KR20070103417A

KR20070103417A - 핵산의 추출 및 확인방법

Info

Publication number: KR20070103417A
Application number: KR1020077017810A
Authority: KR
Inventors: 볼프람 에이치.이. 팔러; 알프레드 엠. 프린스; 돈훈 이; 린다 앤드루스
Original assignee: 더 뉴욕 블러드 센터, 인코포레이티드
Priority date: 2005-01-21
Filing date: 2006-01-20
Publication date: 2007-10-23
Also published as: EP1846579A4; WO2006088601A2; MX2007008847A; AU2006214698A1; CN101268198A; JP2008527997A; WO2006088601A3; EP1846579A2; WO2006088601A8; IL184577A0; US20060240409A1; CA2594491A1

Abstract

본 발명은 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다. 상기 샘플은 세포, 바이러스 또는 세포 및 바이러스를 함유한다. 상기 방법은 세제를 함유하는 용해 용액을 샘플에 첨가하여 세포 또는 바이러스를 용해하여 용해물을 생성하고, 용해물에 알코올을 가하여 핵산을 응집 또는 침전시키고, 및 유리섬유 필터를 통하여 혼합물을 여과하여 용해물-알코올 혼합물로부터 핵산을 정제하는 단계를 포함한다.

핵산, 세포, 바이러스, 추출, 정제

Description

핵산의 추출 및 확인방법{METHOD FOR EXTRACTION AND IDENTIFICATION OF NUCLEIC ACIDS}

본 발명은 세포, 바이러스 또는 세포 및 바이러스를 함유하는 샘플로부터 핵산의 추출방법에 관한 것이다.

본 출원은 본 명세서에 전부 참고로 포함시킨 2005년 1월 21일자로 출원된 미국 가출원 제60/645,905호의 우선권을 주장한다.

공중위생 분야는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 세포유전자에 매우 민감한 분석을 점점 요구하고 있다. 고처리율 샘플 스크리닝 공정(예, 혈액 공급, 모기 중의 아르보 바이러스(Arbo-virus), 분자 수준 감시(예, 새 개체군 중의 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus)), 수질 분석, 감염 진단, 유전인자에 근거한 진단(예, 혈우병, 유방암 기질, 암세포) 등이 유리하다.

인체 면역결핍 바이러스(HIV), A형 간염 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스, 파보바이러스(parvovirus), 거대세포바이러스(cytomegalovirus) 및 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus)와 같은 병원성 바이러스, 및 라임 병(Lyme disease)과 같은 박테리아 감염으로 인한 혈액 공급의 오염이 점점 심각한 문제로 대두되고 있다. 미국 식품의약국(FDA) 및 다른 곳의 지배적인 견해는 모든 혈액은 중합효소연 쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 분석을 이용해 검사(스크리닝)되어야 하며, 궁극적으로는 혈청학적 진단으로 대체되어야 한다고 생각하고 있다. 바이러스 감염에 대한 혈액 검사는 1년에 적어도 100개의 수혈관련 B형 간염(HBV), C형 간염 바이러스(HCV). 및 HIV를 예방할 수 있다고 생각한다.

혈청검사는 최근까지 혈액 스크리닝을 위한 선택방법이었다. 이들 검사는 바이러스제, 바이러스 항원, 박테리아제, 박테리아 항원 등에 의해 야기된 혈액 중의 항체의 존재 여부를 검출한다. 혈청 스크리닝 검사는 항체 반응이 나타나지 않을 때 감염 여부를 검출할 수 없다는 단점이 있다.

예를 들어, 혈청검사는 종종 감염의 초기단계에 감염된 개체를 검출하지 못한다. 더욱이, 낮은 면역응답을 나타내는 개체는 일반적으로 소량의 바이러스를 잠복한다. 전형적으로, 소량의 바이러스는 항체의 생성을 자극하지 않는다. 이러한 바이러스의 예로는 HIV가 있다. 혈청검사가 갖는 이러한 및 다른 실질적인 문제로 인해 개체의 감염단계와 상관없이 감염을 검출할 수 있는 방법이 요구되었다.

CR 증폭에 의해 혈액 플라즈마 중에 존재하는 핵산을 분리하면 항체의 부재하에서 병원체를 검출할 수 있다. 병원체의 검출은 전염성 병원체 없이 혈액의 공급을 보증한다는 점에서 중요하다.

의학적 세팅에서 혈액 및 관련 생물학적 물질의 스크리닝은 통상 대규모로 실시된다. 혈액 센터는 통상적으로 하루에 1천 개 이상의 혈액 단위를 검사한다. 현재 이용가능한 기술을 사용하여 하루에 1천 개의 샘플로부터 분리된 핵산의 제조는 상당한 시간, 노동과 시약을 필요로 한다. 그래서, 개체 샘플들의 대규모 핵산 검사는 일반적으로 기술적 한계로 인해 시행되지 않고 있다.

현재, 스크리닝 및 감시 응용에 핵산 시험이 샘플의 집단에 모두 사용된다. 집단 샘플은 불행하게도 시험의 민감도를 감소시킨다. 집단 샘플이 양성이면, 최종 진단이 연기된다.

검사를 위한 DNA 또는 RNA의 추출은 일반적으로 2가지의 다른 추출방법의 사용을 포함한다. 한 방법은 단지 DNA 추출만을 위한 것이며 다른 방법은 RNA만 추출한다. DNA 추출방법의 사용은 RNA의 낮은 수율을 가져오며, 그 반대도 마찬가지이다. 그래서, 현재까지 혈액 스크리닝은 DNA를 분리하기 위한 하나의 절차와 RNA를 분리하기 위한 다른 절차를 필요로 한다.

따라서 DNA 및 RNA의 고도로 민감한 추출 및 정제가 가능한 간단하고, 효과적이고 신뢰성이 높은 방법이 요구되었다. 이러한 방법은 혈액공급을 스크링할 때 특히 유용하다. 상기 방법은 또한 유전자 기반의 진단, 감염성 질병(예, 새 개체군중의 웨스트 나일 바이러스, 모기 개체의 말라리아), 수질 분석 등과 같은 다수의 다른 적용에 유리하다.

상기의 요구는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공하는 본 발명에 의해 충족되었다. 본 발명의 방법은 세포, 바이러스 또는 세포 및 바이러스를 함유하는 샘플을 수득하고; 세제를 함유하는 용해 용액(lysing solution)을 샘플에 첨가하여 세포 또는 바이러스를 용해하여 용해물(lysate)을 생성하고; 핵산을 응집 또는 침전시키기에 충분한 양의 알코올을 용해물에 가하고; 및 유리섬유 필터를 통하여 혼합물을 여과하여 용해물-알코올 혼합물로부터 핵산을 정제하는 단계를 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 샘플 중의 병원체를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포, 바이러스 또는 세포 및 바이러스를 함유하는 샘플을 수득하고; 세제를 함유하는 용해 용액을 샘플에 첨가하여 세포 또는 바이러스를 용해하여 용해물을 생성하고; 핵산을 응집 또는 침전시키기에 충분한 양의 알코올을 용해물에 가하고; 유리섬유 필터를 통하여 혼합물을 여과하여 용해물-알코올 혼합물로부터 핵산을 정제하고; 및 핵산을 분석하여 병원체를 확인하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 물 샘플 중의 생물학적 오염물질을 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포, 바이러스 또는 세포 및 바이러스를 함유하는 물 샘플을 수득하고; 세제를 함유하는 용해 용액을 샘플에 첨가하여 세포 또는 바이러스를 용해하여 용해물을 생성하고; 핵산을 응집 또는 침전시키기에 충분한 양의 알코올을 용해물에 가하고; 유리섬유 필터를 통하여 혼합물을 여과하여 용해물-알코올 혼합물로부터 핵산을 정제하고; 및 핵산을 분석하여 오염물질을 확인하는 단계를 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 포유동물의 유전장애를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포, 바이러스 또는 세포 및 바이러스를 함유하는 생물학적 샘플을 수득하고; 세제를 함유하는 용해 용액을 샘플에 첨가하여 세포 또는 바이러스를 용해하여 용해물을 생성하고; 핵산을 응집 또는 침전시키기에 충분한 양의 알코올을 용해물에 가하고; 유리섬유 필터를 통하여 혼합물을 여과하여 용해물-알코올 혼합물로부터 핵산을 정제하고; 및 핵산을 분석하여 유전장애를 확인하는 단계를 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 샘플로부터 핵산을 추출하는 키트(kit)를 제공한다. 상기 키트는 세제와 유리섬유 필터를 포함하는 용해 용액을 포함한다.

본 발명은 한 번의 절차를 사용하여 DNA와 RNA를 동시에 함유하는 샘플로부터 DNA와 RNA를 빠르고 효과적으로 추출하는 방법을 발견한 발명자의 놀라운 발견에 근거한다. 샘플을 세제로 용해하고, 알코올을 첨가하여 존재하는 어떠한 핵산을 응집 및 침전하고, 유리섬유 필터를 통하여 혼합물을 여과함으로써 용해물로부터 핵산을 분리하여 DNA와 RNA를 분리 즉, 정제할 수 있다는 것을 뜻밖에 발견하였다.

추출 및 정제 절차는 자동화에 적합하다. 추출된 핵산은 PCR(중합 연쇄반응) 또는 RT-PCR(역전사(reverse transcription) 중합 연쇄반응)과 같은 핵산 증폭 기술과 상용성이 있다.

핵산 추출

하나의 실시태양에서, 본 발명은 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다. 핵산은 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)를 포함한다.

샘플로부터 핵산을 추출하는 방법의 첫 번째 단계는 세포 또는 바이러스를 함유하는 샘플을 수득하는 것이다. 세포 또는 바이러스를 함유하는 어떠한 샘플도 본 발명에 사용될 수 있다. 세포 또는 바이러스를 함유하는 샘플의 예로는 생물학적 샘플 및 수용성 비-생물학적 샘플을 포함하나 이에 한정하지 않는다.

세포 또는 바이러스를 함유하는 어떠한 생물학적 샘플도 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 본원에서 사용된 생물학적 샘플의 예로는 체액, 조직, 및 세포를 포함한다. 생물학적 샘플의 몇몇 구체적인 예로는 혈액, 혈액 플라즈마, 요(오줌), 샐비어(salvia), 질액(vaginal fluid), 뇌척수액, 혈청, 상피세포, 면역세포, 구강 스크래핑, 경부 조직 스크래핑 등을 포함하나 이에 한정하지 않는다.

생물학적 샘플은 기술분야에서 어떤 공지된 방법에 의해 수득할 수 있다. 적당한 방법으로는 예를 들어, 혈액 샘플 채취를 위한 정맥주사 및 구강 샘플을 얻기 위한 볼 세포 스크래핑이 있다.

샘플은 세포를 포함할 수 있다. 세포는 기술분야에 공지된 어떤 세포일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "세포"란 개체 세포 및 조직의 일부인 세포를 포함한다. 세포는 체약중에 존재할 수 있다. 다른 것 중에서 개체 세포는 상기에서 언급한 세포(예: 상피세포, 면역세포 등)를 포함한다.

용어 "세포"는 또한 전체적으로 또는 부분적으로 미생물을 포함한다. 미생물은 전형적으로 병원체(즉, 질병을 유발하는)이나 비-병원체일 수 있다. 미생물의 예로는 박테리아, 기생충, 진균류, 조류(藻類, algae) 등을 포함한다.

박테리아는 기술분야의 숙련자에게 공지된 어떤 박테리아일 수 있다. 박테리아의 몇몇 예로는 보렐리아 종(Borrelia species), 렙토스피라 종(Leptospira species), 미코박테리아 종(Mycobacteria species)등이 있다.

기생충은 다른 유기체에서 보호를 받으면서 자라고 영양을 공급받으면서 전형적으로 자신의 숙주(host)의 생존에 나쁜 영향을 주는 유기체이다. 기술분야에서 공지된 어떤 기생충의 핵산은 본 발명의 방법에 따라서 추출될 수 있다. 몇몇 기생충의 예로는 주혈흡충 종(schistosoma species), 리슈마니아 종(leishmania species), 트리코모나스 종, 플라스모듐 종(예, 말라리아), 톡소플라즈마 종, 크립토스포리디움 종 및 엔타메오바 종 등이 있다.

진균은 엽록소 및 관다발 조직이 없는 진핵 생물이며, 일반적으로 단일 세포로부터 분지 섬질의 균사의 체질량 형태로 존재한다. 기술분야에서 공지된 어떠한 진균도 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다. 진균의 몇몇 예로는 곰팡이 및 효모(예, 칸디다 종, 사카로미세스 종 등)을 포함한다.

조류는 일반적으로 수생 생물, 진핵생물, 광합성 생물이다. 조류는 기술분야의 숙련자에게 공지된 어떤 조류일 수 있다. 조류의 예로는 시아노박테리아가 있으며 이에 한정하지 않는다.

샘플은 바이러스를 함유할 수 있다. 기술분야의 숙련자에게 공지된 어떠한 바이러스 중의 핵산은 본 발명의 방법에 따라 추출할 수 있다. 이러한 바이러스로는 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스를 포함한다.

DNA 바이러스의 예로는 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스(예, B형 간염 바이러스) 및 파보바이러스(예, 파보바이러스 B19 바이러스)를 포함한다. RNA의 바이러스의 예로는 피코나바이러스(예; A형 간염 바이러스), 칼시바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스(예, C형 간염 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스), 코로나바이러스, 레오바이러스, 랩도바이러스, 필로바이러스, 파라믹소바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스, 및 레트로바이러스(예, 인체 면역결핍 바이러스)를 포함한다.

샘플은 어떤 생물체 또는 생물이 적당히 작은 크기이면 전체의 생물로부터 얻을 수 있다. 적당한 생물의 예로는 미생물 및 포유동물, 조류, 수중생물(예, 어류), 또는 절지동물(예, 진드기, 모기 등), 및 진균류의 조직 체액을 포함한다. 미생물은 상기에서 언급한 것을 포함한다.

포유동물은 기술분야의 숙련자에게 공지된 어떤 포유동물일 수 있다. 예를 들어 포유동물은 인간, 개코원숭이(비비), 및 기타 영장류뿐만 아니라 개 및 고양이와 같은 애완동물, 쥐 및 생쥐와 같은 실험실용 동물, 및 말, 양, 및 소와 같은 농장동물을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 샘플은 세포 및/또는 바이러스로 오염될 수 있는 수용성 비-생물학적 샘플이다. 예를 들어, 샘플은 음용수 및 수역(예, 호수, 개울, 강, 대양 등)으로부터 수득할 수 있다. 물 샘플 중에 있는 세포 또는 바이러스로부터 핵산의 추출은 이하에서 논의하는 음용수의 오염물질 검사에 유용하다.

기술분야의 숙련자라면 본 발명의 방법에 사용하기 위한 샘플을 제조하기 위해 여러 가지 형태의 샘플로부터 핵산을 추출하려면 서로 다른 형태의 샘플제조가 필요하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 적당한 제조 기술의 예로는 서로 다른 형태의 완충액, 용액 등을 첨가하는 것을 포함한다.

다른 적당한 제조 기술은 샘플로부터 세포의 제거를 포함한다. 예를 들어, 혈청 샘플을 제조하기 위해, 세포는 통상적으로 반드시 필요하지 않지만 전체 혈액 샘플과 같은 샘플로부터 제거된다. 세포는 기술분야의 숙련자에게 공지된 방법으로 제거될 수 있다.예를 들어, 세포가 없는 샘플을 제조하기 위해 원심분리나 여과가 사용될 수 있다. 예를 들어 혈청은 일반적으로 세포 성분들을 제거하기 위해 원심분리에 의해 응고한 혈액으로부터 수득된다. 플라즈마는 통상적으로 항응고제가 혈액에 첨가되는 것을 제외하고는 혈청과 동일한 방법으로 수득된다.

다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 선택적으로 샘플 중의 세포 또는 바이러스를 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 기술분야의 숙련자에게 공지된 농축방법이 사용될 수 있다. 적당한 농축방법은 폴리에틸렌 글리콜의 사용을 포함하나 이에 한정하지 않는다.

본 방법에 사용하기에 작당한 농축은 전형적으로 샘플의 특성에 따라 부분적으로 달라진다. 농축방법은 예를 들어 샘플이 세포, 바이러스, 또는 둘 다 포함하는지 여부, 세포의 형태 등에 따라 달라진다.

제1 실시태양에서, 바이러스를 포함하는 샘플은 폴리에틸렌 글리콜로 농축된다. 어떠한 폴리에틸렌 글리콜의 중합체도 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 약 120의 최대분자량, 바람직하게는 약 5,000 및 좀 더 바람직하게는 약 7,000의 최대분자량을 가질 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 최대분자량은 약 10,000, 바람직하게는 약 9,500, 좀 더 바람직하게는 약 9,000일 수 있다 상기 최소 및 최대치를 결합하여 적당한 범위의 폴리에틸렌 글리콜을 제공할 수 있다. 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜은 약 8,000의 분자량을 갖는다.

제2 실시태양에서, 세포 또는 바이러스를 농축하기 위해 황산암모늄이 사용된다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 황산암모늄의 농도는 예를 들어 약 5% 내지 약50% v/v이다.

제2 실시태양에서, 샘플 중의 세포 또는 바이러스를 농축하기 위해 원심분리 및/또는 초원심분리가 사용된다. 적당한 원심분리 조건(예, 시간, 속도, 온도 등)은 기술분야의 숙련자라면 결정할 수 있다. 전형적으로, 원심분리는 세포를 농축하기 위한 것이고 초원심분리는 통상 바이러스를 농축하는데 사용된다.

상기 방법의 제2 단계에서, 용해물은 세제를 포함하는 용해 용액을 샘플에 첨가하여 생성된다. 용해 용액은 세포나 바이러스를 용해하기에 충분한 양이 첨가된다. 본원에서 사용된 "용해"란 일반적으로 세포 또는 바이러스의 구조 성분(예, 세포막, 응고된 단백질 등)의 물리화학적인 분열을 말한다.

본 발명의 방법에 유용한 용해 용액은 지질을 용해할 수 있는 세제를 포함한다. 세제는 소디움 도데실 설페이트(즉, 소다움 라우릴 설페이트), 트리-N-부틸포스페이트, Brij-3,5,옥틸 β-티오글루코피라노사이드 등을 포함하나 이에 한정하지 않는다.

용해 용액은 기술분야에 숙련자에게 공지된 방법에 의해 샘플과 접촉된다. 저형적으로, 용해 용액은 세포 및/또는 바이러스를 분열시키기 위한 충분한 시간 및 온도로 샘플과 함께 배양된다. 일반적으로, 용해 용액은 피펫을 이용하여 샘플로 옮긴다. 적당한 배양 조건(예, 시간, 온도 등)은 기술분야의 숙련자라면 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, 샘플은 통상적으로 교반 또는 교반없이, 4℃ 내지 90℃의 온도에서 1분 이상 용해 용액과 함께 배양된다. 교반의 예로는 쉐이킹(흔듦),교반, 진동 또는 기타 형태의 기계적 블랜딩을 포함하며 이에 한정하지 않는다.

용해 용액 중의 세제의 농도는 예를 들어 세제의 강도, 배양조건 등과 같은 여러 요인에 의해 달라진다. 예를 들어, 세제 농도는 일반적으로 약 0.1% 내지 약 10% v/v이다.

하나의 실시태양에서, 용해 용액은 추가로 프로테이나제(단백질 가수분해 효소)를 포함한다. 전형적으로 프로테이나제는 단백질을 소화하는데 유용하다. 프로테이나제는 핵산이 단백질과 관련된 세포 또는 바이러스를 함유하는 샘플에 대한 본 발명의 방법에 특히 유용하다. 이러한 바이러스의 예로는 B형 간염이 있다.

기술분야의 숙련자에게 공지된 어떤 프로테이나제가 사용될 수 있다. 적당한 프로테이나제의 예로는 프로테이나제 K, 펩신, 트립신, 키모트리신 등을 포함한다. 용해 용액 중의 프로테이나제의 최소 함량은 일반적으로 약 0.1 mg/ml, 바람직하게는 약 0.4 mg/ml이며, 좀 더 바람직하게는 약 0.7 mg/ml이다. 용해 용액 중의 프로테이나제의 최대 함량은 전형적으로 약 10 mg/ml, 바람직하게는 약 7 mg/ml이며, 좀 더 바람직하게는 약 5 mg/ml이다. 통상적으로 용해 용액은 약 1 mg/ml의 프로테이나제를 함유한다.

용해물이 생성된 후, 핵산을 추출하기 위한 다음 단계는 용해물에 알코올 특히, 수용성 알코올을 첨가하는 것이다. 기술분야의 숙련자에게 공지된 어떠한 알코올도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 알코올의 예로는 에탄올, 이소프로판올 등을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 유용한 알코올의 다른 예로 메탄올이 있다. 용해물에 알코올을 첨가하면 일반적으로 용액 중에 있는 핵산이 응집 또는 침전된다.

용해물에 첨가되는 알코올의 농도 및 함량은 핵산을 응집 또는 침전시키기에 충분한 함량의 농도 및 함량이다. 이러한 농도 및 함량은 기술분야의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

알코올의 실제 함량은 사용된 특정 알코올, 첨가되는 알코올의 농도, 용해물 용액의 부피, 용해되는 샘플의 형태 및 제제와 같은 기술분야에 잘 알려진 여러 요인에 따라 달라진다. 용해물에 첨가되는 알코올은 100% 알코올 또는 50%, 70% 또는 90% 알코올 용액과 같은 알코올과 물의 용액일 수 있다. 예를 들어, 100% 알코올의 경우, 첨가되는 알코올의 함량은 용해물 용액 부피의 약 1/10 내지 2배이며, 최적으로는 용해물 용액 부피의 약 1/2이다.

핵산 추출방법의 마지막 단계는 용해물-알코올 혼합물로부터 핵산을 정제하는 것을 포함한다. 핵산은 유리섬유 필터를 통하여 혼합물을 여과하여 용해물-알코올 혼합물의 비-핵산 부분으로부터 핵산을 분리하여 정제된다. 이들 필터는 보로실리케이트 유리(붕규산 유리)로부터 제조된 마이크로섬유필터이다. 유리섬유 필터는 예를 들어 뉴저지주의 와트만 클리톤(Whatman Clifton)으로부터 상업적으로 이용가능한 GF/F형을 포함한다.

유리섬유 필터의 최소 기공크기는 약 0.4 ㎛이며, 바람직하게는 약 0.6 ㎛이다. 최대 기공크기는 약 1.2 ㎛이며, 좀 더 바람직하게는 약 0.8 ㎛이다. 상기 최소 및 최대치를 결합하여 적당한 필터의 기공크기 범위를 제공할 수 있다. 바람직하게는 기공크기는 약 0.7 ㎛이다.

용해물-알코올 혼합물은 필터를 통하여 지나간다. 용해물-알코올 혼합물의 유속은 힘을 가하여 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 필터 아래로 음압을 제공하거나 필터 위로 양압을 제공하는 장치를 제공하여 알코올 용액이 필터를 통과하는데 필요한 힘을 제공할 수 있다.

여과단계 예를 들어, 진공 다기관(매니폴드)에 부착된 다중 웰 여과 플레이트를 사용할 수 있다. 여과 플레이트는 필터 요소로서 본 발명의 방법의 유리섬유 필터를 구비한다. 사용하기에 적합한 여과 플레이트는 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어 96-웰 유리섬유 필터 GF/F형은 뉴저지주의 와트만 클리톤으로부터 상업적으로 이용가능하다. 96-웰 이상 또는 96-웰 이하를 함유하는 플레이트가 또한 적합하며, 사용자의 요구에 맞게 제조될 수 있다.

다중-웰 여과 플레이트에 맞게 설계된 진공 다기관은 상업적으로 이용가능하며, 다중 샘플을 처리하는데 일상적으로 사용된다. 예를 들어, 밀리포아(Milipore)에서 제공하는 진공 다기관이 사용될 수 있다. 다중-웰 여과 플레이트는 플레이트 가장자리에 실링 개스킷으로 지지되는 다기관 플레이트에 안착되도록 놓인다.

96- 또는 386-웰 플레이트와 같은 다중-웰 플레이트를 사용하면 동시에 많은 샘플을 처리할 수 있다. 이러한 플레이트가 진공 다기관에 장착되면, 샘플은 동시에 웰을 통과할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 실험실 로봇을 사용한 자동화가 적용가능하다.

예를 들어, 로봇 액체 취급 시스템을 진공 유닛과 결합하여 샘플을 처리하여 각각의 웰을 통하여 샘플을 배출할 수 있다. 핵산 추출의 자동화 능력은 혈액 또는 유전자 스크리닝과 같이 많은 샘플이 신속히 처리되어야 하는 스크리닝과 같은 곳에 유리하다.

유리섬유 필터를 통과하는 용해물-알코올 혼합물의 흐름 또는 통과를 도와주는데 적용가능한 다른 힘은 필터 플레이트의 상부에서 양압을 사용하거나. 원심분리 또는 중력의 사용을 포함한다. 다중-웰 플레이트는 다수의 샘플을 동시에 처리하기 위해 플레이트 회전자를 사용하는 특별 제작된 원심분리 시스템과 함께 사용될 수 있다.

유리섬유 필터를 통하는 혼합물을 여과하여 용해물-알코올 혼합물로부터 핵산을 정제한 후, 유리섬유 필터에 결합된 핵산은 임의로 세척 완충액으로 세척된다. 가압장치를 사용하여 유리섬유 필터를 통과하는 세척 완충액의 흐름 또는 통과를 지원할 수 있다. 양자택일하여, 진공, 원심분리 또는 중력을 사용하여 필터를 통과하는 세척 완충액의 흐름을 도울 수 있다.

세척 완충액은 기술분야의 숙련자에게 공지된 어떤 핵산 세척 완충액일 수 있다. 바람직한 세척 완충액은 약 10% 내지 약 100%의 에탄올, 최적으로는 약 50% 내지 약 70%의 에탄올을 함유하는 용액이다. 세척 완충액은 추가로 약 10 내지 약 1,000 mM의 NaCL, 10 mM의 Tris-NaCL 및 2 mM의 EDTA, 및 임의로 100 mM의 EDTA를 포함한다. 기타 염, 완충액, 킬레이트제 및 알코올은 기술분야에 공지된 것이 적합하다. 세척 완충액은 전형적으로 적어도 한 번, 일반적으로 2번 이상 결합된 핵산을 통과한다. 결합된 핵산의 세척 횟수는 용해물-알코올 혼합물의 조성물 및 부피와 같은 다수의 요인에 따라 달라진다.

결합된 핵산을 함유하는 유리섬유 필터는 임의로 건조될 수 있다. 유리섬유 필커는 기술분야의 숙련자에게 공지된 방법으로 건조될 수 있다. 예를 들어, 필터는 전형적으로 90℃ 이하의 온도로 1회 이상 가열건조될 수 있다. 건조 조건은 핵산을 파괴하거나 변성(變性)하지 않는 조건으로 선택된다. 필터의 다른 건조방법은 공기 건조, 데시케이터를 사용하는 것을 포함하나 이에 한정하지 않는다.

건조 후, 핵산은 필터를 통해 적당한 용출 용액을 통과시킴으로써 필터로부터 용출될 수 있다. 용출 용액은 바람직하게는 낮은 이온 강도를 갖는다. 그래서, 용출 용액 중의 염과 이온 화합물의 농도는 최저 상태로 유지된다. 이러한 용출 용액의 예로는 뉴클레아제가 없는 물, 임의로 약 0.01% 내지 2.00% Tween 20을 함유하며, 최적으로는 약 0.02% 내지 약 1.0% Tween 20을 함유하는 뉴클레아제가 없는 물이다.

핵산은 다중-웰 여과 플레이트(상기에서 기술) 아래에 놓여 지며, 필터를 통과하는 유체 샘플을 회수할 수 있는 위치인 진공 또는 압력 다기관에 장착된다. 다중-웰 회수 플레이트는 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 96-웰 플레이트는 Becton Dickinson Company(Franklin Lakes N.J)에서 Microtest RTM이라는 상표명으로 시판된다. 양자택일하여, 조직 배양 플레이트가 사용될 수 있다.

회수 플레이트는 일반적으로 다중-웰 여과 플레이트와 매치되는 웰(well)을 가지고 있으며, 핵산이 유리섬유 필터를 통과할 때 이들을 회수할 수 있는 위치인 여과 플레이트 아래에 장착된다. 이들 플레이트 즉, 플레이트 및 회수 플레이트는 둘 다 인터로킹 중첩에 있는 진공 다기관 내에 장착된다.

회수 플레이트는 쉽게 상업적으로 이용가능하다. 그러나 상기에서 논의한 96-셀 여과 플레이트와 함께 회수 플레이트는 크거나 작은 부피를 갖는 많거나 적은 웰을 갖도록 적용될 수 있으나 이는 사용자의 요구에 따라 달라진다.

추출된 핵산은 예를 들어 후술하는 방법에 사용될 수 있다.

상기에 기술한 추출법은 DNA와 RNA를 효율적으로 분리하는 것으로 뜻밖에 발견되었다. 다른 표준 분석은 일반적으로 DNA를 분리하기 위한 하나의 방법과 RNA를 효율적으로 분리하기 위한 별개의 방법이 필요하다.

샘플 중의 병원체의 확인

하나의 실시태양에서, 본 발명은 샘플에 있는 병원체를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 제1 단계는 샘플 중의 세포 또는 바이러스로부터 핵산을 추출하는 것이다. 핵산은 상술한 추출방법에 따라서 추출된다.

일단 샘플로부터 핵산을 추출하면, 병원체 확인방법의 다음 단계는 핵산을 분석하는 것이다. 핵산은 해당 기술분야의 숙련자에게 공지된 어떤 방법으로 분석될 수 있다.

핵산은 전형적으로 핵산 증폭 및/또는 기타 표준 분석기술을 적용한다. 예를 들어 PCT 또는 RT-PCR 방법을 이용하는 핵산 증폭 시스템은 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.

핵산증폭 기술에 관한 일반적인 개요 및 병원체 진단을 위한 이들 증폭 기술의 응용에 관한 기술은 Dieffenbach et al, PCT Printer: A Laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nwe York(1995) 및 Clewley, The Polymerase Chain Reaction ( PCR ) for Human Viral Diagnosis, CRC Press, Boca Raton, Fla., Chapter 5(1995)를 참조하시오.

PCR 방법을 사용하는 핵산 증폭 시스템은 이미 자동화되어 있다. 상기에서 논의한 바와 같이, 핵산 추출에 관한 청구된 본 발명의 방법 또한 자동화될 수 있다. 핵산 증폭 기술과 결합한 추출 및 정제의 자동화는 이들 방법을 사용하여 샘플에 극히 낮은 농도로 존재하는 혈액, 병원체(예: 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충 등)와 같은 대량의 샘플을 단기간에 스크리닝할 수 있도록 한다.

핵산 증폭(앰플리콘)의 생성물과 핵산으로부터 병원체의 동일성 확인은 예를 들어 혼성화(hybridization) 기술에 측정할 수 있다. 일반적으로 혼성화 기술은 공지된 핵산 서열과 보완적으로 독특하게 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probe)를 사용한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 RNA 또는 DNA 분자일 수 있다.

올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성화 분석법을 핵산에 사용할 수 있다. 예를 들어, 서든 혼성화(서든 블러팅)는 특히 알려진 이러한 기술의 예이다. 서든 블러트(Sourthern blot) 기술은 핵산 증폭을 제한효소(restriction endonuclease)로 쪼개고(cleaving), 겔 일렉트로포레시스(gel electrophoreses)로 쪼개진 분획을 분리하고, 스페시픽 올리고뉴클레오티드 프로브로 탐침하여, 혼성화의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.기타 관련된 방법은 해당 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다. Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor(1989)를 참조하시오.

올리고뉴클레오티드 프로브의 길이는 중요하지 않으며 표적 분자를 혼성화할 수 있을 만큼 길다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 6개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 10개의 뉴클레오티드, 좀 더 바람직하게는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 함유하여야 한다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에 대한 상한선은 없다. 그러나 보다 긴 프로브는 제조하기 어렵고, 보다 긴 혼성화 시간을 필요로 한다. 그러므로 프로브는 필요 이상으로 길지 말아야 한다. 정상적으로 올리고뉴클레오티드 프로브는 50 이상의 뉴클레오티드를 함유하지 말아야 하며, 바람직하게는 40개의 뉴클레오티드를, 좀 더 바람직하게는 30개의 뉴클레오티드를 함유하지 말아야 한다.

이러한 프로브는 예를 들어 라디오라벨, 효소, 발색단(chromophore), 형광물질(fluorophores) 등과 같은 기술분야에서 알려진 방법에 따라 검출가능한 라벨링할 수 있다. 라벨의 검출은 핵산을 지닌 올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성화를 나타낸다. 따라서, 라벨의 검출은 샘플이 특정 병원체를 함유하는 것을 나타내며, 올리고뉴클레오티드 프로브가 샘플 중의 특정 병원체를 확인한다.

양자택일하여, 특정 병원체에 대해 특별한 올리고뉴클레오티드 프로브로 혼성화를 검출하지 못하는 경우, 올리고뉴클레오티드 프로브가 특정한 특별한 병원체에 대해 검출가능한 양의 핵산을 샘플이 함유하지 않는다는 것을 의미한다.

핵산 분석에 대한 다른 접근은 종래 또는 유니버셜 분자 비콘(molecula beacons)을 사용하는 것이다. 이러한 방법은 따기(Tyagi) 및 크래머(Kramer)의 Nature Biotechnology 14, 303-308, 1996 및 New York, N. Y. 소재 뉴욕 혈액 센터(New York Blood Center)로 양도된 Andrus 및 Nichols의 미국 특허출원 공개번호 제 20040053284호에 기술되어 있다.

간단히 말해, 분자 비콘은 스템(stem) 및 루프-구조를 형성하는 단일-스트랜드(single-strand) 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브이다. 루프는 표적 서열과 보완족인 프로브 서열을 함유한다. 스템은 프로브 서열의 측면에 상호보완적인 암 서열(arm sequence)을 어닐링(annealing)하여 생성된다. 전형적으로 형광물질은 하나의 암(arm)의 끝에 공유결합되어 있으며, 급냉기(quencher)는 다른 암의 끝에 공유결합되어 있다. 분자 비콘은 스템-루프 구조 및 형광물질의 급냉으로 인해 용액 중에 유리될 때 형광을 내지 않는다. 그러나 분자 비콘이 표적 서열을 함유하는 핵산에 혼성화될 때 분자 비콘은 형광을 낼 수 있는 형태 변화를 겪는다.

분자 비콘 프로브는 핵산(예, PCR 증폭 생성물)을 검출할 수 있는 어떤 방법으로 변경될 수 있다. 변경된 프로브로는 예를 들어 본원에 참고로 인용한 미국특허 제6,037,130호에 기술된 "파장-시프팅" 분자 비콘 프로브가 있다. 특히, 이들 변경된 프로브는 기본 분자 비콘 프로브 구조 즉, 루프; 스템 듀플렉스(stem duplex); 한쪽 끝에 급냉기(quencher); 및 다른 끝에는 리포터 부분(reporter moiety), 전형적으로 형광물질을 가지고 있다. 리포터는 "하베스터 리포터(harvester reporter)"로 칭하기도 한다. 프로브의 변경(수정)은 "하베스터 리포터"를 통과하는 몇몇 뉴클레오티드의 확장을 포함한다. 확장은 "에미터 리포터(emitter reporter)", 전형적으로는 다른 형광물질에 연결되는 뉴클레오티드에서 종결된다. 표적 핵산 및 분자의 존재하에서, 급냉기는 리포터로부터 분리된다. 이러한 개구 형태에서, "하베스터 리포터"는 여기 소스로부터 에너지를 흡수하지만, 몇몇 구조에서 대부분의 에너지를 전달된 에너지를 흡수하고 에너지의 특성, 장파장을 방출하는 "에미터 리포터"로 전달한다.

분자 비콘은 전형적으로 프로브와 표적 서열 사이에 어울리지 않는 소수의 뉴클레오티드에 민감하다.(Tyagi et al., 1998, nat Biotech., 16:49-53). 분자 비콘 기술은 예를 들어 고도의 변형 바이러스 종의 검출에 사용할 수 있도록 변경될 수 있다. 안드러스(Andrus) 및 니콜스(Nichols)의 미국 특허출원 제 10/399,843호(미국 공개번호 20040053284, 뉴욕 혈액 센터로 양도됨)는 표적 서열을 마주보고 (즉, 2개 프라이머의 혼성화 위치 사이에 틈이 없는) 배열된 포워드 및 리버스 프라이머의 사용에 관해 기술하고 있다.분자 비콘 프로브는 2개의 프라이머의 결합부를 따라 비대칭으로 혼성화하도록 설계되어 있다. PCR 프라이머는 뉴클레오티드 미스메치의 존재하에 표적 서열의 증폭을 개시하여 혼성화할 수 있다. 프라이머가 마주보는 형태로 인해, 증폭된 PCR 생성물은 분자 비콘 프로브로 뉴클레오티드 서열 동일성 확인을 공유한다.

그래서, 예를 들어, 유니버셜 분자 비콘 RT-PCR 분석은 예를 들어 그룹 O와 같은 모든 주요한 유전자형(genotype)의 HIV-1, 및 모든 아류형(subtype)의 HCV를 포함하는 고도의 변종 균주를 검출할 수 있도록 개발될 수 있다. 고도의 변종 바이러스 균주를 검출하는 유니버셜 분자 비콘의 RT-PCR의 예는 미국 특허출원 ㅈ제/399,843호(미국 출원 공개번호 20040053284)에 개시되어 있다.

바람직한 실시태양에서, 복합(멀티플렉스) PCR이 사용된다. 이 분석에서, PCR 혼합물은 복합 병원체의 핵산에 관한 프러이머 및 프로브를 함유한다. 전형적으로, 단일 형광색소가 이 분석에 사용된다. 그래서, 양성 신호의 검출은 어떤 하나의 병원체가 존재한다는 것을 나타낸다.

검출된 특정 병원체의 동일성 확인은 예를 들어 검사하는 각각의 병원체에 관한 개별 PCR 반응을 가동하거나, 별개의 고정 표적물에 앰플리콘(amplicon)을 라벨링하고 혼성화함으로써 측정할 수 있다. 표적물은 예를 들어 니트로셀룰로즈, DNA 칩, 마이크로비드(microbead) 등에 고정화될 수 있다.

샘플 중의 병원체를 확인하기 위해 핵산을 분석하는 경우 기타 PCR-기반의 방법을 도입할 수 있다. 이러한 방법의 예는 겔 분석, 타크만(Taqman^®)등이 있다.

수용성 비-생물학적 샘플 중의 오염물의 확인

다른 실시태양에서 본 발명은 세포, 바이러스, 또는 세포 및 바이러스를 함유할 것으로 의심되거나 함유하는 것으로 알려진 수용성 비-생물학적(즉, 물) 샘플 중의 생물학적 오염물을 확인하는 방법을 제공한다. 그래서, 음용수 또는 레크리에이션(예, 수영)으로서 안전한지를 보증하기 위해 물(즉, 음용수, 물, 호수 등)의 생물학적 오염물을 검사할 수 있다. 생물학적 오염물로는 세포 또는 바이러스를 포함한다. 물 중의 생물학적 오염물로는 박테리아(예, 대장균(E. coli), 분변계 대장균(Fecal coliform), 조류(예, 남조류, 시아노박테리아 등), 진균류(피알로포라 sp, 엑소피알라 ap. 및 dkzmfpahsba 네), 기생충(예, 크립토스포리듐, 레이시마니아, 지아르디아 람브리아, 아메바, 편모충류 등) 및 바이러스가 있다.

상기 방법의 제1 단계는 샘플 중의 세포 또는 바이러스에서 핵산을 추출하는 것이다. 상기에서 기술한 추출방법에 따라 핵산을 추출한다.

오염물을 확인하기 위해, 핵산은 예를 들어 해당 기술분야의 숙련자에게 공지된 PCR-기반 방법에 의해 분석할 수 있다. 적당한 분석방법은 상기에서 기술한 것을 포함한다.

유전장애 확인

다른 실시태양에서, 본 발명은 포유동물 중의 유전장애를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 제1 단계는 샘플 중의 세포로부터 핵산을 추출하는 것이다. 상기에서 기술한 추출방법에 따라 핵산을 추출한다. 바람직하게는 세포는 포유동물 통상적으로 사람으로부터 수득한다.

유전장애를 확인하기 위해 기술분야의 숙련자에게 공지된 어떤 방법에 의해 분석할 수 있다. 적당한 분석방법은 상기에서 기술한 것을 포함한다.

어떠한 유전장애도 본 발명의 방법에 따라서 확인될 수 있다. 유전장애의 예로는 겸상세포빈혈증(sickle-cell anemia), 다운증후군, 암, 암 소질(예, BRCA1 유전자 분석), 테이삭스(tay-sachs), 낭포성섬유증(cystic fibrosis), 뇌성마비, 마르판증후군(Marfan Syndrome) 등이 있다.

키트

다른 실시태양에서, 본 발명은 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 키트(kit)를 제공한다,키트는 용해 용액 및 유리섬유 필터를 포함한다. 용해 용액은 세제를 포함한다. 키트는 선택적으로 하나 이상의 다음 성분을 함유한다: 알코올, 프로테이나제, 세척 완충액, 용출 완충액 및 용기(예, 시험관, 다중 웰 플레이트 등).

용해 용액, 세제, 유리섬유 필터, 알코올, 프로테이나제, 세척 완충액, 용출 완충액 및 용기는 상기에서 기술하였다.

도 1은 바이러스 검출시 PEG의 효과를 나타낸 그래프이다. 정상 사람의 플라즈마는 104.5 WNV 게놈 당량/㎖일 때 급격히 상승한다. PEG 8000을 여러 농도에서 가하였다. 2.0㎖의 PEG-플라즈마를 혼합하고 원심분리하였다. 200㎕의 각각의 침전물 및 상등액을 추출하고 RT-PCT 정량하였다.

도 2는 바이러스 검출시 PEG의 효과를 나타낸 그래프이다. 200㎕의 비-농축 및 PEG 농축 플라즈마를 추출하고, PCR 정량하였다. 0%의 PEG와 비교하여 3%의 PEG에서 약 10배의 RNA가 검출되었다.

도 3은 4℃에서 플라즈마 중의 WNV의 안정성을 나타낸 그래프이다. 종점 RT-PCR은 4℃에서 0일, 7일 또는 14일간 저장한 WNV 샘플로부터 추출한 RNA상에서 실시하였다. 결과는 4개의 복제 샘플의 평균 상대 형광 유니트(RFU) +/- 표준 편차로 나타내었다.

실시예 1: 물질

웨스트 나일 바이러스(하와이 균주)를 뉴욕주 보건부로부터 수득하였으며 베로(Vero) 세포에서 배양하였다. 감염 바이러스 입자의 함량을 종래의 플라크 분석 법으로 측정하였다.(Beaty et al, Arboviruses,p.797-856. In N.J. Schmidt, and R. W. Emmons(ed.), Diagnostic procedure for viral, rickettsial and chalmydial infections. American Public Health Association, Washington, D.C.1989). 바이러스성 게놈 당량의 함량은 정량 표준으로서 WNV RNA 성질 패널, QWN702 (BBI Diagnostics, West Bridgewater,MA)를 사용한 정량 RT-PCR로 확인하였다.

뉴욕 혈액 센터에서 HBV-감염된 플라즈마 및 HCV-감염된 혈액 기증자로부터 나온 플라즈마를 제공하였다. HIV 저장품은 HIV-감염된 사람의 말초 혈액 림프구 조직으로부터 세포가 없는 상등액이었다.

혈액에 기인한 병원체에 대해 사전-시험한 정상 사람의 플라즈마는 양성 또는 시료 샘플의 계단 희석(serial dilution)용으로 사용된다.

실시예 2: 플라즈마 중의 다중 바이러스 게놈의 추출

HBV-, HCV-, HIV- 및 WNV- 샘플의 분취액(aliquots)을 다양한 용적으로 피펫을 사용하여 96 웰 2.2ml의 저장 플레이트(ABgene, Surrey, KT, UK)에 옮겼다. 직접 추출을 위해 사용된 플라즈마 용적은 150 내지 450㎕이다.

프로테이나제는 K(Qiagen, Chatsworth, CA) 및 AL 용해 용액(lysis buffer, Qiagen, Chatsworth, CA)를 최적의 함량으로 첨가하고(표1), 간단히 혼합하였다. AL 용해 용액은 그중에서 특히 세제 및 구아니디늄 염을 함유한다. 58℃로 유지되는 진탕 수조에서 25분간 플레이트를 배양한 후, 미리 정한 함량의 무수 에탄올(표1)을 용해물(lysate)과 부드럽게 섞었다. 상기 제제를 0.7 ㎛의 유리 섬유 필터 플 레이트(GF/F, Whatman, Clifton, NJ)에 옮기고 -450 mmHg 진공하에서 여과하였다.용해물 제제의 총 용적에 따라 1 내지 3회 피펫으로 옮기었다. 적재된 필터 플레이트를 동일한 진공상태에서 AW2 세척 완충액(Qiagen, Chatsworth, CA)으로 세척하였다. 세척 용적 및 세척의 반복횟수는 초기 샘플 용적(표1)에 따라 달라진다. 세척 후, -350 mmHg의 압력을 필터 플레이트에 10분간 가하여 전여 세척 용액을 제거하였다. 이어서, 진공 없이 플레이트를 실온에서 10분간 유지하여 최종 공기 건조하였다. 정제된 핵산을 0.05% Tween 20을 함유하는 65-100 ㎕ 뉴클레아제 유리수(free water)로 -350 mmHg로 진공 여과하여 U-보톰 96-웰 플레이트 또는 PCT 플레이트로 용출하였다.

[표 1] GF/F법에 의한 다양한 플라즈마 용적의 추출조건

프로토콜

I

II

III

플라즈마

150 ㎕

300 ㎕

450 ㎕

프로테이나제 K	20 ㎕	40 ㎕	60 ㎕
AL 용해 완충액	200 ㎕	400 ㎕	600 ㎕

58℃에서 25분간 혼합 및 배양

에탄올

200 ㎕

400 ㎕

600 ㎕

총 용해물 용적

570 ㎕

1140 ㎕

1710 ㎕

혼합 후, GF/F 필터 플레이트로 이송

450 mmHg에서 진공 여과

세척 용적

600 ㎕

1200 ㎕

1600 ㎕

450 mmHg에서 진공 여과

세척 단계

1

3

300 mmHg에서 10분간 필터플레이트를 진공 건조

진공 없이 10분간 필터플레이트를 공기 건조

용출

65-100 ㎕

300 mmHg에서 1분간 여과 전 1분간 접촉 시간

피펫팅 및 여과는 수작업 또는 Genesis RSP 150 및 Genesis Workstation 200(Tecan, Maennedorf, 스위스)을 사용하여 자동화하였다.

핵산 증폭 및 검출은 Lee 등에 의해 기술된 인-하우스 PCR 반응 및 사이클 조건에 따라 수행하였다.(Stabilized viral nucleic acids in plasma as an alternative shipping method for NAT. Transfusion 42, 409-413, 2002).

분자 비콘 기술(Tyagi 및 Kramer, 분자 비콘: 프로브는 혼성화시 형광한다. nature Biotechnology 14, 303-308, 1996)을 도입하여 PCR 앰플리콘을 검출하고 정량화하였다. 프라임 및 분자 비콘은 모든 통상의 균주인 HCV, HIV 및 WNV를 검출하기에 적합하도록 설계되었다. 프라이머 표적물은 HCV 및 웨스트 나일 바이러스(WSNV)의 5'-UTR 미해독 영역, HIV의 gag- 및 pol-유전자 및 HBV의 유전자 해독 표면 항원에 위치하였다.

어닐링 단계에서 매 열적 사이클 동안 약한 방출이 관찰되었다. 시퀀스 디텍션 v 1.6.3 소프트웨어(PE-Biosystems, Foster-City, CA)로 PCR 동안 템플레이트의 증폭의 결과로 형광물질 시그널의 사이클마다 분석하고, 일련의 희석된 공지의 합성 RNA 또는 플라즈미드 DNA 표준 샘플과 미상의 샘플을 비교함으로써 표적 템플레 이트의 복제 수를 측정하였다. 모든 표준치를 복제 수 측정용 EUROHEP 패널(CLB, 네덜란드)로 보정하였다.

보호성 캡시드(capsid) 및 엔빌로프(envelope)로부터 바이러스 RNA 및 DNA의 방출은 프로테이나제와 결합한 AL 용해 완충액을 사용하여 수행되었다. AL 용해 완충액 중의 RNA의 안정성은 구아니딘 티오시아네이트(데이터는 도시하지 않음)와 상용성이 있는 것으로 평가 및 관측되었다. 핵산 포획, 세척 및 용출은 유리섬유 멤브레인을 통하여 진공여과에 의해 수행될 수 있다. 결과치를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2] GF/F 프로토골 대 퀴아젠(Qiagen) 키트를 사용하여 측정한 플라즈마 바이러스 로드의 비교

¹정상 인간 플라즈마에서 양성 샘플의 희석. 각 바이러스에 대해 10배 희석 한 시리즈를 선택하여 10³ 내지 10⁸copies/mL의 범위를 포함하였다.

²150㎕의 플라즈마를 프로테이나제 K/ AL 완충액 용해 및 와트만 96-월 유리섬유 필터 플레이트(n=8)fmf 통한 여과에 의해 추출하였다.

³140㎕의 HCV 및 HIV 플라즈마를 QiaAmp RNA 키트를 사용하여 추출하였다. 200㎕의 HBV 플라즈마에 QiaAmp RNA 키트(n= 8)를 적용하였다.

⁴게놈 양은 정량 실시간 PCR로 측정하였으며, log₁₀ copies/ml로 나타내었다.

⁵GF/F 결과치는 참조 방법과 비교하여 유리섬유 방법의 상대 추출 효율을 측정하기 위해 퀴아젠(Qiagen) 추출 키트로 얻은 결과치로 나누었다.

실시예 3: 핵산 추출의 재생산성은 인트라(intra)-분석 및 인터(inter)-분석 변동으로 평가하였다. 표 3은 실예로서 HCV의 경우, PCR결과에 대해 계산한 변동계수는 GF/F 및 퀴아젠 추출 후에 얻었다. 인트라-분석 변동은 양쪽 절차와 유사하다. 그러나, 인터-분석 PCR 결과는 퀴아젠 방법에 대해 상당히 일관성이 적었다. 자동화 추출뿐만 아니라 수작업으로 핵산 회수는 일관성이 있고 신뢰할 만하였다.

[표 3] GF/F 추출 및 퀴아젠 추출 후 얻은 HCV PCR 결과에 대해 측정한 인트라-분석 및 인터-분석 변동

	변동계수 ⁽¹⁾
추출	인트라-분석	인터-분석
GF/F 방법	0.02	0.02
퀴아젠 방법	0.02	0.05

⁽¹⁾변동계수는 각 8 값의 한 세트에 대해 계산하였다. 시험은 동일한 HCV 감염된 플라즈마(정상 인간 플라즈마를 1/00로 희석)의 분취액을 사용하여 다른 시간에 4개의 별개의 기술로 실시하였다.

실시예 4: 핵산 회수시 PEG의 효과

WNV 샘플의 분취액을 피펫을 이용하여 96 웰 2.2 ml의 저장 플레이트로(ABgene, Surrey, KT, UK)로 옮기고 다양한 함량의 37% PEG 8000 저장 용액rhk 혼합하였다. 플라즈마-PEG 제제의 총 부피는 추출 당 2.0 ml이었다. PEG를 샘플과 혼합한 후, 1500g에서 3분간 회전하기 전에 RT에서 10-30분의 접촉시간을 갖게 한다. 이어서 1.8 ml의 상등액을 폐기하여 부피를 200 ㎕로 줄이고, 약간 남아있는 유체(10 x 부피 감소)를 포함하는 가시 펠릿을 보관하였다.

40 ㎕의 프로테이나제(Qiagen, Chatsworth, CA) 및 270 ㎕의 AL 용해 완충액(Qiagen, Chatsworth, CA)을 가하고 혼합하였다. 이어서, 플레이트를 58℃의 따뜻한 수조에서 25분간 배양하였다. 이어서, 270 ㎕의 무수 에탄올을 용해물과 함께 부드럽게 섞는다. 총 부피가 780 ㎕인 추출 제조액을 0.7 ㎛ 유리섬유 필터(GF/F, Whatman, Clifton, NJ)로 옮기고 -450 mmHg에서 여과하였다. 적재된 필터 플레이트를 동일한 진공 세팅으로 600 ㎕의 AW2 세척 완충액(Qiagen, Chatsworth, CA)으로 1회 세척하였다. 세척 후, -350 mmHg의 진공을 필터 플레이트에 10분간 가하여 잔 여 세척액을 제거하였다. 이어서, 플레이트를 진공 없이 실온에서 10분간 유지하여 최종 공기 건조하였다. 정제된 핵산을 0.05% Tween 20을 함유하는 100 ㎕ 뉴클레아제 유리수를 -350 mmHg의 진공여과에 의해 U-bottom 96-웰 플레이트로 용출하였다. 양자택일하여, 75 ㎕의 Tween-물을 마이크로앰프(MicroAmp) 광학 96-웰 반응 플레이트(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)로 직접 여과하여 용출을 실시하였다.

피펫팅 및 여과는 수작업 또는 제네시스(Genesis) RSP 150 및 제네시스 ㅇ우워크스테이션(Genesis Worstation) 200(Tecan, Research Triangle Park, NC)으로 자동화하여 실시한다.

최대 민감도를 얻기 위해, 100 ㎕ 용출액의 50 ㎕ 또는 75 ㎕ 용출액의 총 부피로 각각 "고-부피" PCR 반응을 실시하였다. cDNA 합성의 경우, 우리는 30 ㎕의 역전사(RT) 믹스를 첨가하였다.(표 4). 반응은 42℃에서 45분간 시행하고, 95℃에서 2분간 시행하였다. 이어서, 40 ㎕의 PCR 마스터-믹스(표 3)를 가하였다. 태크 중합효소(Taq polymerase)를 95℃에서 10분간 활성화하고 30초 단위로 3번의 열 단계(95℃, 58℃ 및 72℃)의 45 사이클 동안 표적 cDNA를 증폭하였다. 120 ㎕의 초 반응부피에 대해 RT 믹스 및 PCR 매스터-믹스를 최적화하였다.

[표 4] 대용적 증폭을 위한 RT 믹스 alc PCR 믹스

반응 당 30 ㎕ RT 믹스

시약	공급자	농축	㎕/toavmf
M-MLV RT 완충액 DTT PCR 뉴클레오티드 믹스 가역 프라이머 Rnase 억제제 M-MLV 가역 전사효소 뉴클레아제-유리수	Invitrogen Gibco Amersham Biosciences Prpomega Invitrogen Promega	5 x 100 mM 10 mM 100 ㎛ 4 U/㎕ 200 U/㎕ 1 x	16.0 4.0 2.0 1.0 0.4 0.4 6.2

반응 당 40 ㎕ PCR

시약	공급자	농축	㎕/toavmf
MgCl2 전진 프라이머 분자 비콘 태크골드 뉴클레아제-유리수	PE Applied Biosystems GeneLink PE Applied Biosystems Promega	25 mM 100 ㎛ 200 U/㎕ 5 U/㎕ 1 x	3.0 0.1 1.0 0.5 35.4

분자 비콘 기술(Tiyagi and Kramer, Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization, Nature Biotechnology 1996, 14, 303-308)을 도입하여 PCR 증폭을 나타내었다. 표적 프라이머는 5'UTR 영역에 위치하고 있다. 가역 프라이머(5'- gct ctt gcc ccc tcc tg-3'), 전진 프라이머(5'- gca cga aga tct cga tgt cta aga aac-3') 및 분자 비콘(5'-FAM cgcacg atc tcg atg tct aag aaa cc cgtgcg DABCYL-3')을 모든 통상의 WNV 균주를 검출하기에 적합하도록 설계하였다.

증폭 및 검출하는데 ABI Prism 7700 및 7900 서열 검출 시스템 도구(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하였다. 증폭 생성물은 정량 실시간 PCR 또는 정성 후-PCR 분석으로 측정하였다. 실시간 PCR의 경우, 서열 검출 v1.6.3 소프트웨어 프로그램(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)은 PCR 동안 템플레이트의 증폭의 결과로서 형광 시그널에서의 사이클 간 변화를 분석함으로써 표적 템플레이트의 복제 수를 측정한다. 후-PCR 분석은 증폭 전후에 방출된 상대 광선 유니트를 측정한다. 정성 후-가동 분석의 컷오프 값은 음성 대조군의 평균 시그널+ 3 표준 편차로부터 계산한다.

다양한 함량의 PEG 8000을 플라즈마에 가하여 바이러스 또는 바이러스성 성분을 농축한다. PEG-플라즈마 침전물의 침강을 위해, 우리는 용해 완충액에 쉽게 재-현탁될 수 있는 일정한 크기의 펠릿을 느슨하게 생성하는 조건을 선택하였다. 침전물을 펠릿화 한 후, 우리는 부피를 200 ㎕로 줄이고 샘플을 처리하였다. AL 용해 완충액/프로테이나제 K, 에탄올 침전, 여과,세척 및 용출을 적용하고, PEG-플라즈마 침전물로부터 핵산을 추출하는데 최적인 상태로 만들었다.

100 ㎕ 또는 75 ㎕ Tween-물로 용출을 각각 실시하여 정제된 RNA의 수율을 최대화하고, 50 ㎕의 추출된 핵산을 PCR 반응에 이용하였다.

PEG 8000은 인간 프라즈마 샘플에 있는 WNV의 검출을 향상시키는데 효과적인 농축 방법이다. 도 1은 바이러스 RNA의 최대 함량은 3% PEG 8000으로 농축한 샘플에서 측정되었음을 보여 준다.

최적 조건을 사용하여, 샘플을 최초의 PEG-플라즈마 부피의 1/10로 농축 및감소시킬때 검출가능한 RNA 분자가 10배 증가하였다.(도 2) PEG는 HBV 양성 샘플에 적용될때, HBV DNA사에서 유사한 농축 효과를 나타내었다.

실시예 5: 검출 한계

검출의 낮은 한계를 평가하기 위해, 배양된 WNV로 돌출된 플라즈마 샘플의 종말점(end-point) 적정을 실시하였다. RNA 분자 및 WNV 제제의 감염성 비리온(virion)의 양은 BBI 패널에 비교하여 정량 PCR 및 플라크 분석으로 사전에 측정한다. 우리의 저장 바이러스 제제의 바이러스 게놈의 양은 플라크 생성 바이러스 입자 수의 740 내지 1500배 높은 것으로 발견되었다.

WNV 분석의 민감도를 측정하기 위해, BBI 저장품(Uganda, 7.33 X 104 copies/mL, Lot# 101702C)을 희석하고 시험하였다. BBI 저장품을 12.5, 6.3, 3.2, 1.6 및 0.8/copies/mL에서 음성 플라즈마에서 희석하였다. 검출(LOD)의 95% 및 50% 한계를 측정하기 위해 프로빗(Probit) 분석으로 희석 당 80개의 복제물을 시험하고 분석하였다.

전형적인 결과치는 하기 표 5, 6, 7 및 8에 도시하였다.

[표 5] FAM (WNV)

웰 1 A-H: 내부 컨트롤(IC) 음성.

WNV 컷오프: 웰 2A-2D (음성 플라즈마) + 5SD의 평균 = 1197

웰 E2: ∼300 copies/mL(평가)에서 WNV 양성 컨트롤

웰 F2: ∼60 copies/mL(평가)에서 WNV 양성 컨트롤

양성 WNV 결과치는 굵은 글씨(볼드체)로 표시하였다.

[표 6] 5 WNV 희석을 사용한 민감도 데이터의 요약

WNV 희석^* (WNV copies/mL)	양성#/ 시험#
	작업#
	1	2	3	4	5
0.8	0/16	1/16	0/6	2/16	1/16
1.6	7/16	3/16	6/16	6/16	1/16
3.2	15/16	15/16	12/16	13/16	12/16
6.3	16/16	16/16	16/16	16/16	16/16
12.5	v	v	16/16	16/16	16/16

^*희석은 BBI 저장품으로부터 제조하였다.(Uganda, 7.33E + 04copies/mL, lot# 101702C).

[표 7] 이들 실험에 대한 개별 프로빗 분석(SPSS 11.5) 및 변동계수는 아래와 같다.

LOD 검출(%)	실험1	실험2	실험3	실험4	실험5	평균	SD	CV
95%	3.09^*	3.36	4.07	4.06	4.18	3.75	0.49	0.13
50%	1.92	2.13	2.33	2.08	2.64	2.22	0.28	0.12

^* WNV copies/mL

LOD = 검출한계

[표 8] 서로 다른 날에 5개의 플레이트에서 시험한 각각의 희석물의 80개 복제물로부터 계산한 전체 프로빗 분석(SPSS 11.5)

LOD 검출(%)	Copies/mL
95%	3.79
50%	2.22

실시예 6: 웨스트 나일 바이러스 분석의 구체적인 기술

WNV 검출용 유니버셜 - 비콘 RT - PCR: 프라이머 및 프로브는 5'-미해독 영역 및 WNV 게놈의 뉴클레오캡시드 출발 위치 사이의 접합부를 연결하는 47 뉴클레오티드-긴 영역을 표적하였다. 프라이머 설계 및 뉴클레오티드 넘버링에 사용된 참조 서열은 Lanciotti 등(Science 286:2333-2337, 1999: Genbank AF196835)에서 보고한 New York 1999-말 분리물이었다. 47 뉴클레오티드 표적 영역이 >97%이면 이용가능한 Genbank 서열 정보에 대해 모든 리니지(Lineage) 1 분리물 내에서 보존되며, WNV Uganda 1937 9Genbank M12294)에 94% 동일하다. 프라이머 및 브로브 서열은 다음과 같다: 전진 프라이머: 5'-GCACGAAGATCTCGATGTCTAAGAAAC-3'(27mer, 위치 83-109; 44% G/C; Tm 77℃) 및 역전사 프라이머: 5'-GCTCTTGCCGGGCCCTCCTG-3' (20mer, 위치 110-129; 75% G/C; Tm 84℃). 분자 비콘 프로브: 5'6-FAM-cgcacgATCTCGATGTCTAAGAAACCcgtgcg-DABCYL-3' (WNV 프로브 영역은 상부 케이스에 잇으며, 스템 뉴클레오티드는 하부 케이스에 있다).

뎅기열 바이러스형 1 내부 컨트롤 RNA 용 RT - PCR. 프라이머를 67 b.p. 영역으 로 증폭하도록 설계한다.(뎅기 타입 1 RNA(참조 서열 Genbank AF513110)의 3' 비코드 영역의 뉴클레오티드 10632-10698). ABI PRISM 7900HT 중의 IC와 WNV 형광 시그널 사이의 유효한 차별을 허용하기 위해 A VIC-라벨 태크맨 프로브를 사용하여 RNA PCR 생성물 검출을 제어하였다. 프라이머 및 브로브 서열은 다음과 같다: 전진 프라이머: 5'-GCATATTGACGCTGGGAGAGA-3'(20mer, 위치 10632-10652; % G/C; Tm 73℃) 및 역전사 프라이머: 5'-GCGTTCTGTGCCT-3'(13mer, 10686-10698; 52% G/C; Tm 51℃). xozmaos vmfhqm 5'-VIC-AGATCCTGCTGTCTCTACA-MGB-3'(19mer, 위치 10657-10675; 47% G/C; Tm 59℃).

샘플 소스: 냉동 플라즈마 샘플을 시험하였다. 샘플은 혈액 기증자로부터 CPDA-1 항응고제로 회수한 전체 혈액으로부터 유도되었다. 이것을 원심분리하고 96-딥 웰 플레이트에서 -80℃에 저장하였다. 저장된 플라즈마 샘플을 사용하기 전, 4℃에서 40-48시간 해동하였다. 이 절차는 모두 WNV RNA를 유지하는 것으로 발견되었다.

샘플 제조: 샘플 추출은 2개의 액체 핸들링 시스템(Tecan, Gnesis RSP 150 및 Genesis Workstation 200)에서 실시하였다. 400 ㎕의 플라즈마 샘플을 로봇을 이용하여 아키브(Archive) 플레이트로부터 96-딥 웰 플레이트로 옮겼다. 4개의 WNV 음성 대조군, 한 개의 WNV 양성 대조군 및 3개의 내부 대조군(IC) 음성치를 로봇을 이용하여 딥 웰 플레이트에 두었다. 내부 대조군 표적 RNA를 사용하기 전에 용해 완충액과 혼합하였다. 추출하는 동안, WNV 샘플과 동일한 방법으로 전 공정을 진행하였다. 프로테이나제 K 및 AL 용해 완충액을 Genesis RSP 150상의 플라즈마 샘플과 혼합하였다.

혼합물을 진탕조에서 58℃로 배양하였다. 배양 후, ETOH(에탄올)을 Genesis 워크스테이션 200상의 용해물에 가하였다. 이어서 혼합물을 96-웰 유리섬유 플레이트로 옮기고 핵산 결합을 위해 진공여과하였다. 여과에 의해 필터를 2회 연속해서 세척하였다. 필터를 진공건조하고 공기 건조하였다. WNV RNA를 뉴클레아제가 없는 H2)로 여과하여 용출하였다. 용출액을 역전자(RT) 믹스를 함유하는 PCR 플레이트의 대응 웰로 직접 회수하였다.

증폭: 역전사 ( RT ) 및 PCR. RT 메스터 믹스 및 용출 샘플을 함유하는 PCR 플레이트를 역전사를 위해 Applied Biosystems Model 2700 써머사이클러(thermocycler)상에서 배양하였다. RT 단계가 종결될 때 역전사를 비활성으로 가열하고 PCR 믹스를 각 웰에 가하였다. PCR 반응 혼합물을 먼저 가열하여 앰플리태크 골드(AmpliTaq)를 활성화하고 이어서 PCR을 45 사이클 시행하였다.

검출: 형광물질 해독 및 계산. 45 PCR 사이클이 끝날 때 종말점 검출을 위해 분광형광계 서머사이클러(ABI PRISM 7900HT, PE-Biosystems, Foster City, CA)를 사용하였다. WNV 시ㅡ널은 522nm에서 읽는 FAM 라벨 프로브 및 554nm에서 읽는 VIC로 IC 시그널 라벨로 검출하였다. 시운전은 음성 및 양성 대조값이 미리 정한 범위 에 들어오면 유효한 것으로 유효한 것으로 간주한다. 양성 및 음성 샘플이 수용가능한 범위에 있으면 시운전은 유효하다. 내부 컨트롤(VIC) RFU값이 IC 컷오프를 초과하면 각 샘플의 결과치는 유효한 것으로 간주된다. IC 컷오프는 IC 음성 컨트롤 + 3 SD(n=3)의 평균 상대 형광 유니트(RFU)로부터 계산한다. WNV 반응성 컷오프는 WNV 음성 컨트롤 + 5 SD(n=4)의 평균 RFU로부터 계산한다. IC 컷오프보다 낮은 RFUs를 갖는 샘플을 WNV PCRdl 양성이지 않는 한 IC를 실패한 것으로 간주된다. 양성 샘플이란 RFU가 IC RFU와 관계없이 WNV 컷오프 RFU보다 크거나 동일한 것이다.

양성 컨트롤 시약: WNV 양성 컨트롤 WNV 조직 배양 상등액을 60℃에서 1시간 가열하여 비활성화하고, 음성 인간 플라즈마로 희석(1000배)하고, 공지된 함량의 WNV RNA를 함유하는 샘플 패널을 사용하여 RT-PCR 분석으로 정량화하였다. 양성 컨트롤 샘플을 60 RNA copies/ml를 함유하도록 조절하고, 급냉하고, -80℃ 또는 그 이하의 온도로 단일 사용 분취액으로 저장하였다. 사용하는 날 37℃의 수조에서 진탕하여 분취액을 해동하였다.

내부 컨트롤 시약: 뎅기열(하와이 균주) 배양 상등액을 60℃에서 1시간 가열하여 비활성화하고, PBS중 107 pfu/mL 및 10% 음성 인간 플라즈마로 희석하고, 단일 또는 다중 플레이트용 내부 컨트롤로 사용하기에 충분한 80 ㎕로 분취하였다. 분취액을 급냉하고, -80℃ 또는 그 이하의 온도로 저장하고, 사용하는 날 37℃의 수조에서 진탕하여 분취액을 해동하였다.

절차 요약: 분석은 AL 용해 완충액/프로테니아제 K 용해 용액으로 비리온을 용해하여 400 ㎕의 플라즈마로 실시하였다. 뎅기열 바이러스를 내부 PCR 컨트롤로 사용하였다. 이어서, 용해물을 역전사 및 PCR를 위해 핵산을 용출하기 전 세척 및 건조시킨 유리섬유 플레이트 상에서 감압 흡수하였다. 모든 피펫 단계는 Tecan Genesis RFP 150 및 200 워크스테이션에서 실시하였다. PCR 증폭은 ABI 모델 2700 서머사이클러상에서 실시하였다. 증폭된 핵산은 ABI 7900 형광분석 리더기로 검출하였다. 내부 컨트롤 이외에 분석 컨트롤은 음성 컨트롤 및 공지의 복사 수를 갖는 RNA를 갖는 WNV RNA 양성 컨트롤을 포함한다. WNV RNA 양성은 시험 샘플의 형광성을 음성 컨트롤의 형광성과 비교한 종말점 계산을 사용하여 확인한다.

샘플 원료 및 제법: -80℃에서 냉각시킨 CPDA-1 항응고된 혈액으로부터 얻은 플라즈마가 본 특정 연구의 원료이다. 샘플은 4℃에서 40-48시간 해동하고, 사용 전에 4℃에 저장하였다.

양성, 음성, 및 내부 컨트롤: 스크리닝 분석을 위해 300 WNV RNA copies/mldp 상응하는 가열 비활성 WNV 바이러스를 함유하는 하나의 양성 컨트롤 웰 을 사용하였다. 4개의 웰은 WNV 음성 컨트롤 플라즈마 및 3개의 추가 웰을 함유하며, 이들은 뎅기열 내부 컨트롤 표적 RRNA가 없는 용해 완충액으로 처리되는IC 음성 컨트롤 플라즈마로 세팅된다. WNV에 대한 양성 컷오프는 4개의 WNV 음성 컨트 롤의 평균 + 5SD로 계산된다. 뎅기열 내부 컨트롤에 대한 양성 컷오프는 뎅기열 바이러스가 없는 3개의 IC 음성 컨트롤의 평균 + 3SD로 계산된다.

비리온(virion)의 용해: 플라즈마 샘플에 함유된 비리온을 프러테이나제 K 및 AL 용해 완충액으로 용해하고, 방출된 핵산을 58℃의 수조에서 25분간 배양 동안 용해 완충액으로 보호하였다. 모든 단계의 공정에 대해 내부 컨트롤로서 사용하기 바로 전에 뎅기열 바이러스 내부 컨트롤을 용해 완충액에 첨가하였다.

WNV RNA 의 분리: 무수 에탄올을 용해물에 가하고, 로봇을 이용하여 샘플을 유리섬유 플레이트에 옮긴 후 진공여과하였다. 이어서 필터를 세척용액으로 세척하여 단백질 및 잠재적인 PCR의 억제제를 제거하고 건조하고 뉴클레아제 유리수로 96 웰 PCR 반응 플레이트로 용출하였다.

역전사: 전체 핵산 용출액 역전사 및 PCR 증폭하였다. 5X 제1 스트랜드 완충액, DTT, dNTPs, RNASE 억제제, WNV 역전사(WNV R) 프라이머, 뎅기열 역전사(DR) 프라이머 및 M-MLV 역전사 효소(reverse transcriptase)를 함유하는 역전사 믹스를 용해 추출물과 혼합하고 42℃에서 45분간 배양한 후, 95℃에서 2분간 배양하였다.

PCR 증폭: WNV 전진(WNV F) 프라이머, FAM 라벨 "유니버셜 비콘" WNV 프로브(WNV P), 뎅기열 전사(DF) 프라이머 및 VIC 라벨 뎅기열 내부 컨트롤 프로 브(DP), MgCl₂, PCR 완충액 및 태크 중합효소(AmpliTaq gold)를 함유하는 PCR 믹스를 RT 웰에 첨가하였다. 먼저, PCR 반응혼합물을 95℃에서 10분간 가열하여 Amplitaq gold를 활성화하고, 45 PCR 사이클을 ABI 2700 서머사이클러상에서 95℃ 58℃ 및 72℃에서 실시하였다.

PCR 생성물의 검출: 표적 서열이 증폭되면, PCR 생성물은 FAM 라벨 WNV 비콘 프로브의 루프 구조를 결합하여, 스템이 혼성화되는 것을 막아 FAM(리포터)와DABCYL(급냉기)를 멀리 떨어 뜨려 형광물질을 수득하였다. FAM은 490 nm에서 빠져나가 522 nm에서 읽힌다. 뎅기열 내부 컨트롤의 경우 VIC 라벨 프로브는 프라이머 사이트의 하나로부터 다운스트림을 어닐링하고 VIC 분자는 프라이머가 확장될 때 태크 DNA 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 쪼개진다. VIC 시그널은 표적 증폭 동안 프로브에서 나온 쪼개진 VIC 리포터를 프로브가 방출할 때 증가한다. VIC는 490nm에서 나와 554nm에서 읽힌다.

실시예 7: 4℃에서 저장한 플라즈마 중의 WNV의 안정성

WNV 샘플(1000, 50, 250, 125, 62.5 GE/ml)의 일련의 희석물을 급냉/해동하기전에 4℃에서 0일, 7일 및 14일간 저장하였다. 샘플 용적은 각각 350㎕ 추출물로, 각각의 샘플에 5개의 복제물이 있다. 각 샘플의 4개의 복제물을 시험하였다. RNA 추출을 테칸 로보틱스(Tecan Robotics)상의 유리섬유 필터 플레이트를 사용하 여 실시하였다. WNV-RNA에 대해 종말점 RT-PCR을 실시하였다.

RT-PCR의 결과치를 도 3에 나타내었으며, 데이터의 통계학적 분석은 표 6에 나타내었다. 4℃에서 7 내지 14일간 저장한 샘플은 4℃에서 0일간 저장한 대조 샘플의 수준과 동등한 WNV 형광 시그널 수준을 나타내었다. 그래서, WNV RNA는 4℃에서 저장시 적어도 14일간은 정상 인간 플라즈마에서 안정하다.

[표 9] 도 3에 나타낸 데이터의 통계학적 분석

4℃에서 경과일수	WNV 검출 평균^*Log₁₀RFU	t-test^**
0	1.92±0.38
7	1.76±0.31	P=0.06
14	1.87±0.35	P=0.34

^*모든 희석물로부터 얻은 데이터는 1000 GE/mL로 환산되었다(도 3 참조).

^**데이터는 0일 대조군에 대해 Student's T-test로 분석하였다.

Claims

a) 세포, 바이러스, 또는 세포 및 바이러스를 함유하는 샘플을 수득하고;

b) 세제를 함유하는 용해 용액(lysing solution)을 샘플에 첨가하여 세포 또는 바이러스를 용해하여 용해물(lysate)을 생성하고;

c) 핵산을 응집 또는 침전시키기에 충분한 양의 알코올을 용해물에 가하고; 및

d) 유리섬유 필터를 통하여 혼합물을 여과하여 용해물-알코올 혼합물로부터 핵산을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 샘플 중의 세포 또는 바이러스를 농축하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서,상기 세포 또는 바이러스는 폴리에틸렌 글리콜로 농축되는 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플은 생물학적 샘플인 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플은 수용성 샘플인 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플은 바이러스를 함유하는 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플은 미생물인 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 용해 용액은 프로테이나제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 프로테이나제는 프로테이나제 K인 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세제는 소디움 도데실 설페이트인 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세제는 트리-N-부틸-부틸포스페이트인 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플은 포유동물로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 포유동물은 사람인 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플은 새로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플은 절지동물로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
a) 세포, 바이러스, 또는 세포 및 바이러스를 함유하는 샘플을 수득하고;

b) 세제를 함유하는 용해 용액을 샘플에 첨가하여 세포 또는 바이러스를 용해하여 용해물(lysate)을 생성하고;

c) 핵산을 응집 또는 침전시키기에 충분한 양의 알코올을 용해물에 가하고;

d) 유리섬유 필터를 통하여 혼합물을 여과하여 용해물-알코올 혼합물로부터 핵산을 정제하고; 및

e) 병원체를 확인하기 위해 핵산을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플에서 병원체 확인방법.
a) 세포, 바이러스, 또는 세포 및 바이러스를 함유하는 샘플을 수득하고;

b) 세제를 함유하는 용해 용액을 샘플에 첨가하여 세포 또는 바이러스를 용해하여 용해물을 생성하고;

c) 핵산을 응집 또는 침전시키기에 충분한 양의 알코올을 용해물에 가하고;

d) 유리섬유 필터를 통하여 혼합물을 여과하여 용해물-알코올 혼합물로부터 핵산을 정제하고; 및

e) 오염물을 확인하기 위해 핵산을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 물 샘플에서 생물학적 오염물질의 확인방법.
a) 세포, 바이러스, 또는 세포 및 바이러스를 함유하는 샘플을 수득하고;

b) 세제를 함유하는 용해 용액을 샘플에 첨가하여 세포 또는 바이러스를 용해하여 용해물을 생성하고;

c) 핵산을 응집 또는 침전시키기에 충분한 양의 알코올을 용해물에 가하고;

d) 유리섬유 필터를 통하여 혼합물을 여과하여 용해물-알코올 혼합물로부터 핵산을 정제하고; 및

e) 유전장애를 확인하기 위해 핵산을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물에서 유전 장애의 확인방법.
a) 세제를 포함하는 용해 용액 및

b) 유리섬유 필터를 포함하는 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 키트.