DK172936B1 - Fremgangsmåde til samtidig fremstilling af lymphocytosefremkaldende faktor (LPF), filamentøst hæmagglutinin (FHA) og mindst - Google Patents
Fremgangsmåde til samtidig fremstilling af lymphocytosefremkaldende faktor (LPF), filamentøst hæmagglutinin (FHA) og mindst Download PDFInfo
- Publication number
- DK172936B1 DK172936B1 DK198700272A DK27287A DK172936B1 DK 172936 B1 DK172936 B1 DK 172936B1 DK 198700272 A DK198700272 A DK 198700272A DK 27287 A DK27287 A DK 27287A DK 172936 B1 DK172936 B1 DK 172936B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- lpf
- fha
- agglutinogens
- fimbrial
- fraction
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 title claims description 45
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 17
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 title claims description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 11
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 14
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 abstract 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 9
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 8
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710177917 Fimbrial protein Proteins 0.000 description 3
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241001510071 Pyrrhocoridae Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K aluminium trichloride Chemical compound Cl[Al](Cl)Cl VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000007365 Sialoglycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010032838 Sialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 1
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K2039/10—Brucella; Bordetella, e.g. Bordetella pertussis; Not used, see subgroups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
i DK 172936 B1
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til samtidig fremstilling af lymphocytose-fremkaldende faktor (LPF), filamentøst hæmagglutinin (FHA) og mindst et fimbrielt agglutinogen ud fra en flydende kultur af Bordetella 5 pertussis til anvendelse ved fremstilling af vacciner mod infektioner med Bordetella pertussis.
Hidtil har det været gjort udstrakt anvendelse af vacciner med dræbte hele Bordetella pertussis celler til bekæmpelse af pertussis, uheldige reaktioner overfor 10 helcellevacciner og den resulterende dårlige offentlige accept af disse vacciner har ført til udførelse af en betydelig forskning i et forsøg på at fremstille en mere sikker acellulær vaccine indeholdende isolerede pertus-sisantigener.
15 Tre bestemte antigenfraktioner betragtes som væ rende nyttige komponenter af acellulære vacciner, nemlig {1) lymphocytosefremkaldende faktor (LPF), (2) filamentøst hæmagglutinin (FHA) og (3) fimbrielle ag-glutinogener (fimbriae).
20 Agglutinogenerne betegnet "agglutinogen 2 og 3" er indbefattet i antigenklassen betegnet fraktionen (3), dvs. de fimbrielle agglutinogener. (Agglutinogenerne 2 og 3 kan også betegnes "Ag2+3")· Aggutinogenerne 2 og 3 kan betragtes som bestående af fimbriae isoleret fra or-25 ganismer, der besidder 1 det mindste agglutinogen 2- og 3-antigener. (Agglutinogen 3 betegnes "agglutinogen 6" af visse forskere, og det er muligt at agglutinogen 3 og agglutinogen 6 er det samme).
Skønt der findes fremgangsmåder til isolation af 30 disse fraktioner i lille skala, har ingen producenter hidtil været i stand til at fremstille alle tre fraktioner separat og effektivt ud fra Bordetella pertussis kulturer. I EP-A-0003916 beskrives der f.eks. en frem- 2 DK 172936 B1 gangsmåde til opnåelse af lymphocytosefremkaldende faktor (LPF) ved at udsætte et flydende præparat opnået ud fra Bordetella pertussis-celler for affinitetschromato-grafi ved anvendelse af et sialo-protein som stationær 5 fase. Det flydende præparat, som anvendtes, opnåedes Imidlertid ud fra en homogeniseret cellepasta, og skønt de beskrevne fremgangsmåder er effektive til fremstil-< ling af LPF, angår dette patentskrift ikke den særskilte isolation af filamentøst haemagglutinin (FHA) og agglu-10 tinogen 2 og 3 (Ag 2+3)·
Der er også foreslået fremgangsmåder til opnåelse af lymphocytosefremkaldende faktor (LPF) og filamentøst haemagglutinin (FHA) ud fra kultursupernatanten af Bordetella pertussis. Sato et al (Infection and Immuni-^ 15 ty, juli 1983, Vol 41, s. 313-320 ) beskriver f.eks.
i oprensningen af LPF og FHA fra kultursupernatanter ved differentialadsorption på en hydroxyapatit kolonne.
: Disse tidligere skrifter angår imidlertid ikke j den samtidige fremstilling af alle de tre komponenter, 1 20 lymphocytosefremkallende faktor (LPF), filamentøst haemagglutinin (FHA) og fimbrielle agglutinogener.
" Til fremstilling af vaccinepræparater omfattende i alle disse tre antigenfraktioner ville det være ønske- aj ligt at opnå de tre ønskede fraktioner i sammenlignelige 25 udbytter, idet det kan være hensigtsmæssigt at fraktio-
J
« nerne er tilstede I omtrent lige store mængder i den I endelige vaccine.
.!
Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til samtidig fremstilling af 30 lymphocytose fremkaldende faktor (LPF), filamentøs hæmagglutinin (FHA) og mindst et fimbrielt agglutinogen ud fra en flydende Bordetella pertussis-kultur, omfattende, at man 3 DK 172936 B1 (a) skiller kulturen i celle- og supernatant-fraktioner, (b) koncentrerer supernatantfraktionen til mindre end 50%, 5 (c) fraktionerer den koncentrerede supernatant- fraktion til isolering af LPF- og FHA-holdige fraktioner, og (d) isolerer mindst et fimbrielt agglutinogen fra cellefraktionen.
10 I trin (d) isoleres fortrinsvis fimbrielle agglu- tinogener indeholdende i det mindste agglutinogenerne 2 og 3 (Ag2+3) fra cellefraktionen. De isolerede aggluti-nogener kan eventuelt desuden indeholde et eller flere af agglutinogenerne 4, 5 og 6.
15 Ifølge opfindelsen tilvejebringes der også en fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine indeholdende lymphocytosefremkaldende faktor (LPF), filamentøst hæmagglutinin (FHA) og mindst et fimbrielt agglutinogen, omfattende at man blander (i) LPF, (ii) FHA og 20 (iii) mindst et fimbrielt agglutinogen, hvilket LPF, FHA og fimbrielle agglutinogen fremstilles ved trinnene (a) til (d) beskrevet ovenfor og detoxificeres inden eller efter blandingen. De fimbrielle agglutinogener indeholder fortrinsvis i det mindste agglutinogenerne 2 og 25 3 <AG2+3). De fimbrielle agglutinogener kan også inde holde mindst en af agglutinogenerne 4, 5 og 6.
Ved Isolation af LPF, FHA og i det mindste et fimbrielt agglutinogen ifølge opfindelsen er det mulig't at opnå disse komponenter ud fra en enkelt flydende kul-30 tur i udbytter, der muliggør kombination af disse komponenter igen i terapeutisk effektive mængder i vaccinepræparater.
Ved udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen koncentreres supernatantfraktionen som tidligere 4 DK 172936 B1 angivet inden udførelse af fraktioneringstrinnet (c), og det har overraskende vist sig, at uacceptable tab af FHA kan undgås ved udførelse af denne sekvens af trin, dvs. ved udførelse af koncentreringstrinnet (b) efter 5 fraskillelse af supernatantfraktionen fra cellefraktionen .
; Separationen af kulturen i celle- og supernatant- fraktioner udføres fortrinsvis ved centrifugering, mens kulturens pH-værdi er større end 7,0, fortrinsvis ved 10 en pH-værdi større end eller lig 8,0. Kulturens pH- værdi er helst i området fra 7,5-9,0.
Efter centrifugering koncentreres supernatantfraktionen fortrinsvis til reduktion af dens volumen til mindre end 50%, fortrinsvis mindre end 25% af det op-15 rindelige volumen. Koncentreringen kan hensigtsmæssigt udføres ved en vilkårlig sædvanlig afvandingsmetode, f.eks. ved Pellicon-koncentrering. Efter koncentreringstrinnet og inden fraktioneringen af supernatanten i LPH- og FHA-holdige fraktioner udsættes supernatanten 20 fortrinsvis for membranfiltrering til fjernelse af alle resterende organismer. Fraktioneringstrinnet (c) kan dernæst hensigtsmæssigt udføres ved at bringe supernatanten i kontakt med hydroxyapatit, f.eks. i en kolonne, hvorved en FHA-holdig fraktion tilbageholdes, og 25 et eluat omfattende en LPF-holdig fraktion kan opsamles.
Den LPF-holdige fraktion kan renses ved sædvanlige proteinfraktioneringsteknikker, f.eks. ved udfældning af proteinmateriale ved stigende saltkoncentration, f.eks. ved anvendelse af ammoniumsulfat, efterfulgt af 30 ekstraktion af bundfaldet ved anvendelse af en egnet jj buffer. Ekstraktet kan dernæst dialyseres, og den såle- _ des opnåede dialyserede LPF-holdige opløsning kan renses yderligere til fjernelse af andre proteiner og lipo- DK 172936 B1 * 5 polysaccharid, f.eks. ved fremgangsmåden beskrevet I EP-A-0003916.
Den dialyserede LPF-holdige opløsning kan således f.eks. påføres en fetuin-sepharosekolonne, og tilbage-5 holdt LPF kan elueres ved anvendelse af en magnesium-chloridbuffer.
Den således rensede LPF-holdige fraktione kan dernæst dialysers igen, filtreres og derefter udsættes for en detoxificeringsbehandling.
10 Rensning af den FHA-holdige fraktion kan opnås ved eluering af fraktionen fra hydroxyapatitadsorben-ten ved envendelse af puffere med stigende ionstyrke efterfulgt af sædvanlige proteinrensningstrin, herunder f.eks. udfældning ved høje saltkoncentrationer og chro-15 matografi. Endelig kan de rensede FHA-holdige fraktioner udsættes for membranfiltrering og derefter et detoxifi-ceringstrin.
Til isolation af fimbrielle agglutinogener, f.eks. agglutinogenerne 2 og 3 (Ag2+3), fra cellefrak-20 tionen bliver cellerne fortrinsvis vasket og dernæst homogeniseret i en passende buffer. Efter centrifugering kan supernatanten dernæst renses ved sædvanlige proteinrensningsmetoder til isolation af en fraktion indeholdende fimbrielle agglutinogener. En fraktion, der inde-25 holder fimbrielle agglutinogener kan således f.eks. udfældes ved stigende ionstyrke af opløsningen efterfulgt af en eller flere ekstraktioner med buffer, genudfældninger og dialyse. Endelig kan den rensede fraktion indeholdende fimbrielt agglutinogen membranfiltreres og 30 dernæst detoxificeres.
Om ønsket kan lipopolysaccharidindholdet af fraktionen af det fimbrielle agglutinogen reduceres ved affinitetschromatografi, f.eks. på en polymyxin-sepharose 4B kolonne.
6 DK 172936 B1
Detoxificesringstrinnerne udføres fortrinsvis ved behandling af de LPF-, FHA- og fimbrielle agglutinogen-holdige fraktioner enkeltvis eller sammen med et sædvanligt toxoideringsmiddel, som f.eks. formaldehyd.
5 Til fremstilling af vaccinepræparater ud fra de LPF-, FHA- og fimbrielle agglutinogenfraktioner, kan disse fraktioner kombineres i terapeutisk effektive mængder og formuleres til dosisenheder, der f.eks. indeholder mindst 1-5, fortrinsvis mindst 2 yg af hver kom-10 ponent per enhedsdosis.
Sædvanlige vækstmedier kan anvendes til fremstil-= ling af den flydende Bordetella pertussis-kultur, der anvendes som udgangsmateriale ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Til fremstilling af kommercielt rentable 15 udbytter af FHA har det vist sig at være ønskeligt at anvende Stainer and Scholte's medium, indeholdende J 2-6 mg/ml dimethyl-B-cyclodextrin (MeCD), især 1 ryste- - kulturer eller omrørte fermentorer. Dyrkning af den sam lede kultur kan hensigtsmæssigt udføres i 1 liters 20 Thompson-flasker, indeholdende 300 ml medium, eller i 10 liters fermentorer. En egnet stamme af Bordetella pertussis er Wellcome 28-stammen, der er af 1.2.3-sero-typen. Ander stammer af 1.2.3-serotypen, der giver tilstrækkelige antigenudbytter kan anvendes. Fremstillingen 25 af lymphocytosefremkaldende faktor -(LPF), filamentøst hæmagglutinin (FHA) og agglutinogenerne 2 og 3 (Ag2+3) vil i det følgende blive belyst nærmere ved hjælp af s» et eksempel.
30 Eksempel
En kultur af Bordetella pertussis fremstilledes som følger:
En frysetørret ampul med B. pertussis, stamme Wellcome 28, åbnedes, indholdet dispergeredes i sterilt 7 DK 172936 B1 vand og afpipetteredes over på en trækuls-agarplade indeholdende 10% defibrineret hesteblod. Efter inkubation ved 35°C i 48 timer dyrkedes organismerne videre på flere trækuls-agarplader, som inkuberedes ved 35eC i 48 5 timer.
Organismerne skrabedes dernæst ned i adskillige 250 ml's koniske kolber indeholdende 100 ml Stainer and Scholte's medium tilsat 1% casaminosyrer og 1 mg MeCD/ml. Kolberne blev rystet orbitalt (180 omdr./min) i 10 24 timer ved 35°C, hvorefter 5-10 ml overførtes til hver af 60 Thompson-flasker, indeholdende 300 ml medium.
Flaskerne blev rystet på en skånsom frem og tilbagegående ryster ved 35°C i 48 timer inden flaskernes Indhold hældtes sammen og inden høst.
15 Den resulterende flydende kultur af Bordetella pertussis centrifugeredes i en Sorvall RC3B centrifuge i en time ved 5000 omdr./min.. Supernatanten dekanteredes fra, og cellerne blev opbevaret ved 4eC til fældning af agglutinogenerne 2 og 3 (Ag2+3>.
20 Supernatanten koncentreredes ved anvendelse af et
Millipore Pellicon apparat forsynet med et filter med en molekylvægt-cut-off-værdi på 10.000. 18 liter superna tant koncentreredes til en volumen på ca. 4 liter. Koncentratet sterilfiltreredes dernæst gennem et Gelman 25 o,2 ym polysulfon-minikapselfilter.
1. Oprensning af filamentøst hæmagglutinin (FHA).
Oprensning af det filamentøse hæmagglutinin (FHA) fra kultursupernatanten opnåedes ved de følgende 30 trin efter hinanden; hydroxyapatitchromatografi, ammoniumsulfatfældning og Sepharose CL-6B-chromatografi.
8 DK 172936 B1 A. Hydroxyapatitchromatografi .
400 g sfærisk hydroxyapatit (BDH Chemical Ltd) suspenderedes i 500 ml 0,1M NaOH. Man lod pulveret bundfælde i ca. 20 min. ved stuetemperatur og den oversky-5 dende væske dekanteredes fra. Vaskningen med natriumhydroxid blev gentaget to gange og efterfulgt af gentagen vaskning med destilleret vand indtil eluatets pH-værdi var ca. 8,0.
Det vaskede pulver suspenderedes i 500 ml 0,01M 10 phosphatbuffer, og efter 20 min. dekanteredes bufferen fra. Vaskningen med phosphatbufferen blev gentaget tre gange.
Det vaskede hydroxyapatit pakkedes i en chromato-grafisk kolonne, ækvilibreret med 0,01M phosphatbuffer 15 ved pH 8,0.
Kolonnen blev dernæst forbundet til et reservoir - indeholdende den koncentrerede supernatant, som pumpedes gennem kolonnen med en strømningshastighed på ca. 500 ml/time ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Eluatet gem-20 tes til isolation af LPF (se nedenfor).
Den tilbageholdte FHA-fraktion elueredes fra kolonnen ved succesiv vaskning med (i) 0,01M phosphat- ϋϋ buffer med pH 8, (ii) 0,1M phosphatbuffer med pH B og (iii) 0,1M phosphat-0,5M natriumchloridbuffer med pH 25 ¢,5. Under den sidste vaskning opsamledes 17 8 ml's fraktioner, og den optiske tæthed ved 2 80 mm for hver fraktion registreredes. Desuden testedes hæmagglutina-tiorisaktiviteten af forskellige fraktioner ved anvendelse af frisk vaskede gedeerythrocyter. Fraktioner med en I 30 hæmagglutinationstiter (log 2) større end eller lig 7 hældtes sammen. En afbildning af elueringen er vist i fig. 1.
' “C
9 DK 172936 B1 B. Ammonliumsulfatfældning.
FHA blev fældet fra de sammenhældte fraktioner ved tilsætning af ammoniumsulfat til opnåelse af en 30% mættet opløsning og dernæst centrifugering. Supernatan-5 ten dekanteredes fra og kasseredes, og bundfaldet opløstes i 0,05M phosphat-0,5M natriumchloridbuffer ved pH
7,2 og dialyseredes mod den samme buffer. Den dialyserede suspension centrifugeredes, og supernatanten bevaredes til efterfølgende oprensning.
10 C. Sepharose CL-6B-chromatografi.
Supernatanten chromatograferedes dernæst på Sepharose CL-6B-gel, som i forvejen var ækvilibrert med o,05M phosphat-0,5M natriumchloridbuffer med pH 7,2.
15 FHA'et blev dernæst elueret fra kolonnen ved an vendelse af 0,05M phosphat-0,5M natriumchloridbuffer med pH 7,2, og 80 5 ml's fraktioner opsamledes. Eluatfrak-tionerne måltes for proteinindhold og hæmagglutinations-aktivitet på samme måde som beskrevet ovenfor, og frak-20 tioner med en hæmagglutinationstiter større end eller lig med 7 hældtes sammen. En afbildning af elueringen er vist i fig. 2.
2. Oprensning af LPF.
25 Eluatet fra hydroxyapatitchromatograferings- 35 trinnet behandledes dernæst til udvinding af LPF.
A. Ammoniumsulfatfældning.
Ved et indledende trin blev urent LPF fældet ved 30 tilsætning af ammoniumsulfat til opnåelse af en 74% mættet opløsning. Den resulterende suspension centrifugeredes, og supernatanten kasseredes. Bundfaldet resuspende-redes i 0,05M phosphat-0,05M natriumchloridbuf fer ved pH
7,2. Suspensionen centrifugeredes dernæst ved 15.000 35 omdr./min. og supernatanten opsamledes. Produktet ek-straheredes yderligere 4 gange ved anvendelse af samme buffer, og de resulterende supernatanter haldtes sammen.
10 DK 172936 B1 B. Fetuin-sepharosechromatografi.
De sanunenhældte supernatanter dialyseredes dernæst med 0,05M phosphat-0,05M natriumchloridbuffer med , pH 7,2 og chromatograferedes dernæst på en fetuin- 5 sepharosegel, som var forækviljbreret i 0,05M phosphat-0,05M natriumchloridbuffer med pH 7,2. Kolonne vaskedes dernæst med den samme buffer, og eluatet kasseredes.
En renset LPF-holdig fraktion elueredes dernæst fra kolonnen ved anvendelse af 7,6mM tris-0,013M
10 natriumchlorid/3M magnesiumchloridbuffer med pH 6,4, og 30 50-dråbers fraktioner opsamledes.
Fraktioner med en hæmagglutinatiostiter større end eller lig 7 opsamledes og dialyseredes mod 2 liter 0,05M tris HCL, 1M NaCl-buffer med pH 8,0. De LPF-15 holdige fraktioner blev dernæst dialyseret igen ved anvendelse af 0,05M phosphat-0,5M natriumchloridbuffer a med pH 7,2, og den resulterende rensede LPF-holdige fraktion opsamledes.
20 3, Fremstilling af agglutinogenerne 2 of 3 (Ag2+3)·
Den centrifugerede cellefraktion vaskedes ved η anvendelse af sterielt, pyrogenfrit, destilleret vand, I centrifugeredes og homogeniseredes dernæst ved an- _ vendelse af 0,014M phosphat-0,14M natriumchloridbuffer 25 med pH 7,2. Den homogeniserede bakteriesuspension cen trifugeredes dernæst ved 9000 omdr./min. til fjernelse ^ af .bakterieceller, og supernatanten, der indeholdt Bor- ^etella pertussis fimbrae opsamledes. Ammoniumsulfat sattes til supernatanten til opnåelse af en slut-30 koncentration på 30%'s mætning, og suspensionen op- bevaredes ved 4°C natten over til fældning af fimbrielle proteiner. Efter centrifugering ved 9000 omdr./min. kas-seredes supernatanten, og pillen ekstraheredes ved anvendelse af forkølet phosphatbuffer. Suspensionen cen-35 trifugeredes ved 15.000 omdr./min., og supernatanten I« sam 1i DK 172936 B1 opsamledes. Ekstraktionen blev gentaget 4 gange, og de resulterende supernatanter blev hældt sammen.
Ammoniumsulfat sattes til de sammenhældte supernatanter til opnåelse af en slutkoncentration på 15% 5 mætning, og den resulterende suspension opbevaredes natten over ved 4°C til fældning af fimbrielle proteiner.
Suspensionen centrifugeredes ved 15.000 omdr./min., og supernatanten kastedes bort.
Pillen ekstraheredes med phosphatbuffer og cen-10 trifugeredes ved 15.000 omdr./min.. Supernatanten opsamledes, ekstraktionen blev gentaget 4 gange og de resulterende supernatanter blev hældt sammen.
Ammoniumsulfat sattes til de sammenhældte supernatanter til opnåelse af en slutkoncentration på 15% 15 mætning, og den resulterende suspension opbevaredes natten over ved 4eC til fældning af fimbrielle proteiner. Suspensionen centrifugeredes ved 15.000 omdr./min. og supernatanten kastedes bort. (Yderligere ammonium-sulfatfældninger kan om nødvendigt anvendes).
20
Pillen ekstraheredes med phosphatbuffer og centrifugeredes ved 15.000 omdr./min.. Supernatanten opsamledes, og ekstraktionen blev gentaget 4 gange, og de resulterende supernatanter blev hældt sammen.
De sammenhældte supernatanter dialyseredes mod 2 5 phosphatbuffer og membranfiltreredes.
4.-Detoxificering.
Alle antigener filtreredes gennem en Millex GV 30 0,22 μιη filterenhed. LPF-præparatet fortyndedes til en slutproteinkoncentration på 200 pg/ml ved anvendelse af 0,05M phosphat-0,5M natriumchloridbuffer med pH 7,2.
En 40%'s formaldehydopløsning tilsattes til opnåelse af en slutkoncentration af formaldehyd på 0,5%. Den LPF-35 holdige fraktion inkuberedes dernæst ved 37°C i 14 dage, idet indholdet blev vendt mindst en gang hver anden dag til dispergering af eventuelt dannet bundfald.
T
12 DK 172936 B1
Den resulterende detoxificerede LPF-fraktion dialyseredes dernæst mod PBS-buffer indeholdende 0,01% formaldehyd og 0,01% thiomersal og dekanteredes over i en beholder til opbevaring, idet man sikrede sig, at alt 5 fældet materiale var overført.
En lignende detoxificeringsmetode anvendtes til FHA-fraktionen og agglutinogen 2 og 3 (Ag2+3)- frektionen, bortset fra at inkubationen ved 37°C varede i 7 dage.
10 De detoxifiserede antigener i PBS, Indeholdende 0,01% formaldehyd og 0,01% thiomersal, blandedes i lige store mængder og fortyndedes med sterilt vand, 4 x koncenteret PBS, indeholdende 0,04% formaldehyd og 0,04% thiomersal, og alhydogel. Den resulterende vaccine, i 15 isotonisk PBS, indeholder 120 pg protein/ml, 25% alhy- drogel, 0,01% formaldehyd og 0,01% thiomersal. Som et alternativt adjuvans til alhydrogel, kan aluminiumphos-phat (tilsat som aluminiumchlorid) anvendes. Vaccinen kan fortyndes yderligere med PBS, diptheria- og tetanus-20 toxoider og alhydrogel til opnåelse af en koncentration af pertussis antigener på 60 pg/ml.
De følgende udbytter af FHA, LPF og agglutinoge-1 nerne 2 og 3 (AG2+3) opnåedes fra 18 liter kultur: FHA - 190 mg 25 LPF - 50 mg agglutinogenerne 2 og 3 (Ag2+3) - 50 mg.
Claims (9)
1. Fremgangsmåde til samtidig fremstilling af lymphocytose-fremkaldende faktor (LPF), filamentøst hæ-magglutinin (FHA) og mindst et fimbrielt agglutinogen ud fra en flydende kultur af Bordetella pertussis, k e n -5 detegnet ved, at man (a) skiller kulturen i celle- og supernatant-fraktioner, (b) koncentrerer supernatantfraktionen til mindre end 50% 10 (c) fraktionerer den koncentrerede supernatant- fraktion til isolation af LPF- og FHA-holdige fraktioner, og (d) isolerer mindst et fimbrielt agglutinogen fra cellefraktionen.
2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendeteg net ved, at de fimbrielle agglutinogener isoleret i trin (d) omfatter mindst et af agglutinogenerne 2, 3, 4, 5 og 6.
3. Fremgangsmåde ifølge krav i, kendeteg- 20 net ved, at de fimbrielle agglutinogener isoleret i trin (d) omfatter i det mindste agglutinogenerne 2 og 3 (Ag2+3)·
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at de isolerede agglutinogener desuden inde- 25 holder et eller flere af agglutinogenerne 4, 5 og 6.
5. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at separationstrinnet (a) udføres ved en pH-værdi, der er større end 7,0.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendeteg net ved, at separationstrinnet (a) udføres ved en pH-værdi i området fra 7,5-9,0. 14 DK 172936 B1 j
‘ 7. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de fore gående krav, .kendete g'net ved, at super-natanten i trin (b) koncentreres til mindre end 50%, I fortrinsvis mindre end 25% af dens oprindelige volumen. ! 5
8. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de fore- : gående krav, kendetegnet ved, at den LPF- holdige fraktion i trin (c) renses ved adsorption på fetuin-sepharose efterfulgt af eluering ved anvendelse : af magnesiumchloridbuffer. - 10
9. Fremgangsmåde til fremstilling af et vaccine- _ præparat indeholdende lymphocytosefremkaldende faktor (LPF), filamentøst hæmagglutinin (FHA) og mindst et fimbrielt agglutinogen, kendetegnet ved, at den omfatter at man blander (i) LPF, (ii) FHA og (i il) 15 mindst et fimbrielt agglutinogen, fremstillet ifølge et vilkårligt af kravene 1-8, og at LPF'et, FHA'et og det/de fimbrielle agglutinogener detoxificeres inden eller efter blandingen. ϋϋ Ί
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB868601279A GB8601279D0 (en) | 1986-01-20 | 1986-01-20 | Purification of pertussis antigens |
| GB8601279 | 1986-01-20 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK27287D0 DK27287D0 (da) | 1987-01-19 |
| DK27287A DK27287A (da) | 1987-07-21 |
| DK172936B1 true DK172936B1 (da) | 1999-10-11 |
Family
ID=10591636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198700272A DK172936B1 (da) | 1986-01-20 | 1987-01-19 | Fremgangsmåde til samtidig fremstilling af lymphocytosefremkaldende faktor (LPF), filamentøst hæmagglutinin (FHA) og mindst |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4784589A (da) |
| EP (1) | EP0231083B1 (da) |
| JP (1) | JP2538224B2 (da) |
| KR (1) | KR950010323B1 (da) |
| CN (1) | CN1028206C (da) |
| AT (1) | ATE92335T1 (da) |
| AU (1) | AU592727B2 (da) |
| CA (1) | CA1280693C (da) |
| DE (1) | DE3786806T2 (da) |
| DK (1) | DK172936B1 (da) |
| GB (1) | GB8601279D0 (da) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1337859C (en) * | 1987-04-24 | 1996-01-02 | Masashi Chazono | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
| GB8807860D0 (en) * | 1988-04-05 | 1988-05-05 | Connaught Lab | Pertussis vaccine |
| CA1341123C (en) * | 1988-10-27 | 2000-10-17 | David A. Relman | Filamentous hemagglutinin of b. pertussis |
| JP2706792B2 (ja) * | 1988-11-29 | 1998-01-28 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 百日咳毒素のトキソイド化法 |
| GB8910570D0 (en) * | 1989-05-08 | 1989-06-21 | Wellcome Found | Acellular vaccine |
| US5391715A (en) * | 1989-11-06 | 1995-02-21 | Smithkline Beecham Biologicals | Method for isolating and purifying bordetella pertussis antigenic factors |
| ATE134194T1 (de) | 1989-11-06 | 1996-02-15 | Smithkline Beecham Biolog | Verfahren |
| ATE129159T1 (de) * | 1990-02-12 | 1995-11-15 | Smithkline Beecham Biolog | Impfstoff. |
| EP0484621A3 (en) * | 1990-07-11 | 1992-08-26 | American Cyanamid Company | Efficacious vaccines against bordetella pertussis comprising a combination of individually purified pertussis antigens |
| US5445817A (en) * | 1992-08-21 | 1995-08-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Pertussis toxin used as a carrier protein with non-charged saccharides in conjugate vaccines |
| ATE183194T1 (de) * | 1994-04-28 | 1999-08-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Verfahren zur trennung von protektiven verbindungen aus bordetella pertussis |
| DK0824358T3 (da) * | 1995-05-04 | 2003-01-27 | Aventis Pasteur | Acellulære pertussisvacciner og fremgangsmåder til fremstilling deraf |
| US7091311B2 (en) * | 1996-06-07 | 2006-08-15 | Smithkline Beecham Corporation | Peptides and compounds that bind to a receptor |
| NZ566812A (en) | 2002-09-18 | 2009-07-31 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Methods of increasing platelet and hematopoietic stem cell production |
| ES2597832T3 (es) | 2013-03-08 | 2017-01-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vacuna acelular contra la tosferina |
| CN110358802B (zh) * | 2019-08-16 | 2021-06-18 | 长春百克生物科技股份公司 | 一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4247452A (en) * | 1978-03-01 | 1981-01-27 | The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Purification of pertussis haemagglutinins |
| JPS5750925A (en) * | 1980-09-12 | 1982-03-25 | Takeda Chem Ind Ltd | Preparation of pertussis toxoid |
| US4474758A (en) * | 1981-11-19 | 1984-10-02 | American Cyanamid Company | Haemophilus influenzae type b and pertussis outer membrane component combined vaccine |
| HU188847B (en) * | 1983-02-22 | 1986-05-28 | Human Oltoanyagtermeloe Es Kutato Intezet,Hu | Process for producing liophylized combined vaccines |
| CA1213234A (en) * | 1983-03-30 | 1986-10-28 | Akihiro Ginnaga | Method for the production of ha fraction containing protective antigens of bordetella pertussis and pertussis vaccine |
| US4551429A (en) * | 1983-09-15 | 1985-11-05 | American Home Products Corporation | Stimulation of antigen production by Bordetella pertussis |
| JPS6098988A (ja) * | 1983-11-01 | 1985-06-01 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Ｌｐｆ−ｈａの精製法 |
| AU571078B2 (en) * | 1984-04-14 | 1988-03-31 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Purification of filamentous hemagglutinin |
-
1986
- 1986-01-20 GB GB868601279A patent/GB8601279D0/en active Pending
-
1987
- 1987-01-16 AT AT87300387T patent/ATE92335T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-01-16 EP EP87300387A patent/EP0231083B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-16 DE DE87300387T patent/DE3786806T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-19 AU AU67664/87A patent/AU592727B2/en not_active Expired
- 1987-01-19 KR KR1019870000366A patent/KR950010323B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-01-19 DK DK198700272A patent/DK172936B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-01-19 CA CA000527592A patent/CA1280693C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-20 CN CN87100399A patent/CN1028206C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-20 JP JP62009178A patent/JP2538224B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-20 US US07/008,880 patent/US4784589A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2538224B2 (ja) | 1996-09-25 |
| DK27287A (da) | 1987-07-21 |
| CN1028206C (zh) | 1995-04-19 |
| DE3786806D1 (de) | 1993-09-09 |
| KR950010323B1 (ko) | 1995-09-14 |
| DK27287D0 (da) | 1987-01-19 |
| EP0231083A3 (en) | 1988-06-08 |
| ATE92335T1 (de) | 1993-08-15 |
| EP0231083A2 (en) | 1987-08-05 |
| KR870006902A (ko) | 1987-08-13 |
| JPS62234031A (ja) | 1987-10-14 |
| EP0231083B1 (en) | 1993-08-04 |
| AU592727B2 (en) | 1990-01-18 |
| CN87100399A (zh) | 1987-09-09 |
| CA1280693C (en) | 1991-02-26 |
| US4784589A (en) | 1988-11-15 |
| DE3786806T2 (de) | 1993-12-09 |
| AU6766487A (en) | 1987-07-23 |
| GB8601279D0 (en) | 1986-02-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK172936B1 (da) | Fremgangsmåde til samtidig fremstilling af lymphocytosefremkaldende faktor (LPF), filamentøst hæmagglutinin (FHA) og mindst | |
| DK165358C (da) | Renset Bordetella pertussis antigen, vaccine indeholdende et sådant antigen og fremgangsmåde til isolering af et sådant ant | |
| US5444159A (en) | Purification of a pertussis outer membrane protein | |
| JPH03191789A (ja) | 百日咳菌からの６９０００ダルトンの抗原性タンパク質の精製方法 | |
| KR940004541B1 (ko) | 트레포네마 히오디센테리아 박테린의 제조방법 | |
| US4220638A (en) | Antigenic complex from N. Gonorrhoeae | |
| JPH0834742B2 (ja) | 百日せき内毒素の除去法，百日せきトキソイドおよびその製造法 | |
| CN103242434B (zh) | 无细胞百日咳疫苗的制备方法 | |
| CN104311647A (zh) | 一种分离纯化百日咳毒素和丝状血凝素的方法 | |
| US4288557A (en) | Antigenic complex from N. gonorrhoeae | |
| US6106842A (en) | Extraction of cell-bound protein from bordetella | |
| RU2041716C1 (ru) | Способ получения миелопида | |
| EP0002645B1 (en) | Antigenic complex from neisseria gonorrhoeae, process and vaccine | |
| US6444211B2 (en) | Purification of a pertussis outer membrane protein | |
| CA2224052C (en) | Pertussis outer membrane protein | |
| US20010051163A1 (en) | Purification of a pertussis outer membrane protein | |
| NO171147B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine mot hepatittb | |
| JPS60218326A (ja) | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |