CN111575244B - 一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法 - Google Patents

一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，具体制备步骤包括：细胞复苏；细胞传代；生物反应器培养；接种病毒；病毒收获；Mustang Q XT140膜层析处理；超滤浓缩及灭活；Sepharose 4FF凝胶层析。其中，用Sepharose 4FF凝胶层析为：按柱床体积5～10％进行上样，以0.01M磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰；其中，病毒收获为：当抗原含量≥0.3IU/mL时，开始收获，并进行灌流补液，连续收获连续补液；并将收获的所述病毒液用玻璃纤维滤芯进行过滤，去除细胞碎片。本发明制备工艺可有效去除过程中的DNA杂质，使产品得到有效的纯化。

Description

一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法
技术领域
本发明涉及狂犬病疫苗纯化领域，具体是一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法。
背景技术
狂犬病疫苗的发展情况，经历了三类制备方法，分别为：神经组织疫苗、原代细胞疫苗、人二倍体细胞疫苗(human diploid cell vaccine，HDCV)和传代细胞培养疫苗(cellculture rabies vaccines，CCV)。神经组织疫苗因其副反应严重，已经停止使用；原代细胞疫苗生产过程中易引入外源污染；人二倍体细胞疫苗产率低成本高，限制了其应用；WHO在上世纪八十年代向发展中国家推荐了用Vero细胞制备狂犬病疫苗的方法。目前，我国市场上有原代细胞、Vero细胞、人二倍体细胞三种狂犬病疫苗存在，主流产品是Vero细胞狂犬病疫苗。在Vero细胞狂犬病疫苗生产工艺中，需要对Vero细胞残余DNA进行残余量的控制，以控制最终产品在致瘤方面的潜在风险。以Vero细胞工艺制备狂犬病疫苗，残余DNA的去除方法非常重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，以解决现有技术Vero细胞狂犬病疫苗制备工艺中，残余Vero细胞DNA的去除问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，具体制备步骤包括：用玻璃纤维滤芯进行过滤；所述玻璃纤维滤芯孔径为0.6～1.0μm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明在病毒收获后，对病毒液进行玻璃纤维过滤，并通过限定玻璃纤维的特定孔径，使破碎的细胞碎片得到有效截流过滤；同时，之所以要采用玻璃纤维作为滤芯材料，是因为玻璃纤维化学本质为二氧化硅，二氧化硅表面硅烷醇基团与细胞破碎产生的生物质表面基团可形成大量氢键，虽然两者之间形成的氢键作用力较弱，但是数量巨大，可以使细胞破裂产生的DNA等生物质杂质在短时间内牢牢的吸附在二氧化硅表面，实现对收获液进行过滤纯化。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，具体制备步骤包括：用玻璃纤维滤芯进行过滤；所述玻璃纤维滤芯孔径为0.6～1.0μm。
上述技术方案在病毒收获后，对病毒液进行玻璃纤维过滤，并通过限定玻璃纤维的特定孔径，使破碎的细胞碎片得到有效截流过滤；同时，之所以要采用玻璃纤维作为滤芯材料，是因为玻璃纤维化学本质为二氧化硅，二氧化硅表面硅烷醇基团与细胞破碎产生的生物质表面基团可形成大量氢键，虽然两者之间形成的氢键作用力较弱，但是数量巨大，可以使细胞破裂产生的DNA等生物质杂质在短时间内牢牢的吸附在二氧化硅表面，实现对收获液进行过滤纯化。
所述具体制备步骤包括：用Mustang Q XT140膜层析处理。
Mustang Q膜是一种复合了离子基团的聚醚砜，它能特异性对滤过的液体中的DNA产生吸附作用，进而去除DNA杂质。
所述Mustang Q XT140膜层析处理时的流速为1300～1500mL/min。
若流速低于1300mL/min，则过滤效率较低，若流速高于1500mL/min，则容易因为流速过快而影响Mustang Q膜对DNA的有效吸附。
所述具体制备步骤包括：用超滤膜浓缩后，用缓冲液进行洗滤。
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
上述技术方案采用超滤膜进行浓缩狂犬病毒，可有效利用超滤膜的截留作用，使小分子DNA被滤过，使产品得到进一步纯化。少部分截留后的DNA则可以通过用磷酸盐缓冲液有效去除。
所述具体制备步骤包括：用Sepharose 4FF凝胶层析。
所述用Sepharose 4FF凝胶层析为：按柱床体积5～10％进行上样，以0.01M磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰。
上述技术方案可以有效利用凝胶层析过程，进一步将体系中游离的小分子DNA去除，有效保障产品的纯度。
所述磷酸盐缓冲液由以下重量份数的原料组成：8～10份氯化钠，0.2～0.4份氯化钾，3～5份十二水合磷酸氢二钠，0.2～0.4份磷酸氢二钾，800～1000份水。
所述具体制备步骤包括：
(1)细胞复苏；
(2)细胞传代；
(3)生物反应器培养；
(4)接种病毒；
(5)病毒收获；
(6)Mustang Q XT140膜层析处理；
(7)超滤浓缩及灭活；
(8)Sepharose 4FF凝胶层析。
所述病毒收获为：当抗原含量≥0.3IU/mL时，开始收获，并进行灌流补液，连续收获连续补液；并将收获的的所述病毒液用玻璃纤维滤芯进行过滤，去除细胞碎片。
实施例1
细胞复苏：从液氮罐中取工作库种子细胞，放入37℃的温水中，使其融化后，无菌操作转入装有生长液的方瓶中，在温度为36℃的培养箱中培养；
细胞传代：于显微镜下观察，待复苏的细胞长满单层后，用0.25％胰蛋白酶消化，使贴壁的细胞脱落，按1：3的比例分种，36℃条件下恒温培养3天；
生物反应器培养:将上述细胞用0.25％胰蛋白酶消化，转移至生物反应器中进行培养。生物反应器中预先装有聚酯片载体，按培养体积每升加30g载体,细胞接种密度按2×105cells/mL。培养参数设定：温度36℃，DO30，pH值7.0。培养至细胞密度达到1×107cells/mL以上；
接种病毒：弃去生物反应器中培养液加入置换液，按0.01MOI感染量加入CTN-1V狂犬病毒种，设定参数：温度33℃，DO30，pH值7.3，进行培养。24小时后，置换成0.01M磷酸盐缓冲液，反复2次后加入维持液，继续培养。设定参数：温度33℃，DO30，pH值7.3；所述磷酸盐缓冲液由以下重量份数的原料组成：8份氯化钠，0.2份氯化钾，3份十二水合磷酸氢二钠，0.2份磷酸氢二钾，800份注射用水；
病毒收获：10小时后，开始取样检测抗原含量。当抗原含量≥0.3IU/mL时，开始收获，并进行灌流补液，连续收获连续补液；当抗原含量≤0.3IU/mL或者培养液较浑浊时，停止收获。收获的的病毒液立即用玻璃纤维滤芯(孔径0.6μm)进行过滤，去除细胞碎片；
Mustang Q XT140膜层析处理：调节病毒收获液pH至8.0，以1400mL/min流速使病毒收获液过膜；
超滤浓缩及灭活：用100kD超滤膜浓缩，再用6倍浓缩液体积的0.01M磷酸盐缓冲溶液洗滤。按1：4000加入β-丙内酯，在2℃条件下灭活24小时，之后在37℃水解β-丙内酯2小时；
Sepharose 4FF凝胶层析：按柱床体积5％进行上样，以0.01M磷酸盐缓冲溶液洗脱，收集蛋白峰。用玻璃纤维滤芯(孔径0.6μm)进行过滤层析收集峰即为狂犬病毒原液。
实施例2
细胞复苏：从液氮罐中取工作库种子细胞，放入38℃的温水中，使其溶解，溶解后，无菌操作转入装有生长液的方瓶中，在温度为37℃的培养箱中培养；
细胞传代：于显微镜下观察，待复苏的细胞长满单层后，用0.25％胰蛋白酶消化，使贴壁的细胞脱落，按1：5的比例分种，37℃条件下恒温培养5天；
生物反应器培养:将上述细胞用0.25％胰蛋白酶消化，转移至生物反应器中进行培养。生物反应器中预先装有聚酯片载体，按培养体积每升加35g载体,细胞接种密度按2×105cells/mL。培养参数设定：温度37℃，DO40，pH值7.1。培养至细胞密度达到1×107cells/mL以上；
接种病毒：弃去生物反应器中培养液加入置换液，按0.01MOI感染量加入CTN-1V狂犬病毒种，设定参数：温度35℃，DO40，pH值7.4，进行培养。24小时后，置换成0.01M磷酸盐缓冲液，反复2次后加入维持液，继续培养。设定参数：温度35℃，DO40，pH值7.4；所述磷酸盐缓冲液由以下重量份数的原料组成：10份氯化钠，0.4份氯化钾，5份十二水合磷酸氢二钠，0.4份磷酸氢二钾，1000份注射用水
病毒收获：10小时后，开始取样检测抗原含量。当抗原含量≥0.3IU/mL时，开始收获，并进行灌流补液，连续收获连续补液；当抗原含量≤0.3IU/mL或者培养液较浑浊时，停止收获。收获的的病毒液立即用玻璃纤维滤芯(孔径0.8μm)进行过滤，去除细胞碎片；
Mustang Q XT140膜层析处理：调节病毒收获液pH至8.0，以1500mL/min流速使病毒收获液过膜；
超滤浓缩及灭活：用200kD超滤膜浓缩，再用10倍浓缩液体积的0.01M磷酸盐缓冲溶液洗滤。按1：4000加入β-丙内酯，在2℃条件下灭活24小时，之后在37℃水解β-丙内酯2小时；
Sepharose 4FF凝胶层析：按柱床体积10％进行上样，以0.01M磷酸盐缓冲溶液洗脱，收集蛋白峰。用玻璃纤维滤芯(孔径1.0μm)进行过滤层析收集峰即为狂犬病毒原液。
实施例3
细胞复苏：从液氮罐中取工作库种子细胞，放入39℃的温水中，使其溶解，溶解后，无菌操作转入装有生长液的方瓶中，在温度为38℃的培养箱中培养；
细胞传代：于显微镜下观察，待复苏的细胞长满单层后，用0.25％胰蛋白酶消化，使贴壁的细胞脱落，按1：10的比例分种，38℃条件下恒温培养6天；
生物反应器培养:将上述细胞用0.25％胰蛋白酶消化，转移至生物反应器中进行培养。生物反应器中预先装有聚酯片载体，按培养体积每升加60g载体,细胞接种密度按2×105cells/mL。培养参数设定：温度38℃，DO80，pH值7.4。培养至细胞密度达到1×107cells/mL以上；
接种病毒：弃去生物反应器中培养液加入置换液，按0.1MOI感染量加入CTN-1V狂犬病毒种，设定参数：温度33℃，DO80，pH值7.7，进行培养。24小时后，置换成0.01M磷酸盐缓冲液，反复2次后加入维持液，继续培养。设定参数：温度37℃，DO80，pH值7.7；所述磷酸盐缓冲液由以下重量份数的原料组成：9份氯化钠，0.3份氯化钾，4份十二水合磷酸氢二钠，0.3份磷酸氢二钾，900份注射用水
病毒收获：10小时后，开始取样检测抗原含量。当抗原含量≥0.3IU/mL时，开始收获，并进行灌流补液，连续收获连续补液；当抗原含量≤0.3IU/mL或者培养液较浑浊时，停止收获。收获的的病毒液立即用玻璃纤维滤芯(孔径1.0μm)进行过滤，去除细胞碎片；
Mustang Q XT140膜层析处理：调节病毒收获液pH至8.0，以1300mL/min流速使病毒收获液过膜；
超滤浓缩及灭活：用300kD超滤膜浓缩，再用8倍浓缩液体积的0.01M磷酸盐缓冲溶液洗滤。按1：4000加入β-丙内酯，在8℃条件下灭活24小时，之后在37℃水解β-丙内酯2小时；
Sepharose 4FF凝胶层析：按柱床体积10％进行上样，以0.01M磷酸盐缓冲溶液洗脱，收集蛋白峰。用玻璃纤维滤芯(孔径1.0μm)进行过滤层析收集峰即为狂犬病毒原液。
实施例4
本实施例相比于实施例1而言，区别在于：病毒收获步骤中，未采用玻璃纤维滤芯进行过滤，其余条件保持不变。
实施例5
本实施例相比于实施例1而言，区别在于：未采用MustangQ XT140膜层析处理，其余条件保持不变。
实施例6
本实施例相比于实施例1而言，区别在于：未采用超滤膜浓缩，其余条件保持不变。
对实施例1-6的工艺过程中的抗原和DNA水平进行测试，具体测试结果如表1和2所示：
表1：实施例1～3测试数据
Figure BDA0002479251090000101
表2：实施例4～6测试数据
Figure BDA0002479251090000102
Figure BDA0002479251090000111
由表1和表2测试结果可知，本申请采用的技术方案可以有效解决Vero细胞狂犬病疫苗制备工艺中，残余Vero细胞DNA的去除，而本申请所述的关键技术工艺缺失后，将导致产品最终的DNA含量显著上升，产品纯度受到显著不良影响。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (6)

1.一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，其特征在于，具体制备步骤包括：用玻璃纤维滤芯进行过滤；所述玻璃纤维滤芯孔径为0.6～1.0μm；具体制备步骤包括：
(1)细胞复苏；
(2)细胞传代；
(3)生物反应器培养；
(4)接种病毒；
(5)病毒收获；
(6)Mustang Q XT140膜层析处理；
(7)超滤浓缩及灭活；
(8)Sepharose 4FF凝胶层析；
所述Mustang Q XT140膜层析处理时的流速为1300～1500mL/min；所述（5）、（8）步骤都包含所述用玻璃纤维滤芯进行过滤的步骤。
2.根据权利要求1所述的一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，其特征在于，所述具体制备步骤包括：用超滤膜浓缩后，用缓冲液进行洗滤。
3.根据权利要求2所述的一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，其特征在于，所述Sepharose 4FF凝胶层析为：按柱床体积5～10％进行上样，以0.01M磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰。
5.根据权利要求3或4任一项所述的一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液由以下重量份数的原料组成：8～10份氯化钠，0.2～0.4份氯化钾，3～5份十二水合磷酸氢二钠，0.2～0.4份磷酸氢二钾，800～1000份水。
6.根据权利要求1所述的一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，其特征在于，所述病毒收获为：当抗原含量≥0.3IU/mL时，开始收获，并进行灌流补液，连续收获连续补液；并将收获的所述病毒液用玻璃纤维滤芯进行过滤，去除细胞碎片。
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多种方法结合除去冻干人用狂犬病疫苗中vero细胞残留DNA;刘杰 等;《中国生物制品学杂志》;20131220;第26卷(第12期);第1828页 左栏第5段-右栏第2段，右栏倒数第2段，第1830页左栏第2段，表1 *
轮状病毒原液不同澄清、超滤方式效果的比较;姜英 等;《中国生物制品学杂志》;20141111;第27卷(第10期);第1321-1324页 *

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