DE60122138T2

DE60122138T2 - Isolierung von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60122138T2
Application number: DE60122138T
Authority: DE
Inventors: c/o Dynal Biotech ASA Stine BERGHOLTZ; c/o Dynal Biotech ASA Lars KORSNES; c/o Dynal Biotech ASA Jack ANDREASSEN
Original assignee: Dynal Biotech ASA
Current assignee: Life Technologies AS
Priority date: 2000-06-05
Filing date: 2001-06-05
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2021-06-06
Also published as: CA2410888A1; US20080293035A1; DE60122138D1; AU6050701A; CA2410888C; ATE335815T1; US8263324B2; WO2001094572A1; ES2269399T3; EP1290155A1; EP1290155B1; AU2001260507C1; AU2001260507B2; US20030180754A1; GB0013658D0; DK1290155T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolation von Nukleinsäure aus Blutzellen, und insbesondere ein Verfahren zur Isolation von DNA oder RNA aus solchen Zellen, das einen Festphasen-Zellisolationsschritt mit einem Festphasen-DNA- oder RNA-Isolationsschritt kombiniert.
Die Isolation von Nukleinsäure ist ein wichtiger Schritt bei vielen biochemischen und diagnostischen Verfahren. Zum Beispiel ist die Trennung von Nukleinsäuren von den komplexen Gemischen, in denen sie gefunden werden, oftmals notwendig, bevor andere Untersuchungen und Verfahren, z.B. Detektion, Klonierung, Sequenzierung, Amplifikation, Hybridisierung, cDNA-Synthese, Untersuchung der Nukleinsäurestruktur und -zusammensetzung (z.B. des Methylierungsmusters der DNA) usw. unternommen werden können; die Gegenwart großer Mengen von zellulärem oder anderen verunreinigendem Material, z.B. von Proteinen oder Kohlehydraten in solchen komplexen Gemischen behindert oftmals viele der Reaktionen und Techniken, die in der Molekularbiologie verwendet werden. Überdies kann DNA RNA-Präparationen kontaminieren und umgekehrt. Somit werden Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren aus komplexen Gemischen wie z.B. Zellen, Geweben usw. benötigt, nicht nur unter einem präparativen Gesichtspunkt, sondern auch bei den vielen heute gebräuchlichen Verfahren, die auf der Identifikation von DNA oder RNA beruhen, z.B. Diagnose mikrobieller Infektionen, forensische Wissenschaft, Gewebs- und Blutklassifikation, Genotyping, Detektion genetischer Variationen usw.
Die Verwendung der DNA- oder RNA-Identifikation ist inzwischen als Mittel zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Zellen oder Zelltypen oder zwischen Varianten des gleichen Zelltyps, die DNA-Mutationen enthalten, allgemein akzeptiert. So kann die HLA-Klassifikation, die üblicherweise durch die Identifikation charakteristischer Oberflächenantigene unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt wird, alternativ durch die Identifikation der solche Antigene codierenden DNA bewerkstelligt werden. Infektion oder Kontamination durch Mikroorganismen kann eher durch Nukleinsäureanalyse zur Detektion des Zielorganismus als durch Vertrauen auf die Detektion charakteristischer Merkmale der Zellen des Mikroorganismus, z.B. durch Detektion morphologischer oder biochemischer Merkmale, identifiziert werden. Genetische Variationen können durch ähnliche Mittel identifiziert werden.
Insbesondere auf den Gebieten der Nukleinsäurediagnostik, der Bevölkerungsuntersuchungen und des Genotypings ist es wichtig, qualitativ hochwertige und reine Nukleinsäurepräparationen zu erhalten, um sicherzustellen, dass weitere Amplifikations- und/oder Detektionsschritte zuverlässig und präzise durchgeführt werden.
Die Isolation von Nukleinsäure aus Blutzellen ist für eine Anzahl von Anwendungen erforderlich, darunter z.B. Charakterisierung oder diagnostische oder Durchmusterungsanwendungen, z.B. zur Detektion von Mutationen oder Polymorphismen. Für solche Anwendungen sind große Mengen reiner Nukleinsäure, insbesondere genomischer DNA, wünschenswert. Insbesondere ist es wünschenswert, solche Nukleinsäure schnell und einfach zu erhalten und die Verwendung von Materialien zu vermeiden, die die Nukleinsäure kontaminieren und/oder abbauen könnten.
Eine Reihe von Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren sind bekannt, aber im allgemeinen beruhen diese auf einer komplexen Reihe von Extraktions- und Waschschritten und sind in der Durchführung zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Weiterhin umfassen sie häufig die Verwendung von Materialien wie Alkoholen und anderen anorganischen Lösungsmitteln, Chaotropen und Proteinasen, was nachteilig ist, da solche Materialien eine Neigung haben, viele enzymatische Reaktionen und andere nachfolgende Bearbeitungsschritte zu stören.
Somit umfassen klassische Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren aus komplexen Ausgangsmaterialien wie Blut oder Blutprodukten oder Gewebe die Lysis des biologischen Materials durch ein Detergens oder Chaotrop, möglicherweise in Gegenwart eines proteinabbauenden Enzyms, gefolgt von mehreren Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, z.B. Phenol und/oder Chloroform, Ethanolfällung, Zentrifugationen und Dialyse der Nukleinsäuren. Solche Verfahren sind nicht nur schwerfällig und zeitaufwendig in der Durchführung, sondern die relativ hohe Anzahl von erforderlichen Arbeitsschritten erhöht auch das Risiko des Abbaus, des Materialverlusts oder der Kreuzkontamination der Proben, wenn mehrere Proben parallel bearbeitet werden. Im Fall der RNA-Isolation ist das Risiko der DNA-Kontamination relativ hoch.
Verbesserungen der Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren wurden erreicht, und in jüngster Zeit wurden andere Verfahren vorgeschlagen, die auf der Verwendung einer Festphase beruhen. Im US-A-5,234,809 ist z.B. ein Verfahren beschrieben, in dem Nukleinsäuren in Gegenwart eines chaotropen Mittels wie eines Guanidiniumsalzes an eine Festphase in Form von Silikatpartikeln gebunden und dadurch vom Rest der Probe abgetrennt werden. WO 91/12079 beschreibt ein Verfahren, in dem Nukleinsäure durch Präzipitation auf der Oberfläche einer Festphase festgehalten wird. Generell werden Alkohole und Salze als Fällungsmittel verwendet.
Während solche Verfahren den Prozess der Nukleinsäurenabtrennung beschleunigen, existiert immer noch ein Bedürfnis nach Verfahren, die schnell und einfach durchzuführen sind, die es ermöglichen, gute Ausbeuten ohne Verluste zu erlangen, und die insbesondere keine Verwendung von Lösungsmitteln, Alkoholen und ähnlichen Mitteln erfordern. Weiterhin sind insbesondere dort, wo große Mengen an Nukleinsäure isoliert werden müssen, Verfahren wünschenswert, die für große ebenso wie für kleine Volumina an Probenmaterial effektiv sind.
Chaotrope müssen mit hoher Molarität verwendet werden, was zu zähflüssigen Lösungen führt, mit denen zu arbeiten schwierig sein kann, insbesondere bei RNA-Arbeit. Amplifikationsverfahren wie PCR und andere enzymbasierte Reaktionen sind sehr empfindlich gegenüber den inhi bitorischen oder auf andere Weise störenden Wirkungen von Alkoholen und anderen Mitteln. Überdies ist auch bekannt, dass die Trocknung des Nukleinsäurepellets, die nach der Alkoholfällung notwendig ist, und die Probleme beim Lösen von Nukleinsäuren zu Artefakten bei enzymbasierten Verfahren wie der PCR führen. Da solche Verfahren jetzt eine Hauptstütze der Molekularbiologie darstellen, besteht ein Bedürfnis nach verbesserten Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren aus Blutproben, und insbesondere nach Verfahren, die schnell und einfach durchzuführen sind, und die die Verwendung von chaotropen Mitteln oder Alkoholfällungen vermeiden. Überdies ist es manchmal wünschenswert, relativ große Nukleinsäuremengen aus Blutproben zu isolieren, und es besteht daher ein Bedürfnis nach Verfahren, die es ermöglichen, gute Ausbeuten von Nukleinsäuren sowohl aus großen (1 ml bis 100 ml oder mehr) als auch aus kleinen (z.B. bis 1 ml) Blutproben zu erhalten. Es besteht auch ein Bedürfnis nach einem Verfahren, das es ermöglicht, zwischen RNA und DNA zu differenzieren und eine getrennte Isolation beider Arten von Nukleinsäuren aus der gleichen Probe zu ermöglichen. Die vorliegende Erfindung versucht, solche Verfahren bereitzustellen.
Insbesondere wurde jetzt gefunden, dass Nukleinsäure aus Blut oder einer aus Blut gewonnenen Probe durch ein leicht und einfach durchzuführendes Verfahren in einer zur Amplifikation oder zu anderen nachfolgenden Verfahren geeigneten Form gewonnen werden kann, welches Verfahren es umfasst, dass man nukleinsäurehaltige Zellen aus der Probe spezifisch auf einen festen Träger isoliert, die isolierten, an den Träger gebundenen Zellen lysiert und die freigesetzte Nukleinsäure an den gleichen festen Träger (oder alternativ an ein Gemisch des gleichen und anderer fester Träger) binden lässt, nach welcher Bindung die Nukleinsäure ohne weiteres von der Probe abgetrennt werden kann, z.B. durch Entfernung des Trägers aus der Probe. Die Bindung der Nukleinsäure ist von ihrer Sequenz unabhängig. Weiterhin kann durch geeignete Wahl der Nukleinsäurebindungsbedingungen und/oder der Natur des festen Trägers ausgewählt werden, ob DNA oder RNA an den Träger bindet, wodurch ein selektives DNA- oder RNA-Isolationsverfahren ermöglicht wird.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure aus einer Blutprobe bereit, umfassend:

a) selektive Isolation von Leukozyten aus der Probe durch Bindung der Leukozyten an einen festen Träger mittels eines für Leukozyten spezifischen Bindungspartners;
b) Lysis der isolierten Leukozyten; und
c) Bindung der aus den lysierten Zellen freigesetzten Nukleinsäure an den festen Träger.

Insbesondere können im Schritt (a) die Leukozyten in der Probe an einen leukozytenspezifischen Bindungspartner gebunden werden, wobei dieser Bindungspartner vor oder nach der Bindung an die Leukozyten an einen festen Träger angeheftet ist, wodurch der Träger an die Leukozyten gebunden wird.
Die Nukleinsäure kann DNA, RNA oder eine beliebige natürlich vorkommende Modifikation davon sowie Kombinationen davon sein. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure jedoch DNA, die einzel- oder doppelsträngig sein oder jede beliebige andere Form haben kann, z.B. linear oder zirkulär sein kann. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für die Isolation genomischer DNA.
Der Ausdruck „Leukozyt" wird hier zur Bezeichnung einer beliebigen nukleinsäurehaltigen Blutzelle verwendet. Somit umfasst der Ausdruck „Leukozyt" alle weißen Blutkörperchen. Solche Zellen können lymphoide Zellen, z.B. Lymphozyten wie z.B. T-Zellen und B-Zellen, oder natürliche Killerzellen (NKs) oder myeloide Zellen, z.B. Monozyten/Makrophagen, Granulozyten/Neutrophile, Eosinophile, Basophile/Mastzellen, Megakaryozyten und Erythrozyten-Vorläuferzellen sein. Auch dendritische Zellen (sowohl myeloide als auch lymphoide) sind ebenfalls eingeschlossen. Alle kernhaltigen Zellen, die im Blut oder im blutbildenden System vorkommen können, sind eingeschlossen.
Die „Blutprobe" kann eine beliebige aus Blut gewonnene Probe sein, die noch Zellen enthält, z.B. Vollblut oder Buffycoat. Die Probe kann frisch erhalten oder gelagert oder auf eine beliebige gewünschte oder passende Art behandelt sein, z.B. durch Verdünnung oder Zusatz von Pufferlösung oder anderen Lösungen oder Lösungsmitteln, enzymhaltigen Lösungen usw., solange die Integrität der Leukozyten darin erhalten bleibt (d.h. solange die Leukozytenoberfläche intakt bleibt). Die „Blutprobe" kann auch eine beliebige „blutartige" Probe sein, z.B. eine aus anderen blutbildenden Geweben wie z.B. Knochenmark oder aus anderen Geweben/Körperflüssigkeiten, die Zellen hämatopoietischen Ursprungs enthalten können, z.B. Ascites, Lymphflüssigkeit oder Zellsuspensionen (z.B. Einzelzellsuspensionen), oder aus beliebigen solchen Geweben oder Körperflüssigkeiten erhaltene Zellsuspensionen (z.B. Einzelzellsuspensionen), erhaltene Probe. Somit kann die „Blutprobe" eine beliebige hämatopoietischen Probe oder Zellen hämatopoietischen Ursprungs enthaltende Probe (z.B. eine klinische Probe) sein. Somit kann nach einer alternativen Definition die Erfindung darin gesehen werden, dass sie ein Verfahren wie oben beschrieben bereitstellt, welches ein Verfahren zur Isolation von Nukleinsäure aus einer Zellprobe (z.B. einer klinischen Probe) ist, insbesondere aus einer Probe, die Zellen hämatopoietischen Ursprungs enthält. Solch eine Zellprobe ist somit eine Leukozyten enthaltende Probe.
Bevorzugte Proben haben eine Größe von 10 μl bis 100 ml, vorzugsweise von 200 μl bis 10 ml. Das erfindungsgemäße Verfahren kann für kleine Proben, z.B. weniger als 1 ml, oder für größere Proben, z.B. mindestens 2 ml, z.B. mehr als 5 ml oder 10 ml oder 50 ml, verwendet werden.
Affinitätsbasierte Trennungs- oder Isolationssysteme für gewünschte Zielzellen sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt und beruhen auf der Spezifität eines Bindungspartners, der für die Zielzelle spezifisch oder selektiv ist, um die selektive Isolation der Zelle zu erreichen. Ein solches System wird erfindungsgemäß verwendet, um die selektive Isolation von Leukozyten aus der Probe zu erreichen. Somit kann der Bindungspartner im Schritt (a) eine beliebige Gruppe mit Bindungsaffinität für einen Leukozyten und insbesondere mit einer selektiven oder spezifischen Bindungsaffinität, so dass sie spezifisch an die in der Probe vorliegenden Leukozyten, aber nicht an andere Zellen oder Bestandteile der Probe bindet, sein.
Der Bindungspartner kann ein beliebiges Molekül oder eine beliebige Gruppe sein, der bzw. die imstande ist, an einen Leukozyten zu binden, aber zweckmäßigerweise ist er ein Protein, ein Polypeptid oder ein Peptid. Andere Gruppen oder Moleküle anderer chemischer Natur, z.B. Kohlenhydrate oder kleine organische Moleküle, können jedoch ebenfalls verwendet werden. Auch Nukleinsäurenbindungspartner, z.B. Aptamere, können verwendet werden.
Der Bindungspartner kann an Moleküle oder Strukturen auf der Leukozytenoberfläche binden, z.B. an Zelloberflächenantigene, die (z.B. spezifisch) auf der Leukozytenoberfläche exprimiert werden. Alternativ kann der Bindungspartner eine Gruppe sein, die an ein auf der Zelloberfläche exprimiertes Protein bindet, z.B. an einen Zelloberflächenrezeptor.
Der Bindungspartner kann z.B. zweckmäßigerweise ein für ein Leukozytenoberflächenantigen spezifischer Antikörper sein. Auch Antikörperfragmente und Derivate können verwendet werden, gemäß aus dem Stand der Technik wohlbekannten Techniken.
Die Antikörper zur Verwendung als Bindungspartner in erfindungsgemäßen Verfahren können von jeder Art, jeder Klasse oder jedem Subtyp sein. Des weiteren können die Antikörper natürlich, derivatisiert oder synthetisch sein. Zu repräsentativen „Antikörpern" gehören somit:

(a) alle der verschiedenen Klassen oder Sub-Klassen des Immunglobulins, z.B. IgG, IgA, IgM, IgD oder IgE, von beliebigen Tieren gewonnen, z.B. von beliebigen der gewöhnlich verwendeten Tiere, z.B. Schafen, Kaninchen, Ziegen oder Mäusen,
(b) monoklonale oder polyklonale Antikörper,
(c) intakte Antikörper oder Antikörperfragmente, monoklonal oder polyklonal, wobei die Fragmente diejenigen sind, die die Bindungsregion des Antikörpers enthalten, z.B. Fragmente, denen der Fc-Teil fehlt (z.B. Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), die so genannten „Halbmolekül"-Fragmente, die durch reduktive Spaltung der Disulfidbrücken erhalten werden, die im intakten Antikörper die Schwerkettenkomponenten verbinden,
(d) durch rekombinante DNA oder andere synthetische Techniken hergestellte oder modifizierte Antikörper einschließlich von monoklonalen Antikörpern, Antikörperfragmenten, „humanisierten Antikörpern", chimären Antikörpern oder synthetisch hergestellten oder veränderten antikörperähnlichen Strukturen. Auch funktionale Derivate oder „Äquivalente" von Antikörpern sind eingeschlossen, z.B. Einzelkettenantikörper, CDR-Graft-Antikörper, Antikörper mit minimaler Erkennungseinheit usw.

Verfahren zur Herstellung solcher Fragmente oder Derivate sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt und in der Literatur umfassend beschrieben.
Zusätzlich zu Antikörpern oder antikörperbasierten Molekülen können andere Arten von Bindungspartnern verwendet werden, z.B. Peptide oder andere Moleküle, synthetisch hergestellt und/oder aus Display-Bibliotheken oder kombinatorischen Bibliotheken, z.B. Phage-Display-Bibliotheken, ausgewählt. Aptamere können genannt werden. Zu anderen Arten von leukozytenspezifischen Bindungspartnern können Affibodies oder andere synthetische Affinitätsmoleküle und Lektinen gehören.
Leukozyten können eine Vielfalt von Molekülen auf ihren Oberflächen exprimieren oder tragen, die von einem spezifischen Bindungspartner erkannt werden können. Solche Moleküle können allen oder den meisten (z.B. im Wesentlichen allen) Leukozyten gemeinsam sein (als „Pan-Leukozyten" bezeichnet), oder sie können lediglich von einer Untergruppe der Leukozyten getragen/exprimiert werden, z.B. von bestimmten Zelltypen wie T-Zellen, B-Zellen, Lymphozyten im allgemeinen, Monozyten usw. Idealerweise werden für Pan-Leukozytenmoleküle oder Antigene spezifische Bindungspartner verwendet. Jedoch erlaubt die Erfindung die Verwendung von einem oder mehreren verschiedenen Bindungspartnern, und somit können Kombinationen oder Gemische von Bindungspartnern verwendet werden, um die gewünschte Auftrennung zu erreichen.
Somit kann ein Bindungspartner oder eine Kombination oder ein Gemisch von Bindungspartnern ausgewählt werden, um eine gewünschte Trennung oder Isolation von Leukozyten aus der Probe zu erreichen. Vorteilhafterweise können alle oder im Wesentlichen alle (d.h. beinah alle) in der Probe vorliegenden Leukozyten aufgetrennt werden. Die erreichbare Trennung kann nicht nur von dem ausgewählten Bindungspartner oder den ausgewählten Bindungspartnern abhängen, sondern auch von der Natur der Probe, den Bindungsbedingungen usw. Überdies sind biologische Systeme von Natur aus variabel, und eine 100%ige Trennung kann nicht immer erreicht werden, und in der Tat ist sie erfindungsgemäß nicht notwendig; wie in jedem biologischen System muss ein gewisses Maß an Toleranz gewährt werden. Jedoch können in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% der in der Probe vorliegenden Leukozyten abgetrennt werden.
Leukozyten exprimieren auf ihrer Oberfläche eine Reihe von Molekülen, die nach dem „CD"-System klassifiziert werden, und auch HLA-Antigene, die als „Ziele" für die leukozytenspezifischen Bindungspartner verwendet werden können. Zu den bevorzugten erfindungsgemäßen Bindungspartnern gehören somit diejenigen, die eines oder mehrere der Folgenden erkennen oder spezifisch binden können: HLA-I, CD11a, CD18, CD45, CD46, CD50, CD82, CD100 oder CD162. Auch CD5 und/oder CD15 können in diese Liste mit einbezogen werden. Einer oder mehrere solcher Bindungspartner können verwendet werden.
Andere Antigene werden selektiver exprimiert, z.B. wird CD5 von lymphoiden Zellen exprimiert, einschließlich von T- und B-Zellen und NK-Zellen. CD15 wird von Monozyten und Neutrophilen exprimiert. HLA-I wird von Lymphozyten, aber nicht von Granulozyten exprimiert. Tabelle 1 unten zeigt andere solcher Antigene, und Tabelle 2 zeigt die typische Verteilung von verschiedenen Leukozytenzelltypen in einer Blutprobe. Passende Kombinationen von Bindungspartnern, die die verschiedenen Antigene der Tabelle 1 erkennen, können ausgewählt werden, um die erwünschte Abtrennung von Leukozyten aus einer Probe zu ermöglichen, z.B. zur Isolation der Hauptmenge der Leukozyten aus einer Probe.
Eine Kombination von Bindungspartnern für CD45 und CD15 stellt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Tabelle 1 Verschiedene Zelloberflächenmoleküle, die im blutbildenden System exprimiert werden.

*CD45 hat keine hohe Expression auf Neutrophilen

Tabelle 2 Verteilung verschiedener Leukozyten in normalen Blutproben
Normalerweise enthält eine Blutprobe 6 × 10⁹ Leukozyten/l (Bereich 2–12 × 10⁹).
Der feste Träger kann irgendeine der wohlbekannten Träger oder der Matrizen, die gegenwärtig weithin zur Immobilisation, Auftrennung usw. verwendet werden oder vorgeschlagen worden sind, sein. Diese können die Form von Partikeln, Schichten, Gelen, Filtern, Membranen (z.B. Nylonmembranen), Fasern, Kapillaren, Nadeln oder Mikrotiterstreifen, Röhren, Platten oder Näpfen usw., Kämmen, Pipettenspitzen, Mikroarrays, Chips oder in der Tat irgendeinem festen Oberflächenmaterial haben.
Zweckmäßigerweise kann der Träger aus Glas, Silikat, Latex, Kunststoff oder irgendeinem polymeren Material gefertigt sein. Allgemein ist zur Isolation von DNA die Natur des Trägers nicht kritisch, und eine Vielzahl von Oberflächenmaterialien können verwendet werden. Die Oberfläche des festen Trägers kann hydrophob oder hydrophil sein. Materialien, die eine große Oberfläche zur Bindung von Zellen und nachfolgend der Nukleinsäure bieten, sind bevorzugt. Solche Träger haben im allgemeinen eine irreguläre Oberfläche und können z.B. porös oder feinkörnig sein, z.B. Partikel, Fasern, Gewebe, Sinter oder Siebe. Feinkörnige Materialien, z.B. Beads, sind wegen ihrer größeren Bindungskapazität grundsätzlich bevorzugt, insbesondere polymere Beads/Partikel.
Zweckmäßigerweise umfasst ein feinkörniger fester Träger, der erfindungsgemäß verwendet wird, sphärische Beads. Die Größe der Beads ist nicht kritisch, aber sie können z.B. einen Durchmesser in der Größenordnung von mindestens 1 und vorzugsweise mindestens 2 μm und einen maximalen Durchmesser von vorzugsweise nicht mehr als 10 und bevorzugter nicht mehr als 6 μm haben. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Beads mit einem Durchmesser von 2,8 μm und 4,5 μm gut funktionieren.
Monodisperse Partikel, d.h. solche, die im Wesentlichen einheitlich in ihrer Größe sind (z.B. mit einer Größe, deren Durchmesser eine Standardabweichung von weniger als 5% besitzt), haben den Vorteil, dass sie eine sehr einheitliche Reproduzierbarkeit der Reaktion bereitstellen. Durch die in US-A-4336173 beschriebene Technik hergestellte monodisperse Polymerpartikel sind besonders geeignet.
Zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignete nicht-magnetische Polymer-Beads sind von Dynal Particles AS (Lillestr⌀m, Norwegen; zuvor Dyno Particles oder Dyno Speciality Polymers) ebenso wie von Qiagen, Amersham Pharmacia Biotech, Serotec, Seradyne, Merck, Nippon Paint, Chemagen, Promega, Prolabo, Polysciences, Agowa, Bangs Laboratories und Dyno Particles oder Dyno Speciality Polymers erhältlich.
Zur Unterstützung von Manipulation und Auftrennung sind jedoch magnetische Beads bevorzugt. Der Ausdruck „magnetisch" bedeutet hier, dass der Träger imstande ist, ein magnetisches Moment zu besitzen, das ihm vermittelt wird, wenn er in einem Magnetfeld platziert wird, und er somit unter der Wirkung dieses Feldes bewegt werden kann. In anderen Worten kann ein magnetische Partikel umfassender Träger durch magnetische Aggregation ohne weiteres entfernt werden, was eine schnelle, einfache und wirksame Art bereitstellt, nach den Zell- und Nukleinsäurebindungsschritten die Partikel abzutrennen, und was ein erheblich weniger drastisches Verfahren darstellt als herkömmliche Techniken wie z.B. Zentrifugation, die Scherkräfte erzeugen, die die Zellen auflösen oder die Nukleinsäure abbauen können.
Somit können unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens die magnetischen Partikel mit den angehefteten Zellen durch Anwendung eines Magnetfelds, z.B. Verwendung eines Permanentmagneten, auf eine geeignete Oberfläche entfernt werden. Es ist üblicherweise genügend, einen Magneten auf die Seite des Gefäßes aufzulegen, das das Probengemisch enthält, um die Partikel an der Wand des Gefäßes zu aggregieren und den Rest der Probe abzugießen.
Besonders bevorzugt sind superparamagnetische Partikel, z.B. die von Sintef in EP-A-106873 beschriebenen, da magnetische Aggregation und Verklumpung der Partikel während der Reaktion vermieden werden können, wodurch eine einheitliche Nukleinsäureextraktion sichergestellt wird. Die wohlbekannten magnetischen Partikel, die von Dynal Biotech ASA (Oslo, Norwegen, zuvor Dynal AS) als DYNABEADS verkauft werden, sind zur Verwendung in der gegenwärtigen Erfindung besonders geeignet.
Funktionalisierte beschichtete Partikel zur erfindungsgemäßen Verwendung können durch Modifikation der Beads gemäß US-Patenten 4,336,173, 4,459,378 und 4,654,267 hergestellt werden. Somit können Beads oder andere Träger hergestellt werden, die verschiedene Arten von funktionalisierten Oberflächen haben, z.B. positiv oder negativ geladen, hydrophil oder hydrophob.
Der Bindungspartner oder die Bindungspartner kann bzw. können auf jede zweckmäßige Art vor oder nach Bindung an die Leukozyten gemäß den aus dem Stand der Technik wohlbekannten und in der Literatur beschriebenen Techniken an den festen Träger angeheftet werden. Somit kann der Bindungspartner direkt oder indirekt an den festen Träger angeheftet werden.
In einer zweckmäßigen Ausführungsform kann der Bindungspartner vor dem Kontakt mit der Probe an den Träger angeheftet werden. Eine solche Anheftung kann durch aus dem Stand der Technik wohlbekannte Verfahren (z.B. Kopplungschemie) ohne weiteres erreicht werden, und der Bindungspartner wird zweckmäßigerweise direkt an den festen Träger gebunden, z.B. durch Beschichtung. Jedoch kann er auch über Spacer- oder Linker-Moleküle gebunden werden. Der Bindungspartner kann wahlweise entweder kovalent oder reversibel angeheftet werden.
Alternativ kann, wie oben beschrieben, der Bindungspartner zuerst mit der Probe in Kontakt gebracht werden, um an die Leukozyten zu binden, bevor er an den festen Träger angeheftet wird. In diesem Fall kann der feste Träger zweckmäßigerweise eine Bindungsgruppe tragen oder damit ausgestattet sein, die imstande ist, den leukozytenspezifischen Bindungspartner zu binden. Solche Bindungssysteme sind abermals aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Die feste Oberfläche kann z.B. einen (sekundären) Antikörper tragen, der imstande ist, den Anti-Leukozyten-Bindungspartner zu binden (z.B. einen polyklonalen Anti-Spezies-Antikörper).
Wenn mehr als ein verschiedener Typ von Bindungspartnern verwendet wird (z.B. Anti-CD45- und Anti-CD15-Antikörper), können sie an den gleichen oder an verschiedene feste Träger angeheftet sein. Ein solches System, das verschiedene feste Träger verwendet, ist im Fall von feinkörnigen Trägern wie z.B. Beads besonders verwendbar. Auf diese Weise können verschiedene Bindungspartner an verschiedene Beads angeheftet sein.
In Ausführungsformen, in denen mehr als eine verschiedene Art von Bindungspartnern verwendet wird, können geeignete Mengen oder Verhältnisse, in denen die verschiedenen Arten von Bindungspartnern verwendet werden können, vom Fachmann ohne weiteres bestimmt werden. Zum Beispiel können in bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, in denen Anti-CD45- und Anti-CD15-Antikörper verwendet werden, diese in beliebigen Verhältnissen verwendet werden, sofern ein solches Verhältnis es erlaubt, die Zellen zu isolieren. Bevorzugte Verhältnisse sind 1:1 und 2:1 von CD45 zu CD15.
Wie oben erwähnt, sind auf Festphasen-Affinitätsbindung basierende Zelltrennungstechniken (z.B. immunomagnetische Trennung (immunomagnetic separation, IMS)) aus dem Stand der Technik wohlbekannt, und die Bedingungen, um eine solche Zelltrennung zu erreichen, können von einem Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres bestimmt werden. So kann z.B. ein fester Träger, der einen oder mehrere Antileukozytenbindungspartner trägt, mit der Probe in Kontakt gebracht werden. Ein feinkörniger fester Träger kann z.B. in einem geeigneten Medium (z.B. einem Puffer) enthalten (z.B. suspendiert) der Probe zugesetzt werden. Der Träger kann dann über einen Zeitraum, der es ermöglicht, dass die Bindung an die Zellen erfolgt, mit der Probe in Kontakt gelassen (z.B. inkubiert) werden. Die Bedingungen während dieses Schrittes sind nicht kritisch, und das Probe-Träger-Gemisch kann über einen Zeitraum von 10 Minuten bis 2 Stunden, z.B. 20 bis 45 Minuten, bei z.B. 4 bis 20°C inkubiert werden.
Nach der Zellbindung werden die isolierten oder an den Träger gebundenen Zellen lysiert, um ihre Nukleinsäure freizusetzen. Verfahren zur Lyse von Zellen sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt und in der Literatur eingehend beschrieben, und jedes der bekannten Verfahren kann verwendet werden. Zum Beispiel könnte jedes der folgenden Verfahren verwendet werden: Detergentien-Lysis unter Verwendung von z.B. SDS, LiDS oder Sarkosyl in geeigneten Puffern; Verwendung von Chaotropen wie Guanidinhydrochlorid (GHCl), Guanidinthiocyanat (GTC), Natriumiodid (NaI), Perchlorat usw.; mechanische Auflösung, wie z.B. durch eine hydraulische Hochdruckpresse, Beschallung, Mahlen mit Glasbeads, Aluminium oder in flüssigem Stickstoff; enzymatische Lysis, z.B. unter Verwendung von Lysozym, Proteinasen, Pronasen oder Cellulasen oder irgendeinem anderen der kommerziell verfügbaren Lysisenzyme; Lysis der Zellen durch Bakteriophagen- oder Virusinfektion; Gefriertrocknung; osmotischer Schock; Mikrowellenbehandlung; Temperaturbehandlung; z.B. durch Erhitzen oder Kochen oder durch Einfrieren, z.B. in Trockeneis oder flüssigem Stickstoff, und Tauen; alkalische Lysis. Wie oben erwähnt, sind alle solchen Verfahren standardmäßige Lysistechniken und aus dem Stand der Technik wohlbekannt, und jede dieser Methoden oder Kombination von Methoden kann verwendet werden.
Wie oben erwähnt, bietet die vorliegende Erfindung den Vorteil, dass die Verwendung von Mitteln wie Lösungsmitteln, Alkoholen und Chaotropen vermieden werden kann. Somit wird, während Lysismethoden wie die oben beschriebenen unter Verwendung solcher Mittel eingesetzt werden können, in den vorteilhaften Ausführungsformen der Erfindung die Verwendung solcher Mittel vermieden.
Zweckmäßigerweise wird die Lysis erfindungsgemäß unter Verwendung von Detergentien erreicht. Ein beispielhaftes geeignetes Lysismittel umfasst somit ein Detergens wie z.B. SDS oder ein anderes Alkalimetall-Alkylsulfat-Salz, z.B. LiDS oder Sarkosyl oder Kombinationen davon. Die Lysismittel können in einfachen wässrigen Lösungen geliefert werden, oder sie können in einer Pufferlösung enthalten sein, um einen so genannten „Lysispuffer" zu bilden. Jeder geeignete Puffer kann verwendet werden, darunter z.B. Tris, Bicine, Tricine und Phosphatpuffer. Alternativ können die Lysismittel separat zugesetzt werden. Es können auch Salze, z.B. LiCl und NaCl, in den Lysispuffern enthalten oder ihnen zugesetzt sein. Insbesondere wird LiCl bevorzugt, wenn LiDS verwendet wird, und NaCl wird bevorzugt, wenn SDS verwendet wird.
Die geeigneten Konzentrationen und Mengen der Lysismittel variieren in Abhängigkeit von dem genauen System usw. und können passend bestimmt werden, aber Konzentrationen von z.B. 2 M bis 7 M an Chaotropen wie z.B. GTC, GHCl, NaI oder Perchlorat, 0,1 M bis 1 M an alkalischen Mitteln wie z.B. NaOH und 0,1 bis 50% (Gewicht/Volumen), z.B. 0,5 bis 15% an Detergens, können verwendet werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können isolierte, an den Träger gebundene Zellen zweckmäßigerweise vom Rest der Probe entfernt oder abgetrennt werden, wodurch die Zellen konzentriert oder angereichert werden. Somit dient der Leukozytenbindungsschritt dazu, die Zellen anzureichern oder sie in einem kleineren Volumen als dem der ursprünglichen Probe zu konzentrieren. Zur Erleichterung der nachfolgenden Schritte kann es wünschenswert sein, vor dem Lysisschritt die an den Träger gebundenen Zellen zu verdünnen, z.B. in einem passenden Puffer oder anderem Medium. Gewünschtenfalls können die Zellen weiterbehandelt werden, z.B. durch Erhitzen oder Mischen (z.B. Vortexen). Ein Verdünnungsschritt kann von Vorteil sein, um die Agglomeration/Aggregation eines feinkörnigen Trägers wie z.B. von Beads zu verhindern, insbesondere bei einer genomischen DNA-Matrix, die die weitere Handhabung der Beads erschwert und für den Transfer des Überstandes oder des Bead-Pellets in ein anderes Kompartiment oder Gefäß, z.B. einem Napf, einem Röhrchen, eine Schale usw. unzuverlässig macht. Die Lysis kann dann zweckmäßigerweise erreicht werden, indem man einen geeigneten Lysispuffer zusetzt, der die erwünschten Lysismittel enthält, oder indem man die isolierten Zellen den erwünschten Lysisbedingungen aussetzt. Zum Beispiel können, wenn einfach ein geeignete Lysismittel enthaltender Lysispuffer zugesetzt wird, die isolierten Zellen einfach über einen Zeitraum, der geeignet ist, die Lysis stattfinden zu lassen, in Gegenwart des Lysispuffers inkubiert werden. Für verschiedene Lysissysteme können verschiedene Inkubationsbedingungen geeignet sein, und sie sind aus dem Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel kann mit einem detergentienhaltigen Lysispuffer die Inkubation bei Raumtemperatur oder höheren Temperaturen, z.B. bei 37°C, 50°C oder 65°C stattfinden. Ebenso kann die Inkubationszeit von einigen Minuten, z.B. 5 oder 10 Minuten, bis zu Stunden, z.B. 20 bis 40 Minuten oder 1 bis 2 Stunden, variieren. Zur enzymatischen Lysis, z.B. unter Verwendung von Proteinase K usw., können längere Behandlungszeiten erforderlich sein, z.B. über Nacht.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfasst der Lysisschritt des Verfahrens einen weiteren Schritt, der den Zusatz eines weiteren oder einer weiteren Menge festen Trägers zu den isolierten Leukozyten umfasst. Ein solcher „weiterer" fester Träger (hier auch als „zweiter" fester Träger bezeichnet) kann den gleichen wie den oder einen anderen als den in Schritt (a) des Verfahrens verwendeten festen Träger umfassen und kann der Zellprobe vor oder nach dem Zusatz des Lysispuffers als separate Komponente zugesetzt werden oder in der Lysislösung oder dem Lysispuffer enthalten sein. Der weitere oder zweite feste Träger kann somit jeden der oben zur Verwendung in Schritt (a) diskutierten festen Träger umfassen. Da jedoch die Isolation der Leukozyten zum Zeitpunkt der Lysis bereits durchgeführt worden ist, gibt es kein absolutes Erfordernis für die zweite feste Phase, einen leukozytenspezifischen Bindungspartner mit seiner Oberfläche assoziiert haben zu müssen. Es wurde gefunden, dass die Verwendung eines zweiten festen Trägers Vorteile bei der Probenentnahme bietet, z.B. durch Verbesserung der Pelletbildung und damit der Isolation des ersten festen Trägers. Die verbesserte Pelletbildung kann auch die unspezifische Bindung von Substanzen oder Entitäten in dem Pellet reduzieren, oder in anderen Worten, die Kontamination des Pellets verringern. Ohne Beschränkung auf die Theorie wird angenommen, dass, wenn nur ein erster fester Träger verwendet wird, das isolierte Nukleinsäuremolekül den ersten festen Träger als lockeres, nicht zusammenhängendes Netz bindet, was zu einem relativ lockeren nichtkompakten Pellet führt. Wenn jedoch ein zweiter Träger verwendet wird, und insbesondere, wenn dieser zweite feste Träger Partikel umfasst, die kleiner oder größer als der erste feste Träger sind, füllt der zweite feste Träger die Lücken (oder umgekehrt) des lockeren Netzwerks, wodurch er das Pellet fester und kompakter macht, was die Neigung verringert, kontaminiertes Material festzuhalten.
Somit kann der zweite feste Träger von vergleichbarer Größe und Dichte wie der erste feste Träger sein. Vorzugsweise ist der zweite feste Träger jedoch von geringerer Größe als der erste feste Träger. Zum Beispiel umfasst der zweite feste Träger, wenn die Träger feinkörnig sind, Partikel von geringerem Durchmesser (z.B. dem ungefähr halben Durchmesser) als dem derjenigen, die der erste feste Träger umfasst. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst der erste feste Träger Partikel mit einem Durchmesser von 4,5 μm (z.B. die hier beschriebenen M450-Beads), während der zweite feste Träger Partikel von 2,8 μm Durchmesser umfasst (z.B. die hier beschriebenen M280 und M270 Beads). Alternativ kann der erste Träger kleiner als der zweite Träger sein, und die oben beschriebenen Dimensionen können umgekehrt sein.
Es ist besonders bevorzugt, wenn der zweite feste Träger eine aktivere Rolle bei der Isolation der Nukleinsäure spielt, und in solchen Fällen ist die zweite Festphase imstande, Nukleinsäure zu binden, d.h. sie hat nukleinsäurebindende Eigenschaften. Daher kann der zweite feste Träger vorzugsweise aus Glas, Silikat, Latex, Kunststoff oder irgendeinem polymeren Material (d.h. mit unbeschichteter Oberfläche) bestehen, das imstande ist, Nukleinsäure zu binden, und solch ein fester Träger kann gewünschtenfalls funktionalisiert sein, z.B. um die Nukleinsäurebindung zu unterstützen oder zu verbessern. Besonders bevorzugt sind in diesem Hinblick funktionalisierte feste Träger, die eine Oberflächenladung haben, vorzugsweise eine negative Oberflächenladung. Am bevorzugtesten sind feste Träger, die mit funktionellen Carboxylgruppen beschichtet sind. Solche festen Träger sind kommerziell verfügbar, z.B. die von Dynal Biotech ASA hergestellten M-270-Carbonsäurebeads oder M-280-Hydroxylbeads. Die zweiten festen Träger sind vorzugsweise feinkörnig, z.B. Beads, und besonders bevorzugt magnetisch.
Die Bereitstellung einer weiteren oder zusätzlichen Menge festen Trägers nach dem Zellisolationsschritt ergibt eine erhöhte Ausbeute an Nukleinsäure und macht auch die Elution der Nukleinsäure von dem festen Träger leichter, insbesondere dort, wo feste Träger mit einer negativ geladenen Oberfläche verwendet werden. Ohne Beschränkung auf die Theorie wird wie oben beschrieben angenommen, dass die Zugabe einer zusätzlichen Menge eines „zweiten" festen Trägers die Kompaktheit des Pellets aus Beads und Nukleinsäure erhöht, und insbesondere dort, wo die DNA imstande ist, an dem zweiten festen Träger zu binden, eine effektivere und vollständigere Bindung von Nukleinsäuremolekülen erreicht wird, anstelle dass die Nukleinsäuremoleküle nur an einem Ende an die Beads gebunden sind oder lose an die Beads gebunden sind.
Somit stellt eine weitere Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Isolation von Nukleinsäure aus einer Blutprobe bereit, wobei dieses Verfahren umfasst:

(a) selektive Isolation von Leukozyten aus der Probe durch Bindung der Leukozyten an einen festen Träger mittels eines für Leukozyten spezifischen Bindungspartners;
(b) Lysis der isolierten Leukozyten;
(c) Bindung der aus den lysierten Zellen freigesetzten Nukleinsäure an den ersten festen Träger; und
(d) In-Kontakt-bringen der isolierten Leukozyten des Schrittes (b) oder der Nukleinsäure des Schrittes (c) mit einer zusätzlichen Menge eines zweiten festen Trägers, vorzugsweise unter Bindung der Nukleinsäure an den zweiten festen Träger, der Nukleinsäure zu binden vermag.

Vorzugsweise werden die isolierten Lymphozyten in Gegenwart des zweiten festen Trägers lysiert.
Dieses Verfahren unter Verwendung eines zweiten festen Trägers kann gleichermaßen verwendet werden, um selektiv Nukleinsäuren aus Zellen in einer beliebigen Probe zu isolieren. Bei solchen Verfahren werden die Zellen, aus denen die Nukleinsäure isoliert werden soll, selektiv aus der Probe isoliert, indem man diese Zellen an einen ersten festen Träger vermittels eines oder mehrerer geeigneter Bindungspartner bindet, wonach die Schritte (b), (c) und (d) des oben beschriebenen Verfahrens auf die betreffenden besonderen isolierten Zellen angewandt werden.
Geeignete erste und zweite feste Träger zur Verwendung in solchen Verfahren werden hier diskutiert (und können gleichartig oder verschieden sein), ebenso auch geeignete Verfahren zur selektiven Isolation von Zellen und Lysisverfahren. Vorzugsweise umfasst der Lysisschritt (b) des Verfahrens auch die Verwendung von Proteinasen und insbesondere von Proteinase K in geeigneter Konzentration. Wie oben diskutiert, ist die Verwendung von Proteinasen bei konventionellen Techniken der Nukleinsäureisolation oftmals nachteilig, da solche Materialien dazu neigen, mit vielen enzymatischen Reaktionen und anderen späteren Verarbeitungsmaßnahmen zu interferieren. In bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung werden diese nachteiligen Wirkungen der Proteinasen jedoch durch die Verwendung einer magnetischen Trennungstechnologie minimiert, wobei die Menge an kontaminierenden Enzymen vernachlässigbar ist, da die Beads während der Isolation der Nukleinsäure und der nachfolgenden Waschschritten von Gefäß zu Gefäß bewegt werden.
Der Begriff „zusätzliche" oder „extra" oder „weitere" Menge wird hier, wenn im Zusammenhang mit dem Zusatz einer zweiten Festphase gebraucht, dazu verwendet, den Zusatz jeder Menge (an Gewicht) einer zweiten Festphase zu bezeichnen, wodurch die Isolation der Nukleinsäure verbessert wird, z.B. die Ausbeute der isolierten Nukleinsäure erhöht wird. Zum Beispiel kann die zugesetzte Menge der zweiten Festphase die gleiche Menge wie die verwendete Menge der ersten Festphase sein, oder sie kann bis zu ungefähr dem 3- bis 5-fachen der verwendeten Menge der ersten Festphase betragen. Alternativ kann die zugesetzte Menge der zweiten Festphase geringer sein als die Menge der ersten Festphase, sofern die Isolation der Nukleinsäure verbessert wird. Vorzugsweise beträgt die verwendete Menge der zweiten Festphase das 0,5- bis 3-fache der Menge der ersten Festphase.
Da die „Menge" der Festphase sich auf das Gewicht der Festphase bezieht, sind in den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, in denen die erste und zweite Festphase feinkörnig sind und die die zweite Festphase bildenden Partikel kleiner (oder größer) als die die erste Festphase bildenden Partikel sind, die Anzahlen der für die erste und die zweite Festphase verwendeten Partikel im allgemeinen verschieden.
Nach der Lysis wird die freigesetzte Nukleinsäure an die gleichen Träger gebunden, an die die lysierten Zellen gebunden sind, oder in anderen Ausführungsformen der Erfindung wird die freigesetzte Nukleinsäure an den gleichen festen Träger gebunden, an dem die lysierten Zellen gebunden sind, und an den zusätzlichen zweiten Träger. Diese Nukleinsäurebindung kann auf jede aus dem Stand der Technik für die Bindung von Nukleinsäure an einen festen Träger bekannte Weise erreicht werden. Zweckmäßigerweise wird die Nukleinsäure unspezifisch, d.h. unabhängig von ihrer Sequenz, an den Träger gebunden. So kann die freigesetzte Nukleinsäure z.B. unter Verwendung beliebiger der bekannten Ausfällungsmittel für Nukleinsäure, z.B. von Alkoholen, Alkohol/Salz-Kombinationen, Polyethylenglykolen (PEGs) usw., auf den Träger gefällt werden. Die Ausfällung von Nukleinsäuren auf Beads auf diese Weise ist z.B. in WO 91/12079 beschrieben. So können Salze dem Träger und der freigesetzten Nukleinsäure in Lösung zugesetzt werden, gefolgt von Zugabe von Alkohol, die die Nukleinsäure ausfallen lässt. Alternativ können Salz und Alkohol zusammen zugesetzt werden, oder das Salz kann ausgelassen werden. Wie oben im Hinblick auf den Zellbindungsschritt beschrieben, kann jeder geeignete Alkohol oder jedes geeignete Salz verwendet werden, und die geeigneten Mengen oder Konzentrationen können ohne weiteres bestimmt werden. Jedoch ist es, wie oben beschrieben, bevorzugt, die Verwendung von Lösungsmitteln, Alkoholen und ähnlichen Mitteln zu vermeiden. Somit sind alternative Techniken, die die Verwendung solcher Mittel vermeiden, bevorzugt.
Eine solche alternative und bevorzugte Nukleinsäurebindungstechnik umfasst die Verwendung von Detergentien, wie in WO 96/18731 von Dynal AS beschrieben (die so genannte „DNA Direct"-Methode). Verschiedene detergentien-basierte Systeme zur Bindung von Nukleinsäuren an einen festen Träger sind in dieser Publikation beschrieben und können erfindungsgemäß verwendet werden.
Zweckmäßigerweise kann der Nukleinsäurenbindungsschritt gleichzeitig oder parallel zu dem Zelllysisschritt erfolgen. Dies kann zweckmäßigerweise unter Verwendung der detergentienbasierten Verfahren aus WO 96/18731 erreicht werden. So können z.B. ein oder mehrere Mittel zur Lysis und Nukleinsäurebindung zweckmäßigerweise in einem geeigneten Medium (z.B. einem Puffer oder einer anderen wässrigen Lösung) enthalten sein und den an den Träger gebundenen Zellen zugesetzt werden. Die Zellen können dann in Kontakt mit dem Medium gehalten werden, z.B. inkubiert werden (z.B. wie oben beschrieben), um es zu ermöglichen, dass Lysis und Nukleinsäurebindung stattfinden. Ein solches Medium kann als „Lysis/Bindungs"-Medium bezeichnet werden. Ein Detergens kann sowohl als Lysismittel als auch zur Unterstützung der Bindung der Nukleinsäure an den Träger fungieren.
Das Detergens kann ein beliebiges Detergens sein, und eine große Anzahl sind in der Literatur bekannt und beschrieben. So kann das Detergens ionisch, auch anionisch und kationisch, nicht-ionisch oder zwitterionisch sein. Der Begriff „ionisches Detergens" wird hier verwendet, um jedes Detergens einzuschließen, das, wenn es in Wasser gelöst ist, teilweise oder vollständig in ionischer Form vorliegt. Es wurde gezeigt, dass anionische Detergentien besonders gut funktionieren, und sie sind daher bevorzugt. Zu geeigneten anionischen Detergentien gehören z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS) oder andere Alkalimetallalkylsulfatsalze oder ähnliche Detergentien, Sarkosyl oder Kombinationen davon.
Zweckmäßigerweise kann das Detergens in einer Konzentration von 0,2 bis 30% (Gewicht/Volumen), z.B. 0,5 bis 30%, vorzugsweise 0,5 bis 15%, insbesondere bevorzugt 1 bis 10% verwendet werden. Für anionische Detergentien wurde gezeigt, dass Konzentrationen von 1,0 bis 5%, z.B. 0,5 bis 5%, gut funktionieren.
Das Detergens kann in einfacher wässriger Lösung, die sauer oder alkalisch sein kann, oder, bevorzugter, in einem Puffer bereitgestellt werden. Jeder geeignete Puffer kann verwendet werden, darunter z.B. Tris, Bicine, Tricine und Phosphatpuffer. Zweckmäßigerweise kann eine Quelle monovalenter Kationen, z.B. ein Salz, zur Verbesserung des Festhaltens der Nukleinsäuren eingeschlossen werden, obwohl dies nicht notwendig ist. Zu geeigneten Salzen gehören Chloridsalze, z.B. Natriumchlorid, Lithiumchlorid usw. in Konzentrationen von 0,1 bis 1 M, z.B. 250 bis 500 mM. Wie oben erwähnt, können auch andere Substanzen wie z.B. Enzyme enthalten sein.
Zu anderen optionalen Komponenten in der Detergenszusammensetzung gehören Chelatoren, z.B. EDTA, EGTA und andere Polyaminocarbonsäuren, zweckmäßigerweise in Konzentrationen von 1 bis 50 mM usw., Reduktionsmittel wie Dithiotreitol (DTT) oder β-Mercaptoethanol in Konzentrationen von z.B. 1 bis 10 mM.
Bevorzugte Detergentienzusammensetzungen können z.B. umfassen:
100 mM Tris-HCl pH 7,5
10 mM EDTA
2% SDS
oder:
100 mM TrisCl pH 7,5
10 mM EDTA
5% SDS
10 mM NaCl
oder:
100 mM TrisCl pH 7,5
500 mM LiCl
10 mM EDTA
1% LiDS
Im Hinblick auf weitere Details, beispielhafte Reaktionsbedingungen usw. wird Bezug auf WO 96/18731 genommen.
In denjenigen Ausführungsformen der Erfindung, in denen ein zweiter fester Träger zugesetzt wird, kann dieser zweite feste Träger in der Detergenszusammensetzung enthalten sein. Weitere bevorzugte Detergenszusammensetzungen umfassen somit die oben genannten Zusammensetzungen, die weiterhin eine geeignete Menge an zweitem festen Träger enthalten, z.B. M-270-Carbonsäurebeads oder M-280-Hydroxylbeads, z.B. in einer Konzentration von ungefähr 1,5 mg/ml und gewünschtenfalls eine geeignete Menge Proteinasen, z.B. Proteinase K, z.B. 20 mg/ml.
Durch Auswahl geeigneter „Nukleinsäurebindungs"-Bedingungen (d.h. eines geeigneten Puffers oder einer geeigneten Lysis/Bindungsmedium-Zusammensetzung) kann ausgewählt werden, ob aus den Zellen freigesetzte DNA oder aus den Zellen freigesetzte RNA an den festen Träger gebunden werden soll. Somit können „Bindungsmedium"-Zusammensetzungen ausgewählt werden, die die Bindung von DNA (oder insbesondere die Bindung von genomischer DNA) an den festen Träger begünstigen. Zu solchen Bindungsmedium-Zusammensetzungen gehören die oben genannten, die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen, und die Zusammensetzungen der WO 96/18731. Zum Beispiel kann ein repräsentatives DNA-Bindungsmedium GuHCl und optional EDTA enthalten.
Zur Bindung von RNA geeignete Mediumzusammensetzungen oder Bedingungen sind aus dem Stand der Technik bekannt oder können anhand von aus dem Stand der Technik bekannten RNA-Isolationsverfahren ohne weiteres bestimmt werden, und sie können z.B. die in EP-A-0389063 und US-A-5,234,809 von Akzo Nobel NV beschriebenen Verfahren und Puffer umfassen.
Repräsentative RNA-Bindungszusammensetzungen können somit Guanidinthiocyanat (GTC) mit EDTA enthalten.
Für die Bindung von RNA kann die Natur des festen Trägers bedeutsam sein, und insbesondere eine feste Oberfläche aus „Silikat" (d.h. Silikat selbst umfassend oder auf Silikat oder einem Silikatderivat basierend) sollte verwendet werden (siehe weiter unten).
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolation von DNA verwendet wird, kann es vorteilhafterweise mit einem weiteren Schritt kombiniert werden, um separat die RNA aus der Probe zu isolieren. Somit kann gemäß den oben beschriebenen Verfahren durch Auswahl von DNA- Bindungsbedingungen in dem Nukleinsäurebindungsschritt (z.B. ein Lysis/Bindungs- oder Bindungs-Medium, das die DNA-Bindung begünstigt) die aus den an den Träger gebundenen Zellen freigesetzte DNA an den Träger gebunden und aus der Probe entfernt werden. Aus den Leukozyten freigesetzte RNA, insbesondere mRNA, verbleibt in der Probe (genauer gesagt im Überstand). Diese RNA kann unter Verwendung von Standardverfahren ohne weiteres aus der Probe isoliert werden, z.B. durch Bindung an eine Fängersonde, zweckmäßigerweise immobilisiert (z.B. durch Bindung an einen festen Träger), aus Oligo dT bestehend.
Es können auch alternative Nukleinsäurebindungstechniken verwendet werden, um den Schritt der Bindung der freigesetzten Nukleinsäure an den festen Trägern zu erreichen. Zum Beispiel kann ein solches Verfahren das wohlbekannte Prinzip der Bindung von Nukleinsäure an eine Silikatoberfläche ausnutzen.
Somit kann in einer solchen Ausführungsform der feste Träger ein Silikat oder ein silikatbasiertes oder davon abgeleitetes Material umfassen oder daraus bestehen. Viele solche Materialien sind bekannt und im Stand der Technik beschrieben, und die Literatur ist voll von Quellen, die die Isolation von Nukleinsäuren durch Bindung an Silikatoberflächen beschreiben (siehe z.B. EP-A-0389063 von AKZO N. V., US-A-5,342,931, US-A-5,503,816 und US-A-5,625,054 von Becton Dickinson, US-A-5,155,018 von Hahnemann University, US-A-6,027,945 von Promega Corp. und US-A-5,945,525 von Toyo Boseki KK).
Eine ionische Bindung der Nukleinsäure an den Träger kann durch Verwendung eines festen Trägers mit geladener Oberfläche, z.B. eines mit Polyaminen beschichteten Trägers, erreicht werden.
Der Träger, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann auch funktionale Gruppen tragen, die die spezifische oder unspezifische Bindung von Nukleinsäuren unterstützen, z.B. DNA-Bindungsproteine, z.B. Leucinzipper oder Histone oder interkalierende Farbstoffe (z.B. Ethidiumbromid oder Hoechst 42945), mit denen der Träger beschichtet sein kann.
Gleichermaßen kann der Träger mit Bindungspartnern versehen sein, um das selektive Einfangen von Nukleinsäuren zu unterstützen. Zum Beispiel können komplementäre DNA- oder RNA-Sequenzen oder DNA-Bindungsproteine verwendet werden. Die Anheftung solcher Proteine an den festen Träger kann unter Verwendung von aus dem Stand der Technik wohlbekannten Techniken erreicht werden. Zweckmäßigerweise können solche Nukleinsäure-Bindungspartner auf dem festen Träger mit den Antileukozyten-Bindungspartnern vermischt sein.
Obwohl es nicht notwendig ist, kann es zweckmäßig sein, in das erfindungsgemäße Isolationsverfahren einen oder mehrere Waschschritte einzuführen, z.B. nach dem Zellisolations- und/oder Nukleinsäurebindungsschritt. Beliebige herkömmliche Waschpuffer oder andere Medien können verwendet werden. Allgemein sind salzhaltige Puffer mit niedriger bis mittlerer Ionenstärke bevorzugt, z.B. 10 mM Tris-HCl, pH 8,0/10 mM oder 40 mM NaCl. Andere standardmäßige Waschmedien, z.B. Alkohol, können gewünschtenfalls ebenfalls verwendet werden, z.B. Waschen mit 70% Ethanol.
Die Verwendung magnetischer Partikel erlaubt leichte Waschschritte, einfach durch Aggregation der Partikel, Entfernung des Nukleinsäurebindungsmediums, Zusatz des Waschmediums und Reaggregation der Partikel, so oft wie erforderlich.
Nach dem Nukleinsäureisolationsverfahren und allen eventuellen optionalen Waschschritten kann der die gebundene Nukleinsäure tragende Träger in irgendein geeignetes Medium, z.B. Wasser oder einen Puffer mit niedrigerer Ionenstärke, übertragen, z.B. darin resuspendiert oder eingetaucht werden. Auf diese Weise kann die isolierte Nukleinsäure von der Probe entfernt oder getrennt werden. In Abhängigkeit von dem Träger und der Natur einer eventuell gewünschten nachfolgenden Weiterverarbeitung kann es wünschenswert oder nicht wünschenswert sein, die Nukleinsäure von dem Träger freizusetzen.
Im Fall eines feinkörnigen festen Trägers wie z.B. von magnetischen oder nichtmagnetischen Beads kann sie in vielen Fällen direkt verwendet werden, z.B. zur PCR oder anderen Amplifikationen, ohne die Nukleinsäure von dem Träger zu eluieren. Auch für viele DNA-Detektions- oder -Identifikationsverfahren ist keine Elution erforderlich, da, obwohl die DNA in zufälligem Kontakt mit der Blutoberfläche stehen oder an einer Anzahl von Punkten durch Wasserstoffbrücken oder ionische oder andere Kräfte gebunden sein kann, im allgemeinen ausreichende DNA-Längen zur Hybridisierung an Oligonukleotide und zur Amplifikation verfügbar sind.
Jedoch kann gewünschtenfalls die Elution der Nukleinsäure ohne weiteres unter Verwendung bekannter Mittel erreicht werden, z.B. durch Erhitzung, z.B. 5 bis 10 Minuten lang auf 65°C, wonach der Träger aus dem Medium entfernt wird, was die Nukleinsäure in der Lösung zurücklässt. Eine solche Erhitzung wird bei der PCR durch den DNA-Denaturierungsschritt, der dem Zyklusprogramm vorangeht, automatisch erreicht. Ein Elutionspuffer, der kein Salz enthält, kann ebenfalls zweckmäßigerweise verwendet werden.
Wenn es gewünscht wird, die RNA von der DNA zu entfernen, kann dies durch Zerstörung der RNA vor dem DNA-Abtrennungsschritt erreicht werden, z.B. durch Zusatz einer RNAase oder einer Lauge wie z.B. NaOH.
Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass sie schnell und einfach durchzuführen ist und mit einer geeigneten Kombination von Zellbindungs-, Lysis- und Nukleinsäurebindungsschritten ein Verfahren bereitstellt, das auf einfache und zuverlässige Weise isolierte Nukleinsäure innerhalb von kurzer Zeit, in vielen Fällen weniger als einer Stunde oder sogar weniger als 45 Minuten liefert. Die Einfachheit des Verfahrens erlaubt hohen Probendurchsatz. Parallel dazu führt der Zellbindungsschritt zu einer Anreicherung oder Konzentration der Zellen und zu einer Reinigung von anderen Bestandteilen der Probe, was den Nukleinsäureisolationsvorgang verbessert. Es ist ebenfalls vorteilhaft, dass die Verwendung von Lösungsmitteln wie Chloroform/Phenol vermieden wird. Vorteilhafterweise erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren, Nukleinsäure aus relativ kleinen Blutproben zu isolieren, z.B. bis zu 10 ml Blut, z.B. 10 μl bis 2 ml Blut, z.B. 200 bis 500 μl Blut oder 50 bis 200 μl (z.B. 100 μl) Buffycoat. Die Ausbeuten und die Qualität der durch das erfindungsgemäße Verfahren isolierten Nukleinsäure sind gut. Zum Beispiel stellen 0,2 ml Blut routinemäßig 5–12 μg DNA mit einem OD_260/280-Verhältnis von 1,75–1,9 bereit. Weiterhin können, wie oben beschrieben, die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um Nukleinsäure aus großen Blutproben zu isolieren, z.B. aus Proben von mehr als 10 ml.
Besonders günstige Resultate wurden bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolation genomischer DNA aus Blutproben erreicht. Insbesondere wurde gezeigt, dass qualitativ hochwertige DNA mit geringer Fragmentation erhalten werden kann.
Die Erfindung ist auf vorteilhafte Weise der Automation zugänglich, insbesondere wenn Partikel und namentlich magnetische Partikel als Träger verwendet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Nukleinsäureisolationsverfahren unter Verwendung eines automatisierten Systems zur Handhabung des festen Trägers während der Schritte der Zelllysis, Nukleinsäurebindung und optional der Waschung durchgeführt. Somit können die isolierten an den Träger gebundenen Zellen in ein solches Gerät transferiert werden, gewünschtenfalls gewaschen und lysiert werden; die Nukleinsäure kann an den Träger binden, und die gebundene Nukleinsäure kann unter Verwendung eines solchen Geräts ohne weiteres gewaschen werden. Weiterhin kann ein solches Gerät auch verwendet werden, um den Träger während des Zellisolationsschrittes zu handhaben. Insbesondere zu erwähnen ist hierbei der Bead Retriever^TM, erhältlich von Dynal ASA, Norwegen. Das Gerät hat ein System zum einfachen und effizienten Transfer des Trägers (der Zellen oder Nukleinsäure trägt) von einem Napf zum anderen. Solch ein Gerät ist besonders wirksam bei der Handhabung der qualitativ hochwertigen viskosen DNA, die sich aus dem erfindungsgemäßen Verfahren ergibt.
Wie oben beschrieben, ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders nützlich als präliminärer erster Schritt bei der Präparation von Nukleinsäuren zur Verwendung in nukleinsäurebasierten Detektionsverfahren, z.B. beim Genotyping.
Wie oben beschrieben, braucht vorteilhafterweise die gebundene Nukleinsäure nicht vor Durchführung des Detektionsschrittes von dem Träger eluiert oder entfernt zu werden, obwohl dies durchgeführt werden kann, wenn es gewünscht wird. Ob die Nukleinsäure eluiert wird oder nicht, kann auch von dem individuellen Verfahren abhängen, das in dem Nukleinsäure-Bindungsschritt verwendet wurde. So binden bestimmte Nukleinsäurebindungsverfahren die Nukleinsäure fester als andere. Zum Beispiel wird im Fall der DNA-Bindung unter Verwendung von Detergentien (z.B. durch DNA Direct) die Nukleinsäure von dem festen Träger eluiert, wenn ein Elutionspuffer oder ein anderes geeignetes Medium eingeführt wird. Durch ein Präzipitationsmittel wie Alkohol oder ein Chaotrop gebundene Nukleinsäure verbleibt fester gebunden, wird möglicherweise durch Platzieren in einem Puffermedium nicht eluiert und kann Erhitzung zur Elution erfordern.
Somit kann die an den Träger gebundene Nukleinsäure in einem nukleinsäurebasierten Detektionsverfahren direkt verwendet werden, insbesondere wenn der Träger feinkörnig ist, einfach indem man den Träger in einem für den Detektionsschritt geeigneten Medium resuspendiert oder den Träger diesem Medium zusetzt. Die Nukleinsäure kann entweder in das Medium eluiert werden, oder, wie oben beschrieben, es ist nicht notwendig, dass sie eluiert wird.
Eine Reihe verschiedener Techniken zur Detektion von Nukleinsäuren sind bekannt und in der Literatur beschrieben, und jede von ihnen kann erfindungsgemäß verwendet werden. Zweckmäßigerweise können Nukleinsäuren durch optische Verfahren detektiert werden, z.B. durch Messung oder Bestimmung der optischen Dichte (OD). Alternativ kann die Nukleinsäure durch Hybridisierung mit einer Sonde detektiert werden, und sehr viele solcher Hybridisierungsprotokolle sind beschrieben worden (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Gewöhnlich umfasst die Detektion einen in situ-Hybridisierungsschritt und/oder einen in vitro-Amplifikationsschritt unter Verwendung irgendeines der in der Literatur hierzu beschriebenen Verfahren. So können, wie erwähnt, Techniken wie LAR, 3SR und das Q-beta-Replikase-System verwendet werden. Jedoch sind die PCR und ihre verschiedenen Modifikationen, z.B. die Verwendung von „Nested Primers", im allgemeinen das Verfahren der Wahl (siehe z.B. Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4: 41–47 für eine Übersicht der Nukleinsäureamplifikationstechnologien).
Andere Detektionsverfahren können auf einem Sequenzierungsansatz beruhen, z.B. dem Minisequenzierungsansatz wie von Syvänen und Söderlund, 1990, Genomics, 8: 684–692, beschrieben.
Bei Amplifikationstechniken wie der PCR kann die im ersten Schritt zum Schmelzen des DNA-Doppelstrangs erforderliche Erwärmung die gebundene DNA von dem Träger freisetzen. Somit kann im Fall eines nachfolgenden Detektionsschrittes wie z.B. der PCR die an den Träger gebundene Nukleinsäure dem Reaktionsgemisch direkt zugesetzt werden, und die Nukleinsäure wird im ersten Schritt des Detektionsprozesses eluiert. Es kann die gesamte erfindungsgemäß erhaltene isolierte an den Träger gebundene Nukleinsäureprobe oder ein Teil davon in dem Detektionsschritt verwendet werden.
Die Ergebnisse des PCR- oder anderen Detektionsschritts können auf viele Weisen detektiert oder visualisiert werden, die im Stand der Technik beschrieben sind. Zum Beispiel können die Produkte der PCR oder anderen Amplifikation auf einem elektrophoretischen Gel aufgetrennt werden, z.B. einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel, unter Verwendung bekannter Techniken. Alternativ kann das DIANA-System verwendet werden, das eine Modifikation der „nested primer"-Technik ist. Bei dem DIANA (Detection of Immobilised Amplified Nucleic Acids, Detektion immobilisierter amplifizierter Nukleinsäuren)-System (siehe Wahlberg et al., Mol. Cell Probes 4: 285(1990)), trägt das innere, zweite Primerpaar jeweils Mittel zur Immobilisierung, um ein Einfangen der amplifizierten DNA zu ermöglichen, und eine Markierung oder ein Mittel zum Anhängen einer Markierung, um eine Erkennung zu ermöglichen. Dies bringt den doppelten Vorteil eines verringerten Hintergrundsignals und eines schnellen und einfachen Mittels zur Detektion der amplifizierten DNA.
Die amplifizierte Nukleinsäure kann auch detektiert, oder das Resultat bestätigt, werden, indem man unter Verwendung einer der vielen verschiedenen Sequenzierungstechnologien, die jetzt verfügbar sind, z.B. Standardsequenzierung, Festphasensequenzierung, zyklischer Sequenzierung, automatischer Sequenzierung und Minisequenzierung, sequenziert.
Vorteilhafterweise wurde gefunden, dass isolierte Zellen in einem erfindungsgemäßen „Zell-Bindungs"-Puffer, z.B. einem Salz/Alkohol-Puffer, mindestens eine Woche lang bei Raumtemperatur ohne detektierbarem Verlust an Sensitivität in einem nachfolgenden Nukleinsäuredetektionsschritt gehalten werden können. Eine solche Stabilität ist in Feldsituationen ein Vorteil.
Somit können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um Nukleinsäure für jeden passenden nachfolgenden Gebrauch zu isolieren. Beispiele solcher Verwendungen sind oben kurz beschrieben. Vorteilhafterweise könnten die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um Nukleinsäure vor Ort aus Proben zu präparieren und zu isolieren, z.B. am oder nahe dem Krankenbett oder im Behandlungszimmer eines Arztes, wo die isolierten oder erhaltenen Nukleinsäuren dann optional ebenfalls vor Ort in nachfolgenden Tests verwendet werden könnten, z.B. zu Ja/Nein-Gentests in z.B. einem Dot-Hybridisierungsassay verwendet werden könnten.
Die verschiedenen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren erforderlichen Reagenzien und Komponenten können zweckmäßigerweise in Form eines Kits geliefert werden. Solche Kits stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
In der einfachsten Form stellt dieser Aspekt der Erfindung ein Kit zur Isolation von Nukleinsäure aus einer Probe bereit, umfassend:

(a) einen festen Träger;
(b) ein Mittel zur Bindung von Leukozyten an den festen Träger;
(c) ein Mittel zur Lysis der Zellen; und
(d) ein Mittel zur Bindung von aus den lysierten Zellen freigesetzter Nukleinsäure an denselben festen Träger. Zu weiteren optionalen Komponenten des Kits gehören
(e) ein zweiter fester Träger, der mit der festen Trägerkomponente (a) identisch oder davon verschieden sein kann, und
(f) eine Proteinase wie z.B. Proteinase K.

Im Hinblick auf die erfindungsgemäßen Kits, die einen zweiten festen Träger enthalten, sollte festgehalten werden, dass solche Kits ebenso gut verwendet werden können, um Nukleinsäure aus einer beliebigen Zellprobe zu isolieren, und nicht darauf beschränkt sind, Nukleinsäure aus einer Leukozyten enthaltenden Probe, z.B. einer Blutprobe, zu isolieren. In solchen Kits ist die Komponente (b) durch ein geeignetes Mittel zur Bindung der besonderen Zellen, aus denen die Nukleinsäure isoliert werden soll, an einen festen Träger ersetzt.
Die verschiedenen Mittel (b), (c), (d), (e) und (f) können im Hinblick auf die erfindungsgemäßen Verfahren wie oben beschrieben und diskutiert sein.
Eine weitere optionale Komponente ist (g), ein Mittel zur Detektion der Nukleinsäure. Wie oben diskutiert, können solche Mittel geeignete Sonden- oder Primer-Oligonukleotidsequenzen zur Verwendung bei hybridisierungs- und/oder amplifikationsbasierten Detektionstechniken umfassen.
Optional können in einem solchen Kit weiterhin Puffer, Salze, Polymere, Enzyme usw. enthalten sein.
Die Erfindung wird jetzt in den folgenden nicht beschränkenden Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen detaillierter beschrieben, wobei:
1 ein Diagramm ist, das die DNA-Ausbeute (μg) zeigt, die aus einer 100 μl Buffycoat-Probe wie in Beispiel 2, Isolationen I, II und III beschrieben, isoliert wurde;
2 ein Diagramm ist, das die DNA-Ausbeute (μg) zeigt, die aus einer 100 μl Buffycoat-Probe wie im Beispiel 2, Isolationen I, II und III beschrieben, isoliert wurde;
3 ein Diagramm ist, das den prozentualen Anteil der DNA zeigt, die wie in Beispiel 4 beschrieben unter Verwendung von verschiedenen Antikörper-Bead-Präparationen (CD45/CD15-Beads: KB 458-18; KB 458-16; und KB 458-10; und getrennte CD45- und CD15-Beads) aus einer 1 ml-Blutprobe isoliert wurde; und
4 ein Diagramm ist, das die Ausbeute der DNA (μg) zeigt, die wie in Beispiel 6 beschrieben aus 200 μl Blut isoliert wurde. Der Wert eines Verhältnisses, der einen Maßstab der Reinheit der DNA ergibt, wie in Beispiel 6 beschrieben, ist ebenfalls dargestellt (ausgefüllte Raute ♦).
Beispiel 1
Allgemeines Protokoll zur Isolation von DNA aus Leukozyten
Wir haben ein Verfahren zur Isolation und Reinigung von DNA aus spezifisch isolierten Zellen, nämlich Leukozyten, aus dem Blut entwickelt. Das Verfahren basiert auf der Verwendung von Antikörpern oder anderen Affinitätsmolekülen, mit denen ein fester Träger beschichtet ist, wie z.B. magnetische Beads zur spezifischen Zellisolation. Die nachfolgende Lysis dieser Zellen in einem geeigneten Medium, z.B. einem Puffer mit Salz oder Chaotrop, der ein Detergens enthält, setzt die DNA frei, und die DNA wird an die Beads adsorbiert. RNA und andere Verunreinigungen verbleiben im Überstand, und durch Abtrennung des Trägers, z.B. auf magnetische Weise, wird der DNA/Träger-Komplex gewaschen, um diese Rückstände von Verunreinigungen zu entfernen. Die DNA wird dann in einem geeigneten Puffer resuspendiert und ist zur Verwendung in nachfolgenden Anwendungen bereit.
Leukozytenisolation
Jeweils 375 μg von magnetischen M450 CD45 und von M450 CD15 Dynabeads^TM (von Dynal ASA erhältlich), mit Anti-CD45- oder Anti-CD15-Antikörper bereitgestellt, (in PBS, pH 7,4, mit 0,1% BSA und 0,02% NaN₃ resuspendiert) in einem Verhältnis von 1:1 werden gewaschen und in DPBS (Dulbecco's PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ verwendet), pH 7,4 mit 0,1% BSA und 0,6% Natriumcitrat resuspendiert. Die Beads werden dann dem Blut oder Buffycoat zugesetzt und 20–45 Minuten lang bei 4–20°C inkubiert. Die Zellen werden magnetisch isoliert und in DPBS, pH 7,4, mit 0,1% BSA und 0,6% Natriumcitrat gewaschen oder direkt dem Lysis/Bindungspuffer (siehe Zelllysis) ohne Waschen zugesetzt.
Zelllysis
Die Beads mit den angehefteten isolierten Zellen werden dem Lysis/Bindungspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM LiCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, 1% LiDS und 5 mM DTT (Dithiothreitol)) zugesetzt und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Waschung und Elution
Der DNA/Bead-Komplex wird auf magnetische Weise isoliert und in 40 mM NaCl gewaschen. Die DNA wird durch heftiges Pipettieren und nachfolgende fünfminütige Inkubation bei 65°C in 10 mM Tris-HCl pH 7,4 eluiert. Die Beads werden auf magnetische Weise von der eluierten DNA entfernt.
Beispiel 2
Automatisierte Isolation genomischer DNA aus Buffycoat
Bei diesem Verfahren sind sowohl der Zellisolationsschritt als auch der DNA-Isolationsschritt automatisiert.
Die DNA-Isolation aus 100 μl Buffycoat, mit DPBS, pH 7,4, mit 0,1% BSA und 0,6% Natriumcitrat, verdünnt auf 1 ml, wurde unter Verwendung von 375 μg M450 CD45 und 375 μg M450 CD15 durchgeführt.
Sowohl die Isolation der Zellen als auch der DNA wurde unter Verwendung des Dynal BeadRetriver^TM-Geräts durchgeführt. Die isolierten Zellen wurden in Lysis/Bindungspuffer transferiert, und der DNA-Bead-Komplex wurde vor der teilweisen Eluation in 10 mM Tris-HCl pH 7,4 zweimal mit 40 mM NaCl gewaschen. Um die DNA komplett zu eluieren, wurden heftiges Pipettieren und Elution bei 65°C manuell durchgeführt. Die DNA-Ausbeute wurde durch Messung der OD₂₆₀ und OD₂₈₀ und durch Verwendung der Warburg-Christian-Formel ([Nukleinsäure, μg/ml] = 62,9 OD₂₆₀– 36,0 OD₂₈₀) bestimmt. Die Reinheit der isolierten DNA wurde anhand des OD₂₆₀/OD₂₈₀-Verhältnisses bestimmt, wobei ein Verhältnis zwischen 1,7 und 2,0 als reine DNA-Präparation gilt. Die Resultate sind in Tabelle 3 unten und auch in 1 gezeigt.
Tabelle 1
Beispiel 3
Halbautomatische Isolation genomischer DNA aus Buffycoat
Bei diesem Verfahren werden die Zellen manuell isoliert, und die DNA-Isolation ist automatisiert.
Die DNA-Isolation aus 100 μl Buffycoat, mit DPBS, pH 7,5, mit 0,1% BSA und 0,6% Natriumcitrat, auf 300 μl verdünnt, wurde unter Verwendung von 375 μg M450 CD45 und 375 μg M450 CD15 durchgeführt. Die Isolation der Zellen erfolgte manuell, und die DNA-Isolation erfolgte unter Verwendung des Dynal BeadRetriever^TM. Die manuell isolierten Zellen wurden vor dem Zusatz des Lysis/Bindungspuffers dreimal gewaschen. Der DNA-Bead-Komplex wurde vor der teilweisen Elution dreimal in 10 mM Tris-HCl pH 7,4 gewaschen. Um die DNA komplett zu eluieren, wurden heftiges Pipettieren und Elution bei 65°C manuell durchgeführt. Die DNA-Ausbeute wurde durch Messung der OD₂₆₀ und OD₂₈₀ und durch Verwendung der Warburg-Christian-Formel ([Nukleinsäure, μg/ml] = 62,9 OD₂₆₀ – 36,0 OD₂₈₀) bestimmt. Die Reinheit der isolierten DNA wurde anhand des OD₂₆₀/OD₂₈₀-Verhältnisses bestimmt, wobei ein Verhältnis zwischen 1,7 und 2,0 als reine DNA-Präparation gilt. Die Resultate sind in Tabelle 4 unten und auch in 2 gezeigt.
Tabelle 4
Beispiel 4
DNA-Isolation aus Blut unter Verwendung von Beads mit sowohl CD45 als auch CD15 im Vergleich zu Beads mit CD45 und CD15 auf zwei getrennten Beads
Unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen allgemeinen Verfahrens wurden Zellen aus 1 ml Vollblutprobe (ungefähr 2 × 10⁷ Leukozyten enthaltend) isoliert. Sowohl Anti-CD45 als auch Anti-CD15 tragende Beads (KB 458-18; KB 458-16 und KB 458-10; diese Bezeichnungen stehen für verschiedene Bead-Präparationen) wurden mit einem Verfahren, das eine Kombination von getrennten CD45- und CD15-Beads verwendete (wie in den vorigen Beispielen), verglichen. In jedem Fall wurden 375 μg Beads verwendet.
Die Anzahl der Leukozyten in 1 ml Blut wurde durch Durchflusszytometrie auf 2.600.000 bestimmt. Die Blutproben wurden von 9,6 ml auf 12,5 ml verdünnt, also eine 1,3-fache Verdünnung, was 2.000.000 Leukozyten ergab. Die Annahme von 5 pg DNA pro Zelle ergibt eine Schätzung von 12 μg DNA in 1 ml Blut.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 und in 3 dargestellt.
Beispiel 5
Allgemeines Protokoll zur Isolation von DNA aus Leukozyten unter Verwendung des Dynal BeadRetriever^TM
Materialien:

Blut M450 CD45 und M450 CD15 oder M450 CD45/15 DPS/BSA (0,1% BSA og 0,6% Natriumcitrat) (50 ml DPBS + 250 μl 20% BSA + 30 mg Natriumcitrat)
Lysis/Bindungspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8, 0,5 mM DTT, 1% SDS)
Waschpuffer (40 mM NaCl)
10 mM Tris-HCl pH 7,4
DPBS = Dulbecco's PBS, ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ verwendet
DTT = Dithiothreitol

Verfahren:
Isolation und Waschung von Leukozyten:

1. Verwende 1 × 10⁷ Beads pro 1 ml Blut. Die Beads sind entweder 1:1 M450-CD45 und -CD15 oder M450-CD45/15.
2. Entferne den Überstand und wasche die Beads mit dem DPBS/BSA-Puffer.
3. Fülle die Beads in 2-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss.
4. Füge 1 ml Blut hinzu. Mische vor dem Pipettieren vorsichtig, aber gründlich.
5. Inkubiere 20 Minuten lang bei 2–8°C auf einem Roller.
6. Stelle in das Gefäß-Rack für den BeadRetriever: Gefäß 1 – leer (um 1 ml Blut mit isolierten Zellen hinzuzufügen) Gefäß 2, 3, 4 und 5 – 1 ml DBPS/BSA
7. Nach der Isolation der Zellen: Füge das Blut mit den isolierten Zellen dem ersten Gefäß des BeadRetriever-Gefäß-Racks hinzu.
8. Stelle die Gefäße und Spitzen in den BeadRetriever und starte das Programm: Gefäß 1 – isolierte Zellen auffangen Gefäße 2, 3 und 4 – 1 Minute waschen Gefäß 5 – 1 Minute waschen, Zellen auf Spitzen auffangen und in Position 0 bringen. Lysis, DNA-Bindung und Waschung im BeadRetriever:
9. Stelle in ein neues Gefäß-Rack für den BeadRetriever: Gefäß 1–500 μl Lysis/Bindungspuffer Gefäße 2, 3 und 4 – 1 ml Waschpuffer Gefäß 5–200 μl 10 mM Tris-HCl pH 7,4
10. Lasse die Spitzen in der Maschine, aber ersetze die Gefäße von der Zellwaschung durch die neuen Gefäße für die DNA-Bindung und Waschung.
11. Starte das Programm: Gefäß 1 – 5 Minuten Lysis Gefäße 2, 3 und 4 – 1 Minute Waschung Gefäß 5 – heftiges Schütteln zur Freisetzung des Bead-Komplexes Elution und Bestimmung der DNA-Reinheit und -Ausbeute
12. Die DNA wird während des Schüttelns im BeadRetriever nicht freigesetzt und muss manuell gehandhabt werden. Übertrage alles in Gefäß 5 in ein Eppendorf-Gefäß und pipettiere mehrfach auf und nieder, bis die Beads in Lösung sind.
13. Eluiere die DNA 5 Minuten lang bei 65°C. Übertrage den Überstand in ein neues Gefäß.
14. Bestimme die OD₂₆₀, OD₂₈₀ und OD₃₂₀. Berechne das Verhältnis: (OD₂₈₀ und OD₃₂₀)/(OD₂₈₀ und OD₃₂₀)
15. Berechne die isolierte DNA-Menge: μg DNA = [62,9·(OD260 und OD320) – 36,0·(OD280 und OD320)]·ml Elutionsvolumen
16. Trage 5 μl der Probe auf ein Agarosegel auf, um die Größe einer DNA-Menge zu visualisieren.

Beispiel 6
DNA-Isolation aus Leukozyten unter Verwendung sowohl eines ersten als auch eines zweiten festen Trägers
Material

– Blut
– M450 CD45 (4 × 10⁸ Beads/ml und 30 mg/ml)
– M450 CD15 (4 × 10⁸ Beads/ml und 30 mg/ml)
– DPBS mit 0,1% BSA
– Lysis/Bindungspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, 0,5 mM DTT, 1% LiDS) mit 1,5 mg/ml M270-COOH
– 20 mg/ml Proteinase K
– Waschpuffer (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM LiCl)
– Resuspensionspuffer (Tris-HCl pH 8,0, 0,01% Tween-20)

Verfahren
Isolation und Waschung der Leukozyten:

1. Verwende 6 × 10⁶ Beads (450 μg) pro 200 μl Blut bei einem Verhältnis von 2:1 von M450-CD45 und -CD15. Entferne den Überstand und wasche die Beads mit DPBS/BSA-Puffer.
2. Füge die gewaschenen Beads zu 200 μl Blut, mit 200 μl DPBS/BSA-Puffer verdünnt, zu. Mische durch Pipettieren vorsichtig, aber gründlich.
3. Inkubiere 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit konstanter Bewegung.
4. Wasche die isolierten Zellen dreimal in DPBS/BSA-Puffer. Wechsle das Gefäß bei der ersten Waschung. Entferne den Überstand.

Lysis der Leukozyten und DNA-Isolation

5. Setze den isolierten Zellen und Beads 0,5 ml Lysis/Bindungspuffer, enthaltend 1,5 mg/ml an zusätzlichen Beads und 20 μl an 20 mg/ml Proteinase K, zu. Mische nicht durch Pipettieren.
6. Inkubiere 5 Minuten lang unter konstanter Bewegung bei Zimmertemperatur.
7. Wasche dreimal durch durch Zusatz von Waschpuffer ohne weiteres Pipettieren.
8. Setze 200 μl Resuspensionspuffer zu und inkubiere 5 Minuten lang bei 80°C.
9. Zentrifugiere kurz, pipettiere einige Male und/oder stürze das Gefäß um. Übertrage den Überstand in ein neues Gefäß.

Bestimmung der DNA-Reinheit und Ausbeute:

10. Bestimme die OD₂₆₀, OD₂₈₀, OD₃₂₀. Bestimme das Verhältnis: (OD₂₆₀–OD₃₂₀)/(OD₂₈₀–OD₃₂₀).
11. Berechne die Menge an isolierter DNA: μg DNA = [50 × (OD260–OD320)] × ml Elutionsvolumen.

Die Ergebnisse aus fünf verschiedenen Blutproben, die dieses Protokoll durchliefen, sind in 4 dargestellt.

Claims

Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure aus einer Blutprobe, umfassend: (a) solektive Isolation von Leukozyten aus der Probe durch Bindung der Leukozyten an einen festen Träger mittels eines für Leukozyten spezifischen Bindungspartners; (b) Lysis der isolierten Leukozyten; und (c) Bindung der aus den lysierten Zellen freigesetzten Nukleinsäure an den festen Träger.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (a) die Leukozyten in der Probe an einen leukozytenspezifischen Bindungspartner gebunden werden, welcher Bindungspartner vor oder nach der Bindung an die Leukozyten an einen festen Träger angeheftet ist, wodurch der Träger an die Leukozyten gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleinsäure DNA, RNA oder eine beliebige, natürlich vorkommende Modifikation davon oder eine Kombination davon ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Bindungspartner in Schritt (a) spezifisch an in der Probe vorliegende Leukozyten, aber nicht an andere Zellen oder Bestandteile der Probe bindet.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Bindungspartner ein Antikörper oder ein Fragment oder Derivat eines Antikörpers ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei ein oder mehrere verschiedene Bindungspartner zur Isolation der Leukozyten verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei alle oder im Wesentlichen alle in der Probe vorliegenden Leukozyten abgetrennt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Bindungspartner eines oder mehrere der unter HLA-I, CD11a, CD18, CD45, CD46, CD50, CD82, CD100, CD162, CD5 und CD15 ausgewählten Moleküle erkennt oder spezifisch zu binden vermag.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei einer oder mehrere der Bindungspartner verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei eine Kombination von für CD45 und CD15 spezifischen Bindungspartnern verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der feste Träger des Schrittes (a) Partikel umfasst, vorzugsweise Polymerpartikel.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der feste Träger magnetisch ist, vorzugsweise superparamagnetisch.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Bindungspartner direkt oder indirekt an einen festen Träger des Schrittes (a) angeheftet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei mehr als ein verschiedener Typ von Bindungspartnern verwendet wird und die Bindungspartner an den gleichen festen Träger oder an verschiedene feste Träger angeheftet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Bindung der Nukleinsäure in Schritt (c) unter Verwendung eines detergenzbasierten Systems durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die isolierten Zellen des Schrittes (b) oder die Nukleinsäure des Schrittes (c) des Weiteren mit einer zusätzlichen Menge eines zweiten festen Trägers in Kontakt gebracht werden, vorzugsweise unter Bindung der Nukleinsäure an den zweiten festen Träger, der Nukleinsäure zu binden vermag.
Verfahren zur Isolation von Nukleinsäure aus einer Zellprobe, umfassend: (a) selektive Isolation von Zellen aus der Probe durch Bindung dieser Zellen an einen festen Träger mittels eines für diese Zellen spezifischen Bindungspartners; (b) Lysis der isolierten Zellen; (c) Bindung der aus den lysierten Zellen freigesetzten Nukleinsäure an den festen Träger; und (d) In-Kontakt-Bringen der isolierten Zellen des Schrittes (b) oder der Nukleinsäure des Schrittes (c) mit einer zusätzlichen Menge eines zweiten festen Trägers, vorzugsweise unter Bindung der Nukleinsäure an den zweiten festen Träger, der Nukleinsäure zu binden vermag.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Zellen Leukozyten sind.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Zellprobe eine Blutprobe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die in den Schritten (a), (b) und (c) verwendeten Bestandteile oder vorliegenden Merkmale wie in einem der vorangegangenen Ansprüche definiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die isolierten Zellen in Gegenwart des zweiten festen Trägers lysiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei der erste feste Träger wie in einem der Ansprüche 8 bis 10 definiert ist und der zweite feste Träger, der sich von dem ersten festen Träger unterscheidet, negativ geladen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die isolierte Nukleinsäure DNA ist und das Verfahren einen weiteren Schritt zur Isolation von RNA aus der Probe umfasst.
Kit zur Isolation von Nukleinsäure aus einer Probe, umfassend: (a) einen festen Träger; (b) Mittel zur Bindung von Leukozyten an den festen Träger; (c) Mittel zur Lyse der Zellen; und (d) Mittel zur Bindung von aus den lysierten Zellen freigesetzter Nukleinsäure an denselben festen Träger.
Kit nach Anspruch 24, weiterhin umfassend einen oder mehrere der Folgenden: (e) einen zweiten festen Träger; (f) eine Proteinase; und (g) Mittel zur Detektion von Nukleinsäure.
Kit zur Isolation von Nukleinsäure aus einer Zellprobe, umfassend: (a) einen festen Träger; (b) Mittel zur Bindung der besonderen Zellen, aus denen Nukleinsäure zu isolieren erwünscht ist, an den festen Träger; (c) Mittel zur Lyse der Zellen; (d) Mittel zur Bindung der aus den lysierten Zellen freigesetzten Nukleinsäure an denselben festen Träger; und (e) einen zweiten festen Träger.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das Verfahren unter Verwendung eines automatisierten Systems zur Handhabung des festen Trägers während der Zelllyse, der Bindung der Nukleinsäuren und optionaler Waschschritte durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das automatisierte System außerdem während des Zellisolationsschrittes den Träger handhabt.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Bead Retriever^TM-Gerät verwendet wird.