CN103242434B - 无细胞百日咳疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备无细胞百日咳疫苗的方法,所述方法包括将百日咳杆菌培养上清液进行超滤浓缩处理,从而得到浓缩液;将所述浓缩液进行阳离子交换柱层析,分离出百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA);任选地,将在步骤2)中得到的流穿液进行多结合性阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素(Prn),或者将百日咳杆菌菌体溶解、浓缩,并进行硫酸铵沉淀和多结合性阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素(Prn);将PT单独制成无细胞百日咳疫苗,或者将PT同FHA和/或Prn混合在一起制成无细胞百日咳疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及百日咳疫苗的制备方法以及百日咳疫苗。更具体而言,本发明涉及百日咳有效抗原成分的分离纯化、无细胞百日咳疫苗的制备方法和无细胞百日咳疫苗。
背景技术
百日咳疫苗是预防该病最有效、最经济的手段,其包括全细胞百日咳疫苗(wholecell pertussis vaccine,WPV)和无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine,APV)。
全细胞百日咳疫苗于1914年首次研制成功,其是通过将细菌大量培养增菌后采用适宜的方法杀菌,使其灭活成无传染性但具有良好免疫原性的百日咳全菌体,再加入佐剂制备而成。在控制和降低儿童百日咳发病方面,全细胞百日咳疫苗发挥了巨大作用,其优点在于价格低,有效性已经确认,只要达到一定的接种覆盖面,就可有效预防百日咳的流行。但该制品存在一些缺点:副反应较大,安全性还存在一定问题。
在这种情况下,日本于80年代率先研制并使用了以百日咳毒素(pertussistoxin,PT)和丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)为主要有效成分的无细胞百日咳疫苗。无细胞百日咳疫苗被认为是近二十年来疫苗学领域十大进展之一。
无细胞百日咳疫苗的主要成分有PT、FHA、粘附素(pertacin,Prn)、凝集原(agglutigogen,AGG)等。
PT:是百日咳杆菌致病的主要毒力因子,同时也是其所产生的诸多生物活性物质中唯一不受争议的保护性抗原。在鲍特氏菌属中,百日咳杆菌是唯一能产生PT的细菌。PT是由S1、S2、S3、S4和S5等5个亚单位以1∶1∶1∶2∶1的比例组成,相对分子质量为117×103,为一个典型的“A-B核糖基转移酶”模式的细菌毒素。A部分由毒性亚基构成,主要具有识别生物学活性的功能,PT的大部分酶活性是S1的作用,例如促淋巴细胞增多、激活胰岛素细胞、簇集CHO细胞生长和组胺致敏等,而B部分由S2、S3、S4(2个)和S5组成,参与与真核细胞表面受体结合及毒性亚基的跨膜运输。
FHA:是由鲍特氏菌属百日咳杆菌产生的一种具有粘附作用的表面蛋白质分子,因对红细胞有凝集作用而得名。FHA相对分子量为220×103。FHA与百日咳杆菌粘附和定居在呼吸道器官的上皮细胞有关,也是百日咳杆菌致病的重要毒力因子,同时还具有较强免疫原性,能刺激机体免疫系统产生特异的保护性抗体。
Prn:是一种非纤毛性的凝集原,存在于百日咳杆菌表面,它在百日咳杆菌侵袭宿主呼吸系统上皮细胞的感染粘附过程发挥着重要的作用,也具有较强的免疫原性。
AGG:百日咳杆菌有8种AGG,其中6种是百日咳杆菌所特有的。百日咳杆菌以AGG1、2、3为主,其他几种AGG为辅。研究证实AGG2和3在细菌感染过程中对宿主支气管细胞有粘附作用,所以,AGG也是百日咳杆菌的致病因子之一。一些国家的临床试验报道,百日咳菌体疫苗中的效价与小鼠的免疫应答和疫苗对儿童的免疫保护性之间有着良好的相关性。因此,WHO推荐在百日咳疫苗生产中应选用含有2、3型AGG的菌株,目前世界上一些国家生产的无细胞百日咳疫苗中含有AGG2或3,或者两者均有。
无细胞百日咳疫苗是通过纯化工艺,提取细菌中具有免疫原性的抗原成分,去除无免疫原性并且引起不良反应的毒性物质制备而成的。
目前抗原提取的方法有两种。第一种方法是日本首先研制成功的共纯化方法,同时收集PT和FHA等有效成分。该方法通过硫酸铵反复沉淀来获得保护性抗原,然后通过蔗糖密度梯度离心去除杂质,之后制成疫苗。这种方法生产无细胞百日咳疫苗的产率较高,成本较低,但是抗原之间的比例不稳定。
第二种方法是分别纯化的方法。该方法通过各种理化方法如柱层析先分别纯化各抗原组分,再将这些抗原组分按一定的比例混合制成疫苗。现有的百日咳有效抗原成分的分离纯化方法采用羟基磷灰石-结合珠蛋白柱层析和凝胶过滤法、蓝胶亲和层析和胎球蛋白亲和层析法、蓝胶亲和层析和羟基磷灰石层析法。
亲和层析法所采用的亲和配基来源于人的珠蛋白或牛的胎球蛋白,因此不能保证配基来源的生物安全性。同时在纯化过程中配基容易脱落从而污染成品,限制了该方法的应用。羟基磷灰石层析法一般和疏水层析、珍珠岩层析等层析介质结合在一起分离PT和FHA。该方法的洗脱条件复杂,收率低。另外,羟基磷灰石材料作为填料使得液相流动的阻力较大,导致吸附、洗脱时流速较低,处理通量较小(王爱娟等,羟基磷灰石在生物活性物质分离与提纯领域中应用的研究进展,材料导报,2006年6月,20(6):111-118)。而且,片状或球状烧结的羟基磷灰石填料对较大直径层析柱的填装效果不佳,柱效重现性差,不利于工艺放大;柱内发生菌体蛋白或毒素蛋白的吸附或沉淀后,填料容易板结不易再生(陈浩军等,无细胞百日咳疫苗抗原精致的新技术,中国生物制品学杂志,2010年9月,23:1032)。羟基磷灰石填料的这些性质严重阻碍了其在大规模生产中的应用。
再者,虽然这些方法可以相对容易地对各抗原成分的比例等进行质量控制,但是纯度与收率之间有冲突,尤其是在PT纯度达到90%以上时,产率很难超过70%。
发明内容
基于上述技术问题,本发明的一个目的是提供一种从百日咳杆菌培养上清液分离纯化百日咳有效抗原成分的方法,所述方法包括以下步骤:
1)将百日咳杆菌培养上清液进行超滤浓缩处理,从而得到浓缩液;
2)将所述浓缩液进行阳离子交换柱层析,分离出百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA);
3)任选地,将在步骤2)中得到的流穿液进行多结合性阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素(Prn),或者将百日咳杆菌菌体溶解、浓缩,并进行硫酸铵沉淀和多结合性阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素(Prn)。
本发明的又另一个目的是提供一种制备无细胞百日咳疫苗的方法,所述方法包括:
1)将百日咳杆菌培养上清液进行超滤浓缩处理,从而得到浓缩液;
2)将所述浓缩液进行阳离子交换柱层析,分离出百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA);
3)任选地,将在步骤2)中得到的流穿液进行多结合性阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素(Prn),或者将百日咳杆菌菌体溶解、浓缩,并进行硫酸铵沉淀和多结合性阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素(Prn);
4)将PT单独制成无细胞百日咳疫苗,或者将PT同FHA和/或Prn混合在一起制成无细胞百日咳疫苗。
本发明的再又一个目的是提供一种通过上述制备无细胞百日咳疫苗的方法获得的无细胞百日咳疫苗。
本发明中PT和FHA分离纯化采用的是阳离子层析柱,通过样品蛋白与填料介质带相反电荷,将蛋白质结合到柱子上,然后改变条件,使结合物逐步被洗脱。因此,可以通过一次上样,改变洗脱条件,分别收获PT和FHA。该层析柱以高流速的琼脂糖为骨架,具有更高的流速和更高的载量,大大提高生产效率。且CM柱的非特异性吸附较低,收获蛋白纯度更高。该方法稳定性好,介质化学性质稳定,可以通过增加柱径直接进行线性放大,易于进行大规模放大生产。此外,CM柱可使用氢氧化钠在位清洗与除菌,符合GMP要求。
本发明中Prn的纯化采用的是多结合性阴离子交换层析,优选采用的是以Capto-adhere为介质的多结合性阴离子交换层析。将分离PT和FHA后的流穿液通过Capto-adhere树脂,Prn及一些杂蛋白结合在Capto-adhere上,通过洗脱,收获目的蛋白Prn。Capto-adhere主要是起离子交换作用,但其他形式的作用如氢键和疏水作用也参与层析过程。因此,Capto-adhere介质的基质为高流速琼脂糖,因此较常规使用的羟基磷灰石介质具有高流速、高载量的特点,可以处理粘度较高的样品,获得蛋白的纯度也较高。使用该层析工艺纯化Prn,工艺简单,处理步骤较少,可以不对样品进行硫酸铵沉淀等处理,且该层析介质化学性质稳定,可以进行氢氧化钠在位清洗,适合产品生产需要。
附图说明
图1.细菌生长(*108细胞/ml)和时间(小时)图。
图2.CM柱层析分离纯化PT和FHA的紫外监测图。
图3.CM柱层析分离PT和FHA的SDS-PAGE(15%)电泳图。
图4.S-200分离FHA的SDS-PAGE(15%)电泳图。
图5.Capto-adhere层析柱分离纯化Prn的紫外监测图。
图6.Capto-adhere层析柱分离纯化Prn的Western-blot鉴别图。
图7.Capto-adhere层析柱分离纯化Prn的SDS-PAGE(15%)电泳图。
具体实施方式
根据本发明的第一方面,提供了一种从百日咳杆菌培养上清液分离纯化百日咳有效抗原成分的方法,所述方法包括以下步骤:
1)将百日咳杆菌培养上清液进行超滤浓缩处理,从而得到浓缩液;
2)将所述浓缩液进行阳离子交换柱层析,分离出百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA);
3)任选地,将在步骤2)中得到的流穿液进行多结合性阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素(Prn),或者将百日咳杆菌菌体溶解、浓缩,并进行硫酸铵沉淀和多结合性阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素(Prn)。
根据本发明的第二方面,提供了一种制备无细胞百日咳疫苗的方法,所述方法包括:
1)将百日咳杆菌培养上清液进行超滤浓缩处理,从而得到浓缩液;
2)将所述浓缩液进行阳离子交换柱层析,分离出百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA);
3)任选地,将在步骤2)中得到的流穿液进行多结合性阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素(Prn),或者将百日咳杆菌菌体溶解、浓缩,并进行硫酸铵沉淀和多结合性阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素(Prn);
4)将PT单独制成无细胞百日咳疫苗,或者将PT同FHA和/或Prn混合在一起制成无细胞百日咳疫苗。
任何可以产生PT抗原和FHA抗原的百日咳杆菌均可使用。在一个具体的实施方案中,使用了百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)CSI相菌株。
百日咳杆菌的培养可以使用液体综合培养基,例如SS综合培养基。在一个具体的实施方案中,使用的是改良的SS液体培养基,即加入有0.25%酸水解酪蛋白氨基酸和0.1%β-环糊精的SS液体培养基。
在一个优选的实施方案中,所述百日咳杆菌培养上清液事先进行过离心处理。
在上述方法中,对百日咳杆菌培养上清液进行了超滤浓缩处理。用超滤处理替代共纯化方法中的硫酸铵沉淀,可以大大缩短工艺周期:两次硫酸铵沉淀需要约28-40天,而超滤仅需要几天即可。由此,也就不需要硫酸铵盐析沉淀蛋白,从而可节约大量硫酸铵:100L发酵液约需要35Kg硫酸铵。
在一个优选的实施方案中,所述超滤浓缩处理为切向流超滤处理。本文所提及的“切向流超滤处理”是指液体流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式。在一个优选的实施方案中,可以使用截留分子量为10KD/30KD的中空纤维柱进行超滤。在一个具体的实施方案中,所述超滤浓缩处理采用的是例如GE公司的Quixstand中空纤维膜分离系统。通过采用切向流超滤,液体流动在过滤介质表面产生剪切力,减少了滤饼层或凝胶层的堆积,保证了稳定的过滤速度。
在一个优选的实施方案中,通过超滤浓缩处理,将百日咳杆菌培养上清液的体积缩减至初始体积的1%至10%。优选地,该体积缩减至初始体积的4%-7%。
通过阳离子交换层析法,可从经过上述超滤浓缩处理得到的浓缩液中纯化出PT和FHA。在一个优选的实施方案中,所述阳离子交换柱层析为CM-Sepharose柱层析。采用阳离子交换层析柱有以下优点:(1)可以通过一次上样,改变洗脱条件,分别收获PT和FHA;(2)生产效率大大提高;(3)收获的蛋白纯度更高;(4)该方法稳定性好,介质化学性质稳定,可以通过增加柱径直接进行线性放大,易于进行大规模放大生产;和(5)CM柱可使用氢氧化钠在位清洗与除菌,符合GMP要求。
在优选的实施方案中,所述PT的洗脱是在PH 7.4-7.6的条件下进行的,优选地,所述PT的洗脱是用pH为7.4-7.6的0.5-2M尿素+20-50mM Tris-HCl缓冲液进行的;所述FHA的洗脱是在0.2M-0.6M NaCl的条件下进行的,优选地,所述FHA的洗脱是用pH为7.0-8.0的0.2-0.6M氯化钠+20-50mM磷酸盐缓冲液进行的。
在一个优选的实施方案中,可以将在步骤2)中得到的FHA抗原进一步纯化,例如通过Sephacryl S-200High Resolution柱层析进行进一步纯化。
任选地,所述方法包括将在步骤2)中得到的流穿液进行多结合性阴离子交换层析,或者百日咳杆菌菌体溶解、浓缩,并进行硫酸铵沉淀和多结合性阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素(Prn)。
优选地,可以将在步骤2)中得到的流穿液事先进行硫酸铵沉淀处理,然后再进行多结合性阴离子交换层析。优选地,百日咳杆菌菌体使用尿素溶解。
优选地,所述多结合性阴离子交换层析所用的层析介质为Capto-adhere。优选地,在所述多结合性阴离子交换层析中,Prn是用以下溶液连续洗脱获得的:i)5-10mM磷酸盐缓冲液(pH 6.6-7.5)、ii)0.5-1M NaCl磷酸盐缓冲液(pH 6.6-7.5);和iii)5-10mM醋酸钾缓冲液(pH 4.0-5.0)。
在制备无细胞百日咳疫苗的方法的一个优选实施方案中,对所得PT抗原脱毒。脱毒可以用例如戊二醛或者甲醛进行。优选地,所述脱毒包括:使所述50-200μg/ml PT与0.5%-1.5%戊二醛室温作用4-8小时,随后加入L-赖氨酸使其终浓度为0.01-0.02M,再在室温下作用2-4小时,终止反应。优选地,在脱毒过程中可加入保护剂,例如赖氨酸、甘氨酸或天冬氨酸等等。优选地,在脱毒过程中还可加入分散剂,例如吐温20或吐温80。传统的脱毒处理通常需要3至5天的时间。相对而言,采用本发明的脱毒方法,整个脱毒处理仅需1天即可。
所制得的无细胞百日咳疫苗可以仅包含抗原成分PT,但是也可包含其他成分,例如FHA、Prn、防腐剂和/或佐剂。在优选的实施方案中,所述无细胞百日咳疫苗包含抗原成分PT、FHA和Prn。优选地,在步骤4中,相对于3重量份PT,FHA为0-3重量份,Prn为0-3重量份。更优选地,所述抗原PT、FHA和Prn的混合比例为3∶3∶1至3∶3∶3,更优选为3∶3∶1。
优选地,所述防腐剂为硫柳汞或苯氧乙醇。更优选地,所述防腐剂为硫柳汞。
优选地,所述佐剂为氢氧化铝或磷酸铝。更优选地,所述佐剂为氢氧化铝。
在本发明的第三方面,提供了一种通过本发明第二方面的方法获得的无细胞百日咳疫苗。
实施例
下面参照附图,并结合实施例对本发明进行详细描述。应理解,在下文给出具体实施方式并非意欲以任何方式对本发明的范围作出任何限制。本发明的范围应该根据随附权利要求书作出解释。在不背离本发明的精神和主旨的情况下,可以对本发明作出任何修饰和改进。
实施例1.百日咳杆菌的发酵培养
试验材料:
菌种:百日咳博德特氏菌CS I相菌株
培养基:采用改良的SS液体培养基:即加入0.25%酸水解酪蛋白氨基酸和0.1%β-环糊精的SS液体培养基
补液:谷氨酸钠4g/L,酸水解酪蛋白氨基酸2g/L,pH7.6
主要设备:40L发酵罐(BIO-FLOW5000,NBS)、300L发酵罐(BIOF-6300B 300L,上海高机生物工程有限公司)
试验方法:
将百日咳CS株的冻干菌种于含有25%脱纤维的羊血鲍姜琼脂培养基上,37℃,培养72小时后,传至活性碳琼脂培养基上,37℃培养48小时;传3代(活性碳琼脂培养基),继续37℃培养48小时后,刮种于150ml磷酸盐缓冲液(即PBS缓冲液,137mM NaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、2mM KH2PO4;PH7.2)内,获得菌悬液,调整菌浓度在800-1200×108个细胞/ml。然后将150ml菌悬液接种于40L的发酵罐中,40L发酵罐的培养基装量为15L(121℃,30分高压灭菌),于34~37℃通气搅拌培养。培养过程中控制pH7.0~8.0、搅拌转速200~500rpm、通气量80~200L/min、溶解氧在50%以上。培养至12小时时开始取样,之后每隔2小时取样一次,监控菌浓度及培养物的纯度。当菌浓度达80~160×108个细胞/ml时,将该种子液转移至含有150L培养基的300L发酵罐培养,培养过程中控制温度34~37℃、pH 7.0~8.0、搅拌转速200~500rpm、通气量80~200L/min、溶解氧在50%以上,当发酵培养培养至20小时,开始补料(速度控制在2~8ml/min)。当发酵培养至40小时以上,菌浓度达300×108个细胞/ml以上、血凝活性(测定方法参照文献Sato H.Monoclonal antibody against pertussistoxin:Effect on toxin activity and pertussis infections.Infect Immun,1984,46(2):422)达到1∶128以上时,停罐收获。
试验结果:
随着培养时间的增加,菌浓度也逐渐上升,培养12小时菌浓度为40×108个细胞/ml;培养终止时(42小时),菌浓度为380×108个细胞/ml。培养开始时,上清中的血凝效价较低(1∶2),当菌浓度达到80×108个细胞/ml时,血凝效价开始上升,收获时血凝效价为1∶256,结果见图1。
实施例2.发酵液的超滤处理
试验材料及样品:
中空纤维滤柱:UFP-10/30-C-4MA-0.065m2,GE
切向流处理系统:Quixstand中空纤维膜分离系统,GE
样品:百日咳发酵收获菌液,经离心或其他方法分离菌体后的上清液,过0.22μm滤膜除杂,样品量为3000ml。
试验方法:
将3000ml菌体分离后的上清液加入磷酸盐缓冲液(pH8.0)及尿素使其终浓度分别为50mmol/l和1mol/l,作为超滤过程的保护剂。加入保护剂的上清液使用10KD/30KD截留分子量的中空纤维柱在4000/sec流速下进行超滤浓缩,保持浓缩过程进液端压力在15~20psi。当体积浓缩至约200ml时,用平衡液A(50mmol/l磷酸盐缓冲液、2mol/l尿素,pH 8.0)进行洗滤,至收获液电导率与平衡液A电导率基本一致(电导率仪DDS-307,上海天达仪器有限公司)。
试验结果:
超滤过程进液端压力保持在15~20psi,体积浓缩后,约使用3×的平衡液A将收获液的电导率洗滤至0.5S/cm。
实施例3.百日咳有效抗原的纯化(1)
试验材料及样品:
层析柱:XK26×20,GE
紫外检测仪:UVD-680-1,上海金达生化仪器有限公司
蠕动泵:BT-300J,保定兰格恒流泵有限公司
离子交换填料:CM-Sepharose,GE;Capto-adhere,GE
凝胶过滤填料:Sephacryl S-200High Resolution
样品:超滤浓缩处理后的收获液200ml
PT、FHA的纯化:
将60ml CM-Sepharose介质装入2.6×20CM层析柱内,用pH6.02M尿素、50mM磷酸盐缓冲液平衡3-5个柱体积。取超滤处理得到的上清液200ml,以300ml/h的流速把该液体通过层析柱,紫外监测蛋白质A280吸收值,同时收集流穿液,用以分离Prn。然后用pH6.0的2M尿素+50mM磷酸盐缓冲液、pH7.2的2M尿素+50mM磷酸盐缓冲液、pH 7.4的2M尿素+50mM Tris-HCl缓冲液和pH8.0的0.2M氯化钠+50mM磷酸盐缓冲液进行连续洗脱(每种洗脱液的体积是180ml),分别收集洗脱液。其中pH7.4的2M尿素+50mM的Tris-HCl缓冲液收集的洗脱峰为抗原PT(见图2-1,峰2),pH8.0的0.2M氯化钠+50mM磷酸盐缓冲液洗脱的为抗原FHA(见图2-1,峰1)。将收获的PT抗原用透析、超滤或脱盐层析柱将溶液体系置换为0.5M氯化钠、50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0),2-8℃保存。
收获的FHA抗原经过Sephacryl S-200High Resolution层析介质分离:将500mlSephacryl S-200High Resolution层析介质装于2.6×100CM层析柱内,用pH 8.0的0.5M氯化钠+50mM磷酸盐缓冲液平衡3~5个柱体积,将收获的FHA洗脱液上到S-200层析柱上,监测蛋白质A280的紫外吸收值。然后用平衡液进行洗脱,收集第一个从层析柱上流出的峰,即为FHA。
Prn的纯化:
在从CM层析柱收集得到的流穿液中加入硫酸铵,使其终浓度为350g/L。将所得混合物于2-8℃至少搅拌2小时或静置过夜,离心(12000g,30min),收集沉淀,弃掉上清。沉淀用pH6.6的2M尿素+50mM磷酸盐缓冲液溶解。在得到的上清液中再加入硫酸铵,使其终浓度为250g/L。将所得混合物于2-8℃搅拌至少2小时或静置过夜,离心(12000g,30min),收集沉淀。沉淀用pH6.6的2M尿素+50mM磷酸盐缓冲液溶解,再离心(12000g,30min),收集上清液,并调节pH至6.6。
取20ml Capto-adhere胶装入XK16×20层析柱内,然后用pH6.6的2M尿素+50mM磷酸盐缓冲液平衡3-5柱体积。将调节好pH的流穿液用蠕动泵以恒定流速把该液体加入到装好的Capto-adhere层析柱内,然后用以下溶液连续洗脱该层析柱:i)PH 6.6的10mM磷酸盐缓冲液;ii)pH6.6的1M NaCl磷酸盐缓冲液;和iii)pH4.0的10mM醋酸钾缓冲液。收集流穿液和每步的洗脱峰,取样做SDS-PAGE和western检测。Prn蛋白在醋酸钾缓冲液的洗脱峰内。将得到的Prn蛋白用脱盐柱、透析或10-30KD膜的方法将溶液置换到0.5M NaCl+50mM磷酸盐缓冲液内,最后用0.22μM微孔滤器过滤除菌,置于2-8℃保藏备用。
试验结果:
通过CM柱可以分离PT及FHA,紫外监测结果见图2-1。将获得的各峰值蛋白溶液用SDS-PAGE鉴定纯度(见图3-1),与标准Mark蛋白的电泳图谱对照比较可知,峰1为纯化分离的PT,峰2为FHA。FHA经S-200进一步分离后,纯度明显增加(电泳结果见图4-1)。最终分离纯化的PT和FHA蛋白纯度均在95%以上,Lowry测定收获PT的蛋白浓度为166.6μg/ml(产率在80%以上),FHA的蛋白浓度为438.8μg/ml(产率85%以上)。
通过Capto-adhere柱层析,可分离出外膜蛋白Prn,紫外吸收结果见图5-1,Western-blot鉴别结果见图6-1。SDS-PAGE鉴定纯度分离纯化的Prn蛋白纯度达90%以上(产率在85%以上),结果见图7-1。Lowry测定收获Prn的蛋白浓度为104μg/ml。
实施例4.百日咳有效抗原的纯化(2)
试验材料及样品:
层析柱:XK26×20,GE
紫外检测仪:UVD-680-1,上海金达生化仪器有限公司
蠕动泵:BT-300J,保定兰格恒流泵有限公司
离子交换填料:CM-Sepharose,GE;Capto-adhere,GE
凝胶过滤填料:Sephacryl S-200High Resolution
样品:超滤浓缩处理后的收获液200ml
PT、FHA的纯化
将60ml CM-Sepharose介质装入2.6×20CM层析柱内,用pH6.02M尿素、50mM磷酸盐缓冲液平衡3-5个柱体积。取超滤处理得到的上清液200ml,以300ml/h的流速把该液体通过层析柱,紫外监测蛋白质A280吸收值,同时收集流穿液,用以分离Prn。然后用pH6.0的2M尿素+50mM磷酸盐缓冲液,PH7.2的2M尿素+50mM磷酸盐缓冲液、PH7.6的0.5M尿素+20mM Tris-HCl缓冲液和0.6M氯化钠+pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液进行连续洗脱(每种洗脱液的体积是180ml),分别收集洗脱液。其中PH7.6的0.5M尿素+20mM Tris-HCl缓冲液收集的洗脱峰为抗原PT;0.6M氯化钠+pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液收集的是抗原FHA。将收获的PT抗原用透析、超滤或脱盐层析柱将溶液体系置换为0.5M氯化钠、50mM磷酸盐缓冲液(pH8.0),2-8℃保存。
收获的FHA抗原经过Sephacryl S-200High Resolution层析介质分离:将500mlSephacryl S-200High Resolution层析介质装于2.6×100CM层析柱内,用pH 8.0的0.5M氯化钠+50mM磷酸盐缓冲液平衡3~5个柱体积,将收获的FHA洗脱液上到S-200层析柱上,监测蛋白质A280的紫外吸收值。然后用平衡液进行洗脱,收集第一个从层析柱上流出的峰,即为FHA。
Prn蛋白的纯化:
将收获的菌体按照1∶5(W/V)的比例溶解于含有4M尿素pH7.4PBS缓冲液(10mM磷酸钾,0.15mM NaCl)内,混合搅拌一小时,离心(12000g,30min)收集上清液,弃掉沉淀。将得到的上清液用0.22μM澄清,然后用10-30KD的膜浓缩到原体积的1/5,浓缩液然后加入250g/L的硫酸铵,2-8℃搅拌至少2小时或静置过夜,离心(12000g,30min)收集沉淀,沉淀用pH7.5的2M尿素+50mM磷酸盐缓冲液溶解,再离心(12000g,30min),收集上清液,并调节pH至7.5。然后上Capto-adhere层析柱,用以下溶液连续洗脱:i)PH 7.5的5mM磷酸盐缓冲液;ii)pH7.5的0.5M NaCl磷酸盐缓冲液;和iii)pH5.0的5mM醋酸钾缓冲液。收集流穿液和每步的洗脱峰,取样做SDS-PAGE和western检测,Prn蛋白在醋酸钾缓冲液的洗脱峰内。
试验结果:
通过CM柱可以分离PT及FHA,紫外监测结果见图2-2。将获得的各峰值蛋白溶液用SDS-PAGE鉴定纯度(见图3-2),与标准Mark蛋白的电泳图谱对照比较可知,峰1为纯化分离的PT,峰2为FHA。FHA经S-200进一步分离后,纯度明显增加(电泳结果见图4-2)。最终分离纯化的PT和FHA蛋白纯度均在95%以上,Lowry测定收获PT的蛋白浓度为147.1μg/ml(产率在80%以上),FHA的蛋白浓度为395.2μg/ml(产率83%以上)。
通过Capto-adhere柱层析,可分离出外膜蛋白Prn,紫外吸收结果见图5-2,Western-blot鉴别结果见图6-2。SDS-PAGE鉴定纯度分离纯化的Prn蛋白纯度达90%以上(产率在87%以上),结果见图7-2。Lowry测定收获Prn的蛋白浓度为141μg/ml。
实施例5.百日咳有效抗原的脱毒(1)
试验材料及样品:
中空纤维滤柱:UFP-10-C-4MA-0.065m2,GE
切向流处理系统:Quixstand中空纤维膜分离系统,GE
试验方法:
将制备的纯PT调整蛋白浓度50μg/ml,加入终浓度为0.004M的赖氨酸,再加入终浓度1%的吐温20作为分散剂;然后将1%的戊二醛溶液分2-3次加入,至终浓度为0.5%,使其室温作用4小时,脱毒。然后加入0.2M L-赖氨酸使其终浓度为0.02M,室温作用2小时终止反应。将脱毒收获的混合物经10KD的中空纤维滤柱进行换液透析处理,透析液为20mM PB+0.5M NaCl(pH7.6)。
对脱毒后的PT样品的特异性毒性检查:用体重14~16g的NIH小鼠,每只小鼠腹腔注射0.5ml,于注射前和注射后16~18小时分别称取小鼠体重;每只小鼠于腹腔注射后3天进行末梢血白细胞计数;每只小鼠于注射后4天,腹腔注射0.5ml溶液(含二盐酸组胺4mg),30分钟后测小鼠的肛温。将该脱毒PT样品置37℃4周,然后再进行组织胺致敏毒性的活性检查。
试验结果:
注射PT样品的小鼠体重减轻毒性的活性为0.06BWDU/ml;小鼠白细胞增多毒性的活性为0.08LPU/ml;小鼠组织胺致敏毒性的活性为0.13HSU/ml。脱毒PT样品置37℃4周,小鼠组织胺致敏毒性的活性为0.22HSU/ml,以上结果均符合药典的相关规定。
实施例6.百日咳有效抗原的脱毒(2)
试验材料及样品:
中空纤维滤柱:UFP-10-C-4MA-0.065m2,GE
切向流处理系统:Quixstand中空纤维膜分离系统,GE
试验方法:
将制备的纯PT调整蛋白浓度200μg/ml,加入终浓度为0.004M的甘氨酸,再加入终浓度1%的吐温80作为分散剂;然后将1%的戊二醛溶液分2-3次加入,至终浓度为1.5%,室温作用8小时,脱毒。然后加入0.2M L-赖氨酸使终浓度为0.01M,室温作用4小时终止反应。将脱毒收获的混合物经10KD的中空纤维滤柱进行换液透析处理,透析液为20mM PB+0.5MNaCl(pH7.6)。
脱毒后的PT样品进行特异性毒性检查:用体重14~16g的NIH小鼠,每只小鼠腹腔注射0.5ml,分别于注射前和注射后16~18小时称取小鼠体重,观察小鼠体重减轻情况。然后每只小鼠于腹腔注射后3天进行末梢血白细胞计数;每只小鼠于注射后4天,腹腔注射0.5ml溶液(含二盐酸组胺4mg),30分钟后测小鼠的肛温,观察小鼠对组织胺的致敏活性。此外,将该脱毒PT样品置37℃4周,然后再进行组织胺致敏毒性的活性检查。
试验结果:
注射PT样品的小鼠体重减轻毒性的活性为0.08BWDU/ml,小鼠白细胞增多毒性的活性为0.05LPU/ml,小鼠组织胺致敏毒性的活性为0.16HSU/ml。脱毒PT样品置37℃4周后,小鼠组织胺致敏毒性的活性为0.23HSU/ml,以上结果均符合药典的相关规定。
实施例7.组分百日咳疫苗的配制
将PT、FHA、Prn分别吸附到氢氧化铝上,将适宜体积的氢氧化铝无菌条件下分别加入PT、FHA、Prn中,均和均匀,室温下摇动2天。按以下比例进行配置,每0.5ml人用剂量的疫苗包含:
试验方法:腹腔免疫小鼠,3周后用百日咳毒力菌株经脑腔攻击感染,记录小鼠的存活率,根据与标准疫苗的比较,计算出相对效力。
试验结果:以上各配苗经小鼠效力试验,结果:以上各配苗的效力均大于4.0IU。
Claims (15)
1.一种从百日咳杆菌培养上清液分离纯化百日咳有效抗原成分的方法,所述方法包括以下步骤:
1)将百日咳杆菌培养上清液进行切向流超滤浓缩处理,从而得到浓缩液;
2)对所述浓缩液进行CM-Sepharose阳离子交换柱层析,分离出百日咳毒素和丝状血凝素;
3)将在步骤2)中得到的流穿液进行多结合性Capto-adhere柱阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素;
其中,所述百日咳毒素的洗脱是用pH为7.4-7.6的0.5-2M尿素+20-50mM Tris-HCl缓冲液进行的;所述丝状血凝素的洗脱是用pH为7.0-8.0的0.2-0.6M氯化钠+20-50mM磷酸盐缓冲液进行的;并且所述多结合性Capto-adhere柱阴离子交换层析中,百日咳粘着素是用以下溶液连续洗脱获得的:i)5-10mM磷酸盐缓冲液,pH 6.6-7.5;ii)0.5-1M NaCl磷酸盐缓冲液,pH 6.6-7.5;和iii)5-10mM醋酸钾缓冲液,pH 4.0-5.0。
2.一种制备无细胞百日咳疫苗的方法,所述方法包括:
1)将百日咳杆菌培养上清液进行切向流超滤浓缩处理,从而得到浓缩液,其体积为初始体积的1%至10%;
2)将所述浓缩液进行CM-Sepharose阳离子交换柱层析,分离出百日咳毒素和丝状血凝素;
3)将在步骤2)中得到的流穿液进行多结合性Capto-adhere柱阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素,以及将百日咳杆菌菌体溶解、浓缩,并进行硫酸铵沉淀和多结合性Capto-adhere柱阴离子交换层析,分离出百日咳粘着素;
4)将百日咳毒素单独制成无细胞百日咳疫苗,或者将百日咳毒素同丝状血凝素和/或百日咳粘着素混合在一起制成无细胞百日咳疫苗;
其中,所述百日咳毒素的洗脱是用pH为7.4-7.6的0.5-2M尿素+20-50mM Tris-HCl缓冲液进行的;所述丝状血凝素的洗脱是用pH为7.0-8.0的0.2-0.6M氯化钠+20-50mM磷酸盐缓冲液进行的;并且所述多结合性Capto-adhere柱阴离子交换层析中,百日咳粘着素是用以下溶液连续洗脱获得的:i)5-10mM磷酸盐缓冲液,pH 6.6-7.5;ii)0.5-1M NaCl磷酸盐缓冲液,pH 6.6-7.5;和iii)5-10mM醋酸钾缓冲液,pH 4.0-5.0。
3.权利要求2的方法,其中步骤1)中的浓缩液体积为初始体积的4%至7%。
4.权利要求1-3任一项的方法,其中将所述丝状血凝素进一步进行Sephacryl S-200High Resolution柱层析。
5.权利要求1-3任一项的方法,其中将在步骤2)中得到的流穿液事先进行硫酸铵沉淀处理。
6.权利要求2或3的方法,其中将所述百日咳毒素脱毒。
7.权利要求6的方法,其中使用戊二醛或甲醛进行百日咳毒素脱毒。
8.权利要求7的方法,所述脱毒过程包括:使所述50-200μg/ml百日咳毒素与0.5%-1.5%戊二醛室温作用4-8小时,随后加入L-赖氨酸使其终浓度为0.01-0.02M,再在室温下作用2-4小时,终止反应。
9.权利要求6的方法,其中在脱毒过程中加入保护剂和/或分散剂。
10.权利要求9的方法,其中所述保护剂为赖氨酸、甘氨酸或天冬氨酸,所述分散剂为吐温20或吐温80。
11.权利要求2或3的方法,其中,在步骤4)中,相对于3重量份百日咳毒素,丝状血凝素为0-3重量份,百日咳粘着素为0-3重量份。
12.权利要求11的方法,其中所述抗原百日咳毒素、丝状血凝素和百日咳粘着素的混合比例为3:3:1至3:3:3。
13.权利要求12的方法,其中所述抗原百日咳毒素、丝状血凝素和百日咳粘着素的混合比例为3:3:1。
14.权利要求2或3的方法,其中在步骤4)中,将抗原成分与防腐剂和/或佐剂混合起来,其中所述防腐剂为硫柳汞或苯氧乙醇,和/或所述佐剂为氢氧化铝或磷酸铝。
15.权利要求14的方法,其中所述防腐剂为硫柳汞,和/或所述佐剂为氢氧化铝。
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Rapid purification of pertussis toxin(PT) and filamentous hemagglutinin(FHA) by cation-exchange chromatography;Erkan Ozcengiz et al.;《Vaccine》;20041231;第22卷;1570-1575 * |
百日咳黏着素的纯化及生物性特性的初步研究;王玲等;《2011中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会论文集》;20110921;271-274 * |
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