH 6,5 und 9,5 für einen längeren Zeitraum (z. B. 2 bis 4 Stunden) gehalten werden, was eine geeignete Caprylsäurekonzentration zur Virusinaktivierung liefert. Die Voraussetzung hier ist, Virusinaktivierung liefert. Die Voraussetzung hier ist, daß die nicht-ionisierte Säureform (Caprylsäure) der Wirkstoff ist, das Virus abzutöten, indem irgendwie die Lipidhülle oder die darin eingebetteten Proteine beeinflußt werden, und daß aufgrund der Dissoziationsreaktion Caprylsäure in einer Konzentration durch Erhöhung der Konzentration der ionisierten Form (Natriumcaprylat) gehalten wird, die hoch genug zur Abtötung der Viren bei höheren pH-Werten ist.
Die Mischung der Proteinzusammensetzung und der viralen und bakteriellen Inaktivierungsmittel wird im allgemeinen bei einer Temperatur von 2 bis 60ºC (vorzugsweise 4 bis 20ºC) für einen Zeitraum von mindestens 0,25 Stunden (vorzugsweise 0,5 bis 3 Stunden) gehalten. Wie oben bemerkt, wird die erfindungsgemäße Behandlung im allgemeinen unter pH-Bedingungen durchgeführt, die mit dem zu behandelnden Proteinmaterial verträglich sind. Daher sollte der pH der Mischung in Abhängigkeit vom Protein im allgemeinen innerhalb des Bereiches von 4 bis 10, vorzugsweise 4,5 bis 8,5 und besonders bevorzugt 4,8 bis 8,0 für die meisten biologisch-aktiven Proteine liegen. Im allgemeinen werden pH- und Temperaturbereiche so gewählt, daß sie eine möglichst geringe Beeinträchtigung des aktiven Proteins in der Zusammensetzung sicherstellen. Der Fachmann ist mit den bevorzugten pH-Bereichen für ein bestimmtes Protein vertraut.
Der Fachmann wird ebenfalls einen geeigneten Stabilisator für das Protein während der Behandlung der Mischung, wie oben beschrieben, zugeben. Die Proteinzusammensetzung kann anschließend weiter behandelt werden, um das zugesetzte Caprylsäure/Caprylat zu entfernen. Übliche Verfahren können hierzu eingesetzt werde. Z. B. kann die Mischung dialysiert werden, oder das Protein wird an ein Anionen-Austauscherharz gebunden und zur Entfernung der zugesetzten Caprylsäure/Caprylat gewaschen werden, und nachfolgender Elution des Proteins. Andere Mittel zur Entfernung des Agents sind dem Fachmann bekannt.
Wir haben gefunden, daß unsere Behandlung zur Inaktivierung von Viren in einem weiten Bereich biologisch-aktiver therapeutischer Proteine, wie Antikörper (aus Plasma und Monoklonal), Humanserumalbumin, Koagulationsfaktoren, Fibronektin und Transferrin anwendbar ist.

Definitionen

Caprylsäure bedeutet die nicht-ionisierte Form, wie oben definiert. Wie hierin verwendet, bedeutet eine wesentliche Verminderung der Infektiösität, daß der virale Infektionstiter einer gegebenen Präparation um mindestens 4 logarrhythmische Einheiten, oder auf eine nicht nachweisbare Stufe (N.N.) vermindert wird. Eine im wesentlichen sofortige Inaktivierung des Virus bedeutet, daß die Virusinaktivierung stattfindet, bevor der Virustiter mit sofortigen üblichen Verfahren gemessen werden kann (z. B. daß er N. N. ist). Keine negative Beeinflussung der biologischen Aktivität bedeutet, daß der Kontakt mit der Caprylsäure zu einem Verlust von weniger als 30 % der ursprünglichen biologischen Aktivität, unter Verwendung üblicher Verfahren gemessen aktiver Proteine bestimmt, führt. Kein negativer Effekt auf die Menge des biologisch-aktiven Proteins bedeutet, daß Kontakt mit der Caprylsäure zu einem Verlust von weniger als 40 % der ursprünglichen Proteinmenge (der Menge vor der Virusinaktivierungsbehandlung) führt. Dies ist vorzugsweise weniger als 10%. Ein Virus mit Lipidhülle, wie hierin verwendet, bedeutet ein Virus, dessen Nukleinsäure durch ein Kapsid eingehüllt ist, welches Lipide enthält. Diese sind dem Fachmann bekannt, wie auch die Expression von Viren mit Lipidhülle. Therapeutisch bedeutet die Fähigkeit, zu einer medizinisch vorteilhafte Wirkung bei Verabreichung an einen Säuger.
Beispiele der Offenbarung sind im folgenden gegeben, welche zeigen, wie Variable, wie Konzentration der Caprylsäure und Caprylat, pH, Temperatur, Zeit, die Reduktion der Virusinfektiösität, der Proteinausbeute und des Erhalt der biologischen Aktivität des Proteins beeinflussen können.

Beispiel 1

Pseudomonas aeruginosa monoklonaler IgM Antikörper (Mensch) (Ps MAb-IgM) wurde mit durch Epstein-Barr-Virus (EBV) transformierten humanen B-Lymphozyten (A.T.C.C. CRL 8752) hergestellt. Die vortransformierten Zellen wurden von Spendern mit natürlich vorkommenden Antikörpertitern, die spezifisch aus einem der sieben Fisher-Devlin- Serotypen F-4 sind erhalten. Die Antiköper binden an eine serotypische Determinante auf den Oberflächen- Lipopolysaccharid-Molekülen des Bakteriums. Der Überstand aus der Zellkultur für den F-4-Antikörper wurde geklärt, teilweise gereinigt und auf pH 8 mit 1 N NaOH eingestellt. Die IgM-Lösung mit 0,38 mg/ml (19 mg gesamt), wurde bei Raumtemperatur (R.T.) zunächst mit Herpes Simplex Typ I (HSV-1) Virus und vesikularen Stomatitisvirus (VSV) in Kontakt zugegeben und die Lösung wurde auf pH 8 eingestellt, welcher nach der Henderson Hasselbach-Gleichung 0,0014 Gew.% Caprylsäure und 1,9986 Gew.% Caprylat in ionisierter Form entspricht. Nach der Viruszugabe wurde die Lösung 60 Minuten stehen gelassen. Virusvorbehandelte Proben dienten als Kontrolle bei diesen und den nachfolgenden Beispielen.
Die Ausbeutewerte für PS MAb-IgM F-4-Protein basieren auf Radikal-Immuno-Diffusionstests (RID). Die funktionale Aktivität wurde als spezifische Lipopoly-Saccarid-(LPS)- Bindungsfähigkeit angegeben. Untersuchungen bei den folgenden IgM F-4-Proben zeigten im wesentlichen auch keinen Verlust bei der LPS-Bindungskapazität.
Die Ergebnisse aus Beispiel 1 sind in Tabelle 1 gezeigt: Tabelle 1 Virus (Log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0;/ml) Temperatur Zeit (Minuten) %Ausbeute LPS-Bindungs-Kapazität N.N.: Nicht nachweisbar (≤ 1,5)

Beispiel 2

Ps MAb (F-4) wurde hergestellt und behandelt wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß zusätzlich zu VSV die Untersuchung Epstein Barr-Virus (EBV) mit beinhaltete, und der Inaktivierungsschritt bei einer niedrigeren Temperatur (5ºC) durchgeführt wurde. Nach Zugabe des Virus wurde die Lösung 120 Minuten stehen gelassen.
Die Ergebnisse aus Beispiel 2 sind in Tabelle II gezeigt. Tabelle II Virus Log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0;/ml) Temperatur Zeit (Minuten) %Ausbeute N.U.: Nicht untersucht

Beispiel 3

PS MAb (F-4) wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß die teilweise gereinigte IgM-Lösung zur Inaktivierung eine Temperatur von 5ºC hatte und auf einen pH von 4,8 mit 1N HCl eingestellt wurde. Die Probe wurde zunächst mit dem Virus in Kontakt gebracht und anschließend wurden 0,1 Gew.% Caprylsäure zugegeben und der pH auf 4,8 mit 1N NaOH eingestellt, was nach der Henderson Hasselbach-Gleichung 0,05 Gew.% Caprylsäure und 0,045 Gew.& Caprylat in ionisierter Form entspricht. Nach Viruszugabe wurde die Lösung 60 Minuten bei 4 ºC aufbewahrt.
Die Ergebnisse aus Beispiel 3 sind in Tabelle III gezeigt. Tabelle III Virus Log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0;/ml) Temperatur Zeit (Minuten) %Ausbeute N.U.: Nicht nachweisbar (untere Nachweisgrenze - 1,5)

Beispiel 4

Pseudomonas Exotoxin A Antikörper IgG (Mensch) (MAb Exo A IgG) wurde durch EBV-transformierte menschliche B- Lymphozyten (A.T.C.C. CRL 8833) aus Spendern mit einem natürlichen Antikörpertiter gegen Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A hergestellt. Des Zellkulturüberstands von MAb Exo A IgG wurde geklärt und gereinigt. Das MAb Exo A IgG wurde bei 5ºC auf 0,5 mg/ml (25 mg gesamt) bei einem pH von 6,5 eingestellt und wurde zunächst mit VSV- und HSV- 1-Virus in Kontakt gebracht. Anschließend wurden 2,0 Gew.% Natriumcaprylat zugegeben und der pH auf 6,5 mit 1N HCl eingestellt, was nach der Henderson Hasselbach- Gleichung 0,042 Gew.% Caprylsäure und 0,958 Gew.% Caprylat in ionisierter Form entspricht. Nach Zugabe wurde die Lösung 30 Minuten aufbewahrt.
Die Ergebnisse aus Beispiel 4 sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle IV Virus Log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0;/ml) Temperatur Zeit (Minuten) %Ausbeute N.N.: Nicht nachweisbar (untere Nachweisgrenze ≤ 1,5)

Beispiel 5

MAb Exo A IgG wurde wie in Beispiel 4 hergestellt, mit der Ausnahme, daß 2 Konzentrationen von Nariumcaprylat, wie in den Ergebnissen angegeben, eingesetzt wurden. Die Proben für die Untersuchungen zur Wirksamkeit der viralen Inaktivierung wurden 60 Minuten bei pH 6,3 und 5ºC kontaktiert. Die Viren umfaßten VSV, HSV-1, Vacciniavirus und Sindbis-Virus.
Die Ergebnisse aus Beispiel 5 sind in Tabelle V gezeigt. Tabelle V Virus (Log&sub1;&sub0;TCID&sub5;&sub0;/ml) Vaccinia Sindbis Temperatur Behandlungszeit (Minuten) NN: Nicht nachweisbar (untere Nachweisgrenze ≤1,5) A* Den Proben wurde 1,0 Gew.% Natriumcaprylat zugesetzt, und sie wurden mit 1N HCl auf einen pH von 6,3 eingestellt, was nach der Henderson Hasselbach-Gleichung 0,033 Gew.% Caprylsäure und 0,967 Gew.% Caprylat in ionisierter Form entsprach. B** Den Proben wurde 2,0 Gew.% Natriumcaprylat zugegeben, und sie wurden mit 1N HCl auf einen pH von 6,3 eingestellt, was nach der Henderson Hasselbach-Gleichung 0,065 Gew.% Caprylsäure und 1,935 Gew.% Caprylat in ionisierter Form entsprach.

Beispiel 6

Zwei nicht-lipid beschichtete Viren, Rinder-Parovirus (BPV) und Polio II, wurden mit Caprylsäure umgesetzt, und das Fehlen der Wirkung im Gegensatz zur Inaktivierung von Viren mit Lipidhülle zu demonstrieren. Ps MoAb IgM (F-4) wurde hergestellt und chemisch behandelt, wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß die Inaktivierungstemperatur 5ºC betrug und der Virus BPV war. MoAb Exo A IgG wurde hergestellt und chemisch behandelt wie im Beispiel 5, mit der Ausnahme, daß die IgG-Lösung auf pH 6,3 eingestellt wurde. Die IgG-Proben wurden zunächst mit BPV- und Polio II-Viren in Kontakt gebracht, und anschließend wurde Natriumcaprylat auf 2,0 Gew.% zugegeben, und der pH auf 6,3 mit 1N HCl eingestellt, was nach der Henderson Hasselbach-Gleichung 0,065 Gew.% Caprylsäure und 1,935 Gew.% Caprylat in ionisierter Form entsprach. Nach der Viruszugabe wurde die Lösung 120 Minuten aufbewahrt.
Die Ergebnisse aus Beispiel 6 sind in Tabelle VI gezeigt. Tabelle VI Virus (Log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0;/ml Temperatur Behandlungszeit (Minuten)

Beispiel 7

Humanserumalbumin wurde aus dem Überstand IV-4 nach dem kalten Ethanolreinigungsverfahren von E. J. Cohn isoliert. Das Albumin wurde auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml (25 mg gesamt) bei pH 6,0 eingestellt. Bei 4ºC wurde die Albuminlösung mit dem vesikularen Stomatitis- Virus (VSV) in Kontakt gebracht, und anschließend wurde Natriumcaprylat auf 1,0 Gew.% zugegeben und der pH auf 6,0 mit 1N HCl eingestellt, was nach der Henderson Hasselbach-Gleichung 0,062 Gew.% Caprylsäure und 0,938 Gew.% Caprylat in ionisierter Form entsprach. Nach Viruszugabe wurde die Lösung 60 Minuten aufbewahrt.
Die Ergebnisse aus Beispiel 7 sind in Tabelle VII gezeigt. Tabelle VII Albumin Temperatur Zeit (Minuten) % Ausbeute VSV (Log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0;/ml) N.N.: Nicht nachweisbar (untere Nachweisgrenze ≤ 1,5)

Beispiel 8

Mit den labilen Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X angereichertes humanes Serumprotein wurde durch Anionenaustausch-Absorption von Ausfluß I aus dem kalten Ethanolreinigungsverfahren nach E. J. Cohn abgetrennt. Die eluierten Koagulationsfaktoren wurden weiter gereinigt und auf eine Proteinkonzentration von 1,73 mg/ml bei pH 6,8 eingestellt. Natriumcaprylat wurde auf eine Konzentration von 2,0 Gew.% zugegeben, und der pH auf 6,8 mit 1N HCl eingestellt, was nach der Henderson Hasselbach-Gleichung 0,022 Gew.% Caprylsäure und 1,978 Gew.% Caprylat in ionisierter Form entsprach. Nach Inkubation bei 4ºC für 2 Stunden wurden die Koagulationsproteine von den klinischen Reaktionsmitteln durch Größen-Ausschluß-Chromatografie unter Verwendung von Sephadex G-50 abgetrennt. Die Ausbeuteergebnisse basieren auf der in Tabelle VIII gezeigten funktionalen Koagulationsaktivität. Tabelle VIII Koagulationsfaktoren (Einheiten/ml) Temperatur Zeit (Minuten) Probenbeschreibung unbehandelt behandelt Prozent funktionale Ausbeute

Beispiel 9

Mit Fibronektin angereichertes Protein wird aus der Abfallsproteinfraktion während der Reinigung von humanen Faktor VIII auf Cryopräzipitat isoliert. Das Fibronectin wurde auf eine Proteinkonzentration von 1,34 mg/ml bei pH 6,9 (33,5 mg gesamt) eingestellt. Es wurde Natriumcaprylat auf eine Konzentration von 2,0 Gew.% zugegeben, und der pH auf 6,9 mit 1N HCl eingestellt, was nach der Henderson Hasselbach-Gleichung 0,014 Gew.% Caprylsäure und 1,986 Gew.% Caprylat in ionisierter Form entsprach. Nach Inkubation bei 5ºC für eine Stunde wurde das Fibronektin von den chemischen Reaktanten durch Größen-Ausschluß-Chromatografie unter Verwendung von Sephadex G-50 abgetrennt. Proben vor und nach der Caprylsäurebehandlung wurden mit einem Enzym-linked- immunosorbent-assay überprüft, um die Ausbeute festzustellen, und wurden auf strukturelle Veränderungen durch Fast-Protein-liquid-chromatography (FPLC) analysiert. Die Ergebnisse des Beispiels 9 sind unten in Tabelle IX gezeigt. Tabelle IX Fibronektin Temperatur Zeit (Minuten) % Ausbeute

Beispiel 10

Das auch als alpha&sub1; Metall-bindende Globulin bekannte Transferrin wurde aus der Fraktion IV-1 nach dem kalten Ehtanolreinigungsverfahren von E. J. Cohn isoliert. Das Transferrin wurde auf 3,35 mg/ml (105 mg gesamt) bei pH 6,8 eingestellt. Es wurde Natriumcaprylat auf eine Konzentration von 2,0 Gew.% zugegeben, und der pH auf 6,8 mit 1N HCl eingestellt, was nach der Henderson Hasselbach-Gleichung 0,022 Gew.& Caprylsäure und 1,978 Gew.% Caprylat in ionisierter Form entsprach. Nach 60- minütiger Inkubation bei 5ºC wurde das Fibronektin von den chemischen Reaktanten durch Größen-Ausschluß- Chromatografie, unter Verwendung von Sephadex G-50, abgetrennt. Proben vor und nach der Caprylsäurebehandlung wurden durch RID getestet, um die Ausbeute zu bestimmen, und wurden auf strukturelle Veränderungen durch FPLC analysiert. Die Ergebnisse aus Beispiel 10 sind in Tabelle X gezeigt. Tabelle X Transferrin Strukturelle Veränderungen Temperatur Zeit (Minuten) %Ausbeute Aggregate/ Fragmente N.N: Nicht nachweisbar

Beispiel 11

Das Cryopräzipitat wurde durch Zentrifugation aus aufgetauten Vorrat von menschlichen gefrorenem humanem Plasma gewonnen. Kuagulationsfaktor VIII, auch als antihemophiler Faktor (AHF) bekannt, wurden aus dem Cryopräzipitat gewonnen und gereinigt. Die gereinigte AHF-Lösung wurde auf eine AHF-Konzentration von 1,7 Einheiten/ml (46,2 AHF-Einheiten gesamt) bei pH 7,2 eingestellt. Natriumcaprylat wurde bei 5ºC auf eine Konzentration von 2,0 Gew.% zugegeben, und der pH auf 7,2 mit 1N HCl eingestellt, was nach der Henderson Hasselbach-Gleichung 0,0087 Gew.% Caprylsäure und 1,9913 Gew.% Caprylat in ionisierter Form entsprach. Nach 2- stündiger Inkubation bei 5ºC, wurde das AHF-angereicherte Protein von den chemischen Reaktionsmitteln durch Größen- Ausschluß-Chomatografie unter Verwendung von Sephadex G- 50 abgetrennt. Die Ausbeuteergebnisse beruhen auf die funktionelle Faktor VIII Koagulationsakitvität und sind in Tabelle XI gezeigt. Tabelle XI Faktor VIII Temperatur Zeit (Minuten) Gesamteinheiten %Ausbeute

Beispiel 12

Immun-Globulin-M (IgM-pd) aus menschlichem Plasma, das aus der Fraktion III gereinigt wurde, wurde untersucht, um die Rolle eines niedrigen pH-Werts (pH 4,8) bei der Viruszerstörung aufzuklären. Die Fraktion III-Paste wurde aus normalem humanen Plasma nach dem kalten Ethanolfraktionierungsverfahren von Cohn-Oncley behandelt. Fraktion III-Paste wurde durch Mischen bei 20ºC in 0,05 M Natriumacetat bei pH 4,0 suspendiert. Unlösliche Proteine wurden durch Zentrifugation und Filtration entfernt. Das geklärte, mit IgM-pd angereicherte Filtrat wurde auf pH 4,8 eingestellt. Die IgM-pd-Lösung wurde bei 5ºC mit VSV in Kontakt gebracht. Gewebekultur-Medienproben (T.C.) wurden zur Kontrolle mit VSV in Kontakt gebracht. Zu den Proben wurde keine Caprylsäure zugesetzt. Nach Viruszugabe wurden die Proben auf Infektiösität in Abständen bis zu 8 Stunden untersucht. Die Ergebnisse aus Beispiel 12 sind in Tabelle XII dargestellt. Tabelle XII Infektiösität Log&sub1;&sub0;TCID&sub5;&sub0;/ml Temperatur Zeit (Stunden) T.C.-Kontrolle N.U.: Nicht untersucht
In Übereinstimmung mit der obigen Offenbarung und den Beispielen sind dem Fachmann Variationen bekannt. Es ist somit beabsichtigt, daß die hier offenbarte Erfindung nur die folgenden Ansprüche eingeschränkt sein sollte.

Claims

1. Verfahren zur Inaktivierung eines Virus mit Lipidhülle in einer Lösung von biologisch-aktiven therapeutischen Proteinen, wobei das Verfahren den Schritt, des Kontaktierens der Lösung mit Caprylsäure unter Bedingungen umfaßt, die im wesentlichen ausreichend sind, die Infektiösität des Virus zu vermindern, ohne einen negativen Einfluß auf die Menge und die biologische Aktivität der Proteine auszuüben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Caprylsäure in nicht-ionosierten Form in einer Menge im Bereich von 0,07 bis 0,001 %, bezogen auf Gew.%, in Wasser vorliegt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, worin die Infektiösität auf ein nicht nachweisbares Ausmaß vermindert wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, worin die Bedingungen der Caprylsäurekonzentration und des Lösungs-pH-Werts durch das schraffierte Gebiet der Fig. definiert sind.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, worin das biologisch-aktive therapeutische Protein an IgM- Antikörper und der pH der Lösung 8,0 ist, oder ein IgG-Antikörper und der pH 6,3 ist.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, worin das biologisch-aktive therapeutische Protein ein menschlicher monoklonaler Antikörper ist, umfassend den Schritt des Kontaktierens des Virus mit Caprylsäure bei einer Konzentration im Bereich von 0,07 bis 0,001 %, bezogen auf Gew.%, für eine Zeit, die ausreichend ist, den Virustiter auf ein nicht nachweisbares Ausmaß zu vermindern.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Antikörper solche Antikörper sind, die an eine Serotypdeterminante auf den Lipopolysaccharidmolekülen eines Pseudomonas aeruginosa Bakteriums bilden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Bakterium eines aus den Fisher-Devlin-Immunotyp 1 bis 7.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Bakterium Fisher-Immunoyp 4 ist.

10. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Antikörper Antikörper sind, die an Exotoxin A von Pseudomonas aeruginosa binden.