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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit
von Molekülen von
Interesse in biologischen Ausgangsmaterialien. Dies entspricht einem
allgemeinen Bedürfnis
auf vielen Gebieten der wissenschaftlichen Forschung. In der Tat
war das Vermögen
zur Feststellung der Anwesenheit von Molekülen, die beispielsweise mit
klinischen Pathologien assoziiert sind, in biologischen Proben immer
eine wichtige Aufgabe der Forschung, insbesondere auf dem Gebiet
der Medizin.
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Das
Gebiet der Biomedizin ist zweifellos das hauptsächliche (allerdings nicht das
einzige) Gebiet, auf dem dieses Verfahren angewandt wird. In der
Tat wurden die Erfindungen, welche diesbezügliche Verfahren betreffen,
mit dem Ziel entwickelt, ein zunehmend hohes Maß an Nachweisempfindlichkeit,
insbesondere auf einem diagnostischen Niveau, zu erreichen.
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Das
biochemische Instrument, das am häufigsten zum Nachweis der Anwesenheit
spezifischer Moleküle
in Zell- oder Gewebeextrakten verwendet wird, sind aufgrund ihrer
extremen Sensitivität
und hohen Bindungsspezifität
Antikörper.
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Wenn
eine Wechselwirkung mit dem Molekül von Interesse bei diesen
Verfahren stattfindet, wird es mit Hilfe von Markern, die mit den
Antikörpern selbst
verknüpft
sind, beispielsweise fluoreszierenden Substanzen, Proteinen mit
enzymatischer Aktivität
oder radioaktiven Markern, hervorgehoben.
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Die
Nachweiskapazität
dieser Marker wurde in jedem Fall befunden, durch die Verwendung
sogenannter Signalamplifizierungsmethoden beträchtlich erhöht zu werden. Diese ermöglichen
es, ein stärkeres
Nachweissignal zu erhalten, beispielsweise durch Verknüpfung des
Markers nicht mit dem zur spezifischen Erkennung verwendeten Antikörper (primärer Antikörper), sondern
mit einem zweiten Antikörper,
welcher zur Bindung dieses ersten in der Lage ist (sekundärer Antikörper). Eine
Reihe von Verfahren wurde entwickelt, bei denen sekundäre Antikörper verwendet
werden, an die Markermoleküle
kovalent gebunden sind, beispielsweise fluoreszierende Substanzen
wie Fluorescein oder Rhodamin, Proteine mit enzymatischer Aktivität, wie z.B.
alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase, im Falle eines
Nachweises mit Hilfe des Elektronenmikroskops werden auch Ferritin
oder kolloidale Goldsphären
verwendet.
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Alternative
Amplifizierungssysteme nutzen die hohe Bindungsaffinität von Molekülen wie
Biotin (einem kleinen wasserlöslichen
Vitamin) und Streptavidin (einem bakteriellen Protein) oder derjenigen zwischen
Lecithinen (Proteinen, die zur Erkennung und Bindung spezifischer
Saccharidreste in der Lage sind) und Molekülen wie Glycoproteinen, Glycolipiden
oder Proteoglycanen.
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Eine äußerst große Reihe
von Variationen dieses Themas ist möglich, einschließlich derjenigen, welche
die Bildung eines Netzwerkes von Markern erlauben, das in der Lage
ist, das Nachweissignal beträchtlich
zu verstärken.
In jedem Fall sind alle diese Verfahren verbunden mit der Anwendung
von Antikörpern
als Moleküle,
welche zur spezifischen Identifizierung eines Zielmoleküls in der
Lage sind, und sie haben auch ein Sensitivitätsniveau, welches durch die
Konzentration der Zielmoleküle
begrenzt ist.
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Die
letztere Begrenzung wurde durch in jüngerer Zeit entwickelte Verfahren
aufgehoben, welche auf der Anwendung von PCR (Polymerasekettenreaktion)-Techniken
für diesen
Zweck basieren, hier anstelle der Nachweisenzyme verwendet. Diese
Verfahren basieren tatsächlich
wiederum auf der Verwendung monoklonaler Antikörper gegen einen spezifischen
Liganden, welche jedoch in diesem Fall nicht physisch an Proteine
gekoppelt sind, sondern an Polynukleotide mit einer bekannten Sequenz.
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Dies
ermöglicht
es, einen nachfolgenden Nachweis durch Amplifizierung der bekannten DNA-Sequenz
durchzuführen,
welches effektiv mit Hilfe einer Polymerasekettenreaktion (PCR)
(V. Ruzicka et al., 1993; T. Sano et al., 1992; H. Zhou et al., 1993)
erreicht wird.
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Dieses
Verfahren als Immuno-PCR bekannt, macht es praktisch möglich, sogar
einen einzigen Antikörper
nachzuweisen, der an das Zielmolekül gebunden ist. Trotz der beträchtlichen
Verbesserung der Sensitivität
stellen diese Verfahren eine Reihe von Problemen, unter diesen ist
die direkte Assoziation von Polynukleotiden und Antikörpern und
der resultierende hohe Hintergrund aufgrund der unvermeidlichen
Interferenz durch das Polynukleotid während der Bindung des Antikörpers an
das Molekül
von Interesse.
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Vorausgesetzt,
dass die Spezifität
und die Ausbeute der Amplifizierungsreaktion von der Temperatur
abhängen,
bei der die Reagenzien gemischt werden, ist es darüber hinaus
möglich,
unspezifische Hybridisierungsprodukte zu erhalten, falls die Assemblierung
der PCR-Reaktion bei niedrigeren Temperaturen stattfindet als sie
für die
Hybridisierung der Primer optimal betrachtet werden.
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Gegenwärtig wurde
dieses Problem gelöst, indem
ein essentielles Reagenz erst zu der Amplifizierungsreaktion zugegeben
wird, nachdem das System die Temperatur erreicht hat, welche eine
spezifische Hybridisierung der "Heißstart"-Primer erlaubt. Diese
Prozedur erfolgt durch mechanische Separierung eines Reagenzes (D.
E. Birch et al., 1996) oder durch Verwendung von Antikörpern, um
die enzymatische Aktivität
von DNA-Polymerase zu blockieren (J. Cheng et al., 1996).
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Kürzlich wurde
auch ein PCR-Verfahren entwickelt, das auf Zellen durchgeführt wird,
bekannt als in situ-PCR (G. J. Nuovo, 1994), wobei die Amplifizierung
einer in situ-Hybridisierungsreaktion folgt. Gemäß diesem Verfahren werden die
DNA-Matrize und die Primer bis zum Moment der Zellyse physisch separiert
gehalten, mit dem Vorteil, dass jegliche unspezifische Hybridisierungsreaktionen
vermieden werden (
EP 524808 Hoffmann
La Roche Inc.).
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Ferner
gibt es eine Reihe von Patenten, welche alle neue diagnostische
Verfahren betreffen, von denen man annimmt, dass sie viele der typischen Probleme
von gegenwärtigen
Verfahren beheben und folglich die Amplifizierung des Antwortsignals verbessern.
Diese haben als Gegenstand verschiedene Verfahren, wie z.B. die
Anwendung von PCR, die mit der Entdeckung spezieller Proteine verbunden
ist (WO9421676); die Verwendung von gentechnisch manipulierten Hybridenzymen,
die mit Liganden konjugiert sind, wie z.B. Epitopen des Virus HIV-1
(WO942636); die Verwendung von viralen Epitopen, welche von Nukleinsäuren in
Kombination mit Proteinen, die das Antigen binden, gebildet werden (WO9406934);
die Verwendung von Teilen viraler cDNA, beispielsweise aus HCV,
um ein virales Epitop zu exprimieren, das mit einer Kontrollsequenz
verknüpft ist,
und eines monoklonalen Antikörpers,
der gegen das Epitop gerichtet ist. Im letzteren Fall erlaubt die cDNA-Region
von Interesse die Durchführung
von Quervergleichskontrollen zwischen der Antikörperreaktion und derjenigen,
welche nach Hybridisierung mit der DNA resultiert (EP388232).
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Wiederum
ein anderes Patent hat als Gegenstand die Erstellung einer Bank
antigener Determinanten, erhalten durch Verdauung des Genoms eines
Virus, beispielsweise HIV, mit DNase-I, gefolgt von der Expression
dieser Fragmente, die mit Hilfe eines geeigneten Vektors erhalten
wird, und anschließende
Selektion der Expressionsprodukte durch die Verwendung von Antikörpern (EP373070).
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In
diesem Kontext besteht der Wert der vorliegenden Erfindung darin,
dass sie als Gegenstand ein äußerst vielseitiges
Verfahren hat, welches in stark unterschiedlichen Situationen und
für stark
unterschiedliche Zwecke eingesetzt werden kann, gemäß Verfahren,
welche die Überwindung
verschiedener Probleme ermöglichen,
die im Stand der Technik bestehen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
setzt in der Tat nicht die Bildung spezieller Antikörper voraus, sondern
die Verwendung rekombinanter filamentöser Phagen, welche auf dem
Kapsid irgendein Molekül aufweisen,
das zur Wechselwirkung mit dem Molekül von Interesse in der zu untersuchenden
Probe in der Lage ist.
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Es
erlaubt auch, wenn ein Phage, der ein geeignetes Molekül aufweist,
zur Verfügung
steht, den Nachweis der Anwesenheit irgendeines Typs von Molekül von Interesse
(nicht nur Aminosäuren), selbst
wenn das fragliche Molekül
in unendlich kleinen Mengen vorhanden ist, in biologischen Proben unterschiedlichen
Ursprungs (nicht nur in Proben, die dem menschlichen Körper oder
dem Körper
von Tieren entnommen wurden, sondern auch in Proben anderer Typen,
beispielsweise Wasser, Getränken
oder Lebensmittelsubstanzen).
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Die
Kombination der Vorgänge,
welche den Gegenstand der Erfindung bilden, ist auch ausgelegt, um
das Risiko einer unspezifischen Assoziation zwischen DNA und Reagenzien
und den entsprechenden Hintergrund, welcher die Klarheit des Ergebnisses
beeinträchtigen
kann, zu eliminieren.
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Diese
Vorteile sind eine Folge der Tatsache, dass die zum Nachweis mittels
PCR verwendete DNA nicht direkt den Reagenzien ausgesetzt wird, sondern
im Inneren der eingesetzten rekombinanten Phagen enthalten ist.
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Die
Anwesenheit der Protein-Kapsid-Hülle verhindert
tatsächlich,
dass die für
den nachfolgenden Nachweis verwendete DNA während der Bindungsreaktion
zwischen dem Ligandenmolekül
(dem auf dem Kapsid exponierten) und dem Rezeptormolekül (dem von
Interesse in der Probe) stört.
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Danach
werden nach Wechselwirkung zwischen dem Ligandenmolekül und dem
Rezeptormolekül
geeignete Waschvorgänge
durchgeführt,
um die Phagen zu eliminieren, welche nicht durch spezifische Wechselwirkung
an den Rezeptor gebunden haben. Schließlich werden die Nukleotidsequenzen der
Phagen-DNA amplifiziert durch Hinzufügung der erforderlichen Reagenzien
gemäß einem
Verfahren, welches störende
Unspezifität
vermeidet. In der Tat bleibt die zu amplifizierende DNA während der
anfänglichen
Stadien durch die Proteine des Phagen-Kapsid geschützt, welche
erst in dem Moment denaturiert werden, in dem die Polymerisationsreaktion
beginnt.
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Ein
weiterer Vorteil ergibt sich aus der Tatsache, dass das zugrunde
liegende rekombinante Phagemid, das zur Konstruktion der Rezeptorphagen verwendet
wird, von E. coli im wesentlichen als ein Partikel ausgeschieden
wird, das einzelsträngige DNA
enthält.
Es ist in der Tat aus dem Stand der Technik bekannt, dass der Einsatz
von PCR mit einer einzelsträngigen
DNA-Matrize bessere Ergebnisse ergibt als die mit doppelsträngiger DNA
durchgeführte.
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Die
Erfindung wird unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher erläutert werden.
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1 zeigt
das Ergebnis der Amplifizierung der DNA eines Phagen P787, welcher
auf der Oberfläche
des Kapsids ein Peptid aufweist, das zur Bindung von Anti-HCV-Antikörpern in
der Lage ist. Die Sichtbarmachung erfolgt mittels UV-Fluoreszenz
auf einem Agarosegel, das Ethidiumbromid enthält. M ist ein Verweis auf Molekulargewichte,
welche durch Hydrolyse der Plasmid-DNA von pUC19 mit dem Restriktionsenzym
Hinf I erhalten werden.
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2 zeigt
das Ergebnis der Amplifizierung der DNA einer Phagenmischung nach
Inkubation mit C17- und C22-Serum von Patienten, deren Serum Anti-HCV-Antikörper enthält. Die
Sichtbarmachung erfolgt mittels UV-Fluoreszenz auf einem Agarosegel,
das Ethidiumbromid enthält.
PC89 ist der nicht-rekombinante Phage, mit dem die Phagenbank erstellt
wurde, der hier als negative Kontrolle verwendet wird.
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3 zeigt
das Ergebnis der Amplifizierung der DNA derselben Phagenmischung,
die in 2 verwendet wurde, nach Inkubation mit N57- und N60-Serum
von zwei Freiwilligen, deren Serum keine Anti-HCV-Antikörper enthält, und
die deshalb als negative Kontrollen betrachtet werden. Die Sichtbarmachung
erfolgt mittels UV-Fluoreszenz auf einem Agarosegel mit Ethidiumbromid.
PC89 ist ein Negativkontroll-Phage, der oben in Beispiel 1 beschrieben wurde.
M ist ein Verweis auf Molekulargewichte, erhalten durch Hydrolyse
der DNA des Plasmids pUC19 mit dem Restriktionsenzym Hinf I.
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Der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Feststellung
und Messung der Anwesenheit bestimmter Moleküle von Interesse, in diesem
Kontext auch als Rezeptormoleküle
bezeichnet, auf Grundlage ihres Vermögens, von mindestens einem
bestimmten Molekül,
hier als Ligandenmolekül bezeichnet,
welches auf dem Phagen-Kapsid exponiert ist, spezifisch erkannt
zu werden.
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Es
ist nötig
zu unterstreichen, dass in der vorliegenden Beschreibung die Konzepte
des Ligandenmoleküls
und Rezeptormoleküls
strikt voneinander abhängig
sind und streng an den speziellen Arbeitskontext gebunden sind.
Als Folge davon wird ein Molekül,
das auf der Oberfläche
des Kapsids exponiert ist, als "Ligand" definiert nur auf
der Grundlage seines Vermögens
zur spezifischen Bindung des mutmaßlich in der Probe vorhandenen
Moleküls, dessen
Anwesenheit oder Konzentration zu messen ist, welches deshalb als "Rezeptor" definiert wird und umgekehrt.
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In
der vorliegenden Erfindung wird jedes Molekül, das von Quellen wie biologischen
Flüssigkeiten,
Oberflächen
von Zellen oder Geweben erhalten wird, als ein "Rezeptor" betrachtet, falls seine Anwesenheit
mit Hilfe der Wechselwirkung mit einem spezifischen "Liganden", wie oben definiert,
festgestellt werden kann. Beispielsweise gehören Antikörper, welche zur Erkennung
von klar identifizierten Antigenen (wie z.B. viralen Antigenen,
Tumorantigenen oder in normalen Geweben vorliegenden Antigenen) oder
Antigenen, deren genaue molekulare Natur noch nicht identifiziert
wurde, zur Kategorie von "Liganden", obwohl sie in dieser
Kategorie nicht alleine sind. In diesem Fall werden diese Antigene
als "Rezeptoren" betrachtet werden.
Diese Definitionen beziehen sich beispielsweise auf den Fall, in
dem die Anwesenheit und/oder Konzentration dieser Antigene in den
biologischen Flüssigkeiten
oder auf den Oberflächen
von Zellen und Geweben, die untersucht werden, ein Indiz mit diagnostischem
Wert ist. Jedoch können
gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung die Antigene selbst als "Liganden" verwendet werden,
falls das Rezeptormolekül
von Interesse, dessen Anwesenheit oder Konzentration bestimmt werden
muss, aus Antikörpern
besteht.
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Auf
die gleiche Weise ist es möglich,
als "Rezeptoren", falls von Interesse,
sogar spezifische Rezeptoren zu betrachten, die auf der Membran
von einzelnen Zellen oder den Zellen in Geweben vorliegen, zusammen
mit den löslichen
Rezeptoren, die in biologischen Flüssigkeiten vorliegen, welche
in diesem Fall durch die Moleküle
nachgewiesen werden, welche in der Lage sind, diese spezifisch zu
binden, und als "Liganden" wirken. Natürlich ist
es möglich, die
Beziehung umzukehren, wenn die Moleküle von Interesse nicht mehr
aus Membranrezeptoren bestehen (welche in diesem Fall als "Liganden" wirken werden),
sondern aus ihren spezifischen Liganden (welche in diesem Fall als "Rezeptoren" betrachtet werden).
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Es
ist somit verständlich,
dass jegliches Molekül,
dessen Anwesenheit in der untersuchten Probe als von diagnostischem
und/oder prognostischem Wert betrachtet wird (nachdem dessen Assoziation mit
dem Auftreten einer speziellen Pathologie sichergestellt wurde)
oder für
einen beliebigen Zweck von Interesse ist, in die Kategorie "Rezeptoren" eingeschlossen werden
kann.
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Die
vielen Anwendungen dieses Verfahrens sind recht offensichtlich,
insbesondere auf dem Gebiet der Medizin und Veterinärmedizin,
jedoch auch in anderen Gebieten, wie z.B. Nahrungsmittel und Umwelt.
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Dieses
Verfahren wurde entwickelt nach der Bestätigung durch die Erfinder,
dass es möglich
ist, filamentöse
Bakteriophagen, entweder rekombinant oder nicht-rekombinant, zu
verwenden, um eine Wechselwirkung zwischen einem "Liganden" und einem Rezeptormolekül, das in
einer Probe vorliegt, selbst bei extrem niedrigen Konzentrationen
durch Amplifizierung spezifischer Nukleotidsequenzen, die in dem
Phagengenom vorliegen und physisch oder genetisch mit dem "Liganden" assoziiert sind,
nachzuweisen.
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In
Kürze,
das erfindungsgemäße Verfahren kann
jederzeit angewandt werden, falls es möglich ist zu identifizieren:
- A) ein Rezeptormolekül oder eine homogene Klasse
von "Rezeptoren", die eine Gruppe
bilden, dessen/deren Anwesenheit in biologischen Flüssigkeiten
oder auf den Oberflächen
von Zellen oder Geweben mit einer speziellen Pathologie korreliert
oder in jedem Fall von erheblichem Interesse ist, beispielsweise
für diagnostische
Zwecke;
- B) einen "Liganden" oder eine Klasse
von "Liganden", beispielsweise
vom Polypeptidtyp, deren Struktur ihnen erlaubt, unter Erhaltung
des Vermögens
zur spezifischen Bindung an das Rezeptormolekül, auf dem Kapsid von Bakteriophagen exponiert
zu werden.
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Der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Verfahren,
welches im wesentlichen auf den folgenden Vorgängen basiert:
- a) Immobilisieren der Moleküle
von Interesse ohne Zerstörung
des Vermögens
zur Wechselwirkung mit den Molekülen,
welche auf den Oberflächen
des Phagens exponiert sind;
- b) Veranlassen, dass ein Molekül von Interesse, welches wie
oben immobilisiert ist, spezifisch an mindestens einen der rekombinanten
filamentösen
Bakteriophagen bindet, welche im Inneren ein einzelsträngiges DNA-Molekül aufweisen,
dessen Sequenz mindestens teilweise bekannt ist, und Exponieren
von mindestens einem Molekül,
welches zur spezifischen Bindung an mindestens ein Molekül von Interesse,
das in der biologischen Probe vorliegt, in der Lage ist, auf den
Oberflächen
des Kapsids;
- c) Abtrennen der auf diese Weise erhaltenen Molekül-Bakteriophagen-Komplexe
von der Reaktionsmischung;
- d) Waschen zur Entfernung der Komplexe, welche durch unspezifische
Wechselwirkung zwischen Molekül
und Bakteriophagen gebildet wurden;
- e) Zugeben der Reagenzien zur Durchführung des unter g) unten beschriebenen
Vorgangs;
- f) Lysieren der Proteine, welche das Protein-Kapsid der auf
diese Weise ausgewählten
Bakteriophagen bilden;
- g) Amplifizieren der wie oben erhaltenen DNA durch Polymerasekettenreaktion
(PCR);
- h) Nachweisen der wie oben amplifizierten DNA, beispielsweise
unter Anwendung herkömmlicher Verfahren.
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Die
Verfahren zum Nachweis der amplifizierten DNA können beispielsweise Elektrophorese
auf einem Agarosegel in Anwesenheit von Ethidiumbromid, Kapillarelektrophorese,
Hybridisierung an spezifische radioaktiv markierte oder lumineszierende Sonden
sein.
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Insbesondere
der unter g) angegebene Vorgang, d.h. die Amplifizierung der Phagen-DNA, erfolgt mittels
PCR-Techniken unter Verwendung eines Paars von Oligonukleotiden,
von denen mindestens eines komplementär zu einer bekannten Sequenz der
Phagen-DNA ist. Ferner wurde festgestellt, dass bei Verwendung eines
Protokolls zur Lyse der Phagen-Kapsidproteine
bei der Temperatur, bei der die Denaturierung der DNA stattfindet,
welche gewöhnlich
innerhalb des Bereichs von 93-96° C
liegt, ein Kontakt zwischen Primern und DNA-Matrize bei derselben
Temperatur stattfindet und somit ein "Heißstart" für PCR erzielt
wird, mit der folglichen praktischen Eliminierung von unspezifischen
Reaktionsprodukten. Eine wichtige Anwendung dieses Verfahrens liegt
vor, wenn die Moleküle
von Interesse Antikörper
sind.
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Eine
weitere spezielle Anwendung liegt vor, wenn die Immobilisierung
der Moleküle
von Interesse in der festen Phase durchgeführt wird, und in diesem Fall
wird sie wiederum erzielt durch passive Adsorption und/oder Verwendung
von Antikörpern,
die für die
Moleküle
selbst spezifisch sind.
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Auf
jeden Fall kann eine Immobilisierung auch erzielt werden durch Verwendung
von Bakterien oder von mindestens einem der bakteriellen Proteine,
welche aus der Gruppe, die Protein A von Staphylococcus aureus,
Protein G der Gruppe C-Streptokokken und irgendein anderes Bakterienprotein, welches
zur Bindung von tierischen Immunglobulinen in der Lage ist, umfasst,
ausgewählt
sind.
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Weitere
Anwendungen des Verfahrens von speziellem Interesse sind diejenigen,
bei denen die verwendeten Bakteriophagen auf den Oberflächen des
Kapsids virale Antigene, Autoantigene (Antigene, die in dem Lebewesen
vorliegen können,
welches der Ursprung der biologischen Flüssigkeiten ist), Allergene,
Zellmembranrezeptoren, Teile dieser Moleküle oder Oligopeptide, welche
zur Nachahmung ihrer Anwesenheit in den untersuchten biologischen Flüssigkeiten
in der Lage sind, sowie spezifische Zellemembranrezeptoren oder
davon abgeleitete Peptide, oder Liganden von Aminosäurenatur,
deren Rezeptor in den zu testenden Flüssigkeiten vorliegt, aufweisen.
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Unter
den grundsätzlichen
Aspekten dieses Verfahrens ist zunächst die Tatsache, dass die
zum Nachweis verwendeten Instrumente immer filamentöse Bakteriophagen
sind, im allgemeinen des rekombinanten Typs M13, f1 oder fd, welche
es ermöglichen,
auf den Oberflächen
des Kapsids ein oder mehrere Moleküle zu exponieren, vorzugsweise
von Aminosäurenatur,
welche als "Liganden" wirken, die zur
spezifischen Wechselwirkung mit dem zu testenden "Rezeptor" in der Lage sind.
Dies stellt ein erstes neuartiges Element dar, da nicht mehr eine
direkte Verwendung von Ligandenmolekülen, sondern von Phagen, die
geeignet ausgewählte
natürliche
Liganden, deren Teile oder Mimetika enthalten, vorliegt.
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Die
vorliegende Erfindung unterscheidet sich von anderen in der Vergangenheit
beschriebenen Nachweisverfahren, wie z.B. Immuno-PCR, worin ein Antikörper künstlich
an ein Polynukleotidmolekül
mit einer bekannten Sequenz, das als Sonde verwendet wird, gebunden
wird, genau darin, dass in dieser Erfindung die innerhalb des Phagen
enthaltene genetische Information zur Feststellung der Anwesenheit eines
Moleküls
von Interesse verwendet wird.
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Ferner
ermöglicht
es das Vermögen
zur gleichzeitigen Verwendung verschiedener Phagen, gleichzeitig
verschiedene Teile eines Moleküls
von Interesse oder sogar eine Anzahl von Molekülen von Interesse nachzuweisen.
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Das
Hauptcharakteristikum ist jedoch in erster Linie die Assoziation
des auf den Oberflächen
des Phagens exponierten "Liganden" und der Phagen-DNA,
welche für
den Nachweis mittels PCR verwendet wird. Diese kann aus der genetischen
Information bestehen, welche für
den "Liganden" kodiert, jedoch
allgemeiner aus irgendeiner Nukleotidsequenz in dem Phagengenom.
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Als
Folge davon ermöglicht
es das Verfahren der Erfindung auch, die Nukleotidsequenzen auszuwählen, welche
mit dem "Liganden", der zum Nachweis
verwendet werden soll, assoziiert sind, um die Spezifität zu erhöhen und
die Amplifizierungsreaktionszeit zu verringern. Tatsächlich können zur
Erzielung einer PCR-Reaktion die Sequenz der Oligonukleotid-Primer,
die Dauer und die Temperatur, bei der jede Inkubation stattfindet,
und die Anzahl der Zyklen in jeder Reaktion zu diesem Zeitpunkt
vorgewählt werden,
um eine extrem schnelle und hoch spezifische Amplifizierung zu erhalten.
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Tatsächlich ist
die genetische Information, die innerhalb des Phagens vorliegt und
zum Nachweis verwendet wird, aufgrund ihrer Natur besonders geeignet
zur Amplifizierung unter Anwendung gegenwärtiger PCR-Verfahren, welche
es ermöglichen,
die Anwesenheit selbst eines einzigen DNA-Moleküls im Reaktionsgefäß hervorzuheben.
Die Sensitivität,
welche bei Verwendung der Polymerasekettenreaktion erhalten werden
kann, kann nicht leicht mit Hilfe anderer Nachweisverfahren, die
gegenwärtig
angewandt werden, erreicht werden.
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Ein
weiterer Vorteil, der sich daraus ergibt, ist eng mit der Tatsache
verbunden, dass die zur Amplifizierung verwendeten Oligonukleotid-Sonden
so konstruiert werden können,
dass sie eine spezifische Amplifizierung einer in einem Phagen vorliegenden speziellen
Sequenz ergeben, selbst in Gegenwart der DNA anderer Phagen, welche
diese nicht einschließen.
Beispielsweise ist es möglich,
die Sonden so zu konstruieren, dass sie nur die DNA von Phagen amplifizieren,
welche ein spezielles Insert enthalten (beispielsweise dasjenige,
welches für
das Molekül kodiert,
das als "Ligand" wirkt, wenn es auf
dem Kapsid exponiert ist), sogar in Gegenwart der DNA von Phagen,
welche dieses Insert nicht enthalten oder welche Inserts mit einer
unterschiedlichen Sequenz enthalten. Die direkteste Folge davon
ist, dass es möglich
ist, das Rezeptormolekül
(oder die Rezeptormoleküle),
welches) untersucht wird/werden, mit einer Mischung verschiedener
Phagen umzusetzen und die Bindung mit jedem einzelnen Phagentyp
sogar in Gegenwart der anderen zu identifizieren.
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Ferner
ermöglicht
die Tatsache, dass die DNA innerhalb des Protein-Kapsids enthalten
ist, das Überschreiten
der Grenzen der Nachweisspezifität, die
für PCR-Verfahren
typisch sind. Diese Beschränkung
ist das Erfordernis, die DNA-Matrize bei einer relativ niedrigen
Temperatur, gemäß der Sequenz der
beiden Primer, mit den Amplifizierungssonden in Kontakt zu bringen.
Wenn die Temperatur erhöht wird,
um den ersten Amplifizierungszyklus zu beginnen, bleibt ein Teil
der DNA mit der Sonde komplexiert und dies führt zu einer unspezifischen
Verlängerung
der Sonde selbst auf der DNA-Matrize. Verschiedene Verfahren wurden
vorgeschlagen, um dieses Problem zu beheben (4, 5). Das Verfahren
der vorliegenden Erfindung, wie oben erwähnt, ermöglicht eine ausgezeichnete
Lösung
des Problems, welche die Tatsache nutzt, dass eine natürlich verkapselte
DNA verwendet wird, welche deshalb bis zum Zeitpunkt der Lyse des
Kapsids vor dem Kontakt mit den spezifischen Sonden geschützt ist.
In dieser Hinsicht kann lediglich durch Perfektionierung des Verfahrens und
Verwendung eines thermischen Lyse-Protokolls, welches einen Kontakt
zwischen der DNA und der spezifischen Sonde nur bei hoher Temperatur
erlaubt, eine extrem hohe Spezifität erhalten werden.
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Auf
diese Weise, welche in der Ausführung ziemlich
einfach und äußerst praktisch
ist, ist es möglich
zu erzielen, was technisch als "Heißstart" für die PCR
bekannt ist.
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Bisher
wurde eine allgemeine Beschreibung der vorliegenden Erfindung gegeben.
Mit Hilfe der folgenden Beispiele wird nunmehr eine detailliertere Beschreibung
von speziellen Ausführungsformen
gegeben, mit dem Ziel ein klareres Verständnis der Aufgaben, charakteristischen
Eigenschaften, Vorteile und Durchführungsverfahren der Erfindung
zu vermitteln. Diese Beispiele sind lediglich illustrativ und beschränken in
keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung, welcher in den
beigefügten
Ansprüchen
definiert ist.
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BEISPIEL 1
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Verfahren zum Nachweis,
im Serum von Patienten, der Anwesenheit von Antikörpern, welche
für die
Antigene von Human-Hepatitis C-Virus (HCV) spezifisch sind
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Das
folgende Verfahren wurde erfindungsgemäß angewandt:
Mengen von
humanen Ziegen-Anti-IgG-Immunglobulinen, spezifisch für den Fc-Anteil,
wurden in den Mulden einer Polycarbonat-Platte aus 96 Mulden, die
gegenwärtig
für PCR-Verfahren verwendet
wird (Thermowell-IITM-Typ 6509, hergestellt
von Costar), absorbiert. Nach der Inkubation wurde die Platte mit
einem Salzlösung-Phosphat-Puffer
gewaschen und die restlichen Absorptionsstellen wurden durch Inkubation
in einem Puffer, in dem Magermilchpulver resuspendiert war (wie
in der Literatur beschrieben), blockiert. Folgendes wurde in den
Mulden auf der in dieser Weise vorbereiteten Platte verteilt: 1)
Mengen des getesteten Humanserums, auf verschiedene Niveaus verdünnt; in
diesem Beispiel wurden die Humanserum-Typen C17 und C22 von Patienten,
die mit HCV infiziert waren und Anti-HCV-Antikörper enthielten, verwendet.
N57 und N60 waren Serumtypen, welche von anscheinend gesunden Individuen
erhalten wurden, bei denen keine Anti-HCV-Antikörper gefunden wurden. Mengen
dieser Seren wurden mit einem Phagen eines nicht-rekombinanten Typs
gemischt, welcher als unspezifischer Träger dient. Ein rekombinanter
Phage 2A wurde ebenfalls zugegeben, welcher in der PCR-Reaktion
amplifiziert werden kann, jedoch nicht den spezifischen Liganden auf
dem Kapsid aufweist, in diesem Beispiel Peptide, welche zur Bindung
von humanen Anti-HCV-Antikörpern
in der Lage sind, und alternativ 2B, der HCV-spezifische Phage P787.
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Nach
Inkubation für
90 Minuten bei 37° C wurde
die Platte geleert und mit Phosphatpuffer gewaschen, um alle rekombinanten
Phagen zu entfernen, welche nicht spezifisch gebunden waren. Dann wurde
eine Mischung jeder Mulde zugegeben, welche die für die Amplifizierung
spezifischen DNA-Sonden, die Polymerase Taq, Triphosphat-Desoxynukleotide
in einem für
die PCR-Reaktion geeigneten Puffer enthielt.
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Die
Platte wurde in einen thermischen Inkubator für die PCR überführt und das Verfahren mit Reaktionszyklen
fortgesetzt, welche mit Erwärmen für fünf Minuten
bei 95° C
begannen. Diese Passage ist besonders wichtig, da nur bei dieser
Temperatur die Lyse der Phagenproteine stattfindet und der folgliche
Kontakt der spezifischen Sonden mit der zu amplifizierenden DNA.
Die PCR-Reaktion beginnt so bei hoher Temperatur (Heißstart)
und setzt sich mit 25 Zyklen von 10 Sekunden bei 94° C und 10
Sekunden bei 72° C
fort. Die Reaktion endet mit einer Inkubation bei 72° C für zwei Minuten.
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Die
DNA des Phagen P787, welche auf diese Weise amplifiziert wurde,
wird durch Elektrophorese auf einem Agarosegel, das Ethidiumbromid
enthält, hervorgehoben,
wie im speziellen Beispiel von 1 gezeigt.
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BEISPIEL 2
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Verwendung einer Zusammensetzung
von Phagen zur Diagnose der Anwesenheit von Anti-HCV-Antikörpern im Serum von Patienten
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Eine
Zusammensetzung einer Anzahl spezifisch ausgewählter Phagen, von denen jeder
unterschiedliche Proteinregionen des Human-Hepatitis C-Virus nachahmt,
wurde zur Diagnose der Anwesenheit von Anti-HCV-Antikörpern in
einem Serum eingesetzt. Nachdem die Phagen gemäß der Sequenz, die sie tragen,
jedoch auch einfacher durch die Länge ihres Inserts unterschieden
werden können,
ist es möglich,
eine Amplifizierung von DNA-Fragmenten
unterschiedlicher Längen
auf dem Agarosegel gemäß den Abmessungen
des Phagen-DNA-Inserts zu beobachten.
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In
diesem Beispiel wird gezeigt, wie es unter Verwendung einer Mischung
von Phagen möglich
ist, eine Reaktion auf einem Agarosegel wie in Beispiel 1 beschrieben
zu erhalten. Das Beispiel zeigt, dass eine Mischung von Phagen aussagekräftiger ist
als die Verwendung eines einzigen Phagen.
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Es
ist überraschend,
dass es in einem Serum möglich
ist, Antikörper
für unterschiedliche
Antigene zu identifizieren, und dass die Amplifizierungsreaktion
spezifisch ist. Das in 2 und 3 gezeigte
Ergebnis besteht jedoch aus einer Reaktion, welche mittels Elektrophorese
analysiert werden kann wie oben für Beispiel 1 beschrieben.
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BEISPIEL 3
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Verfahren zum Nachweis
in vitro von Human-Anti-IL-6-Antikörpern
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Es
wird ein Verfahren beschrieben, bei dem der Rezeptor für IL-6 auf
einer Platte immobilisiert ist und Phagen, die IL-6 exprimieren,
werden zum Nachweis seiner Anwesenheit in extrazellulären Kulturmedien
verwendet.
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Die
humane cDNA, welche für
hIL-6 kodiert, wurde mit dem aminoterminalen Ende des Gens III eines
Phagemids fusioniert, das aus M13 wie in der Literatur beschrieben
erhalten wurde. Der rekombinante hIL-6/M13-pIII-Phage kann zum Nachweis
der Anwesenheit des Human-Interleukin 6-Rezeptors verwendet werden.
Im Stand der Technik wurde bereits eine Beschreibung gegeben, wie
es möglich
ist, einen hIL-6 exprimierenden Phagen zu selektionieren, der zur
Bindung in vitro von sowohl hIL-6/R als auch Anti-hlL-6-Antikörpern in
der Lage ist, wie in der Literatur beschrieben. Wir haben belegt,
dass eine Erkennung möglich
ist und effektiver, wenn das in der vorliegenden Erfindung beschriebene
Verfahren angewandt wird.
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Auf
einem festen Träger,
beispielsweise einer Kunststoffperle, wurden 1 μg monoklonaler Anti-hIL-6-Antikörper in
10 mM NaHCO3 bei pH 9,2 für die Inkubation
bei 4° C über Nacht
fixiert. Nach Blockieren in 1 ml TBS/6 % BSA für 4 h bei 4° C wurden die Perlen über Nacht
mit hIL-6 bei 4° C
inkubiert. Die Perlen wurden zweimal einem Waschschritt mit 2 ml TBST,
gefolgt von Inkubation für
eine 1 h in 1 ml TBST/0,1 % BSA bei 20° C, unterworfen. Anschließend wurden
die Phagen in 500 μl
100 mM Glycin-HCl, pH 2,2, eluiert und das Eluat wurde mit 3 M Tris-HCl,
pH 8,9, neutralisiert. Die an die Antikörper gebundenen Phagen können mittels
PCR nachgewiesen werden, wie in der Erfindung beschrieben.
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BEISPIEL 4
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Verfahren zum Nachweis
der löslichen
Form des Human-IL-6-Rezeptors in einer Kultur von gentechnisch manipulierten
CHO-Zellen
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Es
wird ein Verfahren beschrieben, bei dem der Human-IL-6-Rezeptor,
exprimiert in gentechnisch manipulierten Eierstockkarzinom-Zellen,
nach dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren nachgewiesen
wird und, falls möglich,
quantitativ bestimmt unter Verwendung von Phagen, welche zur Expression
von IL-6 oder Superantagonisten von IL-6 in der Lage sind.
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Eine
CHO-Zellinie (CsRh14) ist in der Lage, eine lösliche Form des Interleukin
6-Rezeptors (ref) zu
sekretieren. Unter Verwendung von 100 μl tosyl-aktivierter Dynabeads
M450 (Unipath) wurde eine konzentrierte Form unter Verwendung eines
Magnetpartikel-Konzentrators
hergestellt, mit 50 mM Natriumborat bei pH 9,5 gewaschen und für 24 h bei
25° C in
400 μl des
gleichen Puffers, enthaltend 15 μg monoklonaler
Anti-hIL-6Rα-Anti körper, inkubiert. Nach
einer sättigenden
Passage in TBS/0,1 % BSA für
12 h bei 4° C
wurden die Perlen 4 h lang bei 25° C
mit 400 μl
konditioniertem serumfreien Medium, erhalten aus der Linie CsRh14,
das 250 ng shIL-6Rα enthielt,
inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wurden die Perlen, an welche
die shIL-6Rα gebunden hatten,
für 16
h bei 4° C
mit den Phagen inkubiert, welche hIL-6 exprimierten (in einem Verhältnis von 1:4).
Das Reaktionsvolumen wurde durch Zugabe einer geeigneten Menge an
TBS/0,1 % BSA auf 1 ml gebracht. Die Perlen wurden dreimal mit 1
ml TBST gewaschen und die Phagen in 400 ml 100 mM Citratpuffer bei
pH 3,2 inkubiert. Nach Neutralisation mit 3 M Tris-HCl, pH 8,9,
wurden die gebundenen Phagen mittels PCR-Amplifizierung gemäß der Natur
der vorliegenden Erfindung nachgewiesen.
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Bibliographie
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