DE602004003163T2

DE602004003163T2 - Verfahren zur Bereitstellung von Proben zum Nachweis

Info

Publication number: DE602004003163T2
Application number: DE602004003163T
Authority: DE
Inventors: John J. Concord Quinn; Uri Sharon Piran; Laurie A. Ardsley Livshin; Claudine Z. Newtownville Yannoni
Original assignee: Bayer Healthcare LLC
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2003-03-20
Filing date: 2004-03-18
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2024-03-19
Also published as: EP1475387A2; US20040185449A1; JP2004286749A; EP1475387B1; DE602004003163D1; ES2274388T3; EP1475387A3

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe für die Verwendung in einem Assay. Genauer bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung eines Polyalkylenglycols und magnetischer Teilchen und eine Salzkonzentration von weniger oder gleich etwa 0,2 M zur Vorbereitung von Proben für die anschließende Verwendung in Assays wie Hybridisierungsassays und Immunoassays.
STAND DER TECHNIK
Magnetische Teilchen, die an spezifische Bindemoleküle gekoppelt sind, wurden zur Abtrennung von kleinen Molekülen, Makromolekülen, Viren, Bakterien und Zellen aus Flüssigkeiten durch einen Vorgang der spezifischen Bindung verwendet. Magnetische Teilchen ohne immobilisierte spezifische Binder wurden auch zur Abtrennung von Nukleinsäuren und Viren durch einen Vorgang der unspezifischen Adsorption verwendet (Lyle J. Arnold, Jr. et al., EP 0 281 390 B1 , 1994; Bitton et al., "Removal of Escherichia coli bacteriophage T7 by Magnetic Filtration", Water Research 8:549 (1974); Warren, "New purification procedure for biological vaccines", Immunization Jap. Encephalitis conf, Hammon (Hrsg.), Williams & Wilkins, Baltimore MD, S. 152-154 (1972)). Magnetische Teilchen haben den Vorteil des Absetzens unter Schwerkraft, wobei der Einsatz eines magnetischen Feldes dazu dient, den ohnehin schnellen Vorgang zu beschleunigen. Daher kann eine Abtrennung innerhalb 1-2 Minuten stattfinden, anstelle der üblichen stundenlangen Zentrifugationsmaßnahme. Leider ist unspezifische Adsorption aufgrund von Kompetition an den unspezifischen Bindungsstellen durch unerwünschte Makromoleküle und kleine Moleküle zu schwach und unzuverlässig, wenn sie bei biologischen Proben verwendet wird.
Polyalkylenglycole wie Polyethylenglycol (PEG) wurden extensiv zur Abtrennung von Proteinen und Viren aus biologischen Proben verwendet (Fried et al., Enzymology 22:238 (1971)). PEG fällt Proteine durch Binden von Wasser und Ausschließen von Wasser, das Proteine in Lösung hält. Die Art des gefällten Proteins wird durch die PEG-Konzentration bestimmt. Bei niedrigen Konzentrationen, wie 4% w/v in Kombination mit ein oder zwei molarem Salz, werden Viren und Bakteriophagen gefällt. Dies ist ein normales Verfahren zur Abtrennung und Konzentrierung dieser Mikroorganismen. Dieser Vorgang erfordert üblicherweise eine Inkubation bei 4°C und anschließende Zentrifugation zum Abscheiden des Niederschlags (Yamamoto et al., Virology 40:734 (1971)). WO 2002/055727 lehrt die Aufreinigung von Nukleinsäuren aus einer Probe unter Verwendung von PEG als einziges Reagens.
Die Kombination von magnetischen Teilchen und PEG ist nicht üblich, obwohl sie für die verbesserte Abtrennung von Proteinen vorgeschlagen wurde (Munro et al., Biotechnology Letters 3:297 (1981)). Die Kombination wird auch in US-Patent Nr. 5,681,946 nach Reeve für die unspezifische Bindung von Bakteriophagen und Viren beschrieben, und üblicherweise wird eine hohe Salzkonzentration (z. B. 2,5 M Natriumchlorid) verwendet. Die Kombination wird auch im US-Patent Nr. 5,665,554 nach Reeve et al., als ein Nukleinsäuren fällendes Reagens (z. B. Polyethylenglycol in wäßrigem Natriumchlorid) für die Wiedergewinnung von Material wie Plasmid-DNA aus einer Lösung, die genomische DNA und Zelltrümmer enthält, beschrieben. Es scheint, daß gefällte Bakteriophagen, Viren und Plasmid-DNA leicht mit einem unspezifischen Mechanismus an magnetische Partikel adsorbieren, wodurch der schnelleren und praktischeren magnetischen Abtrennung ermöglicht wird, normale Zentrifugationstechniken zu ersetzen. Die oben erwähnten Abtrennungen wurden für präparative aber nicht für analytische Zwecke durchgeführt.
Trotz der Fortschritte in der Technik besteht weiterhin ein Bedarf an verbesserten analytischen Verfahren. Insbesondere besteht ein Bedarf, schnellere und genauere Untersuchungs- und Analyseverfahren zur Verfügung zu stellen. Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit diesem Bedarf, indem sie ein Verfahren zur Vorbereitung von Proben zur Verwendung in Assays zur Verfügung stellt. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung spezifischer Reagentienkombinationen aus einem Polyalkylenglycol und magnetischen Teilchen, die besonders bei analytischen Anwendungen wie der Vorbereitung von Proben zur Untersuchung in Immunoassays und Hybridisierungsassays verwendbar sind. Im Gegensatz zu den Polyalkylenglycollösungen, die in bisherigen Nukleinsäure- und Proteinabtrennungen verwendet wurden, verwendet die vorliegende Erfindung einen Puffer mit geringer Ionenstärke. Überraschenderweise stellte sich heraus, daß sowohl die Minimierung als auch die Vermeidung des Salzes zu besseren Untersuchungsergebnissen führte, z. B. haftete der Niederschlag bei hohen Salzkonzentrationen nicht an den magnetischen Teilchen an. Zusätzlich stellt die verminderte Salzkonzentration eine universale Probe bereit, die in einer Vielzahl von Assays verwendet werden kann.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Ein Gesichtspunkt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe für die Verwendung in einem Assay, welches folgendes umfaßt: (a) Zugeben eines Polyalkylenglycols und magnetischer Teilchen zu einer Probe unter Bildung einer Mischung, wobei die magnetischen Teilchen in der Lage sind, unspezifisch an Protein enthaltende Materialien, die in der Mischung enthalten sind, zu binden, und wobei die Mischung eine Salzkonzentration von weniger als oder gleich etwa 0,2 M aufweist, (b) Fällen der Protein enthaltenden Materialien aus der Mischung, wenn die Protein enthaltenden Materialien unspezifisch an die magnetischen Teilchen gebunden werden, unter Bildung eines Niederschlags und eines Überstands, (c) Ver werten des Überstands und (d) Isolieren des Niederschlags unter Erzeugung einer vorbereiteten Probe.
Ein Gesichtspunkt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Vorbereitung einer Blutprobe zur Verwendung in einem Assay, welches folgendes umfaßt: (a) Zugeben eines Polyalkylenglycols und magnetischer Teilchen zu einer Blutprobe unter Bildung einer Mischung, wobei die magnetischen Teilchen in der Lage sind, unspezifisch an Zellen, die in der Mischung enthalten sind, zu binden, und wobei die Mischung eine Salzkonzentration von weniger als oder gleich etwa 0,2 M hat, (b) Fällen der Zellen aus der Mischung, wenn die Zellen unspezifisch an die magnetischen Teilchen gebunden werden, unter Bildung eines Niederschlags und eines Überstands, (c) Verwerten des Überstands und (d) Isolieren des Niederschlags unter Erzeugung einer vorbereiteten Blutprobe.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Kit, welches bei der Vorbereitung von Proben für die Verwendung in einem Assay verwendbar ist, welches folgendes umfaßt: (a) ein Polyalkylenglycol, (b) magnetische Teilchen, die in der Lage sind, unspezifisch an Protein enthaltende Materialien zu binden, die in den Proben enthalten sind, (c) Salz, das eine Konzentration von weniger als oder gleich etwa 0,2 M hat und (d) Anweisungen zur Vorbereitung der Proben.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren und Kits, die bei der Vorbereitung von Proben zur Verwendung in einer Vielzahl von Assays verwendbar sind. Die Zugabe eines Polyalkylenglycols und magnetischer Teilchen zu einer Blutprobe unter Bedingungen geringer Salzkonzentration (eine Salzkonzentration von weniger als oder gleich etwa 0,2 M) sieht eine unspezifische Bindung von Zellen, die in der Probenlösung enthalten sind, und anschließende Fällung der gebundenen Zellen vor. Der Überstand wird verworfen und der Niederschlag isoliert und entweder sofort in einem Assay verwendet oder zur anschließenden Verwendung unter geeigneten Lagerbedingungen gelagert.
Einer der Vorteile dieses Vorbereitungsverfahrens ist, daß es ein schnelles Mittel zur Vorbereitung von Proben bereitstellt. Unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren können Proben in wenigen Minuten vorbereitet werden, im Vergleich zu gewöhnlichen Zentrifugationstechniken, die bis zu einer Stunde oder mehr erfordern können, und eliminieren den Bedarf an kostspieligen Zentrifugationsgeräten. Ein weiterer Vorteil ist, daß magnetische Abtrenntechniken einfacher automatisierbar sind.
Vor der ausführlichen Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung ist es nützlich, Definitionen darzulegen, die bei der Beschreibung der Erfindung verwendet werden. Die dargelegten Definitionen beziehen sich nur auf die Begriffe, wie sie in diesem Patent verwendet werden, und können nicht auf die gleichen Begriffe, wie an anderer Stelle verwendet, angewen det werden, zum Beispiel in der wissenschaftlichen Literatur oder anderen Patenten oder Anwendungen einschließlich anderer Anwendungen dieser Erfinder oder gemeinsamen Eigentümern zugeschrieben. Die folgende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind erläuternd und veranschaulichend zur Verfügung gestellt. Als solches sind sie nicht als Beschränkung des Umfangs der Erfindung, wie er durch die Ansprüche definiert wird, zu erachten. Wenn Beispiele angegeben sind, sind diese überdies nur beispielhaft und nicht einschränkend beabsichtigt. Zum Beispiel, wenn angegeben ist, daß ein Beispiel ein bestimmtes Merkmal "umfaßt", ist beabsichtigt, einzubeziehen, daß es dieses Merkmal haben kann, aber nicht daß solche Beispiele auf solche, die das Merkmal umfassen, beschränkt sind.
Es muß beachtet werden, daß die Einzahlformen "ein", "eine" und "der", "die", "das", wie sie in dieser Beschreibung und den angehängten Ansprüchen verwendet werden, Mehrzahlreferenzen umfassen, es sei denn, der Zusammenhang schreibt klar etwas anderes vor. Daher umfaßt zum Beispiel der Bezug auf "ein Material" eine Mischung aus zwei oder mehreren solcher Materialien, ein Bezug auf "ein Detergens" umfaßt Mischungen aus zwei oder mehrerer solcher Detergenzien, und ähnliches.
Beim Beschreiben und Beanspruchen der vorliegenden Erfindung wird die folgende Terminologie gemäß der unten angegebenen Definitionen verwendet.
"Assay" wird hier mit der Bedeutung eines in vitro Tests verwendet, der an biologischen Proben (üblicherweise Blut) durchgeführt wird, zur Messung des Vorhandenseins (qualitativ) oder der Konzentration (quantitativ) eines gegebenen Analyten (interessierendes Material) in vitro.
"Zelle" wird hierin mit der Bedeutung von Zellen verwendet, die üblicherweise in Blut gefunden werden, sowie solche, die in mit einem viralen oder bakteriellen Organismus infizierten Patienten gefunden werden. Diese umfassen veranschaulichend und nicht beschränkend Erythrozyten (rote Blutzellen), Leukozyten (weiße Blutzellen), einschließlich polymorphkerniger Leukozyten (Neutrophile, Eosinophile und Basophile) und einkernige Leukozyten (Monozyten und Lymphozyten), Thrombozyten (Plättchen), Immunzellen oder auf eine Linie festgelegte Zellen, Krebszellen, virale und retrovirale Zellen, Bakteriophagen und andere Bakterienzellen, andere pathogene Zellen usw.
"Hybridisierungsassay" wird hierin verwendet mit der Bedeutung eines Assays, der eine Hybridisierungsreaktion zur Messung des Vorhandenseins oder Konzentration eines gegebenen Polynukleotidanalyten verwendet. Beispielhafte Polynukleotidanalyten umfassen Nukleinsäuren, Gene, Chromosomen, Plasmide, Genome von Bakterien, Hefen, Viren, Viroiden, Schimmelpilzen, Pilzen, Pflanzen, Tieren, Menschen und Teile davon usw. Der Begriff "Nukleinsäure" umfaßt DNA (einschließlich einsträngiger ssDNA, doppelsträngiger dsDNA und verzweigter bDNA), RNA (einschließlich t-RNA, m-RNA, r-RNA), mitochondriale DNA und RNA, Chloroplasten-DNA und RNA, DNA-RNA-Hybride und Mischungen daraus. Ein Hybridisierung sassay umfaßt veranschaulichend und nicht beschränkend bDNA-Assays, Polymerase-Kettenreaktion, reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion, Sandwich-Hybridisierungsassays, Nukleinsäuresequenz-Basenvermehrung, RNAse-Schutzassays, Sequenzieren, Ligationsassays, Primer-Verlängerung usw.
"Immunoassay" ist hierin verwendet mit der Bedeutung eines Assays, der eine immunologische Reaktion zur Messung des Vorhandenseins oder Konzentration eines gegebenen Analyten (z. B. ein Antigen) verwendet. Immunoassays umfassen veranschaulichend und nicht beschränkend Festphasen-ELISA-Immunoassays, Verdrängungsimmunoassays, Sandwich-Assays, Radioimmunoassays, Fluoreszenzimmunoassays usw.
"Unspezifische Bindung" wird hierin verwendet in Bezug auf die nicht-kovalente Bindung von magnetischen Teilchen an Zellen, die in einer Probenlösung enthalten sind.
"Protein enthaltendes Material" wird hierin verwendet in Bezug auf Zellen, Immunglobuline, Proteine, Enzyme usw.
"Probe" wird hierin verwendet in Bezug auf eine biologische Probe, die durch ein Assayverfahren analysiert werden soll, und daher für die Verwendung in den Verfahren der Erfindung geeignet ist. Die Probe wird üblicherweise von einem Individuum erhalten, und daher kann das Testmaterial eine feste Gewebeprobe (z. B. eine Probe eines Gewebes, das aus einer Biopsie erhalten wurde), eine flüssige Probe (z. B. eine Blut- oder Urinprobe) oder irgendein anderes Testmaterial von einem Patienten, das üblicherweise in der medizinischen Gemeinschaft verwendet wird, z. B. eine Zellkulturprobe oder Fäkalienprobe, sein. In einigen Ausführungsformen der Erfindung kann die flüssige Probe eine Körperflüssigkeit, wie Lymphflüssigkeit, Zelllysate, Milch, Plasma, Speichel, Sperma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Tränen, Vollblut, Blutfraktionen, Wundproben, die äußeren Abschnitte der Haut und die Absonderung des respiratorischen, intestinalen und urogenitalen Trakts, sein. Bevorzugt ist die Probe eine Gewebeprobe, eine Vollblutprobe, eine Probe weißer Blutzellen, eine Plasmaprobe, eine Serumprobe, eine Zellkulturprobe, eine Fäkalienprobe oder eine Urinprobe.
PROBENVORBEREITUNGSVERFAHREN
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Vorbereiten von Proben für die Verwendung in einem Assay, welches folgendes umfaßt:

(a) Zugeben eines Polyalkylenglycols und magnetischer Teilchen zu einer Probe unter Bildung einer Mischung, wobei die magnetischen Teilchen in der Lage sind, unspezifisch an Protein enthaltendes Material, welches in der Mischung enthalten ist, zu binden, und wobei die Mischung eine Salzkonzentration von weniger als oder gleich etwa 0,2 M hat,
(b) Fällen des Protein enthaltenden Materials aus der Mischung, wenn das Protein enthaltende Material unspezifisch an die magnetischen Teilchen gebunden wird, unter Bildung eines Niederschlags und eines Überstands,
(c) Verwerfen des Überstands und
(d) Isolieren des Niederschlags unter Erzeugung einer vorbereiteten Probe.

Zahlreiche Polyalkylenglycole können in den Verfahren nach der Erfindung verwendet werden und umfassen veranschaulichend und nicht einschränkend Polyethylenglycole, Polypropylenglycole und Polybutylenglycole sowie Kombinationen daraus. Bevorzugte Polyalkylenglycole sind Polyethylenglycol (PEG)-Polymere, welche Kondensationsprodukte von Ethylenglycol sind und die allgemeine Formel HO-(CH₂CH₂-O)_x-H aufweisen. PEG ist leicht von zahlreichen kommerziellen Quellen erhältlich und wird üblicherweise als eine Mischung von PEG-Polymeren unterschiedlichen molekularen Gewichts verkauft. PEG, das ein durchschnittliches molekulares Gewicht in dem Bereich von etwa 300 bis 30.000 aufweist, ist besonders gut geeignet für die Verwendung bei den Verfahren nach der Erfindung, genauer 2.000-15.000, mit einzelnen molekularen Gewichten von etwa 8.000, die besonders bevorzugt sind.
Es gibt zahlreiche magnetische Teilchen, die geeignet sind für die Verwendung bei den Verfahren und Kits nach der Erfindung, und umfassen paramagnetische Teilchen und magnetische Latexperlen.
Magnetische Teilchen oder magnetische Kügelchen sind handelsüblich von Quellen wie PerSeptive Biosystems, Inc. (Framingham, ME), Bayer Diagnostics (Medfield, MA), Bangs Laboratories (Carmel, IN) und BioQuest, Inc. (Atkinson NH) erhältlich. Beispielhafte Materialien umfassen Eisen, Eisenoxid, Eisennitrid, Eisencarbid, Nickel und Kobalt sowie Gemische und Legierungen davon.
Magnetische Latexkügelchen sind handelsüblich von Quellen wie Seradyne erhältlich. Die magnetischen Teilchen haben üblicherweise einen mittleren Durchmesser von etwa 0,1-100 μm im Durchmesser, bevorzugt etwa 1-50 μm, mehr bevorzugt etwa 1-5 μm. Die Form der magnetischen Teilchen wird üblicherweise kugelförmig sein, aber Teilchen mit anderem Aufbau, unregelmäßig, stabähnlich etc., können auch verwendet werden.
Obwohl die Salzkonzentration bevorzugt weniger als oder gleich etwa 0,2 M ist, kann es wünschenswert sein, Salzkonzentrationen von weniger als oder gleich etwa 0,125 M zu verwenden. Üblicherweise wird das Verfahren innerhalb akzeptabler Parameter funktionieren, wenn es eine Salzkonzentration in dem Bereich von etwa 0,01-0,10 M hat. Typische Salze umfassen veranschaulichend und nicht einschränkend NaCl, MgCl₂, LiCl, KCl usw.
Die Stufe der Fällung kann ausschließlich unter Schwerkraft durchgeführt werden, da die Komplexe aus Protein enthaltendem Material und magnetischen Teilchen sich absetzen. Es kann wünschenswert sein, die Geschwindigkeit dieses Vorgangs durch Anlegen eines magneti schen Feldes am Boden des Reaktionsgefäßes zu fördern. Daher kann der Niederschlag isoliert werden, indem den Komplexen der magnetischen Teilchen ein Absetzen unter Schwerkraft ermöglicht wird oder mit Anwendung eines magnetischen Feldes zu irgendeinem Zeitpunkt während des Absetzstadiums. Bei einer anderen Ausführungsform wird ein magnetisches Feld angelegt, während der Überstand verworfen wird, um die Menge des isolierten Niederschlags zu maximieren.
Die vorbereitete Probe kann dann sofort in einem Assay verwendet werden oder für die anschließende Verwendung unter geeigneten Lagerungsbedingungen gelagert werden.
Wenn die vorbereitet Probe für die anschließende Verwendung gelagert werden soll, wird keine weitere Bearbeitung benötigt. Nachdem der Überstand verworfen wurde und der Niederschlag zum Erhalt der vorbereiteten Probe isoliert wurde, wird die Probe eingefroren. Typische Lagerungsbedingungen sind bei Temperaturen im Bereich von +4 bis –80°C. Bevorzugte Lagerbedingungen sind bei einer Temperatur im Bereich von –20 bis –80°C für bis zu 6 Monate und länger.
Wenn die vorbereitete Probe sofort in einer Untersuchung verwendet werden soll, kann es wünschenswert sein, die Probe weiter zu verarbeiten, üblicherweise die Protein enthaltenden Materialien von den magnetischen Teilchen zu trennen. Dementsprechend umfaßt eine weitere Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung weiterhin folgendes:

(e) Lösen der vorbereiteten Probe in einer Lösung unter Erhalt einer Mischung von ungebundenes Protein enthaltenden Materialien und magnetischen Teilchen,
(f) Anlegen eines magnetischen Feldes an die Mischung zum Entfernen der magnetischen Teilchen,
(g) Sammeln der Protein enthaltenden Materialien unter Bildung einer isolierten vorbereiteten Probe.

Die Lösung, die in dieser Lösungsstufe verwendet wird, kann entweder eine normale Pufferlösung sein oder eine Lyselösung. Die Auswahl der Art der Lösung hängt davon ab, ob es wünschenswert ist, die Unversehrtheit irgendeines zellulären Materials in den Protein enthaltenden Materialien zu erhalten (z. B. zur Verwendung in einem Immunoassay), oder ob es wünschenswert ist, die Zellen unter Freisetzung von irgendeiner DNA oder RNA, die darin enthalten ist, zu zerstören (z. B. zur Verwendung in einem Hybridisierungsassay).
Das Verfahren kann auch die Zugabe eines Detergens umfassen, welches kationisch, anionisch, ionisch etc. sein kann. Kationische Detergenzien sind bevorzugt, und beispielhafte kationische Detergenzien umfassen veranschaulichend und nicht beschränkend quartäre Ammoniumsalze, wie Cetyltrimethylammoniumbromid und Octadecyltrimethylammoniumsalz. Das Detergens kann mit einer Konzentration im Bereich von etwa 1-10 mM vorliegen.
Da Viren dafür bekannt sind, sich mit zahlreichen Proteinen in Proben zu verbinden, erleichtert das Einbeziehen eines Detergens in die Fällungsstufe eine effizientere Freisetzung von Virus (und anschließenden Nukleinsäuren) von diesen gebundenen Proteinen, wobei diese in den bDNA-Hybridisierungsassays zugänglich gemacht werden. Das Einbeziehen eines Detergens ausschließlich bei dem bDNA-Assay führte nicht zu einem höheren Signals als die Kontrolle, was nahelegt, daß dieses Detergens nicht die Hybridisierungsreaktion beschleunigt (Pontius und Berg, 1991). Überdies wird in dem bDNA-Assayprotokoll eine 16-18stündige Hybridisierungsreaktion verwendet, wodurch jegliche mögliche Beschleunigung der Hybridisierung beseitigt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Probe eine Blutprobe, und das Verfahren zur Vorbereitung einer Blutprobe zur Verwendung in einem Assay umfaßt folgendes:

(a) Zugeben eines Polyalkylenglycols und magnetischer Teilchen zu einer Blutprobe unter Erhalt einer Mischung, wobei die magnetischen Partikel in der Lage sind, nicht spezifisch an Zellen zu binden, die in der Mischung enthalten sind, und wobei die Mischung eine Salzkonzentration von weniger als oder gleich etwa 0,2 M aufweist.,
(b) Fällen der Zellen aus der Mischung, wenn die Zellen unspezifisch an die magnetischen Teilchen gebunden werden, unter Erhalt eines Niederschlags und eines Überstands,
(c) Verwerfen des Überstands und
(d) Isolieren des Niederschlags unter Erzeugung einer vorbereiteten Blutprobe.

Die vorbereitete Blutprobe kann wie oben beschrieben gelagert oder weiter behandelt werden, zu unmittelbaren Verwendung in einem Assay.
IMMUNOASSAYS
Die Erfindung ist als Probenvorbereitungsverfahren für Immunoassays besonders verwendbar. In diesen Fällen ist der Analyt üblicherweise ein Protein. Jegliche in der Technik bekannten Immunoassays, die Proteine nachweisen können, können verwendet werden.
Im allgemeinen umfassen Immunoassays Techniken, die die spezifische Bindung zwischen einem Epitop an einem Molekül und dessen homologem Antikörper zur Identifizierung und vorzugsweise mengenmäßigen Bestimmung eines Stoffs in einer Probe nutzen. Daher nutzen die Immunoassays, die zur Messung von Markerproteinen verwendet werden, die spezifische Bindung zwischen dem Markerprotein und einem korrespondierenden Antikörper, der gegen das Markerprotein gerichtet ist. Ein Verfahren zum Nachweis von Markerproteinen umfaßt folgendes: Aufbringen der Probe auf einen Objektträger, Zugeben eines geeigneten markierten Antikörpers, Abwaschen von ungebundenem markiertem Antikörper und Prüfen der Probe mit einer geeigneten Vorrichtung, z. B. Mikroskop, auf die Anwesenheit von gebundenem Protein.
Eine andere Art von Immunoassay umfaßt trägergebundene Antikörper, die gegen ein bestimmtes Markerprotein gerichtet sind, die mit dem Testmaterial von einem Patienten zur Immobilisierung des bestimmten Markerproteins in Kontakt gebracht werden. Nachdem ungebundenes Protein weggewaschen wurde, wird ein zweiter markierter Antikörper, der gegen ein anderes Epitop an dem Markerprotein gerichtet ist, mit dem immobilisierten Protein in Kontakt gebracht. Der markierte Antikörper wird nachgewiesen und mengenmäßig bestimmt. Spezifische Immunoassays sind dem Fachmann gut bekannt. Zum Beispiel verwenden Enzymimmunoassays, wie ein enzymgekoppelter Immunadsorbentassay (ELISA), ein Enzym als die nachweisbare Markierung.
Für den Proteinanalyt spezifische Antikörper können handelsüblich erhältlich sein oder mit in der Technik bekannten Verfahren, wie monoklonale oder polyklonale Herstellung von Antikörpern, hergestellt werden. Zum Beispiel wird ein Protein in einen Wirt (z. B. Hase oder Maus) injiziert und dessen Rückenmark einige Wochen später entfernt. Rückenmarkszellen von dem Wirt werden in der Gegenwart von Ethylenglycol zu Myelomzellen zugegeben, denen die Hypoxanthin-Guanosin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) fehlt. In einem Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymin enthält, können nur verschmolzene Zellen überleben, da unverschmolzene Rückenmarkszellen nicht in vitro wachsen und nicht fusionierte Myelomzellen ohne HGPRT nicht in der Lage sind, neue Nukleotide in dem Medium zu erzeugen. Die fusionierten Zellen können auf die Herstellung des gewünschten Antikörpers getestet werden und anschließend abgetrennt und kultiviert werden. Das Ergebnis ist ein Vorrat an Antikörpern, die gegen das Protein gerichtet sind. Abhängig von der Gestaltung des Assays, können die Antikörper vor der Verwendung markiert werden.
HYBRIDISIERUNGSASSAYS
Die Erfindung ist auch als Probenvorbereitungsverfahren für Hybridisierungsassays, wie verzweigtkettige DNA (bDNA)-Assays und reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktions (RT-PCR)-Assays, verwendbar. Solche Assays sind in der Technik gut bekannt und werden üblicherweise unter Verwendung handelsüblich erhältlicher Kits durchgeführt. Zum Beispiel ist der Amplicor HCV Monitor-Test (Roche Diagnostics, Molecular Systems Division, Nutley, NJ) ein RT-PCR-Test zum Nachweis des Vorhandenseins von HCV-RNA, während der Quantiplex HCV-RNA 2.0-Test (Bayer Diagnostics) ein bDNA-Test für HCV-RNA ist.
Nukleinsäurehybridisierung ist ein gut bekanntes Verfahren zum Identifizieren spezifischer Sequenzen von Nukleinsäuren oder Polynukleotiden. Im allgemeinen basiert Hybridisierung auf der Paarung zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen. Einzelsträngige Olinukleotide mit bekannten Sequenzen können als Sonden zur Identifizierung von Zielsequenzen von Nukleinsäureanalyten verwendet werden, indem die Sonden Probenlösungen, die interessierende Nukleinsäureanalyte enthalten, ausgesetzt werden. Wenn ein Nukleinsäureanalyt an eine Sonde hybridisiert, enthält der Analyt notwendigerweise die Zielsequenz. Zahlreiche Gesichtspunkte dieses Verfahrens wurden ausführliche untersucht. Im wesentlichen ermöglichen alle Abwandlungen von Hybridisierungsassays die Paarung komplementärer Basensequenzen und die Bildung doppelsträngiger Moleküle, und es versteht sich, daß die Verfahren nach der Erfindung in allen Arten von Hybridisierungsassays verwendet werden können. Details einiger dieser Assays werden unten zur Verfügung gestellt.
Sandwich-Hybridisierungsassays
Sandwich-Hybridisierungsassays sind in der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,124,246, 5,710,264 und 5,849,481 nach Urdea et al. in Kürze: eine Probe, wie ein Testmaterial von einem Patienten, wird mit Oligonukleotidsonden unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht. Die Oligonukleotidsonden hybridisieren dann an jegliche interessierende mRNA, die in der Probe vorhanden ist. Die Sonden sind üblicherweise auf einem Trägermaterial immobilisiert, um komplementäre mRNA zu erfassen oder zu immobilisieren. Die Probe verbleibt für eine ausreichende Zeitspanne mit den an ein Trägermaterial gebundenen Oligonukleotidsonden in Kontakt, zur Sicherstellung, daß die Hybridisierung nur an die Oligonukleotidsonden vollständig ist. Ein Fachmann kann die notwendigen "Inkubations"-Zeiten bestimmen, aber eine Zeit zwischen etwa 0,25 Stunden bis etwa 3,0 Stunden ist üblich. Nachdem eine ausreichende Inkubationszeit vergangen ist, wird die Probe zur Entfernung von unhybridisiertem Material mit einer geeigneten Waschlösung gewaschen. Waschtechniken sind gut bekannt und/oder können von einem Fachmann leicht ermittelt werden. Üblicherweise wird eine Waschflüssigkeit eingesetzt, die eine Pufferlösung und möglicherweise ein Detergens umfaßt. Die Pufferlösung kann irgendeine herkömmliche, in der Technik bekannte Lösung sein, die geeignet für die Entfernung von unhybridisiertem Material ist, und enthält üblicherweise ein oder mehrere Alkalimetallsalze, wie Natriumchlorid und Natriumcitrat oder Kombinationen davon. Das Detergens kann irgendein Detergens sein, das für das Waschen von ungebundenen Oligonukleotidsonden geeignet ist, wie die nichtionischen auf Polyoxyethylen basierenden Detergenzien, die unter den Handelsnamen Brij^®, Triton^®, Tween^®, Genapol^®, Igepal Ca^®, Thesit^® und Lubrol^® verkauft werden. Diese sind alle handelsüblich erhältlich von gewerblichen Lieferanten wie Sigma Corp. (St. Louis, MO). Einer oder mehrere Waschschritte werden bei Temperaturen in dem Bereich von etwa 21-60 °C durchgeführt. Am besten wird die Waschstufe bei Raumtemperatur ausgeführt.
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)-Hybridisierungsassays umfassen die Herstellung von cDNA basierend auf jeglicher mRNA, die in der Probe vorhanden ist, gefolgt von einer Messung. Solche Techniken sind in der Technik gut bekannt. Im allgemei nen wird ein Überschuß der vier Desoxynukleotidtriphosphatmoleküle (d.h. Desoxyadenosintriphosphat, Desoxycytidintriphosphat, Desoxythymidintriphosphat und Desoxyguanosintriphosphat) und ein Primer, d.h. ein Oligo-dT-Primer, zu der Probe zugegeben. Nach der Trennung von dem mRNA-Strang (durch Denaturierung in einem basischen Medium) ist das entstehende Oligonukleotid eine einzelsträngige DNA, die zu der ursprünglichen mRNA-Sequenz komplementär ist. Eine DNA-Polymerase kann dann in Gegenwart eines Überschusses der vier Desoxynukleotidtriphosphatmoleküle und eines Primers zur Schaffung einer doppelsträngigen DNA zugegeben werden. Weitere Einzelheiten werden in Gerard et al., Mol. Biotechnol. 8(1):61-77 (1997) und Ando et al., J. Clin Microbiol. 35(3):570-577 (1997) zur Verfügung gestellt. Danach kann die doppelsträngige DNA zu einzelsträngiger DNA denaturiert werden, wobei einer der beiden Stränge im wesentlichen eine DNA ist, die der ursprünglichen mRNA entspricht. Die DNA ist jedoch weniger anfällig für Zersetzung und kann daher als ein stabilerer Ersatz für mRNA bei der Bestimmung der Menge der mRNA in einer Probe verwendet werden. Eine Vielzahl an Verfahren zum Nachweis von DNA sind bekannt und können zum Nachweis und zur Bestimmung der Menge der entsprechenden mRNA, die ursprünglich in der Probe vorhanden war, verwendet werden. Wie es geschätzt wird, können viele der hier beschriebenen Verfahren zum Nachweisen und Messen von mRNA für den Nachweis und Messung von DNA angepaßt werden.
Transkriptionsvermittelte Vervielfältigung
Transkriptionsvermittelte Vervielfältigungs (TMA)-Assays sind insoweit ähnlich zu RT-PCR-Assays, daß reverse Transkriptase für das Erzeugen von cDNA aus der Ziel-mRNA zu einer Probe hinzugegeben wird. Jedoch wird bei der TMA eine RNA-Polymerase zur Synthese von RNA-Amplicons unter Verwendung von cDNA als eine Vorlage zugegeben. Jedes der neu synthetisierten Amplicons tritt wieder in den TMA-Vorgang ein und dient als Vorlage für eine neue Runde der Replikation. Daher führt der TMA-Vorgang zu einer effektiven Vervielfältigung der mRNA. Die RNA-Amplicons werden dann nachgewiesen und durch markierte Sonden, die komplementär zu den RNA-Amplicons sind, gemessen. Ähnliche Assays, die auf TMA basieren, sind in der Literatur beschrieben. Siehe z. B. Pasternack et al., J. Clin. Microbiol. 35(3):676-678 (1997).
Auf Nukleinsäuresequenz basierende Amplifikation
Die auf Nukleinsäuresequenz basierende Amplifikation oder (NASBA^®) ist ein homogener Vervielfältigungsvorgang. Das Verfahren umfaßt die Zugabe von drei Enzymen (reverse Transkriptase, RNase H und T7 RNA-Polymerase) und zwei Primern in ein einzelnes Reaktionsgefäß, welches mRNA aus der Probe enthält. Der erste Primer enthält eine 3' endständige Sequenz, die komplementär zu einer Sequenz auf der mRNA ist, und eine 5' endständige Se quenz, die von der T7 RNA-Polymerase erkannt wird. Zusammengenommen führen diese Reagenzien zur Synthese mehrfacher Kopien von mRNA, die durch Zugabe einer geeigneten markierten Sonde gemessen werden können. Diese Art an Assay ist gut bekannt in der Technik und wird beispielsweise in Davey et al. EP 0 329 822 beschrieben.
RNase-Schutzassay
Bei RNase-Schutzassays wird eine markierte Oligonukleotidsonde zu der Probe gegeben, was zu einer Hybridisierung zwischen der markierten Sonde und jeglicher komplementärer mRNA führt. Die Probe wird dann zum Abbau aller verbleibender einzelsträngiger mRNA mit RNase behandelt. Hybridisierte Teile der Probe werden vor dem Verdau geschützt. Nichthybridisierte Bruchstücke können von den größeren hybridisierten Komplexen, die eine Markierung tragen, z. B. durch Elektrophorese getrennt werden. Die Markierung kann dann gemessen werden. Wird die Probe im Vergleich zu der mRNA in molarem Überschuß zugegeben, z. B. wenigstens zweifacher molarer Überschuß, ist das entstehende Signal proportional zu der Menge der mRNA in der Probe.
Verzweigte DNA-Assays
Verzweigte DNA (bDNA) wird ausführlich in Urdea et al., Gene 61:253-264 (1987) beschrieben. Andere exemplarische bDNA-Assays werden in US-Patent Nr. 4,868,105 nach Urdea et al., US-Patent Nr. 5,124,246 nach Urdea et al., US-Patent Nr. 5,132,204 nach Urdea et al., US-Patent Nr. 5,635,352 nach Urdea et al. und US-Patent Nr. 5,681,702 nach Collins et al. beschrieben. Beispiel 3 veranschaulicht ein solches Protokoll.
KITS
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Kit, das bei der Vorbereitung von Proben für die Verwendung in einem Assay verwendbar ist, welches folgendes umfaßt:

(a) ein Polyalkylenglycol,
(b) magnetische Teilchen, die in der Lage sind, unspezifisch an Protein enthaltendes Material, welches in den Proben enthalten ist, zu binden,
(c) Salz mit einer Konzentration von weniger als oder gleich etwa 0,2 M und
(d) Anweisungen für die Vorbereitung der Proben.

Andere Materialien, die bei der Durchführung der Assays geeignet sind, können auch in den Kits enthalten sein, einschließlich Reagenzgläsern, Magneten, Transferpipetten und ähnliches. Kits können Reagenzien, Nukleinsäuresonden, markierte Analyte und Standardlösungen/-substanzen enthalten. Kits können genug Materialien für ein Assay oder mehrere Assays enthalten, z. B. können Materialien für 10, 25, 50 oder mehr Assays in einem einzigen Kit zur Ver fügung gestellt werden. Die Kits können auch Anweisungen für die Verwendung von einem oder mehreren dieser Reagenzien in einem der hierin beschriebenen Assays umfassen.
BEISPIELE
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung wird, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der pharmazeutischen Formulierung, medizinischen Chemie und ähnlichem, welche im Stand der Technik sind, gebrauchen. Solche Techniken werden in der Literatur vollständig erklärt. Die Herstellung von zahlreichen Arten von pharmazeutischen Formulierungen wird z. B. in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, neunzehnte Ausgabe (1995) oben zitiert und Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6. Ausgabe (Media, PA: Williams & Wilkins, 1995) beschrieben.
Die folgenden Beispiele werden herausgestellt, um dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung, wie die Bestandteile der Erfindung zu machen und zu verwenden sind, zur Verfügung zu stellen und sollen nicht den Umfang dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, einschränken. Es wurden Anstrengungen zur Gewährleistung von Genauigkeit in Bezug auf Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur etc.) unternommen, aber einige Fehler und Abweichungen sollten in Betracht gezogen werden. Sofern nicht anders angegeben, sind Anteile als Anteile pro Gewicht, Temperatur in °C angegeben, und der Druck ist bei oder in der Nähe atmosphärischen Drucks. Alle Bestandteile wurden handelsüblich bezogen, sofern nicht anders angegeben.
ABKÜRZUNGEN

bDNA

verzweigtkettige DNA

BGG

Rinder-Gammaglobulin

DS

Dextransulfat

HBV

Hepatitis B-Virus

HCV

Hepatitis C-Virus

HIV

menschlicher Immunschwächevirus

Meq

Millionenäquivalente

MLP

magnetische Latexteilchen

PBMC

einkernige Zelle im peripheren Blut

PBS

phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PBS/Tx-100

1X Dulbeccos-Lösung, 0,1 % Tx-100

PEG

Polyethylenglycol

PMP

paramagnetische Teilchen

SA

Streptavidin

BEISPIEL 1
Verstärkte Adsorption von mit PEG gefällten Proteinen an magnetische Teilchen in salzarmem Medium
A. BGG-Abtrennung – PEG/NaCl
Eine Lösung von hitzeaggregiertem BGG in PBS wurde durch Erhitzen des BGG auf 60 °C für 20 Minuten hergestellt. Die Lösung hatte eine anfängliche optische Dichte (280 nm) von 0,362 und wurde bei Zugabe von 0,15 ml 17,2% PEG (vol/vol) und 3 M NaCl zu 0,5 ml Proteinlösung stark trübe. Die trübe Mischung wurde für 30 Minuten auf Eis gekühlt und für 20 Minuten bei 2000 UpM (rpm) zentrifugiert zur Abscheidung des gefällten Proteins. Dieser Vorgang klärte die Lösung vollständig und die optische Dichte wurde auf 0,03 reduziert, was das Entfernen des größten Teils des BGGs aus der Lösung anzeigte.
B. BGG-Abtrennung – PEG/NaCl und PMP
Das Experiment zur BGG-Abtrennung wurde wiederholt, außer daß nach der Zugabe von PEG/NaCl 1 mg PMP zugegeben wurde, gefolgt von magnetischer Abtrennung. Es wurde nur eine leichte Abnahme an Trübung beobachtet und keine signifikante Veränderung der optischen Dichte.
C. BGG-Abtrennung – PEG und PMP
Das Experiment zur BGG-Abtrennung wurde wiederholt, außer daß NaCl in der PEG-Lösung weggelassen wurde. Anfänglich entwickelte sich der selbe Trübungsgrad, und bei der Zugabe von 1 mg PMP klärte eine magnetische Abtrennung die Lösung vollständig. Dies deutete an, daß das gefällte Protein in Abwesenheit von Salz effizienter an PMP band.
Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung von 20 verschiedenen humanen Seren anstelle des hitzeaggregierten BGGs durchgeführt. Bei all diesen Seren war die Klärung der durch PEG verursachten Trübheit effizienter in Abwesenheit von NaCl. Eine Klärung wurde unter Verwendung von PMP oder MLP (Seradyne) erreicht.
Anschließende Experimente bDNA-Assays auf HCV und HIV zeigten an, daß die Empfindlichkeit mit PEG/PMP-Mischungen, die 0,01-0,10 M NaCl enthielten, im Vergleich zu 1 M NaCl 3-5 mal höher war.
BEISPIEL 2
A. Hepatitis B bDNA-Hybridisierungsassay: Ermittlung der Viruskonzentration unter Verwendung von PEG/PMP mit und ohne MgCl₂ und Dextransulfat, Freisetzung mit PBS/Tx-100 und Lyselösung
i. Abfang- und Freisetzungsprotokoll
Eine 500 μl Serumprobe wurde mit 150 μl einer PEG/PMP-Lösung (1 mg PMP, 17,2% PEG (vol/vol)) gemischt. Die Mischung wurde gevortext und der Niederschlag abgetrennt. 100 μl des Überstands wurden entfernt und zur Bestimmung von Ungebundenem aufbewahrt. 10 μl des Überstands wurden auf eine Platte verbracht, wenn das Virus auf die Platte verbracht wurde. Der verbleibende Überstand wurde entfernt und verworfen.
150 μl der Lyselösung oder PBS/Tx-100 wurden zu dem Niederschlag gegeben, gevortext und bei 63 °C für 30 Minuten inkubiert. Das PMP wurde abgetrennt. 10 μl des freigesetzten Virus wurden auf die Platte verbracht.
ii. Quantifizierung
Das bDNA-Assay wurde dann nach dem Protokoll des Herstellers ausgeführt. Das verwendete HBV-Kit war MM11225 (Bayer Diagnostics): Die Einsatzmenge positiven Serums war 375 Meq/Probe. Puffer A war PBS/Tx-100. Puffer B war Lyselösung. Tabelle 1: Ungebunden

17,2% PEG (vol/vol) 98 Meq/Probe

17,2% PEG, 0,09% DS 81 Meq/Probe

17,2% PEG, 2% DS 20 Meq/Probe

17,2% PEG, 0,09% DS, 90 mM MgCl₂ 72 Meq/Probe

Tabelle 2: Freigesetzt
B. Hepatitis B bDNA-Hybridisierungsassay mit Aufkonzentrierungsstufe: Auswertung von 4 Konzentrationen Dextransulfat in PEG/PMP-Fällungsreagens und Auswirkung des pH des PBS/Tris/Tx-100-Freisetzungsagens
Die verwendete PBS/Tris-Zusammensetzung war 50 mM Natriumphosphat, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, Tetranatriumsalz und 0,02% NaN₃. Tabelle 3: PEG- und DS-Konzentrationen (% vol/vol)
Tabelle 4: Dextransulfateinsatzmenge (%)
BEISPIEL 3
Hepatitis C bDNA-Hvbridisierungsassay
A. Bindung von HCV unter Verwendung von NH₂-MLP, NH₂-PMP und BGG-PMP/PEG-Fällungsprotokoll
Die folgenden drei Festphasen (50 mg/ml Vorräte) wurden verwendet: NH₂-MLP (hergestellt durch Koppeln von Bis-Amin an COOH-MLP (Seradyne)), BGG-PMP und NH₂-PMP. Tabelle 5: PEG/PMP oder MLP-Fällungsprotokoll
Das Serum wurde nach der Zugabe von PEG trübe, da das Protein aus der Lösung ausfiel. Der Niederschlag (feste Phase) wurde entfernt. 50 μl unverdünnt und 50 μl einer 10X Verdünnung (25 μl + 225 μl negatives Serum) wurden auf die bDNA-Platte überführt. Der Rest des Überstands wurde entfernt und verworfen.
Bei Proben ohne Festphasenübergang wurden 125 μl der Probe und 375 μl der Lyselösung in ein Eppendorfreaktionsgefäß eingebracht und bei 53 °C für 1 Stunde inkubiert. 150 μl wurden dann auf die Platte überführt.
500 μl des Lysereagens wurden zu den festen Phasen gegeben und dann in Eppendorfreaktionsgefäße überführt und bei 53 °C für 60 Minuten in einer Eppendorf Mikrozentrifuge inkubiert. Die feste Phase wurde dann abgetrennt. 150 μl unverdünnt und 150 μl einer 10X Verdünnung (50 μl + 400 μl Lyselösung) wurden auf die bDNA-Platte überführt. Der bDNA-Assay wurde dann nach dem Protokoll des Herstellers ausgeführt. Das verwendete HCV-Kit war das HCV 2.0 bDNA Kit, MM833 (Bayer Diagnostics). Tabelle 6: Nach der Behandlung im Serum verbleibende RNA
Tabelle 7: Von der Festphasenoberfläche freigesetzte RNA
B. Bindung von HCV unter Verwendung von Anti-Hülle- und Anti-Kern-PMP oder einer PEG/PMP-Fällung Tabelle 8: PEG/PMP-Fällungsprotokoll
Nach Zugabe von PEG wurde das Serum trübe, da das Protein aus der Lösung ausfiel. Der Niederschlag (feste Phase) wurde entfernt. 50 μl unverdünnt und 50 μl einer 10X Verdünnung (25 μl + 225 μl negatives Serum) wurden auf die bDNA-Platte überführt. Der bDNA-Assay wurde nach dem Protokoll des Herstellers ausgeführt. Tabelle 9: Nach der Behandlung im Serum verbleibende RNA
BEISPIEL 4
Zellassays
Die gleichen oben beschriebenen Vorgehensweisen wurden bei Zellkulturen (Jurkat) und weißen Blutzellen angewendet und die Anzahl der abgefangenen Zellen wurde mikroskopisch gezählt. Beide Zelltypen wurden mit einer Ausbeute von mehr als 90% abgefangen.
A. Aufreinigung von PBMCs aus 1 ml Vollblut: Materialien/Verfahren

Materialien: 1 ml Gesamtblut, 300 μl PMP/PEG (3,33 mg PMP/8,75% PEG), Milli-Q Wasser, 10 × PBS und 1 × PBS und Vollblut auf Eis.

5 ml Vollblut wurde in 45 ml Milli-Q Wasser resuspendiert und für ungefähr 30 Sekunden invertiert. 5 ml 10 × PBS wurden zugegeben. Die Mischung wurde bei 1000 g für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das Waschen wurde mit 50 ml 1 × PBS wiederholt und dann in 5 ml 1 × PBS resuspendiert unter Bereitstellung der Zellsuspension. Eine Kontrollteilmenge wurde durch Einbringen von 1 ml der Zellsuspension in 1,5 Eppendorfreaktionsgefäße (auf Eis halten) erstellt. 1 ml der Zellsuspension wurde zu 300 μl des PMP/PEG-Reagens gegeben und die Mischung 5 mal invertiert. Die Mischung wurde dann auf Magnete gestellt und für 5 Minuten getrennt. Der Überstand wurde entfernt und in 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäße eingebracht. Die Kontroll- und Proben-Eppendorfreaktionsgefäße wurden für 10 Minuten bei 2000 g in einer Eppendorf Zentrifuge zentrifugiert. Die Flüssigkeit wurde abgesaugt und das Pellet in 100 μl PBS resuspendiert.
B. Bewertung des Verfahrens: Lebendzellzahlbestimmungen
10 μl Trypanblau (4%) wurden in ein Eppendorfreaktionsgefäß eingebracht. 10 μl der resuspendierten Zellen wurden zugegeben. Die Anzahl der lebenden Zellen wurde in einem Hämozytometer (4 Gitter oder 200 Zellen) gezählt. Die Kontrolle (verdünnt 1:100 in PBS), 10 (× 100) Zellen/4 Gitter × 1,0·10⁴ hatte eine Lebendzellzahl von 2.500.000 Zellen/ml. Keine lebenden Zellen wurden in dem Überstand des PMP/PEG gezählt. Daher war die Behandlung mit PMP/PEG nach der Erfindung erfolgreich beim Entfernen aller Zellen aus der Probe.
BEISPIEL 4
Nachweis von Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) aus hypotonisch lysierten PBMCs mit PMP/PEG
Ein bDNA-Assay für GAPDH, ein in Zellen gefundenes Haushaltsgen, wurde zur Überwachung der Linearität der PMP/PEG-Probenkonzentration verwendet. Ein ml hypotonisch vorbehandelter einkerniger Zellen aus periphärem Blut (PBMCs) (5,5·10⁴ Zellen/ml) oder Vollblut (WB) wurden in 1 × PBS auf die unten angegebenen Verhältnisse verdünnt und durch das PMP/PEG-Verfahren wie beschrieben konzentriert. Die entstehende konzentrierte Probe wurde in einem bDNA-Assay auf GAPDH analysiert. Wie unten gezeigt, sind die Signal/Rauschen-Verhältnisse (S/N) linear bis hinunter zur geringsten getesteten Verdünnung sowohl bei PBMCs als auch bei Vollblut, was die breite Anwendbarkeit dieses Probenvorbereitungsverfahrens mit Vollblut, Zellkulturen etc. belegt. Tabelle 10: GAPDH bDNA S/N-Werte von mit PMP/PEG-konzentrierten PBMCs und Vollblut

Claims

Verfahren zur Vorbereitung einer Probe für die Verwendung in einem Assay, welches folgendes umfaßt: (a) Zugeben eines Polyalkylenglycols und magnetischer Teilchen zu einer Probe unter Bildung einer Mischung, wobei die magnetischen Teilchen in der Lage sind, unspezifisch an Protein enthaltende Materialien, die in der Mischung enthalten sind, zu binden, und wobei die Mischung eine Salzkonzentration von weniger als oder gleich etwa 0,2 M hat, (b) Fällen der Protein enthaltenden Materialien aus der Mischung, wenn die Protein enthaltenden Materialien unspezifisch an die magnetischen Teilchen gebunden werden, unter Bildung eines Niederschlags und eines Überstands, (c) Verwerfen des Überstands und (d) Isolieren des Niederschlags unter Erzeugung einer vorbereiteten Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin folgendes umfaßt: (e) Lösen der vorbereiteten Probe in einer Lösung unter Bildung einer Mischung von ungebundenen Protein enthaltenden Materialien und magnetischen Teilchen, (f) Anlegen eines magnetischen Feldes an die Mischung zum Entfernen der magnetischen Teilchen, (g) Sammeln der Protein enthaltenden Materialien unter Bildung einer isolierten vorbereiteten Probe.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Probe eine Gewebeprobe, eine Vollblutprobe, eine Probe weißer Blutkörperchen, eine Plasmaprobe, eine Serumprobe, eine Zellkulturprobe, eine Fäkalienprobe oder eine Urinprobe ist.
Verfahren zur Vorbereitung einer Blutprobe für die Verwendung in einem Assay, welches folgendes umfaßt: (a) Zugeben eines Polyalkylenglycols und magnetischer Teilchen zu einer Blutprobe unter Bildung einer Mischung, wobei die magnetischen Teilchen in der Lage sind, unspezifisch an Zellen, die in der Mischung enthalten sind, zu binden, und wobei die Mischung eine Salzkonzentration von weniger als oder gleich etwa 0,2 M hat, (b) Fällen der Zellen aus der Mischung, wenn die Zellen unspezifisch an die magnetischen Teilchen gebunden werden, unter Bildung eines Niederschlags und eines Überstands, (c) Verwerten des Überstands und (d) Isolieren des Niederschlags unter Erzeugung einer vorbereiteten Blutprobe.
Verfahren nach Anspruch 4, welches weiterhin folgendes umfaßt: (e) Lösen der vorbereiteten Blutprobe in einer Lösung unter Bildung einer Mischung ungebundener Blutzellen und magnetischer Teilchen, (f) Anlegen eines magnetischen Feldes an die Mischung zum Entfernen der magnetischen Teilchen, (g) Sammeln der Blutzellen unter Bildung einer isolierten vorbereiteten Blutprobe.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Stufe des Fällens weiterhin das Anlegen eines magnetischen Feldes umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Polyalkylenglycol Polyethylenglycol ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Lösung eine Pufferlösung ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Lösung eine Lyselösung ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Mischung eine Salzkonzentration von weniger als oder gleich etwa 0,125 M hat.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Mischung eine Salzkonzentration im Bereich von etwa 0,01-0,10 M hat.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Salz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus NaCl, MgCl₂, LiCl und KCl.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Mischung weiterhin ein Detergens umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Detergens in einer Konzentration von etwa 1-10 mM vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Detergens ein kationisches Detergens ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das kationische Detergens ein quartäres Ammoniumsalz ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das quartäre Ammoniumsalz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cetyltrimethylammoniumbromid und Octadecyltrimethylammoniumsalz.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die magnetischen Teilchen aus einem Material bestehen, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Eisen, Eisenoxid, Eisennitrid, Eisencarbid, Nickel und Kobalt und Gemischen und Legierungen davon.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die magnetischen Teilchen paramagnetische Teilchen oder magnetische Latexteilchen sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die magnetischen Teilchen einen mittleren Durchmesser im Bereich von etwa 0,1-100 μm haben.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die magnetischen Teilchen einen mittleren Durchmesser im Bereich von etwa 1-50 μm haben.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die magnetischen Teilchen einen mittleren Durchmesser im Bereich von etwa 1-5 μm haben.
Verfahren nach Anspruch 1 und irgendeinem davon abhängigen Anspruch, wobei die Protein enthaltenden Materialien aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Zellen, Immunglobulinen, Proteinen und Enzymen.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die vorbereitete Probe für die Verwendung in einem Hybridisierungsassay geeignet ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die magnetischen Teilchen beschichtet sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die vorbereitete Probe für die Verwendung in einem Immunoassay geeignet ist.
Kit, der geeignet ist, um Proben für die Verwendung in einem Assay herzustellen, und der folgendes umfaßt: (a) einen Polyalkylenglycol, (b) magnetische Teilchen, die in der Lage sind, unspezifisch an Protein enthaltende Materialien, die in den Proben enthalten sind, zu binden, (c) Salz mit einer Konzentration von weniger als oder gleich etwa 0,2 M und (d) Anweisungen für die Vorbereitung der Proben.
Kit nach Anspruch 27, wobei der Polyalkylenglycol Polyethylenglycol ist.
Kit nach Anspruch 27 oder 28, welcher weiterhin eine Pufferlösung umfaßt.
Kit nach Anspruch 27 oder 28, welcher weiterhin eine Lyselösung umfaßt.
Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei das Salz eine Konzentration von weniger als oder gleich etwa 0,125 M hat.
Kit nach Anspruch 31, wobei das Salz eine Konzentration im Bereich von etwa 0,01-0,10 M hat.
Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 32, wobei das Salz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus NaCl, MgCl₂, LiCl und KCl.
Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 33, welcher weiterhin ein Detergens umfaßt.
Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 34, wobei das Detergens ein kationisches Detergens ist.
Kit nach Anspruch 35, wobei das kationische Detergens ein quartäres Ammoniumsalz ist.
Kit nach Anspruch 36, wobei das quartäre Ammoniumsalz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cetyltrimethylammoniumbromid und Octadecyltrimethylammoniumsalz.
Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 37, wobei die magnetischen Teilchen aus einem Material bestehen, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Eisen, Eisenoxid, Eisennitrid, Eisencarbid, Nickel und Kobalt und Gemischen und Legierungen davon.
Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 38, wobei die magnetischen Teilchen paramagnetische Teilchen oder magnetische Latexteilchen sind.
Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 39, wobei die magnetischen Teilchen einen mittleren Durchmesser im Bereich von etwa 0,1-100 μm haben.