DE69724857T2

DE69724857T2 - Aufbereitung einer Gesamtblutprobe für die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Ammoniumchlorid und Carbonsäuren oder Metall-Carboxylaten zur selektiven Lyse von roten Blutzellen

Info

Publication number: DE69724857T2
Application number: DE69724857T
Authority: DE
Inventors: Tobias E. Ekeze; Joanne Hansen Kerschner
Original assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1996-03-12
Filing date: 1997-03-11
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2017-03-12
Also published as: JPH102898A; US5702884A; EP0795751A2; ATE250226T1; DE69724857D1; EP0795751A3; CA2199337C; EP0795751B1; JP3715405B2; CA2199337A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer Vollblutprobe für die Polymerasekettenreaktion (PCR) mittels Trennung von Leukozyten von Erythrozyten. Sie betrifft auch ein Verfahren zur Amplifizierung einer Zielnukleinsäure, die aus den hergestellten Leukozyten isoliert worden ist, und ein Kit, das beim Ausüben des Verfahrens nützlich ist.
Hintergrund der Erfindung
Die Technologie zur Detektion von Mengen an Nukleinsäure hat rasche Fortschritte über die letzten zwei Jahrzehnte gemacht, einschließlich der Entwicklung von äußerst hoch entwikkelten Hybridisierungsassays unter Verwendung von Sonden bei Amplifizierungstechniken, wie etwa PCR. Forscher haben schnell den Wert einer solchen Technologie zur Detektion von Krankheiten und genetischen Merkmalen bei menschlichen oder tierischen Testproben erkannt. Die Verwendung von Sonden und Primern bei einer solchen Technologie beruht auf dem Konzept der Komplementarität, d. h. der Bindung der beiden Stränge einer Nukleinsäure über Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Nukleotiden (auch als Nukleotidpaaren bekannt).
PCR ist ein signifikanter Fortschritt auf dem Gebiet, der den Nachweis von sehr geringen Konzentrationen einer Zielnukleinsäure ermöglicht. Die Einzelheiten der PCR werden z. B. beschrieben in US-A-4,683,195 (Mullis et al), US-A-4,683,203 (Mullis) und US-A-4,965,188 (Mullis et al), obwohl es eine rasch anwachsende Menge von Literatur auf diesem Gebiet gibt. Ohne in übermäßige Einzelheiten zu gehen, beinhaltet PCR das Hybridisieren von Primern an die Stränge einer Zielnukleinsäure (bezeichnet als „Template") in der Anwesenheit eines polymerisierenden Agens (wie etwa DNA-Polymerase) und Deoxyribonucleosid-Triphosphaten unter geeigneten Bedingungen. Das Ergebnis ist die Bildung von Primer-Verlängerungsprodukten entlang der Template, wobei die Produkte Nukleotide angefügt haben, die zu den Templaten komplementär sind.
Wenn die Primer-Verlängerungsprodukte denaturiert sind und eine Kopie der Template hergestellt worden ist, kann der Zyklus des Priming, Verlängerns und der Denaturierung soviele Male durchgeführt werden, wie erwünscht, um ein exponentielles Anwachsen der Menge an Nukleinsäure zu erzielen, die dieselbe Sequenz wie die Zielnukleinsäure hat. Im Ergebnis wird die Zielnukleinsäure viele Male dupliziert (oder „amplifiziert"), so daß sie leichter nachgewiesen wird.
Um eine Zielnukleinsäure effektiv zu amplifizieren und nachzuweisen, ist es gewöhnlich notwendig, diese Nukleinsäure aus zellulären und anderen Proben-Trümmern zu isolieren. Zum Beispiel ist es auf dem Gebiet gut bekannt, daß rote Blutkörperchen PCR inhibieren. Verschiedene Lyseprozeduren sind bekannt, einschließlich dem Einfrieren, der Behandlung mit Verdauungsenzymen, wie etwa Proteasen (z. B. Proteinase K), Kochen und die Verwendung von Detergenzien (siehe z. B. U.S.S.N. 178,202, eingereicht am 6. April 1988 von Higuchi, und EP-A-0 428 197, veröffentlicht am 22. Mai 1991).
Es ist ebenso bekannt, daß viele Zielnukleinsäuren im Vollblut in spezifischen Zellpopulationen gefunden werden, wie etwa in weißen Blutkörperchen (Leukozyten), im Gegensatz zu roten Blutkörperchen (Erythrozyten).
Es gibt viele bekannte Techniken, die für die Trennung und Aufreinigung von Blutzellpopulationen (und Subpopulationen) verwendet werden. Eine der am häufigsten verwendeten Techniken zum Trennen von Leukozyten von Erythrozyten ist es, einfach eine Probe Vollblut mit einer Lösung zu mischen, umfassend Reagenzien, die die Aggregation der Erythrozyten verursachen, indem ihre Sedimentationsrate erhöht wird. Leukozyten werden durch die Sedimentationsflüssigkeit weniger beeinflußt, so daß sie von dem oberen Teil der Flüssigkeit gesammelt werden können, wenn die Erythrozyten sich abgesetzt haben.
Jüngere Techniken beinhalten die Verwendung von Erythrozyten-aggregierenden Mitteln, wie etwa bestimmten polymeren Verbindungen (z. B. FICOLL^TM 400), wie z. B. beschrieben in US-A-4,255,256 (Ferrante et al). Es ist ebenso möglich, bestimmte Subpopulationen der Leukozyten zu aggregieren, wie in dem Patent von Ferrante et al beschrieben. Die Trennung kann ebenso unter Verwendung von Dextran-Gradiententechniken erzielt werden, wie beschrieben, z. B. von Eggleton et al., J. Immun. Methods 121, S. 105–113 (1989).
Es ist jedoch gefunden worden, daß viele Techniken und Reagenzien, die zum Lysieren von Erythrozyten verwendet werden, die Polymerase-Kettenreaktion stören und damit ihre Effizienz reduzieren. Dies ist insbesondere problematisch, wenn die Zielnukleinsäure in sehr geringen Konzentrationen vorliegt. Ebenso können einige Lysemittel, wie etwa lysierende Detergenzien, die Membranen der Leukozyten löslich machen, was zu einem Verlust von zytoplasmatischer DNA während der Zelltrennung führt. Zusätzlich sind Zellen, die unter Verwendung verschiedener Lysemittel hergestellt werden, nicht lebensfähig und können nicht kultiviert werden. Um diese Probleme zu vermeiden, ist es notwendig, Verbindungen zu verwenden, die Erythrozyten selektiv lysieren, ohne die Unversehrtheit der Leukozyten zu beeinträchtigen.
Eine solche selektive lysierende Verbindung ist Ammoniumchlorid wie z. B. beschrieben in US-A-4,407,942 (Birnboim) und von Eggleton et al., J. Immun. Methods 121, S. 105–113 (1989). Typischerweise wird nach der Verwendung von Ammoniumchlorid das lysierte Material durch die Zentrifugation entfernt, was die Leukozyten für eine weitere Behandlung zurückläßt. Jedoch sind die Protokolle zur Verwendung von Ammoniumchlorid, die auf dem Gebiet gelehrt werden, nicht immer ausreichend. Eggleton et al. lysierten beispielsweise Erythrozyten mit eiskaltem Ammoniumchlorid und wuschen dann die Leukozyten mit Buffer, bis sie weiterverwendet wurden. Während es wichtig ist, die Lebensfähigkeit der Leukozyten aufrechtzuerhalten, fand immer noch bei Verwendung der Prozedur von Eggleton et al. eine Lyse der Leukozyten statt.
Solche Prozeduren sind zum Isolieren von Zielnukleinsäuren für die Polymerase-Kettenreaktion nicht so nützlich, insbesondere wenn die Leukozytenpopulation. einen geringen Titer der Zielnukleinsäure enthält. Eine vorzeitige Lyse der weißen Blutkörperchen kann zu einem signifikanten Verlust an Zielnukleinsäure führen. Darüberhinaus dauert die Prozedur von Eggleton et al. zu lange (über 40 Minuten) für ein kommerziell nützliches Herstellungsverfahren von Zellen.
WO 84/04969 stellt ein Reagenz für das kombinierte Verdünnen und Lysieren von Vollblut bereit. Das Reagenz umfaßt ein quartäres Ammoniumdetergenz und ein Verbindungssalz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Sulfat, Carbonat, Formiat und Acetat.
US 4,185,964 offenbart ein Lysereagenz zum Lysieren der Erythrozyten, während die Leukozyten im wesentlichen intakt bleiben. Das Lysereagenz ist eine wäßrige Lösung eines quartären Ammoniumsalzes, das Chromogene mit Hämoglobin bilden kann, und einer wasserlöslichen Polycarbonsäure oder Salz in einer Menge, die ausreicht, um Lyse der Leukozyten zu inhibieren.
EP 574,267 stellt ein Verfahren und Kit zur Herstellung einer Nukleinsäure aus weißen Blutkörperchen zum Nachweis und zur Amplifizierung bereit. Die Nukleinsäure kann durch Kontaktieren einer Probe von Zellen, z. B. Vollbut, mit einem geeigneten Lyse-Agens unter Bedingungen hergestellt werden, bei der die roten Blutkörperchen lysiert werden, weiße Blutkörperchen aber nicht lysiert werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die oben aufgeführten Probleme werden durch das Verfahren zur selektiven Herstellung von Leukozyten der vorliegenden Erfindung überwunden. Das Verfahren umfaßt:

A) Mischen einer Vollblutprobe mit einer Erythrozyten-Lyse-Lösung, umfassend wenigstens ungefähr 50 mM Ammoniumchlorid und zwischen ungefähr 0,001 Gewichtsprozent und ungefähr 0,1 Gewichtsprozent einer Carbonsäure oder eines Metallcarboxylats mit wenigstens einer Carboxylgruppe, wobei die Carbonsäure oder das Metallcarboxylat die Strukturformel hat: R-COOM, wobei M Wasserstoff oder ein moovalentes Kation ist, und R ein Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein substituiertes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein substituiertes Alkenyl von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Aryl, ein substituiertes Aryl, ein Arylalkyl oder ein substituiertes Arylalkyl ist, und wobei die Lyse-Lösung einen pH von zwischen 6 und 8 hat,
B) Zentrifugieren der resultierenden Mischung, um ein Pellet aus Leukozyten aus der Vollblutprobe zu bilden,
C) nach Entfernen des Überstandes, Waschen des Leukozyten-Pellet in einer frischen Probe Lyse-Lösung, und
D) Zentrifugieren und Isolieren des Leukozyten-Pellet, vorausgesetzt, daß Schritte A) bis D) innerhalb von ungefähr 20 Minuten durchgeführt werden.

Diese Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Amplifizierung und Detektion einer Zielnukleinsäure bereit, umfassend:

I) selektives Herstellen von Leukozyten, von denen angenommen wird, daß sie eine Zielnukleinsäure enthalten, in einer Vollblutprobe durch:
A) Mischen einer Vollblutprobe mit einer Erythrozyten-Lyse-Lösung, umfassend wenigstens ungefähr 50 mM Ammoniumchlorid und zwischen ungefähr 0,001 Gewichtsprozent und ungefähr 0,1 Gewichtsprozent einer Carbonsäure oder eines Metallcarboxylats mit wenigstens einer Carboxylgruppe, wobei die Carbonsäure oder das Metallcarboxylat die Strukturformel hat: R-COOM, wobei M Wasserstoff oder ein monovalentes Kation ist, und R ein Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein substituiertes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein substituiertes Alkenyl von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Aryl, ein substituiertes Aryl, ein Arylalkyl oder ein substituiertes Arylalkyl ist, und wobei die Lyse-Lösung einen pH von zwischen 6 und 8 hat,
B) Zentrifugieren der resultierenden Mischung, um ein Pellet aus Leukozyten aus der Vollblutprobe zu bilden,
C) nach Entfernen des Überstandes, Waschen des Leukozyten-Pellet in einer frischen Probe der Lyse-Lösung, und
D) Zentrifugieren und Isolieren des Leukozyten-Pellet, vorausgesetzt daß Schritte A) bis D) innerhalb von ungefähr 20 Minuten durchgeführt werden,
II) Lysieren der Leukozyten in dem gewaschenen Pellet, um die Zielnukleinsäure freizusetzen,
III) Amplifizieren der freigesetzten Zielnukleinsäure unter Verwendung von Polymerasekettenreaktion und einem Satz an Primern, die für die einander gegenüberliegenden Stränge der Zielnukleinsäure spezifisch und damit hybridisierbar sind, und
IV) Nachweisen der amplifizierten Zielnukleinsäure.

Ein Kit zur Polymerasekettenreaktion, umfassend:

a) einen Satz aus zwei Primern, die für die einander gegenüberliegenden Stränge einer Zielnukleinsäure spezifisch und damit hybridisierbar sind, wobei einer oder beide Primer mit einer Nachweisgruppe markiert sind und, in derselben oder unterschiedlichen Verpackung, wenigstens ein zusätzliches PCR-Reagens, und
b) in einer separaten Verpackung, eine Lösung oder eine trockene Zusammensetzung, enthaltend, wenn die trockene Zusammensetzung mit Wasser rekonstituiert wird, wenigstens ungefähr 50 mM Ammoniumchlorid und wenigstens ungefähr 0,005 Gewichtsprozent einer Carbonsäure oder eines Metallcarboxylats mit wenigstens einer Carboxylgruppe, wobei die Carbonsäure oder das Metallcarboxylat die Strukturformel hat: R-COOM, wobei M Wasserstoff oder ein monovalentes Kation ist, und R ein Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein substituiertes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Alkenyl von stole Kohlenstoffatomen, ein substituiertes Alkenyl von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Aryl, ein substituiertes Aryl, ein Arylalkyl oder ein substituiertes Arylalkyl ist, und wobei die Lösung einen pH von zwischen 6 und 8 hat.

Die vorliegende Erfindung stellt ein rasches und effektives Verfahren zum selektiven Herstellen von Leukozyten aus einer Vollblutprobe zur Amplifzierung und Detektion einer Zielnukleinsäure bereit. Das Herstellungsverfahren kann innerhalb von ungefähr 20 Minuten ausgeführt werden (bevorzugt innerhalb von 15 Minuten), sogar für Zielnukleinsäuren, die in sehr geringen Konzentrationen vorhanden sind. Darüberhinaus kann das Verfahren bei Zimmertemperatur durchgeführt werden, da die Lebensfähigkeit der abgetrennten Leukozyten kein wichtiger Punkt für die Polymerase-Kettenreaktion ist. Sowohl Kern- als auch zytoplasmatische DNA werden unter Verwendung des Herstellungsverfahrens dieser Erfindung zurückgehalten.
Diese Vorteile werden erzielt unter Verwendung einer Lösung, umfassend Ammoniumchlorid und eine Carbonsäure und ein Metallcarboxylat, um die Erythrozyten selektiv zu lysieren, und unter Verwendung derselben Lösung, um die abgetrennten Leukozyten zu waschen, bevor sie lysiert werden, um Zielnukleinsäure freizusetzen. Nur die Verwendung einer Ammoniumchloridlösung, um die Erythrozyten zu lysieren, reicht oft nicht aus, um einen adäquaten Leukozyten-Titer bereitzustellen, der Zielnukleinsäuren enthält, die zur Amplifizierung und Detektion verwendet werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist besonders zur Extraktion und zum Nachweis von einer oder mehreren Zielnukleinsäuren geeignet, die in einer Tieren oder Menschen entnommenen Vollblutprobe vorhanden sind. Da die Zielnukleinsäure typischerweise in bestimmten Zellen (Leukozyten) der Probe vorliegt, werden Schritte unternommen, um diese Zellen in intaktem Zustand von dem Rest der Probe gemäß dieser Erfindung zu trennen.
Die Vollblutprobe wird zuerst mit einer gepufferten Erythrozyten-Lyse-Lösung gemischt, umfassend Ammoniumchlorid und eine Carbonsäure oder ein Metallcarboxylat in einem geeigneten Behälter. Carbonsäuren und Metallcarboxylate, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, haben wenigstens eine Carboxylgruppe und haben die Strukturformel R-COOM. wobei M Wasserstoff oder ein monovalentes Kation (wie etwa Natrium, Kalium oder Lithium) ist, und
R ein Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (wie etwa Methyl, Ethyl, Butyl, Isobutyl, Propyl, Isopropyl und ähnliches), ein substituiertes Alkyl (z. B. ein Halogenalkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (wie etwa Brommethyl, Chlormethyl, Fluormethyl, 1,1-Dichlormethyl, 1,1,1-Trichlormethyl, 1,1,1-Trifluormethyl, 2,2,2-Trichlorethyl und ähnliches), ein Alkoxyalkyl von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen (wie etwa Methoxymethyl, Methoxyethyl und ähnliches), ein Hydroxyalkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (wie etwa Hydroxymethyl, 1-Hydroxyethyl, 2-Hydroxyethyl, 2,3-Hydroxyethyl und ähnliches), ein Aminoalkyl von 1 bis 6 Kohlentoffatomen (wie etwa Aminomethyl, 2-Aminoethyl, 3-Aminoethyl, 3-Aminopropyl, 2-4-Diaminobutyl, Methylaminomethyl, 4-Aminobutyl und ähnliches)], ein Alkenyl von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen (wie etwa Ethenyl, 1-Propenyl, Isopropenyl und 2-Butenyl und ähnliches), ein substituiertes Alkenyl von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Aryl, ein substituiertes Aryl (wie etwa Phenyl, 2-Methoxyphenyl, 3-Methoxyphenyl, 4-Methoxyphenyl, 4-Aminophenyl, 2-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl und ähnliches), ein Arylalkyl oder ein substituiertes Arylalkyl ist.
Bevorzugt ist R substituiertes oder nicht-substituiertes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, bevorzugter mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. Sogar noch bevorzugter ist R ein substituiertes Methyl, wie Halogen-substituiertes Methyl. Am bevorzugten ist R Methyl. Daher schließen Beispiele von bevorzugten Carbonsäuren Monohalogenessigsäure, Dihalogenessigsäure, Trihalogenessigsäure und Essigsäure und Metallcarboxylate davon ein.
Die Erythrozyten-Lyse-Lösung enthält von ungefähr 50 bis 100 mM Ammoniumchlorid. Die Carbonsäure oder das Metallcarboxylat ist in der Lösung in von ungefähr 0,001 bis ungefähr 0,1 Gewichtsprozent vorhanden. Bevorzugt enthält die Lyse-Lösung von ungefähr 0,005 bis ungefähr 0,05 Gewichtsprozent einer Carbonsäure oder eines Metallcarboxylats.
Die Carbonsäuren und Metallcarboxylate dieser Erfindung sind im allgemeinen kommerziell als die freie Säure oder als das Metallcarboxylat erhältlich oder können durch Prozeduren synthetisch gemacht werden, die Fachleuten wohlbekannt sind. Beispiele für kommerziell erhältliche Carbonsäuren der vorliegenden Erfindung schließen die folgenden ein, erhältlich von Eastman Organic Chemicals (Kingsport, Tennessee): Essigsäure, Benzoesäure, p- Aminobenzoesäure, 1,1,1-Trichloressigsäure, 2-Methoxybenzoesäure, 4-Chlorphenyl, 2-brom-3-methylbuttersäure, Isobuttersäure, Cyanoessigsäure, 2-Butensäure, 1,3-Dicarboxylbenzol, 2-ethylbuttersäure, Trans-Zimtsäure und andere. Diese zitierten und andere Säuren sind ebenso von anderen Lieferanten und Herstellern erhältlich, wie etwa TCI America (Portland, Oregon), Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri), ICN (Irvine, California) und viele andere, die Fachleuten wohlbekannt sind.
Das Volumenverhältnis der Vollblutprobe zu der Erythrozyten-Lyse-Lösung, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beträgt von ungefähr 1 : 1 bis ungefähr 1 : 10. Bevorzugt ist das Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 5. Bevorzugter ist das Verhältnis ungefähr 1 : 4. Die Vollblutprobe kann jedes erwünschte Volumen haben, hat aber im allgemeinen von ungefähr 0,1 bis ungefähr 10 ml.
Die Lyse-Lösung, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfaßt im allgemeinen Ammoniumchlorid und eine Carbonsäure oder ein Metallcarboxylat in einem geeigneten Puffer, der einen pH im Bereich von ungefähr 6,0 bis ungefähr 8,0 bereitstellt (bevorzugt von ungefähr 6,5 bis ungefähr 7,5). Nützliche Puffer schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Natriumhydrogencarbonat, Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid, Phosphat und andere, die auf dem Gebiet bekannt sind. Die Lösung kann fakultativ Ionen-chelierende Agenzien enthalten, wie etwa Ethylendiaamintetraessigsäure und andere, die Fachleuten bekannt sind.
Das Mischen wird für bis zu ungefähr 10 Minuten (bevorzugt ungefähr 5 Minuten) bei Zimmertemperatur durchgeführt, um zu ermöglichen, daß die Lyse-Lösung die Erythrozyten lysiert.
Die resultierende Mischung wird für bis zu 10 Minuten (bevorzugt für ungefähr 5 Minuten) unter Verwendung einer herkömmlichen Zentrifuge zentrifugiert, um die Leukozyten (in einem Pellet) von dem Überstand zu trennen, der die Produkte der Lyse und andere unerwünschte Trümmer enthält.
Nach Entfernen des Überstands wird das Leukozyten-Pellet wenigstens einmal bei Zimmertemperatur mit einer frischen Probe der Lyse-Lösung gewaschen, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation bei Zimmertemperatur für bis zu ungefähr 10 Minuten (bevorzugt ungefähr 5 Minuten). Nach dem erneuten Isolieren des Leukozyten-Pellets stehen die Leukozyten für weitere Schritte zur Verfügung (Lysieren vor der Polymerase-Kettenreaktion). Das gesamte Verfahren des Isolierens der Leukozyten benötigt höchstens 20 Minuten und bevorzugt ungefähr 10 bis ungefähr 16 Minuten. Eine Dauer von 15 Minuten wird am meisten bevorzugt.
Die isolierten Leukozyten können für eine Anzahl von Zwecken verwendet werden, die Fachleuten auf dem biologischen und medizinischen Gebiet leicht ersichtlich sind. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um die Funktionen verschiedener Leukozytenzellen zu studieren (was vielleicht eine weitere Fraktionierung von Subpopulationen erfordert), für die Herstellung von menschlichem Gamma-Interferon (wie z. B. in US-A-4,696,899 von Toth et al), zum Bestimmen des T4/T8 Zell-Verhältnisses (z. B. wie in US-A-4,826,760 von Privitera), zum Kultivieren von Viren und zum Herstellen von Vakzinen (z. B. wie in US-A-4,956-278 von Hart et al). Bevorzugt werden die Leukozyten in Vorbereitung für die Polymerasekettenreaktion getrennt, wie im einzelnen unten beschrieben.
Die allgemeinen Prinzipien und Bedingungen zur Amplifizierung und zum Nachweis von Nukleinsäuren unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion sind recht gut bekannt, wobei die Details hiervon in zahlreichen Literaturangaben vorliegen, einschließlich US-A-4,683,195, US-A-4,683,202, US-A-4,965,188 und WO-A-91/12342 und von Guatelli et al, Clin. Microbiol. Rev., 2 (2), S. 217–226 (1989). Im Hinblick auf die auf dem Gebiet vorhandene Lehre und die spezifische Lehre, die hierin bereitgestellt wird, sollte ein Fachmann keine Schwierigkeiten beim Ausüben der vorliegenden Erfindung haben, indem er das Leukozyten-Herstellungsverfahren dieser Erfindung mit Polymerase-Kettenreaktionsprozeduren kombiniert.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Amplifizierung oder den Nachweis von einer oder mehreren spezifischen Nukleinsäuren gerichtet, die in einer oder mehreren Nukleinsäuren in einer Probe aus Vollblut vorhanden sind.
Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich zum Herstellen, in exponentiellen Mengen in Bezug auf die Anzahl an beteiligten Reaktionsschritten, von wenigstens einer spezifischen Nukleinsäuresequenz, die mit einem infektiösen Agens, das in Leukozyten vorhanden ist, assoziiert ist. Das Produkt wird ein diskreter Nukleinsäureduplex mit Termini sein, die den Enden der spezifischen verwendeten Primer entsprechen. Darüberhinaus kann eine Vielzahl von Zielnukleinsäuren durch Verwendung eines entsprechenden Satzes an Primern und Nachweismitteln für jede spezifische Nukleinsäure amplifiziert und simultan nachgewiesen werden. Vielfache Sequenzen in derselben Nukleinsäure können ebenso amplifiziert und nachgewiesen werden. Die vorliegende Erfindung ist besonders zur Amplifizierung und Detektion von Zielnukleinsäuren nützlich, die in bakterieller DNA, Pilz-DNA, viraler RNA oder DNA gefunden wird, die in mit Bakterien infizieren oder Virus-infizierten Leukozyten vorhanden ist.
Das hierin beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um spezifische Nukleinsäuresequenzen, die mit infektiösen Krankheiten, genetischen Störungen oder zellulären Störungen, wie etwa Krebsen oder beliebigen anderen Krankheitszuständen assoziiert sind, die nicht spezifisch in diesen Kategorien eingeschlossen sind. Sie kann ebenso bei forensischen Untersuchungen und DNA-typing verwendet werden. Für die Zwecke dieser Erfindungen schließen genetische Krankheiten spezifische Deletionen oder Mutationen in genomischer DNA von einem beliebigen Organismus ein, wie etwa Sichelzellanämie, zystische Fibrose, α-Thalassämie, (3-Thalassämie und andere, die Fachleuten in leichter Weise offensichtlich sind. Menschliches Leukozyten-Antigen (HLA) kann mit der vorliegenden Erfindung kategorisiert werden. Bakterien, die nachgewiesen werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Bakterien, die im Blut gefunden werden können, Salmonella, Streptococcus-Spezies, Clamydia-Spezies, Gonococcus-Spezies, Mycobacteria-Spezies (wie etwa Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium avium-Komplex), Mycoplasma-Spezies (wie etwa Mycoplasma Haemophilus influenzae und Mycoplasma pneumoniae), Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferei, Pneumocystis carinii, Clostridium difficile, Campylobacter species, Yersinia-Species, Shigella-Species und Listeria-Species. Viren, die nachweisbar sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Herpes Simplex-Viren, Epstein Barr-Virus, respiratorische Syncytial-Viren, Hepatitis-Viren und Retroviren (wie etwa HTLV-I, HTLV-II, HIV-I und HIV-II). Protozoen-Parasiten und Pilze (einschließlich Hefen und Schimmelpilzen) sind ebenso nachweisbar. Andere nachweisbare Spezies sind einem Fachmann in leichter Weise offensichtlich. Die Erfindung ist besonders für den Nachweis des Vorhandenseins von DNA nützlich, die mit verschiedenen Bakterien oder Viren assoziiert sind.
Wie hierin in Bezug auf Primer oder Sonden verwendet, bezieht sich der Begriff „Oligonukleotid" auf ein Molekül, das zwei oder mehrere Deoxyribonucleotide oder Ribonucleotide umfaßt, und bevorzugt mehr als drei. Seine exakte Größe ist nicht wesentlich, hängt aber von vielen Faktoren ab, einschließlich der letztendlichen Verwendung oder Funktion des Oligonukleotids. Das Oligonukleotid kann mittels jedem auf dem Gebiet bekannten Verfahren gewonnen werden.
Ein „PCR-Reagenz" bezieht sich auf eines der Reagenzien, die für die PCR als wesentlich angesehen werden, nämlich einen oder mehrere Primer für die Zielnukleinsäure, eine DNA-Polymerase, ein DNA-Polymerase-Cofaktor und ein oder mehrere Deoxyribonukleosid-5'-Triphosphate.
Der Begriff „Primer" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, sei es natürlich vorkommend oder synthetisch produziert, das in der Lage ist, als ein Initiationspunkt der Synthese zu fungieren, wenn es unter Bedinungen gebracht wird, bei denen die Synthese eines zu einem Nukleinsäurestrang (d. h. Templat) komplementären Primerverlängerungsproduktes induziert wird. Solche Bedingungen schließen das Vorhandensein von Nukleotiden (wie etwa die vier Standard-Deoxyribonucleosid-5'-Triphosphate), eine DNA-Polymerase und DNA-Polymerase-Cofaktor und geeignete Temperaturen und pH ein.
Der Primer ist ausreichend lang, um die Synthese der Verlängerungsprodukte in der Anwesenheit der DNA-Polymerase zu primen. Die genaue Größe jedes Primers wird abhängig von der erwogenen Verwendung, der Komplexität der Zielsequenz, der Reaktionstemperatur und der Quelle des Primers variieren. Im allgemeinen haben die bei dieser Erfindung verwendeten Primer 12 bis 60 Nukleotide, und bevorzugt haben sie 18 bis 45 Nukleotide.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Primer werden so ausgewählt, daß sie im „wesentlichen komplementär" zu den unterschiedlichen Strängen jeder spezifischen, zu amplifizierenden Sequenz sind. Dies bedeutet, daß sie ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren entsprechenden Strängen zu hybridisieren, um die erwünschten hybridisierten Produkte zu bilden um dann durch eine DNA-Polymerase verlängerbar zu sein. In der bevorzugten und praktischsten Situation hat der Primer genaue Komplementärität zu der Zielnukleinsäure.
Primer, die hierin nützlich sind, können von einer Anzahl von Quellen erhalten und unter Verwendung von bekannten Techniken und Ausrüstungen, einschließlich von z. B. einem ABI-DNA-Synthesizer (erhältlich von Applied Biosystems) oder eines Biosearch 8600-Reihe oder 8800-Reihe-Synthesizer (erhältlich von Milligen-Biosearch, Inc.) und von bekannten Verfahren für ihre Verwendung (z. B. wie in US-A-4,965,188 beschrieben) hergestellt werden. Natürlicherweise vorkommende Primer, die aus biologischen Quellen isoliert werden, sind ebenso nützlich (wie etwa Restriktionsendonukleasenverdaue). Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Primer" ebenso auf eine Mischung von Primern.
Einer oder beide Primer können mit demselben oder unterschiedlichen Markierungen zum Nachweis markiert sein. Prozeduren zum Anhängen von Markierungen und zum Herstellen von Primern sind auf dem Gebiet wohlbekannt, z. B. wie beschrieben von Agrawal et al, Nucleic Acid Res., 14, S. 6227–45 (1986), US-A-4,914,210 (Levenson et al) im Hinblick auf Biotin-Markierungen, US-A-4,962,029 (Levenson et al) im Hinblick auf Enzym-Markierungen, und die darin angegebene Literaturangaben. Nützliche Markierungen schließen ebenso Radioisotope, elektronendichte Reagenzien, Chromogene, Fluorogene, phosphoreszierende Gruppen, Ferritin und andere magnetische Partikel (siehe US-A-4,795,698 von Owen et al und US-A-4,920,061 von Poynton et al), chemilumineszierende Gruppen (wie etwa Luminol) und andere spezifische Bindungs-Spezies (Avidin, Streptavidin, Biotin, Zukker oder Lektine) ein. Bevorzugte Markierungen sind Enzyme, Radioisotope und spezifische Bindungsspezies (wie etwa Biotin). Nützliche Enzyme schließen Glukoseoxidase, Peroxidase, Uricase, alkalische Phosphatase und andere auf dem Gebiet bekannte Enzyme ein und können an Oligonukleotide unter Verwendung von bekannten Prozeduren angehängt werden. Reagenzien, um ein kolorimetrisches oder chemilumineszierendes Signal mit solchen Enzymen bereitzustellen, sind wohlbekannt.
Wenn die Markierung ein Enzym ist, wie etwa eine Peroxidase, werden an einem bestimmten Punkt im Assay Wasserstoffperoxide und geeignete farbstoffbildende Zusammensetzungen zugegeben, um einen nachweisbaren Farbstoff bereitzustellen. Zum Beispiel schließen nützliche Farbstoff-bereitstellende Reagenzien Tetramethylbenzidin sowie Derivate davon und Leukofarbstoffe, wie etwa in Wasser unlösliche Triarylimidazol-Leukofarbstoffe (wie beschrieben in US-A-4,089,747 von Bruschi) oder andere Verbindungen ein, die dahingehend reagieren, daß sie einen Farbstoff in der Anwesenheit von Peroxidase und Wasserstoffperoxid bereitstellen. Besonders nützliche Farbstoff-bereitstellende Zusammensetzungen werden in EP-A-0 308 236 beschrieben (veröffentlicht am 22. März 1989). Chemilumineszierende Signale in Antwort auf eine Peroxidase-Markierung können ebenso unter der Verwendung der geeigneten Reagenzien erzeugt werden.
Wenn ein oder beide Primer biotinyliert sind, kann die amplifizierte Nukleinsäure unter Verwendung von nachweisbar markiertem Avidin oder einem Äquivalent davon (wie etwa Streptavidin) nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann Avidin mit einem Enzym konjugiert werden oder ein Radioisotop unter Verwendung von bekannter Technologie aufweisen. Biotin an dem amplifizierten Produkt komplexiert mit dem Avidin, und es werden geeignete Nachweistechniken verwendet, um ein radioaktives, kolorimetrisches oder chemilumineszierendes Signal nachzuweisen.
Wie hierin verwendet, ist eine Fänger-„Sonde" (capture „probe") ein Oligonukleotid, das im wesentlichen zu einer Nukleinsäuresequenz von einer oder mehreren Strängen der Zielnukleinsäure komplementär ist, und das verwendet wird, um die amplifizierte Nukleinsäure unlöslich zu machen. Das Sonden-Oligonucleotid wird im allgemeinen an ein geeignetes in Wasser unlösliches Substrat, wie etwa polymere Kügelchen oder Glaskügelchen, eine Mikrotiterplattenvertiefung, einen dünnen polymeren Film oder Zellulosefilm oder andere Materialien, die Fachleuten offensichtlich sind, angehängt. Das Oligonukleotid ist im allgemeinen ungefähr 12 bis ungefähr 40 Nukleotide lang, obwohl die Länge jedoch nicht wesentlich ist.
Eine DNA-Polymerase ist ein Enzym, das Deoxynucleosid-Monophosphat-Moleküle an das 3'-Hydroxy-Ende des Primer in einem Komplex aus Primer und Templat zufügt, aber diese Zufügung findet auf eine Template-abhängige Weise statt (d. h. abhängig von den spezifischen Nukleotiden in der Template). Viele nützliche DNA-Polymerasen sind auf dem Gebiet bekannt. Bevorzugt ist die Polymerase „thermostabil", was heißt, daß sie hitzestabil und bevorzugt bei höheren Temperaturen aktiv ist, insbesondere den hohen Temperaturen, die für die Denaturierung von DNA-Strängen verwendet werden. Insbesondere werden die thermostabilen DNA-Polymerasen nicht wesentlich durch die hohen Temperaturen inaktiviert, die in der PCR verwendet werden, wie hierin beschrieben. Solche Temperaturen werden von einer Anzahl von Reaktionsbedingungen, einschließlich pH, der Nukleotidzusammensetzung der Zielnukleinsäure und der Primer, der Länge der Primer, der Salzkonzentration und anderen auf dem Gebiet bekannten Bedingungen variieren.
Über eine Anzahl von thermostabilen DNA-Polymerasen ist auf dem Gebiet berichtet worden, einschließlich denjenigen, die im einzelnen US-A-4,965,188 (Multis et al) und US-A-4,889,818 (Gelfand et al) erwähnt werden. Insbesondere nützliche Polymerasen sind diejeni gen, die von verschiedenen Thermus-Bakterien Spezies erhalten werden, wie etwa Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis oder Thermus flavus. Andere nützliche thermostabile Polymerasen werden von einer Vielzahl von anderen mikrobiellen Quellen erhalten, einschließlich Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp. und denjenigen, die in WO-A-89/06691 beschrieben sind (veröffentlicht am 27. Juli 1989). Einige nützliche Polymerasen sind kommerziell erhältlich. Eine Anzahl von Techniken zum Isolieren von natürlich vorkommenden Polymerasen von Organismen, und zum Erzeugen von gentechnologisch veränderten Enzymen unter Verwendung von rekombinanten Techniken sind bekannt, wie in der in diesem Absatz zitierten Literatur dargestellt. Ein bevorzugtes Verfahren zum Herstellen einer DNA-Polymerase, die äquivalent zu derjenigen ist, die aus Thermus aquaticus erhalten wird, wird in EP-A-0 482 714 (veröffentlicht am 29. April 1992) beschrieben.
Ein DNA-Polymerase-Cofaktor bezieh sich auf eine Nicht-Proteinverbindung, von der die Enzymaktivität abhängt. Daher ist das Enzym ohne die Anwesenheit des Cofaktors katalytisch inaktiv. Der genaue Mechanismus der Wechselwirkung zwischen dem Cofaktor und der Polymerase ist gegenwärtig unbekannt. Eine Anzahl von solchen Materialien sind bekannte Cofaktoren, einschließlich Mangan- und Magnesiumverbindungen. Solche Verbindungen enthalten das Mangan oder Magnesium in einer solchen Form, daß divalente Anionen in eine wäßrige Lösung freigesetzt werden. Nützliche Cofaktoren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Mangan- und Magnesiumsalze, wie etwa Chloride, Sulfate, Acetate und Fettsäuresalze (z. B. Buttersäure-, Capronsäure-, Caprylsäure-, Caprinsäure- und Laurinsäuresalze). Die kleineren Salze, d. h. Chloride, Sulfate und Acetate, werden bevorzugt.
Magnesiumsalze, wie etwa Magnesiumchloride und -Sulfate sind bei der Ausübung der Erfindung am meisten bevorzugt.
Ebenso für die PCR benötigt wird ein Deoxyribonucleotid-5'-triphosphat, wie etwa dATP, dCTP, dGTP, dUTP oder dTTP. Gewöhnlich werden dATP, dCTP, dGTP und dTTP alle bei der PCR verwendet. Analoge wie etwa dITP und 7-Deaza-dGTP, sind ebenso nützlich.
Jedes PCR-Reagens kann individuell verpackt oder in einer Mischung mit einem oder mehreren anderen PCR-Reagenzien geliefert werden, einschließlich Primern, DNA-Polymerase-Cofaktoren und Deoxyribonucleosid-5'-Triphosphaten, alle in einem geeigneten Puffer. Re präsentative Puffer schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Tris(hydroxymethyl)aminomethan (was bevorzugt wird), N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure, 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure, N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-hydroxypropansulfonsäure), 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure und N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethansulfonsäure.
Da die zu amplifizierende oder nachzuweisende Nukleinsäure gewöhnlich in doppelsträngiger Form vorliegt, müssen die beiden Stränge getrennt werden (das heißt denaturiert, bevor das Priming stattfinden kann). Dies kann während des Extraktionsprozesses stattfinden oder ein separater Schritt danach sein. Die Denaturierung wird unter Verwendung einer Hitzebehandlung alleine oder in Kombination mit einem beliebigen geeigneten, anderen physikalischen, chemischen oder enzymatischen Mittel, wie im Stand der Technik beschrieben, erreicht werden. Die anfängliche Denaturierung wird im allgemeinen durchgeführt durch Erhitzen der Probe, von der angenommen wird, daß sie die Zielnukleinsäure enthält, auf eine erste Temperatur von 85 bis ungefähr 100°C für eine geeignete Zeit, z. B. von ungefähr einer Sekunde bis 3 Minuten.
Die denaturierten Stränge werden dann auf eine Temperatur abgekühlt, die im allgemeinen im Bereich von ungefähr 55 bis ungefähr 70°C liegt. Die Zeit, die zum Abkühlen der denaturierten Stränge benötigt wird, wird, abhängig von dem Typ der Vorrichtung variieren, der für den PCR-Prozeß verwendet wird.
Wenn die denaturierten Stränge abgekühlt sind, wird die Reaktionsmischung, enthaltend die PCR-Reagenzien auf einer geeigneten Temperatur inkubiert, um die Bildung von Primer-Verlängerungsprodukten zu bewirken. Im allgemeinen liegt diese Temperatur wenigstens bei ungefähr 50°C und bevorzugt im Bereich von ungefähr 65 bis ungefähr 75°C. In einigen Ausführungsformen wird eine Temperatur zum Priming und eine andere Temperatur zur Primer-Verlängerung verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dieselbe Temperatur für sowohl das Priming als auch die Primerverlängerung verwendet. Die Zeit für die Inkubation kann, abhängig von der Inkubationstemperatur, in breiter Weise variieren, aber in bevorzugten Ausführungsformen beträgt sie ungefähr 1 bis ungefähr 120 Sekunden.
Die so gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte können auf eine geeignete Weise nachgewiesen werden, während sie als hybridisierte Produkte vorliegen, oder, wenn sie denaturiert worden sind, entweder zum Nachweis von einem oder beiden Strängen oder für weiteres Cycling in der PCR.
Wenn die hybridisierten Primer-Verlängerungsprodukte denaturiert werden, kann die PCR weiter in beliebig vielen Zyklen der Bildung von Primer-Verlängerungsprodukten und Denaturierung durchgeführt werden. Im allgemeinen werden wenigstens 20 Zyklen durchgeführt, wobei 20 bis 50 Zyklen bevorzugt werden.
Nach der Denaturierung das letzte Mal im Assay können die endgültigen Primer-Verlängerungsprodukte nachgewiesen werden, wie unten beschrieben.
Das Amplifikationsverfahren dieser Erfindung wird bevorzugt auf eine kontinuierliche, automatisierte Weise durchgeführt, so daß die Reaktionsmischung Temperaturzyklen auf eine kontrollierte Weise für erwünschte vorher eingestellte Zeiten unterworfen wird. Eine Anzahl von Instrumenten sind zu diesem Zweck entwickelt worden, was ein Fachmann auf dem Gebiet weiß.
Ein solches Instrument zu diesem Zweck wird in Einzelheiten in US-A-4,965,188 und EP-A-0 236 069 beschrieben und beinhaltet das Bewegen von Flüssigkeiten von einer Temperaturumgebung zu einer anderen unter kontrollierten Bedingungen.
Ein anderes Instrument verwendet die Durchführung von Temperaturzyklen, ohne ein Flüssigkeitshandhabungssystem und wird in Einzelheiten in US-A-4,965,188 und EP-A-0 236 069 beschrieben. Im allgemeinen beinhaltet dieses Instrument einen wärmeleitenden Behälter zum Halten einer Anzahl von Reaktionsröhrchen, enthaltend eine Reaktionsmischung, Mittel zum Heizen, Kühlen und der Temperaturaufrechterhaltung, und Rechnermittel, um Signale zu erzeugen, um die Amplifizierungssequenz, Veränderungen hinsichtlich der Temperatur und des Timings zu steuern.
Ein Gaschromatograph ist ebenso für die Amplifizierung verwendet worden wie z. B. beschrieben von Hoffman et al, Biotechniques, 6(10), S. 932–936 (1988), und die Amplifizierung in einer „Teetasse" ist als eine einfache und billige Technik beschrieben worden [Innis et al (Eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Kapitel 51, S. 429–434 von Robert Watson, Academic Press, Inc., 1990].
Ein bevorzugtes Instrument zum Durchführen von Amplifizierungsreaktionen in einer wegwerfbaren chemischen Testpackung wird in Einzelheiten in EP-A-0 402 994 beschrieben (veröffentlicht am 19. Dezember 1990). Im allgemeinen umfaßt dieses Instrument eine Oberfläche zum Tragen einer chemischen Testpackung, Druckvorrichtungen, die oberhalb der Oberflächen angebracht sind, um auf die Reaktionspackung einzuwirken, um Flüssigkeiten zwischen angrenzenden Kammern in der Testpackung zu übertragen, und Mittel zum Betreiben der Druckvorrichtungen durch eine Reihe von Bewegungen, die sich über die Testpakkung erstrecken.
EP-A-0 402 994 stellt Details von nützlichen chemischen Testpackungen bereit, die unter Verwendung des in derselben Veröffentlichung beschriebenen Instruments verarbeitet werden können. Ebenso sind Mittel zum Heizen und Kühlen der Testpackung in wiederholten Intervallen (d. h. durch Zyklen) darin beschrieben, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Wie oben bemerkt, werden diese Instrumente und Testpackungen, obwohl sie bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, nicht als wesentlich angesehen, um die hierin bemerkten vorteilhaften Resultate zu erhalten.
Es ist ebenso nützlich, daß das Verfahren dieser Erfindung in einem geeigneten Behälter ausgefizhrt wird. Der einfachste Behälter wäre ein Teströhrchen, eine Küvette, ein Kolben oder ein Becher, aber es sind anspruchsvollere Behälter entwickelt worden, um die automatisierten Prozeduren zum Durchführen des Verfahrens zu erleichtern (siehe z. B. WO-A-91/12342). Zum Beispiel werden Küvette und chemische Testpackung (ebenso als Taschen bekannt (pouches)), die konstruiert wurden, um bestimmte Temperatureigenschaften während der Ausübung des Verfahrens bereitzustellen, in US-A-4,902,624 (Columbus et al) und EP-A-0 381 501 beschrieben (veröffentlicht am 8. August 1990). Solche Testpackungen haben eine Vielzahl von Reaktionskammern mit verschiedenen Reagenzien, Puffern und anderen Materialien, die zu verschiedenen Stufen bei der Amplifizierung oder dem Nachweisverfahren nützlich sind. Die Packungen können in geeigneter Weise und rasch in Zyklen erhitzt und abgekühlt werden, um die verschiedenen Schritte des Amplifikationsverfahrens dieser Erfindung zu fördern. Andere nützliche Behälter könnten in geeigneter Weise für die automatisierte oder einzelne Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung ausgebildet sein.
Damit das amplifizierte Produkt nachgewiesen wird, ist es oft nützlich (aber nicht notwendig), daß es von den anderen Materialien in dem Reaktionsmedium getrennt wird. Dies wird auf eine Anzahl von Wegen erzielt, aber bevorzugt unter Verwendung einer Wasser-unlöslichen Fängersonde, so daß die Primer-Verlängerungsprodukte, die bei dem Verfahren repliziert werden, in Wasser unlöslich gemacht und aus der Reaktionsmischung entfernt werden. Die Sonden können an unlösliche Materialien auf eine geeignete Weise angehängt werden.
Das amplifizierte Produkt kann von unerwünschten Materialien unter Verwendung eines Oligonukleotids abgetrennt werden, das dazu komplementär ist, wobei das Oligonukleotid an ein unlösliches Substrat angehängt ist (wie etwa polymere oder magnetische Partikel) unter Verwendung von bekannten Anhängungstechniken, um die (oben aufgeführte) Fängersonde zu bilden. Eine solche Technik wird in EP-A-0 439 222 beschrieben (veröffentlicht am 18. September 1991). Andere Techniken werden z. B. in US-A-4,713,326 (Dattagupta et al), WO-A-88/01302 (veröffentlicht am 25. Februar 1988) und EP-B-0 070 687 (veröffentlicht am 26. Januar 1981) beschrieben, wobei Intermediat-Oligonukleotide in einem hybridisierten Produkt aus vielfachen Bestandteilen verwendet werden, an die das Fängeroligonukleotid und die amplifizierte Nukleinsäure geknüpft werden. Die Trennung kann mittels Zentrifugation oder durch Aussetzen der Mischung gegenüber einem Magnetfeld erzielt werden.
Andere nützliche Trennungsmittel sind mikroporöse Filtermembranen, wie etwa die Polyamidmembranen, vermarktet von Pall Corp. (z. B. als LOPRODYNE^TM oder BIODYNE^TM-Membranen). Sie können unbeschichtet oder mit oberflächenaktiven Mitteln oder anderen Materialien vorbeschichtet sein, die die analytischen Prozeduren erleichtern.
Die Membranen können als ein separates Substrat mit geeigneten Behältern zum Durchführen von anderen Schritten des Assay verwendet werden. Sie können als ein Teil einer wegwerfbaren Testvorrichtung angebracht werden. Verschiedene wegwerfbare Testvorrichtungen sind auf dem Gebiet bekannt, einschließlich denjenigen, die in US-A-3,825,410 (Bagshawe), US-A-3,888,629 (Bagshawe), US-A-3,970,429 (Updike) und US-A-4,446,232 (Liotta) beschrieben sind. Insbesondere nützliche Vorrichtungen werden in US-A-4,921,677 (Hinckley et al) beschrieben und sind kommerziell erhältlich als SURECELL^TM-Testvorrichtungen und Assay-Kits von Eastman Kodak Company.
Jeder nützliche feste Träger kann zur Trennung von Wasser-unlöslichen Produkten zum Nachweis verwendet werden, einschließlich einer Mikrotiterplatte, eines Teströhrchens, eines Bechers, Kügelchen, eines Films, Membranfiltern, Filterpapiere, Gele, magnetische Partikel oder Glaswolle. Er kann aus einer Anzahl von Materialien gemacht sein, einschließlich Glas, Keramik, Metalle, natürlich vorkommende oder synthetische Polymere, Zellulose-Materialien, Filtermaterialien und andere, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Insbesondere nützliche feste Trägermaterialien sind polymere Kügelchen, die im allgemeinen eine durchschnittliche Partikelgröße von ungefähr 0,1 bis ungefähr 10 Mikrometer haben.
Der Nachweis kann ebenso durchgeführt werden durch Immobilisieren einer Fängersonde auf einem flachen Substrat, wie etwa den oben beschriebenen mikroporösen Filtrationsmembranen, oder auf dünnen polymeren Filmen, Filmlaminaten, unbeschichteten Papieren oder Polymer-beschichteten Papieren, von denen eine Anzahl auf dem Gebiet bekannt sind. Andere Einzelheiten über solche Materialien werden in EP-A-0 408 738 bereitgestellt (veröffentlicht am 23. Januar 1991).
Die zum Durchführen des Amplifizierungsverfahrens dieser Erfindung benötigten Reagenzien, Materialien, und Anweisungen, können in einem Testkit geliefert werden. Separate Verpackungen oder Behälter können für das Ammoniumchlorid und die Carbonsäure oder Metallcarboxylat, Primer, PCR-Reagenzien, Testvorrichtungen (oder Testpackungen) und andere Materialien verwendet werden, die im allgemeinen für das Verfahren erforderlich sind. Bevorzugt schließt das Testkit die Mischung von Ammoniumchlorid und Carbonsäure oder eines Metallcarboxylats, alle notwendigen PCR-Reagenzien und einen geeigneten Behälter oder eine Testverpackung zum Durchführen der Reaktionen ein.
Die folgenden Beispiele werden eingeschlossen, um die Praxis dieser Erfindung zu veranschaulichen, und sollen nicht in irgendeiner Weise beschränkend wirken. Alle Prozentangaben sind bezogen auf das Gewicht, sofern nicht anders ausgedrückt.
Beispiel 1 Herstellung einer Vollblutprobe
Dieses Beispiel vergleicht die Leukozytenanzahl, die nach Trennung von Leukozyten von Erythrozyten und anderen Materialien in einer Vollblutprobe unter Verwendung der Erythrozyten-Lyse-Lösung-Zubereitung und Prozeduren erhalten wird, die unten beschrieben sind.
Heparinisierte Vollblutproben wurden von vier unterschiedlichen Spendern erhalten.
Ein Aliquot (0,5 ml) jeder Probe wurde in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml einer Lyse-Lösung (pH 7,2) enthaltend in allen Fällen 10 mM Natriumhydrogencarbonat und,

A. 160 mM Ammoniumchlorid (160AC) oder
B. 160 mM Ammoniumchlorid und 0,01 Gewichtsprozent Essigsäure (160AC/AA), oder
C. 80 mM Ammoniumchlorid (80AC) oder
D. 80 mM Ammoniumchlorid und 0,01 Gewichtsprozent Essigsäure (80AC/AA),

Die Mikrozentrifugenröhrchen, enthaltend die Proben in den obigen Lösungen, wurden bei Zimmertemperatur für 5 Minuten unter Verwendung eines automatischen Schüttlers leicht gemischt. Die Röhrchen wurden dann für 5 Minuten bei 3000 upm bei Umgebungstemperatur zentrifugiert. Der Überstand, enthaltend lysierte Erythrozyten, lösliche Bestandteile und anderes Material, wurde verworfen. Das Pellet, enthaltend Leukozyten, wurde in frischer Lyse-Lösung resuspendiert, die mit der Lösung identisch war, mit der die Probe ursprünglich vermischt wurde. Die Suspension wurde erneut bei 3000 upm für 5 Minuten bei Umgebungstemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in 1 ml PBS (Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,2, Sigma Chemical Company, Produkt-Nr. P0261) resuspendiert. Ein Aliquot der Suspension, enthaltend die abgetrennten Leukozyten, wurde 1 : 10 mit frischer PBS verdünnt. Das gesamte Verfahren wurde in ungefähr 15 Minuten durchgeführt.
Die Anwesenheit von Leukozyten wurde mittels Mikroskopie verifiziert, und die Zellen wurden unter einem Mikroskop unter Verwendung einer Hämozytometerkammer gezählt. Drei Replika-Zählungen wurden an jeder verdünnten und resuspendierten Probe durchgeführt, und die durchschnittliche Zählung und Standardabweichung vom Durschnitt wurde berechnet. Unter Kombination des Verdünnungsfaktors mit dem Hämozytometer-Korrekturfaktor (bereitgestellt vom Hämozytometer-Hersteller) wurde die durchschnittliche Zählung, die unter Verwendung des Hämozytometers erhalten wurde, in eine Schätzung der Anzahl an weißen Blutkörperchen pro ml Vollblut in der ursprünglichen Probe umgewandelt. Diese geschätzten Zahlenwerte werden in Tabelle 1 unten für die unterschiedlichen, oben aufgeführten Ammoniumchloridlösungen unten gezeigt.
TABELLE 1
Die in Tabelle 1 gezeigten Resultate zeigen, daß die Wiedergewinnung von Leukozyten aus der ursprünglichen Probe signifikant größer war; wenn die Carbonsäure, Essigsäure, vorhanden war, wobei die höchste Wiedergewinnung in der bevorzugten Ausführungsform (80AC/AA) erzielt wurde. Dies ist von besonderem Vorteil, wenn die Zielnukleinsäure in sehr geringem Titer in der Zellpopulation vorhanden sein kann.
Beispiel 2 Verfahren zum Isolieren, Amplifizieren und Nachweis einer Zielnukleinsäure
Dieses Beispiel zeigt die Amplifizierung und Nachweis von HIV-I-DNA, die aus Leukozyten unter Verwendung der Prozedur zum Isolieren von weißen Blutkörperchen, beschrieben in Beispiel 1, freigesetzt wurde.
Die folgenden Materialien und Verfahren wurden in diesem Beispiel verwendet: Die in diesem Beispiel verwendeten Primer hatten die folgenden Sequenzen. Beide der folgenden Primer sind zu der gag-Region von HIV-I-DNA komplementär.
In den Primern stellt X eine Biotinyl-Gruppe dar (abgeleitet aus einem Biotin-Phosphoramidit-Reagenz, DuPont), die an das Oligonukleotid durch zwei Aminotetrathylenglycol-Spacergruppe unter Verwendung der in US-A-4,962,029 (Levenson et al) beschriebenen Technologie angehängt ist.
Die Fängersonde, die in diesem Beispiel verwendet wurde, hatte die folgende Sequenz.
„Y" stellt zwei Tetraethylenglycol-Spacer dar, die an eine einzelne Amindiol-Verknüpfungsgruppe unter der Verwendung der Lehre von US-A-4,914,210 (Levenson et al) angehängt wurden.
Die Primer und die Fängersonde wurden unter Verwendung von bekannten Ausgangsmaterialien und -Prozeduren unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 380B, einem Drei-Säulen-DNA-Synthesizer, Standard-Phosphoramidit-Chemie und dem ABI-Schnellzyklusprotokoll mit 1 μmolarem-Maßstab hergestellt. Nukleosid-3'-Phosphoramidite und Nukleosid-derivatisierte Glasträger mit kontrollierten Poren wurden von Applied Biosystems erhalten. Alle Aufreinigungen wurden unter Verwendung einer Nukleinsäureaufreinigungssäule durchgeführt, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC-Techniken.
Um Fängerreagenzien zu bilden, wurden die Proben kovalent an polymere Partikel (1 μm Durchschnittsdurchmesser) angehängt, die unter Verwendung von herkömmlichen Emulsionstechniken aus Poly[styrol-co-3-(p-vinylbenzylthio)propionsäure] (95 : 5 Gewichtsverhältnis, 1 μm Durchschnittsdurchmesser) hergestellt worden waren. Eine Suspension der Partikel in Wasser wurde mit 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (0,1 molar, pH 6) gewaschen und als 10% Feststoff suspendiert. Eine Probe (3,3 ml) der gewaschenen Partikel, verdünnt auf 3,33% Feststoff im Puffer (0,1 molar), wurde mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodümidhydrochlorid (2,1 ml von 84 mg/ml Wasser) und der Sonde (983 μl 44.44 OD/ml nanoreines Wasser) gemischt. Die resultierende Suspension wurde auf 50°C in einem Wasserbad für ungefähr zwei Stunden mit intermettierendem Mischen erhitzt und zentrifugiert. Die Partikel wurden dann dreimal mit Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (0,01 molar, pH 8), enthaltend (Ethylendinitrilo)tetraessigsäure-Dinatriumsalz (0,1 mmolar), gewaschen und darin auf 4% Feststoff resuspendiert.
Nach der Verdünnung auf 0,25% Feststoffe mit Puffer wurden die Fängerreagenzien (1,2 μl) auf definierte Regionen der mikroporösen Membranen (LOPRODYNE-Polyamidmembran, 5 μm durschnittliche Porengröße, von Pall Corp.) aufgetragen und getrocknet, in den Testnäpfen von wegwerfbaren SURECELL-Testvorrichtung, (erhältlich von Johnson & Johnson Cli- nical Diagnostics Company), die im einzelnen in US-A-4,948,561 (Hinckley et al) beschrieben sind.
PCR wurden unter Verwendung einer automatisierten Johnson & Johnson Clinical Diagnostics Company-PCR-Vorrichtung durchgeführt, die im einzelnen in US-A-5,089,233 beschrieben ist, unter Verwendung des Heiz- und Kühl-Protokolls, das unten beschrieben ist.
Rekombinante DNA-Polymerase von Thermus aquaticus wurde unter Verwendung von herkömmlichen Prozeduren erhalten.
Glycerol, Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer und die dNTP's wurden von Sigma Chemical erhalten.
Vollblut aus Patienten, die HIV-sero-positiv (Proben Nr. 1–10) und HIV-sero-negativ (Proben 11 und 12) waren, wurden von einem lokalen Krankenhaus erhalten. Das Vollblut wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 behandelt, um die Erythrozyten zu lysieren und weiße Blutkörperchen zu isolieren, unter Verwendung der Lyse-Lösung D aus Beispiel 1. Die DNA aus den weißen Blutkörperchen wurde von dem Pellet der weißen Blutkörperchen extrahiert, das nach dem zweiten Waschschritt erhalten wurde.
Die Extraktion der DNA aus den weißen Blutkörperchen wurde unter Verwendung einer DNA-Polymer-Fängertechnik erzielt. Kurz gesagt, wurden 150 μl einer Leukozyten-Lyse-Lösung, enthaltend 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer, 0,15% des oberflächenaktiven Mittels Tween 20^TM und 25 μg/μl Kalbsthymus-DNA zu dem Pellet aus weißen Blutkörperchen zugegeben. Die Suspension wurde gemischt und dann auf 100°C für 5 Minuten erhitzt. Nachdem die Suspension auf Zimmertemperatur abkühlte, wurden 150 μl ACES (2-[(2-Amino-2-oxoethyl)-amino]ethansulfonsäure)-Puffer zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 25 μl einer Lösung aus Polymer-Fängeragens. Die Mischung wurde kräftig gemischt und dann bei 14.000 upm für 2 Minuten bei Umgebungstemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und verworfen. Zu dem Pellet, enthaltend den Fängeragens-DNA-Komplex, wurden 100 μl 20 mmolar Natriumhydroxid zugegeben, und die Mischung wurde dann auf 100°C für 5 Minuten erhitzt, um die DNA freizusetzen. Diese Lösung (25 μl), ohne weitere Behandlung, wurde direkt in das PCR-Reagens-Gemisch eingeführt.
Die Leukofarbstoff-Dispersion enthielt Agarose (0,5%), 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)imidazol-Leukofarbstoff (250 μmolar), Diethylentriaminpentaessigsäure (100 μmolar), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mmolar), Polyvinylpyrrolidon (112 mmolar) und Natriumphosphat, einbasig, 1-Hydrat (10 mmolar).
Die Konjugatlösung, die in diesem Beispiel verwendet wurde, enthielt ein Konjugat (126 μl/l) aus Streptavidin und Meerrettichperoxidase, erhalten von kommerziellen Quellen (Zymed Laboratories, Inc.), Casein (0,5%) und Merthiolat (0,5%) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (24 mmolar Natriumphosphat und 75 mmolar Natriumchlorid). Die Konjugatendkonzentration war 312 ng/ml.
Die Waschlösung, die in diesem Beispiel verwendet wurde, enthielt Natriumchlorid (373 mmolar), (Ethylendinitrilo)tetraessigsäure-dinatriumsalz (2,5 mmolar), Decylnatriumsulfat (38 mmolar) und Ethylmercurithiosalicylsäure, Natriumsalz (25 μmolar) in Natriumphosphat, einbasig, 1-Hydrat-Puffer (25 mmolar, pH 7,4).
Ein monoklonaler „TP4"-Antikörper wurde in der Reaktionsmischung verwendet. Dieser Antikörper ist für DNA-Polymerase von Thermus aquaticus spezifisch und in größeren Einzelheiten in US 5,338,671 an Scalice et al beschrieben. Allgemein gesagt, wurde er aus den Immunzellen von Mäusen, die mit DNA-Polymerase immunisiert worden waren, unter Verwendung von herkömmlichen Prozeduren, wie etwa denjenigen, die von Milstein et al, Nature 256, S. 495–497, 1975 beschrieben sind, und Hybridoma-Zellinien (entweder HB 11126 oder 11127 aus ATCC) hergestellt, wobei die Antikörper-sezernierenden Zellen des Wirtstieres aus Lymphgewebe isoliert wurden (wie etwa der Milz) und mit murinen SP2/0-Ag-14-Myeloma-Zellen in der Anwesenheit von Polyethylenglycol fusioniert wurden, in selektive Medien verdünnt und in Multinapf-Gewebekulturschalen ausplattiert wurden. Ungefähr 7–14 Tage später wurden die Hybridomazellen, enthaltend die Antikörper, geerntet und unter Verwendung von herkömmlichen Techniken aufgereinigt.
Die Polymerase-Kettenreaktionsmischung (100 μl) enthielt Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (10 mmolar, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar), dATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 1,5 mmolar), Primer (jeweils 0,4 μmolar), Gelatine (0,01%), die genannte DNA-Polymerase (16 Einheiten/100 μl) und den monoklonalen „TP4"-Antikörper (50 : 1 molares Verhältnis zur DNA-Polymerase).
Der Rest der Reagenzien und Materialien wurde unter der Verwendung von herkömmlichen Quellen erhalten oder in Johnson & Johnson Clinical Diagnostics Company unter Verwendung herkömmlicher Prozeduren hergestellt.
Nachweis der amplifizierten HIV-I-DNA
Das PCR-Protokoll dieser Erfindung schloß ein: 40 Amplifizierungszyklen, wobei jeder Zyklus bestand aus:

A) Erhitzen auf 95°C für 15 Sekunden zur Denaturierung (195 Sekunden nur beim ersten Zyklus), und
B, C) Priming (Annealing) und Verlängerung bei 64°C für 30 Sekunden.

Der Assay wurde unter der Verwendung von 16 Einheiten DNA-Polymerase/100 μl und 25 μl der DNA-Extraktionsmischung, wie oben angezeigt, in der Reaktionsmischung durchgeführt. Der Nachweis der Amplifizierungsprodukte wurde auf die folgende Weise erzielt. Ein Teil (5 μl) der endgültigen Amplifikations-Reaktionsmischung wurde mit einer Pufferlösung [Tris(hydroxymethyl)aminomethan (10 mmolar, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar) und Gelatine (0,01%)] (95 μl) gemischt und bei 95°C für 5 Minuten inkubiert, um die Nukleinsäuren zu denaturieren. Die resultierende Lösung wurde dann auf SURECELL^TM-Testvorrichtungen übertragen. Die so amplifizierten Zielnukleinsäuren konnten an die Fängersonden bei 50°C hybridisiert werden.
Die Testnäpfe der Testvorrichtung wurden dann bei 55°C mit einer Pufferlösung [Natriumdihydrogenphosphat (10 mmolar), Natriumchlorid (150 mmolar), Natriumdecylsulfat (1%) und Ethylendiamintetraessigsäure (1 mmolar)] (250 μl, pH 7,4) gewaschen. Die Streptavidin-Peroxidase-Konjugatlösung (50 μl), die oben angeführt wurde, wurde zu jedem Testnapf dazugegeben, und man ließ sie durch die Membran bei Zimmertemperatur durchfließen. Nach zwei Minuten wurden die Testnäpfe ein zweites Mal gewaschen.
Die oben aufgeführte Leukofarbstoff-Dispersion (100 μl) wurde zu jedem Testnapf zugegeben, und die Vorrichtungen wurden bei Zimmertemperatur für zwei Minuten inkubiert. Eine Lösung (100 μl) von Natriumazid (0,1%) wurde zugegeben, um die Farbstoffentwicklung zu beenden.
Die resultierenden Farbstoffsignale, die in den Assays beobachtet wurden, wurden visuell auf einer Dichteskala von 0 bis 10 eingestuft (wobei 10 die höchste beobachtete Dichte war). Die Resultate der Assays werden unten in Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE 2 Die Resultate der Amplifizierung von DNA aus Leukozyten, die aus Vollblut von Patienten gemäß dem Verfahren dieser Erfindung isoliert worden waren. Nachweis von HIV-I-Produkt.
Ein Farbwert von 2,0 oder weniger, basierend auf internen Kontrollen, stellt ein Signal auf dem Hintergrundslevel dar. Die Farbwerte zeigten deutlich an, daß PCR stattgefunden hatte, und daß die DNA aus dem Ziel-HIV-I amplifiziert und nachgewiesen worden war.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren zur selektiven Herstellung von Leukozyten, umfassend: A) Mischen einer Vollblutprobe mit einer Erythrozyten-Lyse-Lösung, umfassend von 50 mM bis 100 mM Ammoniumchlorid und zwischen ungefähr 0,001 Gewichtsprozent bis ungefähr 0,1 Gewichtsprozent einer Carbonsäure oder eines Metallcarboxylats mit wenigstens einer Carboxylgruppe, wobei die Carbonsäure oder das Metallcarboxylat die strukturelle Formel hat: R-COOM wobei M Wasserstoff oder ein monovalentes Kation ist, und R ein Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein substituiertes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Alkenyl von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein substituiertes Alkenyl von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Aryl, ein substituiertes Aryl, ein Arylalkyl oder ein substituiertes Arylalkyl ist, und wobei die Lyse-Lösung einen pH von zwischen 6 und 8 hat, B) Zentrifugieren der resultierenden Mischung, um ein Pellet aus Leukozyten aus der Vollblutprobe zu bilden, C) nach Entfernen des Überstandes, Waschen des Leukozyten-Pellet in einer frischen Menge Lyse-Lösung, und D) Zentrifugieren und Isolieren des Leukozyten-Pellets, vorausgesetzt, daß Schritte A) bis D) innerhalb von ungefähr 20 Minuten durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lyse-Lösung von ungefähr 50 bis ungefähr 100 mM Ammoniumchlorid enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Menge an Carbonsäure oder Metallcarboxylat zwischen ungefähr 0,005 und 0,05 Gewichtsprozent liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Carbonsäure eine Monohalogenessigsäure, eine Dihalogenessigsäure, eine Trihalogenessigsäure oder Essigsäure ist und bevorzugt Essigsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der pH zwischen 6,5 und 7,5 liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Schritte A) bis D) innerhalb von ungefähr 10 bis ungefähr 16 Minuten durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Vollblutprobe ein Volumen von ungefähr 0,01 bis ungefähr 10 ml hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei jeder Zentrifugationsschritt innerhalb von weniger als ungefähr 10 Minuten durchgeführt wird.
Verfahren zur Amplifizierung und zum Nachweis einer Zielnukleinsäure, umfasend: I) Selektives Herstellen von Leukozyten, von denen angenommen wird, daß sie eine Zielnukleinsäure enthalten, in einer Vollblutprobe durch Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8; II) Lysieren der Leukozyten in dem gewaschenen Pellet, um die Zielnukleinsäure freizusetzen; III) Amplifizieren der freigesetzten Zielnukleinsäure unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und einem Satz an Primern, die für die einander gegenüberliegenden Stränge der Zielnukleinsäure spezifisch und damit hybridisierbar sind; und IV) Nachweisen der amplifizierten Zielnukleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Polymerasekettenreaktion in der Anwesenheit einer thermostabilen DNA-Polymerase durchgeführt wird, und wobei einer oder beide Primer zum Nachweis markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die markierten Primer mit Biotin markiert sind, und der Nachweis unter Verwendung eines Konjugats von Avidin und einem Enzym erzielt wird, das für ein nachweisbares Signal in der Anwesenheit seines Substrates sorgen kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 zum Nachweis einer viralen, bakteriellen, Pilz- oder Protozon-RNA oder -DNA, wie etwa zum Nachweis von RNA oder DNA von einer von Streptococcus-Spezies, Mycobacterium-Spezies, Pneumocystis carinii, Herpes-Simplex-Viren, Epstein-Barr-Virus, Cytomegalovirus, Hepatitis-Viren, Retroviren, Candida-Spezies oder Aspergillus-Spezies.
Verfahren nach Anspruch 12 zum Nachweis von HIV-I-, HIV-2-, Mycobacterium tuberculosis-, Mycobacterium-avium-Komplex- oder Cytomegalovirus-RNA oder -DNA.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die amplifizierte Zielnukleinsäure unter Verwendung eines Reagenz nachgewiesen wird, das für ein kolorimetrisches oder chemilumineszierendes Signal in Antwort auf die Markierung auf dem markierten Primer sorgt.
Ein Kit zur Polymerasekettenreaktion, umfassend: a) Ein Satz aus zwei Primern, die für die einander gegenüberliegenden Stränge einer Zielnukleinsäure spezifisch und damit hybridisierbar sind, wobei einer oder beide Primer mit einer Nachweisgruppe markiert sind und, in derselben oder unterschiedlichen Packung, wenigstens ein zusätzliches PCR-Reagenz, und b) in einer separaten Verpackung, eine Lösung oder eine trockene Zusammensetzung, enthaltend, wenn die trockene Zusammensetzung mit Wasser rekonstituiert wird, wenigstens ungefähr 50 mM Ammoniumchlorid und wenigstens ungefähr 0,005 Gewichtsprozent einer Carbonsäure oder eines Metallcarboxylats mit wenigstens einer Carboxylgruppe, wobei die Carbonsäure oder das Metallcarboxylat die strukturelle Formel hat: R-COOM wobei M Wasserstoff oder ein monovalentes Kation ist, und R ein Alkyl, von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein substituiertes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Alkenyl von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein substituiertes Alkenyl von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein Aryl, ein substituiertes Aryl, ein Arylalkyl oder ein substituiertes Arylalkyl ist, und wobei die Lösung einen pH von zwischen 6 und 8 hat.
Kit nach Anspruch 15, wobei einer oder beide Primer mit Biotin markiert sind und das Kit zusätzlich einen thermostabilen DNA-Polymerase-Cofaktor, der ein Magnesium- oder ein Mangansalz ist, und dATP, dCTP, dGTP und dTTP umfaßt.
Kit nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, wobei der Satz Primer zwei für die einander gegenüberliegenden Stränge von HIV-I-, HIV-2-, Mycobacterium tuberculosis-, Mycobacterium-avium-Komplex- oder Cytomegalovirus-DNA oder -RNA spezifische und damit hybridisierbare Primer umfaßt.