CN104311647A - 一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法 - Google Patents

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吴强
马礼耕
伍长华
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Abstract

本发明公开了一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法，它包括：S1.样品处理：百日咳杆菌培养结束后去除菌体、收集上清液，上清液用超滤膜包浓缩；S2.一次层析：包括洗脱杂蛋白、分离百日咳毒素和分离纯化丝状血凝素；S3.二次层析：将分离的百日咳毒素粗制品上样于CaptoMMC层析柱，缓冲液洗脱，收集OD280洗脱峰处的洗脱液，即为纯化的百日咳毒素。本发明采用CaptoSPImpRes层析柱、CaptoMMC层析柱对百日咳杆菌培养液的上清液进行分离纯化，可精确得到PT和FHA，质量可控，分离纯化百日咳抗原蛋白的纯度达95%以上，该方法具有操作简单、纯化速度快、成本低的优点。

Description

一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法
技术领域
  本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离纯化百日咳抗原蛋白的方法。
背景技术
百日咳（pertussis, whooping cough）是由革兰氏阴性百日咳杆菌引起的一种具有强传染性的呼吸系统疾病，典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，新生儿及婴幼儿患者会引起呼吸暂停和发绀。百日咳在发病初期传染力极强，不易诊断，因此进行疫苗接种是预防和控制百日咳最经济最有效的手段。
百日咳杆菌其致病物质主要包括百日咳毒素(Pertussis Toxin，PT)、丝状血凝素（Filamentous Hemagglutinin，FHA）、百日咳杆菌粘附素(Pertactin，PRN)、凝集原(Agglutinogens，AGGs)、腺苷酸环化酶毒素(Adenylate Cyclase Toxin，ACT)、气管细胞毒素(Tracheal Cytotoxin，TCT)和不耐热毒素(Heat-labile toxin，HLT)等多种生物活性物质，这些生物活性物质在百日咳杆菌的致病作用和引起宿主对疾病的免疫反应方面起着重要作用。目前市场上的百日咳疫苗主要有全菌体百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗两种，后者属于百日咳疫苗的升级产品，其仅含提纯的有效抗原而咩有百日咳菌体，因此大大降低了注射后的不良反应而保留了良好的免疫效果，因此被广泛使用。
无细胞百日咳疫苗的发展趋势，是通过纯化手段去除无用且引起副反应的组分（如HLT、TCT和ACT），保留并提纯具有保护性免疫作用的抗原成分（如PT、FHA和PRN等），传统的无细胞百日咳疫苗抗原制备工艺可以分为以下两种：
1. 离心共纯化工艺：我国和日本大部分厂商采用的离心共纯化工艺，即细菌培养液收获后，通过硫酸铵盐析、高盐溶液浸提和蔗糖密度梯度离心获得精制抗原，然后利用戊二醛溶液或者甲醛溶液将抗原脱毒为类毒素；但此种方法所需设备投资巨大，且此工艺生产的产品纯度不够高、产率也较低，不适宜大规模生产；
2. 柱层析：包括以下几种：（1）羟基磷灰石，结合珠蛋白柱层析和凝胶过滤法；（2）蓝胶亲和层析和胎球蛋白亲和层析法；（3）蓝胶亲和层析和羟基磷灰石层析法；（4）珍珠岩层析和羟基磷灰石柱层析；虽然使用这些工艺都可得到较纯的百日咳抗原PT和FHA，但（1）、（2）、（3）工艺都有其不可避免的问题，例如：蓝胶亲和层析、胎球蛋白亲和层析、结合珠蛋白亲和层析法，层析填料的结合基团容易降解下来而影响疫苗质量。另外，洗脱液中含有毒物质或者洗脱条件过于苛刻，这些都会直接影响抗原产率和质量；工艺（4）虽可获得较高纯度和产率的PT和FHA，但菌苗培养物经珍珠岩柱层析分离纯化后，PT和FHA的纯度只能达到62%-68%，还要经过羟基磷灰石柱层析分离纯化，PT和FHA的纯度才能达到90%左右，羟基磷灰石价格昂贵，并且此步大约10%的PT和FHA损失掉。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法，本发明采用Capto SP ImpRes层析柱、Capto MMC层析柱对百日咳杆菌培养液的上清液进行分离纯化，所得抗原蛋白成分明确、质量可控，纯化方法具有操作简单、纯化速度快、成本低的优点。
    本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法，它包括以下步骤：
    S1. 样品处理：百日咳杆菌培养结束后将培养液立即降温至2～8℃，去除菌体、收集上清液，上清液用截留分子量为10KD的超滤膜包浓缩至原体积的1/12～1/8，调节浓缩液的pH至6.0；
S2. 一次层析
S21.洗脱杂蛋白：将上述浓缩液上样于平衡好的Capto SP ImpRes层析柱，用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.11M NaCl缓冲液洗脱杂蛋白；
S22.分离百日咳毒素：再用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.17M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280洗脱峰处的洗脱液，即为百日咳毒素粗制品；
S23：分离纯化丝状血凝素：然后用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.35M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280下洗脱峰处的洗脱液，即为纯化的丝状血凝素；
S3. 二次层析：将步骤S22所得的百日咳毒素粗制品上样于平衡好的Capto MMC层析柱，用pH8.0、20mM PB、1M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280洗脱峰处的洗脱液，即为纯化的百日咳毒素。
    进一步地，步骤S1中所述去除菌体的方法为培养液经连续流离心或进行切向流微滤、压滤，且滤膜的孔径为0.2μm，所述去除菌体的操作均在2～8℃的温度下进行。
    进一步地，所述分离纯化的百日咳毒素和丝状血凝素置于2～8℃保存。
本发明具有以下优点：本发明采用Capto SP ImpRes层析柱、Capto MMC层析柱对百日咳杆菌培养液的上清液进行分离纯化，可精确得到PT和FHA，质量可控，分离纯化百日咳抗原蛋白的纯度达95%以上，纯化方法具有操作简单、纯化速度快、成本低的优点。
附图说明
    图1为一次层析中百日咳毒素和丝状血凝素的层析图；
图2为二次层析百日咳毒素的层析图；
图3为本发明分离纯化的百日咳毒素和丝状血凝素纯度分析电泳图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法，它包括以下步骤：
    S1. 样品处理：百日咳杆菌培养结束后将培养液立即降温至2℃，培养液经连续流离心去除菌体、收集上清液，该操作在2℃的温度下进行。上清液用截留分子量为10KD的超滤膜包浓缩至原体积的1/12，调节浓缩液的pH至6.0；
S2. 一次层析
S21.洗脱杂蛋白：将上述浓缩液上样于平衡好的Capto SP ImpRes层析柱，用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.11M NaCl缓冲液洗脱杂蛋白，杂蛋白洗脱峰如图1所示；
S22.分离百日咳毒素：再用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.17M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280洗脱峰处的洗脱液，即为百日咳毒素（PT）粗制品，PT洗脱峰如图1所示；
S23：分离纯化丝状血凝素：然后用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.35M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280下洗脱峰处的洗脱液，即为纯化的丝状血凝素（FHA），置于2℃保存，FHA洗脱峰如图1所示；
S3. 二次层析：将步骤S22所得的百日咳毒素粗制品上样于平衡好的Capto MMC层析柱，用pH8.0、20mM PB、1M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280洗脱峰处的洗脱液，即为纯化的百日咳毒素，置于2℃保存，PT洗脱峰如图2所示。
实施例2：一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法，它包括以下步骤：
    S1. 样品处理：百日咳杆菌培养结束后将培养液立即降温至8℃，培养液进行切向流微滤、压滤，滤膜的孔径为0.2μm，去除菌体、收集上清液，该操作在8℃的温度下进行。上清液用截留分子量为10KD的超滤膜包浓缩至原体积的1/8，调节浓缩液的pH至6.0；
S2. 一次层析
S21.洗脱杂蛋白：将上述浓缩液上样于平衡好的Capto SP ImpRes层析柱，用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.11M NaCl缓冲液洗脱杂蛋白，杂蛋白洗脱峰如图1所示；
S22.分离百日咳毒素：再用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.17M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280洗脱峰处的洗脱液，即为百日咳毒素（PT）粗制品，PT洗脱峰如图1所示；
S23：分离纯化丝状血凝素：然后用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.35M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280下洗脱峰处的洗脱液，即为纯化的丝状血凝素（FHA），置于8℃保存，FHA洗脱峰如图1所示；
S3. 二次层析：将步骤S22所得的百日咳毒素粗制品上样于平衡好的Capto MMC层析柱，用pH8.0、20mM PB、1M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280洗脱峰处的洗脱液，即为纯化的百日咳毒素，置于8℃保存，PT洗脱峰如图2所示。
实施例3：一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法，它包括以下步骤：
    S1. 样品处理：百日咳杆菌培养结束后将培养液立即降温至5℃，培养液经连续流离心去除菌体、收集上清液，该操作在5℃的温度下进行。上清液用截留分子量为10KD的超滤膜包浓缩至原体积的1/10，调节浓缩液的pH至6.0；
S2. 一次层析
S21.洗脱杂蛋白：将上述浓缩液上样于平衡好的Capto SP ImpRes层析柱，用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.11M NaCl缓冲液洗脱杂蛋白，杂蛋白洗脱峰如图1所示；
S22.分离百日咳毒素：再用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.17M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280洗脱峰处的洗脱液，即为百日咳毒素（PT）粗制品，PT洗脱峰如图1所示；
S23：分离纯化丝状血凝素：然后用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.35M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280下洗脱峰处的洗脱液，即为纯化的丝状血凝素（FHA），置于6℃保存，FHA洗脱峰如图1所示；
S3. 二次层析：将步骤S22所得的百日咳毒素粗制品上样于平衡好的Capto MMC层析柱，用pH8.0、20mM PB、1M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280洗脱峰处的洗脱液，即为纯化的百日咳毒素，置于6℃保存，PT洗脱峰如图2所示。
实施例4：纯度分析（SDS-PAGE）
1. 实验方法：SDS-PAGE银染法。
1.1 样品处理：待检样品为实施例3分离纯化的百日咳毒素（PT）、纯化的丝状血凝素（FHA），先将样品稀释，一般可以将待检样品稀释成每毫升0.3-0.5毫克，上样样品含四分之三的待检品，四分之一的样品处理液，不需水浴。上样量一般为每道含待检样品百日咳蛋白2微克，百日咳标准品(PT和FHA)蛋白2-3微克，分子量标准品蛋白（Maker）2微克。
1.2电泳并染色：本实验采用垂直电泳，开始浓缩胶电压低些（70-80V，大约20分钟），分离胶时电压高些（150-200V），全过程电泳时间大约60-80分钟。待溴酚蓝前沿到达电泳槽底部（阳极）时，切断电源，打开电泳槽上盖，取出电泳槽支架并倒掉内槽内的液体，小心取下玻板并把两片玻板分开，轻轻地将玻板上的浓缩胶与分离胶分开并舍去浓缩胶部分，将分离胶小心地取下放入已准备好的存有固定液的容器里（或大平皿内）开始染色，染色为银染法。
    2. 实验结果：还原电泳凝胶蛋白质经扫描，计算待检样品相对于PT和FHA的条带占总蛋白的百分比。
电泳图如图3所示：
图中：M：maker；
     浓缩液：实施例3中步骤S1百日咳菌液离心超滤浓缩后浓缩液样品；
     PT：实施例3中步骤S3纯化后百日咳毒素；
     FHA：实施例3中步骤S23分离纯化后收获的丝状血凝素。
结果分析：PT是6nm球星蛋白，由5个亚基S1、S2、S3、S3、S4、S5。分子质量分别为28KD、23KD、22KD、11.7KD、9.3KD。在SDS-PAGE电泳S2和S3，S4和S5不易分开；FHA为丝状蛋白，SDS-PAGE电泳检测在220-90kD之间有五条亚单位带，在图3电泳图谱中得到证明；进行蛋白扫描分析，选中相应蛋白条带计算纯度均超过95%。 

Claims (3)

1.一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1. 样品处理：百日咳杆菌培养结束后将培养液立即降温至2～8℃，去除菌体、收集上清液，上清液用截留分子量为10KD的超滤膜包浓缩至原体积的1/12～1/8，调节浓缩液的pH至6.0；
S2. 一次层析
S21.洗脱杂蛋白：将上述浓缩液上样于平衡好的Capto SP ImpRes层析柱，用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.11M NaCl缓冲液洗脱杂蛋白；
S22.分离百日咳毒素：再用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.17M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280洗脱峰处的洗脱液，即为百日咳毒素粗制品；
S23：分离纯化丝状血凝素：然后用pH6.0、20mM PB、2M尿素、0.35M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280下洗脱峰处的洗脱液，即为纯化的丝状血凝素；
S3. 二次层析：将步骤S22所得的百日咳毒素粗制品上样于平衡好的Capto MMC层析柱，用pH8.0、20mM PB、1M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集OD280洗脱峰处的洗脱液，即为纯化的百日咳毒素。
2.如权利要求1所述的一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法，其特征在于，步骤S1中所述去除菌体的方法为培养液经连续流离心或进行切向流微滤、压滤，且滤膜的孔径为0.2μm，所述去除菌体的操作均在2～8℃的温度下进行。
3.如权利要求1所述的一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法，其特征在于，所述分离纯化的百日咳毒素和丝状血凝素置于2～8℃保存。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105175517A (zh) * 2015-09-17 2015-12-23 北京民海生物科技有限公司 一种百日咳抗原的分离纯化方法
CN108212228A (zh) * 2016-12-12 2018-06-29 东莞东阳光科研发有限公司 全血分离微流控芯片、检测装置及全血检测方法
CN109745548A (zh) * 2019-03-05 2019-05-14 昆明医科大学第一附属医院 一种百日咳毒素在治疗脑梗死中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
田阳: "百日咳毒素、丝状血凝素和黏附素的纯化", 《中国生物制品学杂志》 *
秦力: "白日咳毒素和丝状血凝素的纯制和检测现状", 《微生物学免疫学进展》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105175517A (zh) * 2015-09-17 2015-12-23 北京民海生物科技有限公司 一种百日咳抗原的分离纯化方法
CN108212228A (zh) * 2016-12-12 2018-06-29 东莞东阳光科研发有限公司 全血分离微流控芯片、检测装置及全血检测方法
CN108212228B (zh) * 2016-12-12 2023-10-17 东莞东阳光科研发有限公司 全血分离微流控芯片、检测装置及全血检测方法
CN109745548A (zh) * 2019-03-05 2019-05-14 昆明医科大学第一附属医院 一种百日咳毒素在治疗脑梗死中的应用

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