JPH08785B2 - トレポネマ・ハイオジセンテリアエのバクテリン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、嫌気性スピロヘータで
あるトレポネマ・ハイオジセンテリアエ（Ｔｒｅｐｏｎ
ｅｍａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（以下、
「Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ」と略記する場合
もある）細胞に由来するバクテリンに関する。

【０００２】

【従来の技術】豚の赤痢は離乳後の豚に主として影響を
及ぼす重い粘液出血性下痢である。この病気の抑制は一
般に化学生物物質（ｃｈｅｍｏｂｉｏｔｉｃｓ）および
抗生物質の使用により達成されてきた。今日まで、この
病気を抑制するために有効な薬物以外の予防物質は存在
していない。嫌気性スピロヘータ、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅ
ｎｔｅｒｉａｅは豚の赤痢の主要な病因学的因子である
ことが認識されている。米国特許第４,１００,２７２号
明細書は、豚の赤痢に対する豚の抵抗を増強するため
に、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの殺細胞を含有
するワクチンまたはバクテリンの使用を開示している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】この先行技術の方法
は、バクテリン生成物の活性が比較的低いために、商業
的に受入れられなかった。記載された処置のスケジュー
ルは６回の静脈内注射を含む。より少ない筋肉内注射を
含む処置のスケユールで使用できるバクテリンを得るこ
とは望ましいことである。

【０００４】従って、本発明の目的は、効率よく調製さ
れ、かつ活性の高いバクテリンを提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】ある種のコレステロール
に富んだ分画は、一定有機体のための生育促進剤として
有効であることが知られている。例えば、ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）
Ｖｏｌ. １３５、Ｎｏ．３、８１８−８２７ページ（１
９７８）は、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Ｍｙｃ
ｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプ
ラズマ・アルスリチジス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒ
ｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）の生育におけるコレステロール含
有血清分画の使用を記載している。ジャーナル・オブ・
ゼネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）は、トレポネマ・ハイオジセンテ
リアエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒ
ｉａｅ）、Ｖｏｌ．１１６、５３９−５４３ページ（１
９８０）の生育におけるＵＳＰコレステロールの使用を
記載している。

【０００６】本発明者らは、特定の処理によって得られ
た栄養培地を用いて培養して得られた Ｔ．ｈｙｏｄｙ
ｓｅｎｔｅｒｉａｅの細胞由来のバクテリンは、効率よ
く調製できるだけでなく、高い活性も示すことを見い出
し本発明を完成した。

【０００７】従って、本発明によれば、栄養培地がコレ
ステロールに富んだウシ分画を含有することを特徴とす
る得られた細胞をバクテリン中において引続いて使用す
るために、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを適当な
栄養培地中で生育させて得られる細胞由来のバクテリン
が提供される。

【０００８】生育、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ
の有毒な菌株を用いて実施することができる。有毒な菌
株は典型的な豚の赤痢の感染を起こすことのできる菌株
である。２つの特定の菌株（Ｂ２０４およびＢ２３４）
はこの目的に有効であることがわかった。これらはアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ）の寄託され、そしてＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２１
２（Ｂ２０４）およびＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２８７（Ｂ
２３４）の寄託番号を有する。

【０００９】Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株
は、子牛胎児血清または子羊血清、デキストロース、１
−システインＨＣｌ、ビタミンＢ−１２および酵母エキ
スを補充したトリプチツク・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔ
ｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）［ディフコ・ラボラトリー
ズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］の混合
物がらなる培地中で生育させることができる。本発明の
改良は、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ細胞を生育
させるためのこのような培地中にコレステロールに富ん
だウシ分画を含めることである。コレステロールに富ん
だウシ分画は前記培地の容量に基づいて好ましくは１.
０〜２.５容量％の量で存在するが、０.１〜５.０容量
％の量で存在することができる。

【００１０】本発明の方法における使用に適するコレス
テロールに富んだウシ分画はいくつかの源から入手可能
である。マイルス・ラボラトリーズ・インコーポレーデ
ッド（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）のマイルス・サイエンティフィック・ディヴィジ
ョン（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｖｉｓ
ｉｏｎ）から入手可能でありかつ米国特許第４,２９０,
７７４号において開示されかつ特許請求されている方法
に従ってウシ血清から調製された、コレステロール・コ
ンセントレイト・コード（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｃｏｄｅ）８２−０１０が有用
である。バイオセル・ラボラトリーズ（Ｂｉｏｃｅｌｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手可能であるボビ
ン・コレステロール・コンセントレイト・リスト（Ｂｏ
ｖｉｎｅ ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅＬｉｓｔ）３２００
は、もう一つの有用な材料である。本発明の方法におい
て有用な好ましいコレステロールに富んだウシ分画は、
次の工程： （ａ） 液状のコレステロールを含有するウシの血漿ま
たは血清あるいはその分画をシリカの吸着剤と接触させ
てコレステロールを吸着させ、（ｂ） 吸着されたコレ
ステロールを残りの液状の血漿または血清から分離し、
（ｃ） 吸着されたコレステロールを凍結しかつ融解
し、（ｄ） 吸着されたコレステロールをｐＨ９.０〜
１１.５において溶離し、（ｅ） 溶離されたコレステ
ロール溶液を限外濾過により濃縮し、（ｆ） 濃縮され
たコレステロール溶液のｐＨを１１.０〜１１.４の範囲
内の値に調節し、（ｇ） 濃縮されたコレステロール溶
液を順番に炭酸ナトリウムおよび水に対して透析し、
（ｈ） 透析したコレステロール溶液を限外濾過により
５０〜３０００ｍｇ／ｄｌのコレステロール水準にさら
に濃縮し、（ｉ） 濃縮されたコレステロール溶液のｐ
Ｈを７.０〜１１.０の範囲内の値に調節し、（ｊ） 濃
縮されたコレステロール溶液を５０〜１００℃に３０分
〜２４時間加熱し、そして（ｋ） 精製されたコレステ
ロールに富んだウシ分画をそれから回収する、からなる
方法によって調製される。

【００１１】この特定の分画およびその生産の方法は、
本出願人による本願と同時に提出された同時係属米国特
許出願第７３２,８５６号において記載されかつ特許請
求されている。

【００１２】コレステロールに富んだ分画の生産に使用
するための出発物質は、コレステロールを含有するウシ
の任意の血漿または血清またはその分画であることがで
きる。好ましい出発物質は、ウシ血清である。出発物質
が血清であるとき、可溶性塩、例えば、クエン酸ナトリ
ウムを０.２５〜１.０のイオン強度に添加することが好
ましい。他の適当な塩は、塩化ナトリウム、リン酸ナト
リウム、リン酸カリウム、硫酸アンモニウムおよび硫酸
ナトリウムを包含する。可溶性塩を上の濃度に添加する
と、引続くシリカ吸着工程において吸着されるコレステ
ロールの量は増加する。ウシ血漿は、通常、抗強固剤と
してクエン酸塩を添加することを包含する方法により集
められる。この塩の濃度は通常吸着工程のために十分で
あり、そして追加の塩は不必要である。

【００１３】血漿または血清の出発物質を０〜５０℃、
好ましくは２０〜２５℃の温度に維持する。ｐＨは５.
５〜９.０、好ましくは７.０〜８.０の範囲に調節す
る。

【００１４】本発明において有用なシリカ吸着剤の組成
は臨界的でない。適当なシリカ物質はカボット・コーポ
レーション（Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）か
ら商標カボシル（Ｃａｂｏｓｉｌ）で入手可能な極微小
シリカおよびカリー・カンパニー（Ｃａｒｙ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ）から商標エーロシル（Ａｅｒｏｓｉｌ）３８０
で入手可能な粉末状シリカである。このシリカは液状の
血漿または血清に１〜５０／１、好ましくは１０〜２０
ｇ／１の量で添加される。

【００１５】液状の血漿または血清中のシリカの懸濁液
は次いで約３〜４時間混合する。次いで吸着したコレス
テロールを含有するシリカを残りの液状の血漿または血
清から好ましくは遠心により分離し、そして液相を廃棄
する。次いでのシリカのペーストを−２０℃で凍結し、
そしてこの温度に少なくとも１週間、好ましくは２週間
保持する。次いで、凍結したペーストを室温（約２０〜
２５℃）に２４〜４８時間融解する。融解したペースト
から絞り出される液体を廃棄する。

【００１６】シリカのペーストを洗浄して存在するかも
知れない望ましくない蛋白質を除去する。これは約０.
１５モルの塩化ナトリウムを含有する塩水溶液中にペー
ストを懸濁させることによって達成される。他の有用な
塩は酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムである。こ
の塩溶液はペーストの重量の約２倍の量で使用する。ペ
ーストを液体から分離する。塩溶液を使用するこの洗浄
手順は好ましくは２回反復して吸蔵された蛋白質を除去
する。

【００１７】洗浄されたペーストを約２容量の脱イオン
水または蒸留水中に懸濁させ、そしてｐＨを９.０〜１
１.５、好ましくは１０.４〜１０.６に適当なアルカリ
性物質、例えば、水性水酸化ナトリウムの添加により調
節する。この懸濁液を約２時間撹拌し、その間ｐＨを上
のアルカリ性物質の周期的添加により所望水準に維持す
る。この処理は所望のコレステロール分画をシリカから
溶離する。次いで、懸濁液を１２〜２４時間、好ましく
は１２〜１８時間沈降させる。コレステロールを含有す
る上澄み液をさらに処理するためサイホンで取り出す。
所望のコレステロールに富んだ分画の生産のためのこの
最初の溶離物のみを使用することが好ましい。しかし、
上のアルカリ性懸濁、溶離、撹拌および沈降の工程を２
回以上反復し、そして第１の溶離物質とともに第２およ
び第３の溶離からの懸濁液をプールすることが可能であ
る。シリカは廃棄する。

【００１８】コレステロール溶液を濾過および遠心によ
り清澄にして微量のシリカを除去し、次いでその最初の
体積の１５〜５０％、好ましくは２０％に限外濾過技術
により濃縮する。ｐＨはアルカリの添加により１１.０
〜１１.４の範囲の値、好ましくはｐＨ１１.２に調節す
る。これは引続く除去のために存在するかも知れない残
留シリカの可溶化を促進する。

【００１９】次いで、コレステロールの濃縮物を処理し
て存在する塩の実質的にすべてを除去する。好ましい塩
の除去技術は順次に炭酸ナトリウムおよび水に対して透
析することである。この塩の除去工程は引続く熱処理工
程のために重要である。塩の有意な量の除去は加熱時の
コレステロールの望ましくない変性を起こすであろう。

【００２０】透析したコレステロールの溶液を限外濾過
により５０〜３０００ｍｇ／ｄｌ、好ましくは１０００
〜２０００ｍｇ／ｄｌのコレステロール水準に濃縮す
る。

【００２１】次いで、濃縮したコレステロールの溶液の
ｐＨを７.０〜１１.０の生育、好ましくはｐＨ７.６に
調節して、それを生育培地中における引続く使用に最も
適合するようにさせる。

【００２２】この溶液を５０〜１００℃、好ましくは８
０℃に２０分〜２４時間、好ましくは３０分〜６０分間
加熱して、コレステロールの貯蔵安定性を高める。この
溶液を室温に冷却し、そして滅菌濾過して精製されたコ
レステロールに富んだ分画を回収する。この生成物は純
粋なコレステロールではなく、それは生産プロセスを通
過した少量の同定されない物質が混合している。

【００２３】純粋なコレステロールは、コレステロール
に富んだウシ分画により達成される方法でＴ．ｈｙｏｄ
ｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの生育に適切に影響を及ぼさない
ので、本発明における使用に不適当である。

【００２４】Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの細胞
は、コレステロールに富んだウシ分画を含有する培地中
でこの分野においてよく知られた条件下に生育させる。
次いで、得られる細胞をよく知られた方法においてホル
マリン、マーシオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）ま
たはベータ−プロピオラクトンのような物質を使用して
殺す。次いで、細胞を収穫し、そして適当な担体媒質中
に懸濁させて所望のバクテリンを生産する。

【００２５】バクテリンの活性は、アジュバントの使用
によりさらに増強することができる。本発明の方法によ
り生産されるＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ細胞と
ともに使用するために好ましいアジュバントは、米国特
許第３,９１９,４１１号において開示されかつ特許請求
されているポリアリルサッカリド（Ｐｏｌｙａｌｌｙｌ
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）で架橋されたアクリル酸ポリ
マーと特定の乳剤系との組み合わせである。このような
アジュバントは、商標ＨＡＢＬＯＧＥＮでマイルス・ラ
ボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ｍｉｌｅｓ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のベイベット・デ
ィヴィジョン（Ｂａｙｖｅｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）から
市販されている。

【００２６】上の方法で生産されたＴ．ｈｙｏｄｙｓｅ
ｎｔｅｒｉａｅバクテリンは３週間の間隔でわずかに２
回の投与で筋肉内に注射して、豚の赤痢に対する豚の抵
抗を有意に増加することができることが発見された。

【００２７】

【実施例】次の実施例により、本発明をさらに説明す
る。

【００２８】実施例１ コレステロールに富んだウシ分画は、次のようにして調
製した。新鮮なウシ血清を２０〜２５℃の温度にし、そ
して１４.７ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム（０.５の血清
イオン強度）を添加した。生ずる溶液を３０分間撹拌
し、そしてｐＨを適当量の１Ｎの水酸化ナトリウムの添
加により７.０とした。微細なシリカを１０ｇ／ｌの量
で添加し、そして生ずるスラリーを室温で３時間撹拌し
た。吸着した物質を含有するシリカを次いで液相から遠
心により分離し、そして液体を廃棄した。シリカのペー
ストを−２０℃で凍結し、そしてその温度で２週間貯蔵
した。次いで、凍結したペーストを室温で４８時間融解
した。絞り出された液体を廃棄した。次いでシリカのペ
ーストを２容量の０.８５％（重量／容量基準）の塩化
ナトリウム水溶液（０.１４６モルのＮａＣｌ）中に懸
濁させた。それを１５分間おだやかに混合し、そして少
なくとも３時間沈降させた。上澄み液をサイホンで除去
し、そして廃棄した。この洗浄工程を２回反復した。次
いで、洗浄したペーストを２容量の脱イオン水中に懸濁
させた。ｐＨを１Ｎの水酸化ナトリウムの添加により１
０.５に調節した。生ずる懸濁液を室温で２時間撹拌
し、その間ｐＨを１０.５に調節した。撹拌を停止し、
そして上澄み液を１８時間沈降させた。上澄み液はサイ
ホンで取り出し、そして濾過および遠心により清澄にし
た。シリカを廃棄した。次いで清澄にした溶液を限外濾
過によりその最初の体積の２０％に濃縮した。濃縮した
物質のｐＨは１Ｎの水酸化ナトリウムの添加により１
１.２に調節した。次いで、濃縮した物質のｐＨを６容
量の０.０１モルの炭酸ナトリウムに対してｐＨ１１.２
において透析した。次いで、それを６容積の蒸留水に対
して透析した。この濃縮物のコレステロール水準を既知
の技術により分析し、そしてさらに１０００ｍｇ／ｄｌ
のコレステロール水準に限外濾過により濃縮した。次い
で、ｐＨを１Ｎの塩酸の添加により７.６に調節し、そ
して得られる溶液を８０℃に１時間加熱した。次いで、
この溶液を室温に冷却し、滅菌濾過した。次いで、濾過
した物質を精製したコレステロールに富んだ分画として
回収した。

【００２９】Ｔ．ｈｙｄｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株
ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２１２の凍結した種を、１３ｍｌ
のトリプチック・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏ
ｙＢｒｏｔｈ）［ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃ
ｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２７．５ｇ／ｌ］、
１０％の子牛胎児血清、０.５％のデキストロース、０.
０５％の１−システインＨＣｌおよび０.２５ｍｃｇ／
ｍｌのビタミンＢ−１２を含有するガラス管中に接種し
た。このような百分率は重量／容量基準に基いた。次い
で、ガラス管をシールし、そして１０容量％の水素、８
０容量％の窒素、１０容量％の二酸化炭素を含有する嫌
気性雰囲気中で３７℃において７２時間インキュベーシ
ョンした。次いで、得られる種母を同一の培地を含有す
る２本の管に移し、それらを３７℃で２４時間同一条件
下にインキュベーションした。これらの管の内容物をプ
ールした。次いで、プールした活性な種母７ｍｌの部
を、各々が２００ｍｌのトリプチック・ソイ・ブロス
（Ｔｒｙｐｔｉｃ ＳｏｙＢｒｏｔｈ）、１％の酵母エ
キス、５％の子羊血清、０.５％のデキストロース、０.
０５％の１−システインＨＣｌおよび０.２５ｍｃｇ／
ｍｌのビタミンＢ−１２を含有する２本の５００ｍｌ容
のびんの各々に添加した。このような百分率は重量／容
量基準に基いた。次いで、びんの内容物を記載する嫌気
雰囲気中で３７℃において、濁るまで（約２４時間）、
インキュベーションした。

【００３０】次いで、得られる成長した種母を２つの部
分に分け、そして各部分を単独で使用して、各々が７リ
ットルのトリプチック・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ
Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）、１％の酵母エキス、３％の子
羊血清、１％のデキストロース、０.０５％の１−シス
テインＨＣｌおよび０.２５ｍｃｇ／ｍｌのビタミンＢ
−１２を含有する２つの１４リットル容のパイロツト発
酵槽の一方に接種した。このような百分率は重量／容量
基準に基いた。発酵槽の一方に２.５容量％の上のよう
に調製したコレステロールに富んだウシ分画をさらに補
充した。次いで、両者の発酵槽を３７℃において４４時
間上の嫌気性雰囲気下にインキュベーションした。ｐＨ
を５Ｎの水酸化ナトリウムの周期的添加により６.５に
調節した。

【００３１】上のインキュベーションが完結したとき、
適当な試料を各発酵槽から取り、次いで発酵槽の内容物
を０.１５容量％のホルマリンで処理して細胞を不活化
した。細胞の試料を顕微鏡検査し、合計の細胞の計数を
ペトロッフ−ハウサ−（Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｅ
ｒ）計数室内で測定し、そして生存しうる細胞の計数を
新しく注いだ５％のウシ血液寒天平板上で系統的に希釈
することによって決定した。これらの血液寒天平板を３
７℃において５０容量％の水素および５０容量％の二酸
化炭素の嫌気性雰囲気中で４日間インキュベーションし
た。Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのコロニーを溶
血の個々のゾーンとして観察した。これらの実験の結果
を表１に記載する。

【００３２】

【表１】

【００３３】上のデータから理解できるように、コレス
テロールに富んだウシ分画の存在は合計の細胞の計数を
二倍にし、生存しうる細胞の計数を１００倍増加させ、
そして細胞の形態学に対して陽性の作用を示した。

【００３４】実施例２ 次いで、上の実施例１に記載するように調製したＴ．ｈ
ｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２
１２の種母を使用して、各々が２００ｍｌのトリプチッ
ク・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔ
ｈ）を１％の酵母エキス、５％の子羊血清、０.０５％
の１−システインＨＣｌおよび０.２５ｍｃｇ／ｍｌの
ビタミンＢ−１２と混合して含有する２本の５００ｍｌ
容のびんの各々に接種した。このような百分率は重量／
容量基準に基いた。びんの１つ（対照）は、０.５容量
％の実施例１に記載したようにして調製したコレステロ
ールに富んだウシ分画を含有した。第２のびんは、０.
５容量％のマイルス・ラボラトリーズ・インコーポレー
テッド（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）のコレステロール・コンセントレイト・コード
（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ
Ｃｏｄｅ）８２−０１０を含有した。第３のびんは、
２.５容量％のバイオセル・ラボラトリーズ（Ｂｉｏｃ
ｅｌｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のボビン・コレス
テロール・コンセントレイト・リスト（Ｂｏｖｉｎｅ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｌｉｓｔ）３２００を含有し
た。次いで、これらの接種したびんを１０容量％の水
素、８０容量％の窒素、１０容量％の二酸化炭素を含有
する嫌気性雰囲気中で３７℃において３８時間インキュ
ベーションした。びんの内容物を２Ｎ水酸化ナトリウム
の添加によりｐＨ７.０に２時間および３１時間調節し
た。各びんからの合計の細胞の計数をペトロッフ−ハウ
サー（Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｅｒ）計数室内で測定
した。結果を第２表に示す。

【００３５】

【表２】

【００３６】上のデータから理解できるように、種々の
源からのコレステロールに富んだウシ分画を使用して望
ましく高い細胞計数のＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ
ｅを生産することができる。

【００３７】実施例３ 好ましいコレステロールに富んだ分画を補充した培地と
ともにＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３１２８７を使用して、実施例１の手順を全体
的に反復して、高い濃度の細胞を生産した。

【００３８】実施例４ 実施例１に記載する方法において生育培地中に好ましい
コレステロールに富んだ分画を使用して調製した殺した
Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ細胞と、米国特許第
３,９１９,４１１号に記載する１０容量％のＨＡＢＬＯ
ＧＥＮアジュバントおよび１：１０,０００のメルチオ
レイトと混合することによって、ワクチンまたはバクテ
リンを調製した。このワクチンは２×１０⁹細胞／ｍｌ
を含有した。次いで、このワクチンを５種類の別々のチ
ャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）研究において使用し
て、このワクチンの豚の赤痢に対する作用を決定した。
ワクチン接種／チャレンジ研究（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ
ｓｔｕｄｉｅｓ）の各々において、豚を豚の赤痢の経歴
をもたない群れから入手し、そしてこれらの豚は雌雄混
合のものであり、そして一般にヨゥクシャー（Ｙｏｒｋ
ｓｈｉｒｅ）、ハンプシャー（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）ま
たはクロス（Ｃｒｏｓｓ）の種であった。最初のワクチ
ン接種の時、豚は離乳後少なくとも３週間でありかつ体
重８８.９〜１０１.６ｋｇ（３５〜４０ポンド）のもの
であった。

【００３９】すべてのワクチン接種／チャレンジの研究
は、ワクチン接種した豚および対照の豚を分離すること
のできる隔離設備において実施した。豚に抗生物質を含
有しない蛋白質の１日分の食物の配給量（ｇｒｏｗｅｒ
ｒａｔｉｏｎ）を与えた。チャレンジ前に、豚をレク
タル・スワブ（ｒｅｃｔａｌ ｓｗａｂ）し、そして適
当な単離培地上で試験後、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒ
ｉａｅ およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種
を含有しないことが示された。

【００４０】最終の細胞を殺さなたったことを除き、実
施例１と同様に生育させたＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒ
ｉａｅ菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２１２または３１２８
７により豚を胃内的にチャレンジした。チャレンジの投
与量は１０⁸〜１０⁹の有機体を含有するように希釈され
た１００ｍｌの活性培養物から成っており、これを個々
の豚に胃管を経由して４８時間の断食後に投与した。

【００４１】各チャレンジした豚を毎日の基準でチャレ
ンジ後２８日の観察期間にわたって観察した。臨床的病
気の開始後、赤痢の豚をレクタル・スワブ（ｒｅｃｔａ
ｌｓｗａｂ）して病原因子を単離した。スワブ（ｓｗａ
ｂ）をスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉ
ｎ）血液寒天平板上で継代培養し、４０℃で４〜６日間
インキュベーションし、そして溶血の寒天平板をスピロ
ヘータの存在について顕微鏡検査することによって、
Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの感染を確認した。
５種類の研究の間に死んだ豚の各々を剖検した。巨視的
な病変を記録し、そしてレクタル・スワブ（ｒｅｃｔａ
ｌ ｓｗａｂ）を結腸から取り、上のように継代培養し
た。

【００４２】次の臨床学的指数を使用して、チャレンジ
に対する個々の豚の臨床的応答を測定した：

【００４３】

【表３】 臨床学的指数 全体の状態 糞便の組成 糞便の稠度 ０−正常 ０−正常 ０−正常 １−下痢 １−粘液 １−柔らかい ２−赤痢 ２−血液およ １．５−ゆる ３−やせた び粘液 い ４−死にかけた ３−血液 ２−流動性 ５−死 ３−水つぽい 種々の分析法を使用して、臨床学的指数を評価し、そし
て下に定義する： ａ） 毎日の臨床学的指数（ＤＣＩ）−各チャレンジし
た豚についての毎日の臨床学的指数は、３つの上に記載
したパラメーター： ＤＣＩ＝全体の状態＋糞便の組成＋糞便の稠度 ｂ） 毎日の群の臨床学的指数（ＤＧＣＩ）−ワクチン
接種した群および対照群についての毎日の群の臨床学的
指数を次式に従って計算した：

【００４４】

【数１】 ｃ） 個々の累積臨床学的指数（ＩＣＣＩ）−チャレン
ジ後２８日の期間にわたる各豚についての個々の累積臨
床学的指数は、次のようにして計算した：

【００４５】

【数２】 ｄ） 群の累積臨床学的指数（ＧＣＣＩ）−ワクチン接
種した群および対照群についての群の累積臨床学的指数
は、豚の特定の群内でＩＣＣＩを平均することによって
得た：

【００４６】

【数３】 研究Ｎｏ．１ １０匹の豚を等しく２つに室の中に分割した。５匹のワ
クチン接種した豚に５ｍｌの前述のワクチンを３週の間
隔で２回筋肉内投与した。５匹のワクチン接種しない豚
を別な室内に保持した。促進剤投与（ｂｏｏｓｔｅｒ）
後２週に、すべての豚を毒性のＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔ
ｅｒｉａｅ ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２１２でチャレンジ
させた。

【００４７】研究Ｎｏ．２ ２９匹の豚を５室の２３匹のワクチン接種した豚および
２室の６匹の対照に分割した。ワクチン接種した豚に５
ｍｌの前述のバクテリンを３週の間隔で２回筋肉内投与
した。チャレンジは研究Ｎｏ．１に記載するものと同一
であった。

【００４８】研究Ｎｏ．３ １０匹の豚を等しく２つに室の中に分けた。５匹のワク
チン接種した豚に５ｍｌの前述のバクテリンを３週の間
隔で２回筋肉内投与した。５匹のワクチン接種しない豚
を別の室内に保持した。促進剤投与後２週に、すべての
豚を毒性のＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．３１２８７でチャレンジした。

【００４９】研究Ｎｏ．４ ４６匹の豚を９室の３６匹のワクチン接種した豚および
２室の１０匹のワクチン接種しない対照に分割した。ワ
クチン接種した豚に５ｍｌの前述のバクテリンを３週の
間隔で２回筋肉内投与した。チャレンジは研究Ｎｏ．３
に記載するものと同一であった。

【００５０】研究Ｎｏ．５ ４６匹の豚を９室の３６匹のワクチン接種した豚および
２室の１０匹のワクチン接種しない対照に分割した。ワ
クチン接種した豚に５ｍｌの前述のバクテリンを３週の
間隔で２回筋肉内投与した。チャレンジは研究Ｎｏ．１
に記載するものと同一であった。

【００５１】５種類の研究は合計１０５匹のワクチン接
種した豚および３６匹の対照を含んだ。５種類の研究の
結果を表３および４に要約する：

【００５２】

【表４】

【００５３】菌株ＡＴＣＣ ３１２１２を用いる胃内の
チャレンジ後、臨床学的赤痢はワクチン接種した豚の１
７.２％（６４匹のうち１１匹）および対照の豚の７１.
４％（２１匹のうち１５匹）において観察された。これ
はワクチン接種した豚のうちの臨床学的赤痢の実際の場
合の７５.９％の減少を表わす。チャレンジ後の２８日
の観測の全期間については計算した累積臨床学的指数
（ＧＣＣＩ）はワクチン接種した豚について１０.４で
あり、これに対してワクチン接種したしない豚について
８３.２であった。これは臨床学的指数により測定して
合計の臨床学的症候（下痢、赤痢、やせること、死）の
８７.５％の減少を表わす。死はワクチン接種した豚に
おいて観察されず、これに対して２１匹の対照のうち５
匹はチャレンジ後に死んだ（２３.８％）。臨床学的赤
痢の開始はワクチン接種した豚において遅延され、そし
て臨床学的病気の期間は減少した。無食欲は認められる
ようにワクチン接種した豚において減少した。

【００５４】

【表５】

【００５５】菌株ＡＴＣＣ ３１２８７を用いる胃内的
なチャレンジ後、臨床学的赤痢はワクチン接種した豚の
３５.４％（４１匹のうち１４匹、１匹の豚±）および
対照の豚の７０.０％（１５匹のうち１０匹、１匹の豚
±）において観察された。これはワクチン接種した豚の
うちの臨床学的赤痢の実験の場合の４９.４％の減少を
表わす。累積臨床学的指数（ＧＣＣＩ）はワクチン接種
した豚について１８.６であり、これに対してワクチン
接種したしない豚について７３.５であった。これは合
計の臨床学的症候の７４.７％の減少を表わす。死はワ
クチン接種した豚において観察されず、これに対して１
５匹の対照のうつ２匹はチャレンジ後に死んだ（１３.
３％）。臨床学的赤痢の開始はワクチン接種した豚にお
いて有意に遅延され、そして臨床学的病気の期間は減少
した。

【００５６】臨床学的赤痢の病原性因子としてＴ．ｈｙ
ｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの確認は、スペクチノマイシ
ン血液寒天平板上のレクタル・スワブ（ｒｅｃｔａｌ
ｓｗａｂ）の平板培養後に、すべての場合において達成
された。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種の選択
的培地上の同時の平板培養は陰性の結果を与えた。

【００５７】死んだ豚の結腸の内容物は血液を含みかつ
水っぽく、そして結腸自体は総体的に炎症しかつ繊毛を
欠いていた。剖検時に内壁から取ッたレクタル・スワブ
（ｒｅｃｔａｌ ｓｗａｂ）は、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎ
ｔｅｒｉａｅについて陽性でありかつサルモネラ（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ）種について陰性であった。チャレン
ジ後２８日に保護したワクチン接種した豚から取ったレ
クタル・スワブ（ｒｅｃｔａｌ ｓｗａｂ）は、スペク
チノマイシン血液寒天平板上で４２℃において継代培養
後、すべての場合において陰性であった。

【００５８】ずべての１４１匹のワクチン接種した豚お
よび対照の豚を考慮すると、５種類のチャレンジ研究を
通して臨床学的応答の要約する表５を構成することがで
きる。１０５匹のワクチン接種した豚のうち２５.５匹
は臨床学的赤痢を発現し（２４.３％）、これに対して
３６匹のワクチン接種しない豚のうちの２５.５匹は臨
床学的赤痢を発現した（７０.８％）。これはすべての
ワクチン接種した豚のうちの臨床学的赤痢の６５.７％
の減少を表わす。３６匹の対照の豚の７匹はチヤレンジ
後に死に（１９.４％）、これに対してワクチン接種し
た豚は死ななかつた。すべての１０５匹のワクチン接種
した豚についての群の累積臨床学的指数は１３.６であ
り、そして３６匹のワクチン接種しない豚についてのＧ
ＣＣＩは７９.２であった。これはすべてのワクチン接
種した豚のうちの合計の臨床学的症候（下痢、赤痢、や
せること、死）の８２.８％の減少を表わす。

【００５９】５種類の個々の研究からのワクチン接種／
チャレンジの結果を考慮すると、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎ
ｔｅｒｉａｅバクテリンは、豚の赤痢の予防の条件下で
表面するとき、明確な効能の程度を示すであろうと結論
することができる。

【００６０】

【表６】

【００６１】

【発明の効果】本発明によれば、効率のよい調製方法で
生産することができ、かつ活性の高いバクテリンが提供
できる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トレポネマ・ハイオジセンテリアエ（Ｔ
   ｒｅｐｏｎｅｍａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）を適
   当な栄養培地で生育させて得た細胞から生成したトレポ
   ネマ・ハイオジセンテリアエのバクテリンであって、 前記栄養培地として、次の工程 （ａ） 液状のコレステロールを含有するウシの血漿ま
   たは血清あるいはその分画をシリカの吸着剤と接触させ
   てコレステロールを吸着させ、 （ｂ） 吸着されたコレステロールを残りの液状の血漿
   または血清から分離し、 （ｃ） 吸着されたコレステロールを凍結しかつ融解
   し、 （ｄ） 吸着されたコレステロールをｐＨ９．０〜１
   １．５において溶離し、 （ｅ） 溶離されたコレステロール溶液を限外濾過によ
   り濃縮し、 （ｆ） 濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを１１．
   ０〜１１．４の範囲内の値に調節し、 （ｇ） 濃縮されたコレステロール溶液を順番に炭酸ナ
   トリウムおよび水に対して透析し、 （ｈ） 透析したコレステロール溶液を限外濾過により
   ５０〜３０００ｍｇ／ｄｌのコレステロール水準にさら
   に濃縮し、 （ｉ） 濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを７．０
   〜１１．０の範囲内の値に調節し、 （ｊ） 濃縮されたコレステロール溶液を５０〜１００
   ℃に３０分〜２４時間加熱し、そして （ｋ） 精製されたコレステロールに富んだウシ分画を
   それから回収すること、 からなる方法によって調製されたコレステロールに富ん
   だウシ分画と、ポリアリルサッカリドで架橋されたアク
   リル酸ポリマーと乳剤系との組み合わせから成るアジュ
   バントとを混合したことを特徴とするバクテリン。