JPH069505B2 - トレポネマ・ハイオジセンテリアエの生育方法 - Google Patents
トレポネマ・ハイオジセンテリアエの生育方法Info
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- JPH069505B2 JPH069505B2 JP61105004A JP10500486A JPH069505B2 JP H069505 B2 JPH069505 B2 JP H069505B2 JP 61105004 A JP61105004 A JP 61105004A JP 10500486 A JP10500486 A JP 10500486A JP H069505 B2 JPH069505 B2 JP H069505B2
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- A61P31/04—Antibacterial agents
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- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
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Description
【発明の詳細な説明】 豚の赤痢は離乳後の豚に主として影響を及ぼす重い粘液
出血性下痢である。この病気の抑制は一般に化学生物物
質（ｃｈｅｍｏｂｉｏｔｉｃｓ）および抗生物質の使用
により達成されてきた。今日まで、この病気を抑制する
ために有効な薬物以外の予防物質は存在していない。嫌
気性スピロへータ、トレポネマ・ハイオジセンテリアエ
（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ
ｅ）（以下Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅと記す）
は豚の赤痢の主要な病因学的因子であることが認識され
ている。米国特許第４，１００，２７２号は、豚の赤痢
に対する豚の抵抗を増加するために、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓ
ｅｎｔｅｒｉａｅの殺した細胞を含有するワクチンまた
はバクテリン（バクテリアワクチン）の使用を開示して
いる。
出血性下痢である。この病気の抑制は一般に化学生物物
質（ｃｈｅｍｏｂｉｏｔｉｃｓ）および抗生物質の使用
により達成されてきた。今日まで、この病気を抑制する
ために有効な薬物以外の予防物質は存在していない。嫌
気性スピロへータ、トレポネマ・ハイオジセンテリアエ
（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ
ｅ）（以下Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅと記す）
は豚の赤痢の主要な病因学的因子であることが認識され
ている。米国特許第４，１００，２７２号は、豚の赤痢
に対する豚の抵抗を増加するために、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓ
ｅｎｔｅｒｉａｅの殺した細胞を含有するワクチンまた
はバクテリン（バクテリアワクチン）の使用を開示して
いる。
この先行技術の方法は、バクテリン生成物の活性が比較
的低いために、商業的に受入れられなかった。記載され
た処置のスケジュールは６回の静脈内注射を含む。より
少ない筋肉内注射を含む処置のスケジュールで使用でき
るバクテリンを得ることは望ましいことである。
的低いために、商業的に受入れられなかった。記載され
た処置のスケジュールは６回の静脈内注射を含む。より
少ない筋肉内注射を含む処置のスケジュールで使用でき
るバクテリンを得ることは望ましいことである。
コレステロールに富んだ分画は、ある有機体のための生
育促進剤として有効であることが知られている。ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．）Ｖｏｌ．１３５、Ｎｏ３、８１８−８２７ページ
（１９７８）は、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Ｍ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマ
イコプラズマ・アルスリチジス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ
ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）の生育におけるコレステロ
ール含有血清分画の使用を記載している。ジャーナル・
オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）は、トレポネマ・ハイオジ
センテリアエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｈｙｏｄｙｓｅｎ
ｔｅｒｉａｅ）、Ｖｏｌ．１１６、５３９−５４３ペー
ジ（１９８０）の生育におけるＵＳＰコレステロールの
使用を記載している。
育促進剤として有効であることが知られている。ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．）Ｖｏｌ．１３５、Ｎｏ３、８１８−８２７ページ
（１９７８）は、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Ｍ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマ
イコプラズマ・アルスリチジス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ
ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）の生育におけるコレステロ
ール含有血清分画の使用を記載している。ジャーナル・
オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）は、トレポネマ・ハイオジ
センテリアエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｈｙｏｄｙｓｅｎ
ｔｅｒｉａｅ）、Ｖｏｌ．１１６、５３９−５４３ペー
ジ（１９８０）の生育におけるＵＳＰコレステロールの
使用を記載している。
本発明によれば、栄養培地がコレステロールに富んだウ
シ分画を含有することを特徴とする得られた細胞をバク
テリン中において引続いて使用するためにトレポネマ・
ハイオジセンテリアエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｈｙｏｄ
ｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）を適当な栄養培地中で生育させ
る方法が提供される。
シ分画を含有することを特徴とする得られた細胞をバク
テリン中において引続いて使用するためにトレポネマ・
ハイオジセンテリアエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｈｙｏｄ
ｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）を適当な栄養培地中で生育させ
る方法が提供される。
本発明の方法は、T.hyodysenteriaeに属する有毒な菌株
を用いて実施することができる。有毒な菌株は典型的な
豚の赤痢の感染を生成することのできる菌株である。例
えば、２つの特定の菌株（Ｂ２０４およびＢ２３４）は
この目的に有効であることがわかった。これらはアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ）に寄託され、そしてＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２１２
（Ｂ２０４）およびＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２８７（Ｂ２
３４）として寄託されている（米国特許第４，１００，
２７２号明細書参照）。
を用いて実施することができる。有毒な菌株は典型的な
豚の赤痢の感染を生成することのできる菌株である。例
えば、２つの特定の菌株（Ｂ２０４およびＢ２３４）は
この目的に有効であることがわかった。これらはアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ）に寄託され、そしてＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２１２
（Ｂ２０４）およびＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２８７（Ｂ２
３４）として寄託されている（米国特許第４，１００，
２７２号明細書参照）。
Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株は、子牛胎児血
清または子羊血清、デキストロース、１−システインＨ
Ｃｌ、ビタミンＢ−１２および酵母エキスを補充したト
リプチック・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ
Ｂｒｏｔｈ）［ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］の混合物からなる培地
中で生育させることができる。本発明の改良は、Ｔ．ｈ
ｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ細胞を生育させるためのこ
のような培地中にコレステロールに富んだウシ分画を含
めることである。コレステロールに富んだウシ企画は前
記培地の容量に基づいて好ましくは１．０〜２．５容量
％の量で存在するが、０．１〜５．０容量％の量で存在
することができる。
清または子羊血清、デキストロース、１−システインＨ
Ｃｌ、ビタミンＢ−１２および酵母エキスを補充したト
リプチック・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ
Ｂｒｏｔｈ）［ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］の混合物からなる培地
中で生育させることができる。本発明の改良は、Ｔ．ｈ
ｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ細胞を生育させるためのこ
のような培地中にコレステロールに富んだウシ分画を含
めることである。コレステロールに富んだウシ企画は前
記培地の容量に基づいて好ましくは１．０〜２．５容量
％の量で存在するが、０．１〜５．０容量％の量で存在
することができる。
本発明の方法における使用に適するコレステロールに富
んだウシ分画はいくつかの源から入手可能である。マイ
ルス・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ｍｉｌ
ｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のマイル
ス・サイエンティフィック・ディヴィジョン（Ｍｉｌｅ
ｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）から入
手可能でありかつ米国特許第４，２９０，７７４号にお
いて開示されかつクレイムされている方法に従ってウシ
血清から調製されたコレステロール・コンセントレイト
・コード（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｅ Ｃｏｄｅ）８２−０１０は有用である。バイオ
セル・ラボラトリーズ（Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）から入手可能であるボビン・コレステロ
ール・コンセントレイト・リスト（Ｂｏｖｉｎｅ Ｃｏ
ｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｌｉｓｔ）３２００は、他の有用
な物質である。本発明の方法において有用な好ましいコ
レステロールに富んだウシ分画は、次の工程： （ａ） 液状のコレステロールを含有するウシの血漿ま
たは血清あるいはその分画をシリカの吸着剤と接触させ
てコレステロールを吸着させ、 （ｂ） 吸着されたコレステロールを残りの液状の血漿
または血清から分離し、 （ｃ） 吸着されたコレステロールを凍結しかつ融解
し、 （ｄ） 吸着されたコレステロールをｐＨ９．０〜１
１．５において溶離し、 （ｅ） 溶離されたコレステロール溶液を限外濾過によ
り濃縮し、 （ｆ） 濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを１１．
０〜１１．４の範囲内の値に調節し、 （ｇ） 濃縮されたコレステロール溶液を順番に炭酸ナ
トリウムおよび水に対して透析し、 （ｈ） 透析したコレステロール溶液を限外濾過により
５０〜３００ｍｇ／ｄｌのコレステロール水準にさらに
濃縮し、 （ｉ） 濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを７．０
〜１１．０の範囲内の値に調節し、 （ｊ） 濃縮されたコレステロール溶液を５０〜１００
℃に３０分〜２４時間加熱し、そして （ｋ） 精製されたコレステロールに富んだウシ分画を
それから回収する、 からなる方法によって調製される。
んだウシ分画はいくつかの源から入手可能である。マイ
ルス・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ｍｉｌ
ｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のマイル
ス・サイエンティフィック・ディヴィジョン（Ｍｉｌｅ
ｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）から入
手可能でありかつ米国特許第４，２９０，７７４号にお
いて開示されかつクレイムされている方法に従ってウシ
血清から調製されたコレステロール・コンセントレイト
・コード（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｅ Ｃｏｄｅ）８２−０１０は有用である。バイオ
セル・ラボラトリーズ（Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）から入手可能であるボビン・コレステロ
ール・コンセントレイト・リスト（Ｂｏｖｉｎｅ Ｃｏ
ｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｌｉｓｔ）３２００は、他の有用
な物質である。本発明の方法において有用な好ましいコ
レステロールに富んだウシ分画は、次の工程： （ａ） 液状のコレステロールを含有するウシの血漿ま
たは血清あるいはその分画をシリカの吸着剤と接触させ
てコレステロールを吸着させ、 （ｂ） 吸着されたコレステロールを残りの液状の血漿
または血清から分離し、 （ｃ） 吸着されたコレステロールを凍結しかつ融解
し、 （ｄ） 吸着されたコレステロールをｐＨ９．０〜１
１．５において溶離し、 （ｅ） 溶離されたコレステロール溶液を限外濾過によ
り濃縮し、 （ｆ） 濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを１１．
０〜１１．４の範囲内の値に調節し、 （ｇ） 濃縮されたコレステロール溶液を順番に炭酸ナ
トリウムおよび水に対して透析し、 （ｈ） 透析したコレステロール溶液を限外濾過により
５０〜３００ｍｇ／ｄｌのコレステロール水準にさらに
濃縮し、 （ｉ） 濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを７．０
〜１１．０の範囲内の値に調節し、 （ｊ） 濃縮されたコレステロール溶液を５０〜１００
℃に３０分〜２４時間加熱し、そして （ｋ） 精製されたコレステロールに富んだウシ分画を
それから回収する、 からなる方法によって調製される。
この特定の分画およびその生産の方法は、本出願人によ
る本願と同時に提出された同時係属米国特許出願第７３
２，８５６号において記載されかつクレイムされてい
る。
る本願と同時に提出された同時係属米国特許出願第７３
２，８５６号において記載されかつクレイムされてい
る。
コレステロールに富んだ分画の生産に使用するための出
発物質は、コレステロールを含有するウシの任意の血漿
または血清またはその分画であることができる。好まし
い出発物質は、ウシ血清である。出発物質が血清である
とき、可溶性塩、例えば、クエン酸ナトリウムを０．２
５〜１．０のイオン強度に添加することが好ましい。他
の適当な塩は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム、硫酸アンモニウムおよび硫酸ナトリウム
を包含する。可溶性塩を上の濃度に添加すると、引続く
シリカ吸着工程において吸着されるコレステロールの量
は増加する。ウシ血漿は、通常、抗強固剤としてクエン
酸塩を添加することを包含する方法により集められる。
この塩の濃度は通常吸着工程のために十分であり、そし
て追加の塩は不必要である。
発物質は、コレステロールを含有するウシの任意の血漿
または血清またはその分画であることができる。好まし
い出発物質は、ウシ血清である。出発物質が血清である
とき、可溶性塩、例えば、クエン酸ナトリウムを０．２
５〜１．０のイオン強度に添加することが好ましい。他
の適当な塩は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム、硫酸アンモニウムおよび硫酸ナトリウム
を包含する。可溶性塩を上の濃度に添加すると、引続く
シリカ吸着工程において吸着されるコレステロールの量
は増加する。ウシ血漿は、通常、抗強固剤としてクエン
酸塩を添加することを包含する方法により集められる。
この塩の濃度は通常吸着工程のために十分であり、そし
て追加の塩は不必要である。
血漿または血清の出発物質を０〜５０℃、好ましくは２
０〜２５℃の温度に維持する。ｐＨは５．５〜９．０、
好ましくは７．０〜８．０の範囲に調節する。
０〜２５℃の温度に維持する。ｐＨは５．５〜９．０、
好ましくは７．０〜８．０の範囲に調節する。
本発明において有用なシリカ吸着剤の組成は臨界的でな
い。適当なシリカ物質はカボット・コーポレーション
（Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から商標カボ
シル（Ｃａｂｏｓｉｌ）で入手可能な極微小シリカおよ
びカリー・カンパニー（Ｃａｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）か
ら商標エーロシル（Ａｅｒｏｓｉｌ）３８０で入手可能
な粉末状シリカである。このシリカは液状の血漿または
血清に１〜５０／１、好ましくは１０〜２０ｇ／１の量
で添加される。
い。適当なシリカ物質はカボット・コーポレーション
（Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から商標カボ
シル（Ｃａｂｏｓｉｌ）で入手可能な極微小シリカおよ
びカリー・カンパニー（Ｃａｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）か
ら商標エーロシル（Ａｅｒｏｓｉｌ）３８０で入手可能
な粉末状シリカである。このシリカは液状の血漿または
血清に１〜５０／１、好ましくは１０〜２０ｇ／１の量
で添加される。
液状の血漿または血清中のシリカの懸濁液は次いで約３
〜４時間混合する。次いで吸着したコレステロールを含
有するシリカを残りの液状の血漿または血清から好まし
くは遠心により分離し、そして液相を廃棄する。次いで
のシリカのペーストを−２０℃で凍結し、そしてこの温
度に少なくとも１週間、好ましくは２週間保持する。次
いで、凍結したペーストを室温（約２０〜２５℃）２４
〜４８時間融解する。融解したペーストから絞り出され
る液体を廃棄する。
〜４時間混合する。次いで吸着したコレステロールを含
有するシリカを残りの液状の血漿または血清から好まし
くは遠心により分離し、そして液相を廃棄する。次いで
のシリカのペーストを−２０℃で凍結し、そしてこの温
度に少なくとも１週間、好ましくは２週間保持する。次
いで、凍結したペーストを室温（約２０〜２５℃）２４
〜４８時間融解する。融解したペーストから絞り出され
る液体を廃棄する。
シリカのペーストを洗浄して存在するかも知れない望ま
しくない蛋白質を除去する。これは約０．１５モルの塩
化ナトリウムを含有する塩水溶液中にペーストを懸濁さ
せることによって達成される。他の有用な塩は酢酸ナト
リウムおよびリン酸ナトリウムである。この塩溶液はペ
ーストの重量の約２倍の量で使用する。ペーストを液体
から分離する。塩溶液を使用するこの洗浄手順は好まし
くは２回反復して吸蔵された蛋白質を除去する。
しくない蛋白質を除去する。これは約０．１５モルの塩
化ナトリウムを含有する塩水溶液中にペーストを懸濁さ
せることによって達成される。他の有用な塩は酢酸ナト
リウムおよびリン酸ナトリウムである。この塩溶液はペ
ーストの重量の約２倍の量で使用する。ペーストを液体
から分離する。塩溶液を使用するこの洗浄手順は好まし
くは２回反復して吸蔵された蛋白質を除去する。
洗浄されたペーストを約２容量の脱イオン水または蒸留
水中に懸濁させ、そしてｐＨを９．０〜１１．５、好ま
しくは１０．４〜１０．６に適当なアルカリ性物質、例
えば、水性水酸化ナトリウムの添加により調節する。こ
の懸濁液を約２時間撹拌し、その間ｐＨを上のアルカリ
性物質の周期的添加により所望水準に維持する。この処
理は所望のコレステロール分画をシリカから溶離する。
次いで、懸濁液を１２〜２４時間、好ましくは１２〜１
８時間沈降させる。コレステロールを含有する上澄み液
をさらに処理するためサイホンで取り出す。所望のコレ
ステロールに富んだ分画の生産のためのこの最初の溶離
のみを使用することが好ましい。しかし、上のアルカリ
性懸濁、溶離、撹拌および沈降の工程を２回以上反復
し、そして第１の溶離物質とともに第２および第３の溶
離からの懸濁液をプールすることが可能である。シリカ
を廃棄する。
水中に懸濁させ、そしてｐＨを９．０〜１１．５、好ま
しくは１０．４〜１０．６に適当なアルカリ性物質、例
えば、水性水酸化ナトリウムの添加により調節する。こ
の懸濁液を約２時間撹拌し、その間ｐＨを上のアルカリ
性物質の周期的添加により所望水準に維持する。この処
理は所望のコレステロール分画をシリカから溶離する。
次いで、懸濁液を１２〜２４時間、好ましくは１２〜１
８時間沈降させる。コレステロールを含有する上澄み液
をさらに処理するためサイホンで取り出す。所望のコレ
ステロールに富んだ分画の生産のためのこの最初の溶離
のみを使用することが好ましい。しかし、上のアルカリ
性懸濁、溶離、撹拌および沈降の工程を２回以上反復
し、そして第１の溶離物質とともに第２および第３の溶
離からの懸濁液をプールすることが可能である。シリカ
を廃棄する。
コレステロール溶液を濾過および遠心により清澄にして
微量のシリカを除去し、次いでその最初の体積の１５〜
５０％、好ましくは２０％に限外濾過技術により濃縮す
る。ｐＨはアルカリの添加により１１．０〜１１．４の
範囲の値、好ましくはｐＨ１１．２に調節する。これは
引続く除去のために存在するかも知れない残留シリカの
可溶化を促進する。
微量のシリカを除去し、次いでその最初の体積の１５〜
５０％、好ましくは２０％に限外濾過技術により濃縮す
る。ｐＨはアルカリの添加により１１．０〜１１．４の
範囲の値、好ましくはｐＨ１１．２に調節する。これは
引続く除去のために存在するかも知れない残留シリカの
可溶化を促進する。
次いで、コレステロールの濃縮物を処理して存在する塩
の実質的にすべてを除去する。好ましい塩の除去技術は
順次に炭酸ナトリウムおよび水に対して透析することで
ある。この塩の除去工程は引続く熱処理工程のためのに
重要である。塩の有意な量の除去は加熱時のコレステロ
ールの望ましくない変性を起こすであろう。
の実質的にすべてを除去する。好ましい塩の除去技術は
順次に炭酸ナトリウムおよび水に対して透析することで
ある。この塩の除去工程は引続く熱処理工程のためのに
重要である。塩の有意な量の除去は加熱時のコレステロ
ールの望ましくない変性を起こすであろう。
透析したコレステロールの溶液を限外濾過により５０〜
３０００ｍｇ／ｄｌ、好ましくは１０００〜２０００ｍ
ｇ／ｄｌのコレステロール水準に濃縮する。
３０００ｍｇ／ｄｌ、好ましくは１０００〜２０００ｍ
ｇ／ｄｌのコレステロール水準に濃縮する。
次いで、濃縮したコレステロールの溶液のｐＨを７．０
〜１１．０の生育、好ましくはｐＨ７．６に調節して、
それを生育倍地中における引続く使用に最も適合するよ
うにさせる。
〜１１．０の生育、好ましくはｐＨ７．６に調節して、
それを生育倍地中における引続く使用に最も適合するよ
うにさせる。
この溶液を５０〜１００℃、好ましくは８０℃に２０分
〜２４時間、好ましくは３０分〜６０分間加熱して、コ
レステロールの貯蔵安定性を増加する。この溶液を室温
に冷却し、そして滅菌濾過して精製されたコレステロー
ルに富んだ分画を回収する。この生産物は純粋なコレス
テロールではなく、それは生産プロセスを通過した少量
の同定されない物質が混合している。
〜２４時間、好ましくは３０分〜６０分間加熱して、コ
レステロールの貯蔵安定性を増加する。この溶液を室温
に冷却し、そして滅菌濾過して精製されたコレステロー
ルに富んだ分画を回収する。この生産物は純粋なコレス
テロールではなく、それは生産プロセスを通過した少量
の同定されない物質が混合している。
純粋なコレステロールは、コレステロールに富んだウシ
分画により達成される方法でＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅ
ｒｉａｅの生育に適切に影響を及ぼさないので、本発明
における使用に不適当である。
分画により達成される方法でＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅ
ｒｉａｅの生育に適切に影響を及ぼさないので、本発明
における使用に不適当である。
Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの細胞は、コレステ
ロールに富んだウシ分画を含有する培地中でこの分野に
おいてよく知られた条件下に生育させる。次いで、得ら
れる細胞をよく知られた方法においてホルマリン、メル
チオレイト（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）またはベーター
プロピオラクトンのような物質を使用して殺す。次い
で、細胞を収穫し、そして適当な担体媒質中に懸濁させ
て所望のバクテリンを生産する。
ロールに富んだウシ分画を含有する培地中でこの分野に
おいてよく知られた条件下に生育させる。次いで、得ら
れる細胞をよく知られた方法においてホルマリン、メル
チオレイト（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）またはベーター
プロピオラクトンのような物質を使用して殺す。次い
で、細胞を収穫し、そして適当な担体媒質中に懸濁させ
て所望のバクテリンを生産する。
バクテリンの活性は、アジュバントの使用によりさらの
増大することができる。本発明の方法により生産される
Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ細胞とともに使用す
るための好ましいアジュバントは、米国特許第３，９１
９，４１１号において開示されかつクレイムされている
ポリアリルサッカリド（ｐｏｌｙａｌｌｙｌ ｓａｃｃ
ｈａｒｉｄｅ）で架橋されたアクリル酸ポリマーと特定
の乳剤系との組み合わせである。このようなアジュバン
トは、商標ＨＡＢＬＯＧＥＮでマイルス・ラボラトリー
ズ・インコーポレーテッド（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のベイベット・ディヴィジョ
ン（Ｂａｙｖｅｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）から市販されて
いる。
増大することができる。本発明の方法により生産される
Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ細胞とともに使用す
るための好ましいアジュバントは、米国特許第３，９１
９，４１１号において開示されかつクレイムされている
ポリアリルサッカリド（ｐｏｌｙａｌｌｙｌ ｓａｃｃ
ｈａｒｉｄｅ）で架橋されたアクリル酸ポリマーと特定
の乳剤系との組み合わせである。このようなアジュバン
トは、商標ＨＡＢＬＯＧＥＮでマイルス・ラボラトリー
ズ・インコーポレーテッド（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のベイベット・ディヴィジョ
ン（Ｂａｙｖｅｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）から市販されて
いる。
上の方法で生産されたＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ
ｅバクテリンは３週間の間隔でわずかに２回の投与で筋
肉内に注射して、豚の赤痢に対する豚の抵抗を有意に増
加することができることが発見された。
ｅバクテリンは３週間の間隔でわずかに２回の投与で筋
肉内に注射して、豚の赤痢に対する豚の抵抗を有意に増
加することができることが発見された。
次の実施例により、本発明をさらに説明する。
実施例１ コレステロールに富んだウシ分画は、次のようにして調
製した。新鮮なウシ血清を２０〜２５℃の温度にし、そ
して１４．７ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム（０．５の血
清イオン強度）を添加した。生ずる溶液を３０分間撹拌
し、そしてｐＨを適当量の１Ｎの水酸化ナトリウムの添
加により７．０とした。微細なシリカを１０ｇ／ｌの量
で添加し、そして生ずるスラリーを室温で３時間撹拌し
た。吸着した物質を含有するシリカを次いで液相から遠
心により分離し、そして液体を廃棄した。シリカのペー
ストを−２０℃で凍結し、そしてその温度で２週間貯蔵
した。次いで、凍結したペーストを室温で４８時間融解
した。絞り出された液体を廃棄した。次いでシリカのペ
ーストを２容量の０．８５％（重量／容量基準）の塩化
ナトリウム水溶液（０．１４６モルのＮａＣｌ）中に懸
濁させた。それを１５分間おだやかに混合し、そして少
なくとも３時間沈降させた。上澄み液をサイホンで除去
し、そして廃棄した。この洗浄工程を２回反復した。次
いで、洗浄したペーストを２容量の脱イオン水中に懸濁
させた。ｐＨを１Ｎの水酸化ナトリウムの添加により１
０．５に調節した。生ずる懸濁液を室温で２時間撹拌
し、その間ｐＨを１０．５に調節した。撹拌を停止し、
そして上澄み液を１８時間沈降させた。上澄み液はサイ
ホンで取り出し、そして濾過および遠心により清澄にし
た。シリカを廃業した。次いで清澄にした溶液を限外濾
過によりその最初の体積の２０％に濃縮した。濃縮した
物質のｐＨは１Ｎの水酸化ナトリウムの添加により１
１．２に調節した。次いで、濃縮した物質のｐＨを６容
量の０．０１モルの炭酸ナトリウムに対してｐＨ１１．
２において透析した。次いで、それを６容積の蒸留水に
対して透析した。この濃縮物のコレステロール水準を既
知の技術により分析し、そしてさらに１０００ｍｇ／ｄ
ｌのコレステロール水準に限外濾過により濃縮した。次
いで、ｐＨを１Ｎの塩酸の添加により７．６に調節し、
そして得られる溶液を８０℃に１時間加熱した。次い
で、この溶液を室温に冷却し、滅菌濾過した。次いで、
濾過した物質を精製したコレステロールに富んだ分画と
して回収した。
製した。新鮮なウシ血清を２０〜２５℃の温度にし、そ
して１４．７ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム（０．５の血
清イオン強度）を添加した。生ずる溶液を３０分間撹拌
し、そしてｐＨを適当量の１Ｎの水酸化ナトリウムの添
加により７．０とした。微細なシリカを１０ｇ／ｌの量
で添加し、そして生ずるスラリーを室温で３時間撹拌し
た。吸着した物質を含有するシリカを次いで液相から遠
心により分離し、そして液体を廃棄した。シリカのペー
ストを−２０℃で凍結し、そしてその温度で２週間貯蔵
した。次いで、凍結したペーストを室温で４８時間融解
した。絞り出された液体を廃棄した。次いでシリカのペ
ーストを２容量の０．８５％（重量／容量基準）の塩化
ナトリウム水溶液（０．１４６モルのＮａＣｌ）中に懸
濁させた。それを１５分間おだやかに混合し、そして少
なくとも３時間沈降させた。上澄み液をサイホンで除去
し、そして廃棄した。この洗浄工程を２回反復した。次
いで、洗浄したペーストを２容量の脱イオン水中に懸濁
させた。ｐＨを１Ｎの水酸化ナトリウムの添加により１
０．５に調節した。生ずる懸濁液を室温で２時間撹拌
し、その間ｐＨを１０．５に調節した。撹拌を停止し、
そして上澄み液を１８時間沈降させた。上澄み液はサイ
ホンで取り出し、そして濾過および遠心により清澄にし
た。シリカを廃業した。次いで清澄にした溶液を限外濾
過によりその最初の体積の２０％に濃縮した。濃縮した
物質のｐＨは１Ｎの水酸化ナトリウムの添加により１
１．２に調節した。次いで、濃縮した物質のｐＨを６容
量の０．０１モルの炭酸ナトリウムに対してｐＨ１１．
２において透析した。次いで、それを６容積の蒸留水に
対して透析した。この濃縮物のコレステロール水準を既
知の技術により分析し、そしてさらに１０００ｍｇ／ｄ
ｌのコレステロール水準に限外濾過により濃縮した。次
いで、ｐＨを１Ｎの塩酸の添加により７．６に調節し、
そして得られる溶液を８０℃に１時間加熱した。次い
で、この溶液を室温に冷却し、滅菌濾過した。次いで、
濾過した物質を精製したコレステロールに富んだ分画と
して回収した。
Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．３１２１２の凍結した種を、１３ｍｌのトリプチッ
ク・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔ
ｈ）［ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２７．５ｇ／ｌ］、１０％の子
牛胎児血清、０．５％デキストロース、０．０５％の１
−システインＨＣ１および０．２５ｍｃｇ／ｍｌのビタ
ミンＢ−１２を含有するガラス管中に接種した。このよ
うな百分率は重量／容量基準に基いた。次いで、ガラス
管をシールし、そして１０容量％の水素、８０容量％の
窒素、１０容量％の二酸化炭素を含有する嫌気性雰囲気
中で３７℃において７２時間インキュベーションした。
次いで、得られる種を同一の培地を含有する２本の管に
移し、それらを３７℃で２４時間同一条件下にインキュ
ベーションした。これらの管の内容物をプールした。次
いで、プールした活性な種培養物の７ｍｌの部分を、各
々が２００ｍｌのトリプチック・ソイ・ブロス・（Ｔｒ
ｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）、１％の酵母エキ
ス、５％の子羊血清、０．５％のデキストロース、０．
５％の１−システインＨＣｌおよび０．２５ｍｃｇ／ｍ
ｌのビタミンＢ−１２を含有する２本の５００ｍｌ容の
びんの各々に添加した。このような百分率は重量／容量
基準に基いた。次いで、びんの内容物を記載する嫌気性
雰囲気中で３７℃において、濁るまで（約２４時間）、
インキュベーションした。
ｏ．３１２１２の凍結した種を、１３ｍｌのトリプチッ
ク・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔ
ｈ）［ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２７．５ｇ／ｌ］、１０％の子
牛胎児血清、０．５％デキストロース、０．０５％の１
−システインＨＣ１および０．２５ｍｃｇ／ｍｌのビタ
ミンＢ−１２を含有するガラス管中に接種した。このよ
うな百分率は重量／容量基準に基いた。次いで、ガラス
管をシールし、そして１０容量％の水素、８０容量％の
窒素、１０容量％の二酸化炭素を含有する嫌気性雰囲気
中で３７℃において７２時間インキュベーションした。
次いで、得られる種を同一の培地を含有する２本の管に
移し、それらを３７℃で２４時間同一条件下にインキュ
ベーションした。これらの管の内容物をプールした。次
いで、プールした活性な種培養物の７ｍｌの部分を、各
々が２００ｍｌのトリプチック・ソイ・ブロス・（Ｔｒ
ｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）、１％の酵母エキ
ス、５％の子羊血清、０．５％のデキストロース、０．
５％の１−システインＨＣｌおよび０．２５ｍｃｇ／ｍ
ｌのビタミンＢ−１２を含有する２本の５００ｍｌ容の
びんの各々に添加した。このような百分率は重量／容量
基準に基いた。次いで、びんの内容物を記載する嫌気性
雰囲気中で３７℃において、濁るまで（約２４時間）、
インキュベーションした。
次いで生ずる膨張した種培養物を２つの部分に分け、そ
して各部分を単独で使用して、各々が７リットルのトリ
プチック・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂ
ｒｏｔｈ）、１％の酵母エキス、３％の子羊血清、１％
のデキストロース、０．０５％の１−システインＨＣｌ
および０．２５ｍｃｇ／ｍｌのビタミンＢ−１２を含有
する２つの１４リットル容のパイロット発酵器の一方に
接種した。このような百分率は重量／容量基準に基い
た。発酵器の一方に２．５容量％の上のように調製した
コレステロールに富んだウシ分画をさらに補充した。次
いで、両者の発酵器を３７℃において４４時間上の嫌気
性雰囲気下にインキュベーションした。ｐＨを５Ｈの水
酸化ナトリウムの周期的添加により６．５に調節した。
して各部分を単独で使用して、各々が７リットルのトリ
プチック・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂ
ｒｏｔｈ）、１％の酵母エキス、３％の子羊血清、１％
のデキストロース、０．０５％の１−システインＨＣｌ
および０．２５ｍｃｇ／ｍｌのビタミンＢ−１２を含有
する２つの１４リットル容のパイロット発酵器の一方に
接種した。このような百分率は重量／容量基準に基い
た。発酵器の一方に２．５容量％の上のように調製した
コレステロールに富んだウシ分画をさらに補充した。次
いで、両者の発酵器を３７℃において４４時間上の嫌気
性雰囲気下にインキュベーションした。ｐＨを５Ｈの水
酸化ナトリウムの周期的添加により６．５に調節した。
上にインキュベーションが完結したとき、適当な試料を
各発酵器から取り、次いで発酵器の内容物を０．１５容
量％のホルマリンで処理して細胞を不活性化した。細胞
の試料を顕微鏡検査し、合計の細胞の係数をペトロッフ
ーハウサー（Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｅｒ）計数室内
で測定し、そして生存しうる細胞の計数を新しく注いだ
５％のウシ血液寒天平板上で系統的に希釈することによ
って決定した。これらの血液寒天平板を３７℃において
５０容量％の水素および５０容量％の二酸化炭素の嫌気
性雰囲気中で４日間インキュベーションした。Ｔ．ｈｙ
ｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのコロニーの溶血の個々のゾ
ーンとして観察した。これらの実験の結果を表１に記載
する。
各発酵器から取り、次いで発酵器の内容物を０．１５容
量％のホルマリンで処理して細胞を不活性化した。細胞
の試料を顕微鏡検査し、合計の細胞の係数をペトロッフ
ーハウサー（Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｅｒ）計数室内
で測定し、そして生存しうる細胞の計数を新しく注いだ
５％のウシ血液寒天平板上で系統的に希釈することによ
って決定した。これらの血液寒天平板を３７℃において
５０容量％の水素および５０容量％の二酸化炭素の嫌気
性雰囲気中で４日間インキュベーションした。Ｔ．ｈｙ
ｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのコロニーの溶血の個々のゾ
ーンとして観察した。これらの実験の結果を表１に記載
する。
上のデータから理解できるように、コレステロールに富
んだウシ分画の存在は合計の細胞の計数を二倍にし、生
存しうる細胞の計数を１００倍増加させ、そして細胞の
形態学に対して陽性の作用を示した。
んだウシ分画の存在は合計の細胞の計数を二倍にし、生
存しうる細胞の計数を１００倍増加させ、そして細胞の
形態学に対して陽性の作用を示した。
実施例２ 次いで、上の実施例１に記載するように調製したＴ．ｈ
ｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２１
２種培養物を使用して、各々が２００ｍｌのトリプチッ
ク・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔ
ｈ）を１％の酵母エキス、５％の子羊血清、０．０５％
の１−システムインＨＣｌおよび０．２５ｍｃｇ／ｍｌ
のビタミンＢ−１２と混合して含有する２本の５００ｍ
ｌ容のびんの各々に接種した。このような百分率は重量
／容量基準に基いた。びんの１つ（対照）は、０．５容
量％の実施例１に記載したようにして調製したコレステ
ロールに富んだウシ分画を含有した。第２のびんは、
０．５容量％のマイルス・ラボラトリーズ・インコーポ
レーテッド（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ．）のコレステロール・コンセントレイト・コー
ド（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ
Ｃｏｄｅ）８２−０１０を含有した。第３のびんは、
２．５容量のバイオセル・ラボラトリーズ（Ｂｉｏｃｅ
ｌｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のボビン・コレステ
ロール・コンセントレイト・リスト（Ｂｏｖｉｎｅ Ｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｌｉｓｔ）３２００を含有し
た。次いで、これらの接種したびんを１０容量％の水
素、８０容量％の窒素、１０容量％の二酸化炭素を含有
する嫌気性雰囲気中で３７℃において３８時間インキュ
ベーションした。びんの内容物を２Ｎ水酸化ナトリウム
の添加によりｐＨ７．０に２時間および３１時間調節し
た。各びんからの合計の細胞の計数をペトロッフーハウ
サー（Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｅｒ）計数室内で測定
した。結果を表２に示す。
ｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２１
２種培養物を使用して、各々が２００ｍｌのトリプチッ
ク・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔ
ｈ）を１％の酵母エキス、５％の子羊血清、０．０５％
の１−システムインＨＣｌおよび０．２５ｍｃｇ／ｍｌ
のビタミンＢ−１２と混合して含有する２本の５００ｍ
ｌ容のびんの各々に接種した。このような百分率は重量
／容量基準に基いた。びんの１つ（対照）は、０．５容
量％の実施例１に記載したようにして調製したコレステ
ロールに富んだウシ分画を含有した。第２のびんは、
０．５容量％のマイルス・ラボラトリーズ・インコーポ
レーテッド（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ．）のコレステロール・コンセントレイト・コー
ド（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ
Ｃｏｄｅ）８２−０１０を含有した。第３のびんは、
２．５容量のバイオセル・ラボラトリーズ（Ｂｉｏｃｅ
ｌｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のボビン・コレステ
ロール・コンセントレイト・リスト（Ｂｏｖｉｎｅ Ｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｌｉｓｔ）３２００を含有し
た。次いで、これらの接種したびんを１０容量％の水
素、８０容量％の窒素、１０容量％の二酸化炭素を含有
する嫌気性雰囲気中で３７℃において３８時間インキュ
ベーションした。びんの内容物を２Ｎ水酸化ナトリウム
の添加によりｐＨ７．０に２時間および３１時間調節し
た。各びんからの合計の細胞の計数をペトロッフーハウ
サー（Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｅｒ）計数室内で測定
した。結果を表２に示す。
上のデータからの理解できるように、種々の源からのコ
レステロールに富んだウシ分画を使用して望ましく高い
細胞計数のＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを生産す
ることができる。
レステロールに富んだウシ分画を使用して望ましく高い
細胞計数のＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを生産す
ることができる。
実施例３ 好ましいコレステロールに富んだ分画を補充した培地と
ともにＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３１２８７を使用して、実施例１の手順を全体
的に反復して、高い濃度の細胞を生産した。
ともにＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３１２８７を使用して、実施例１の手順を全体
的に反復して、高い濃度の細胞を生産した。
実施例４ 実施例１に記載する方法において生育培地中に好ましい
コレステロールに富んだ分画を使用して調製した殺した
Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ細胞と、米国特許第
３，９１９，４１１号に記載する１０容量％のＨＡＢＬ
ＯＧＥＮアジュバントおよび１：１０，０００のメルチ
オレイトと混合することによって、ワクチンまたはバク
テリンを調製した。このワクチンは２×１０９細胞／ｍ
ｌを含有した。次いで、このワクチンを５種類の別々の
対抗（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）研究において使用して、こ
のワクチンの豚の赤痢に対する作用を決定した。ワクチ
ン接種／対抗研究（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｓｔｕｄｉｅ
ｓ）の各々において、豚を豚の赤痢の経歴をもたない群
れから入手し、そしてこれらの豚は雌雄混合のものであ
り、そして一般にヨウクシャー（Ｙｏｒｋｓｈｉｒ
ｅ）、ハンプシャー（Ｈａｍｓｈｉｒｅ）またはクロス
（Ｃｒｏｓｓ）の種であった。最初のワクチン接種の
時、豚は離乳後少なくとも３週間でありかつ体重８８．
９〜１０１．６ｋｇ（３５〜４０ポンド）のものであっ
た。
コレステロールに富んだ分画を使用して調製した殺した
Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ細胞と、米国特許第
３，９１９，４１１号に記載する１０容量％のＨＡＢＬ
ＯＧＥＮアジュバントおよび１：１０，０００のメルチ
オレイトと混合することによって、ワクチンまたはバク
テリンを調製した。このワクチンは２×１０９細胞／ｍ
ｌを含有した。次いで、このワクチンを５種類の別々の
対抗（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）研究において使用して、こ
のワクチンの豚の赤痢に対する作用を決定した。ワクチ
ン接種／対抗研究（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｓｔｕｄｉｅ
ｓ）の各々において、豚を豚の赤痢の経歴をもたない群
れから入手し、そしてこれらの豚は雌雄混合のものであ
り、そして一般にヨウクシャー（Ｙｏｒｋｓｈｉｒ
ｅ）、ハンプシャー（Ｈａｍｓｈｉｒｅ）またはクロス
（Ｃｒｏｓｓ）の種であった。最初のワクチン接種の
時、豚は離乳後少なくとも３週間でありかつ体重８８．
９〜１０１．６ｋｇ（３５〜４０ポンド）のものであっ
た。
すべてのワクチン接種／対抗の研究は、ワクチン接種し
た豚および対照の豚を分離することのできる隔離設備に
おいて実施した。豚に抗生物質を含有しない蛋白質の１
日分の食物の配給量（ｇｒｏｗｅｒ ｎａｔｉｏｎ）を
与えた。対抗前に、豚をレクタル・スワブ（ｒｅｃｔａ
ｌ ｓ ｗ ａｂ）し、そして適当な単離培地上で試験
後、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅおよびサルモネ
ラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種を含有しないことが示さ
れた。
た豚および対照の豚を分離することのできる隔離設備に
おいて実施した。豚に抗生物質を含有しない蛋白質の１
日分の食物の配給量（ｇｒｏｗｅｒ ｎａｔｉｏｎ）を
与えた。対抗前に、豚をレクタル・スワブ（ｒｅｃｔａ
ｌ ｓ ｗ ａｂ）し、そして適当な単離培地上で試験
後、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅおよびサルモネ
ラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種を含有しないことが示さ
れた。
実施例１に類似するが、最終の細胞を殺さないで生育さ
せたＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３１２１２または３１２８７で胃内で豚を対抗さ
せた。対抗投与量は１０８〜１０９の有機体を含有する
ように希釈された１００ｍｌの活性培養物から成ってお
り、これを個々の豚に胃管を経由して４８時間の断食後
に投与した。
せたＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３１２１２または３１２８７で胃内で豚を対抗さ
せた。対抗投与量は１０８〜１０９の有機体を含有する
ように希釈された１００ｍｌの活性培養物から成ってお
り、これを個々の豚に胃管を経由して４８時間の断食後
に投与した。
各対抗した豚を毎日の基準で対抗後２８日の観察期間に
わたって観察した。臨床的病気の開始後、赤痢の豚をレ
クタル・スワブ（ｒｅｃｔａｌｓｗａｂ）して病原因子
を単離した。スワブ（ｓｗａｂ）をスペクチノマイシン
（Ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）血液寒天平板上で継代
培養し、４０℃で４〜６日間インキュベーションし、そ
して溶血の寒天平板をスピロヘータの存在について顕微
鏡検査することによって、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒ
ｉａｅの感染を確認した。５種類の研究の間に死んだ豚
の各々を剖検した。巨視的な病変を記録し、そしてレク
タル・スワブ（ｒｅｃｔａｌ ｓｗａｂ）を結腸から取
り、上のように継代培養した。
わたって観察した。臨床的病気の開始後、赤痢の豚をレ
クタル・スワブ（ｒｅｃｔａｌｓｗａｂ）して病原因子
を単離した。スワブ（ｓｗａｂ）をスペクチノマイシン
（Ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）血液寒天平板上で継代
培養し、４０℃で４〜６日間インキュベーションし、そ
して溶血の寒天平板をスピロヘータの存在について顕微
鏡検査することによって、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒ
ｉａｅの感染を確認した。５種類の研究の間に死んだ豚
の各々を剖検した。巨視的な病変を記録し、そしてレク
タル・スワブ（ｒｅｃｔａｌ ｓｗａｂ）を結腸から取
り、上のように継代培養した。
次の臨床学的指数を使用して、対抗に対する個々の豚の
臨床的応答を測定した： 臨床学的指数 全体の状態 糞便の組成 糞便の稠度 ０−正常 ０−正常 ０−正常 １−下痢 １−粘液 １−柔らかい ２−赤痢 ２−血液およ １．５−ゆる ３−やせた び粘液 い ４−死にかけた ３−血液 ２−流動性 ５−死 ３−水っぽい 種々の分析法を使用して、臨床学的指数を評価し、そし
て下に定義する： ａ） 毎日の臨床学的指数（ＤＣＩ）−各対抗した豚に
ついての毎日の臨床学的指数は、３つの上に記載したパ
ラメーター： ＤＣＩ＝全体の状態＋糞便の組成＋糞便 ｂ） の稠度 毎日の群の臨床学的指数（ＤＧＣＩ）−ワクチン接種し
た群および対照群についての毎日の群の臨床学的指数を
次式に従って計算した： ｃ） 個々の累積臨床学的指数（ＩＣＣＩ）−対抗後２
８日に期間のわたる各豚についての個々の累積臨床学的
指数は、次のようにして計算した： ｄ） 群の累積臨床学的指数（ＧＣＣＩ）−ワクチン接
種した群および対照群についての群の累積臨床学的指数
は、豚の特定の群内でＩＣＣＩを平均することによって
得た： 研究Ｎｏ．１ １０匹の豚を等しく２つに室の中に分割した。５匹のワ
クチン接種した豚に５ｍｌの前述のワクチンを３週の間
隔で２回筋肉投与した。５匹のワクチン接種しない豚を
別な室内に保持した。促進剤投与（ｂｏｏｓｔｅｒ）後
２週に、すべての豚を毒性のＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅ
ｒｉａｅＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２１２で対抗させた。
臨床的応答を測定した： 臨床学的指数 全体の状態 糞便の組成 糞便の稠度 ０−正常 ０−正常 ０−正常 １−下痢 １−粘液 １−柔らかい ２−赤痢 ２−血液およ １．５−ゆる ３−やせた び粘液 い ４−死にかけた ３−血液 ２−流動性 ５−死 ３−水っぽい 種々の分析法を使用して、臨床学的指数を評価し、そし
て下に定義する： ａ） 毎日の臨床学的指数（ＤＣＩ）−各対抗した豚に
ついての毎日の臨床学的指数は、３つの上に記載したパ
ラメーター： ＤＣＩ＝全体の状態＋糞便の組成＋糞便 ｂ） の稠度 毎日の群の臨床学的指数（ＤＧＣＩ）−ワクチン接種し
た群および対照群についての毎日の群の臨床学的指数を
次式に従って計算した： ｃ） 個々の累積臨床学的指数（ＩＣＣＩ）−対抗後２
８日に期間のわたる各豚についての個々の累積臨床学的
指数は、次のようにして計算した： ｄ） 群の累積臨床学的指数（ＧＣＣＩ）−ワクチン接
種した群および対照群についての群の累積臨床学的指数
は、豚の特定の群内でＩＣＣＩを平均することによって
得た： 研究Ｎｏ．１ １０匹の豚を等しく２つに室の中に分割した。５匹のワ
クチン接種した豚に５ｍｌの前述のワクチンを３週の間
隔で２回筋肉投与した。５匹のワクチン接種しない豚を
別な室内に保持した。促進剤投与（ｂｏｏｓｔｅｒ）後
２週に、すべての豚を毒性のＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅ
ｒｉａｅＡＴＣＣ Ｎｏ．３１２１２で対抗させた。
研究Ｎｏ．２ ２９匹の豚を５室の２３匹のワクチン接種した豚および
２室の６匹の対照に分割した。ワクチン接種した豚に５
ｍｌの前述のバクテリンを３週の間隔で２回筋肉内投与
した。対抗は研究Ｎｏ．１に記載するものと同一であっ
た。
２室の６匹の対照に分割した。ワクチン接種した豚に５
ｍｌの前述のバクテリンを３週の間隔で２回筋肉内投与
した。対抗は研究Ｎｏ．１に記載するものと同一であっ
た。
研究Ｎｏ．３ １０匹の豚を等しく２つに室の中に分割した。５匹のワ
クチン接種した豚に５ｍｌの前述のバクテリンを３週の
間隔で２回筋肉内投与した。５匹のワクチン接種しない
豚を別の室内に保持した。促進剤投与後２週に、すべて
の豚を毒性のＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．３１２８７で対抗させた。
クチン接種した豚に５ｍｌの前述のバクテリンを３週の
間隔で２回筋肉内投与した。５匹のワクチン接種しない
豚を別の室内に保持した。促進剤投与後２週に、すべて
の豚を毒性のＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．３１２８７で対抗させた。
研究Ｎｏ．４ ４６匹の豚を９室の３６匹のワクチン接種した豚および
２室の１０匹のワクチン接種しない対照に分割した。ワ
クチン接種した豚に５ｍｌの前述のバクテリンを３週の
間隔で２回筋肉内投与した。対抗は研究Ｎｏ．３に記載
するものと同一であった。
２室の１０匹のワクチン接種しない対照に分割した。ワ
クチン接種した豚に５ｍｌの前述のバクテリンを３週の
間隔で２回筋肉内投与した。対抗は研究Ｎｏ．３に記載
するものと同一であった。
研究Ｎｏ．５ ４６匹の豚を９室の３６匹のワクチン接種した豚および
２室の１０匹のワクチン接種しない対照に分割した。ワ
クチン接種した豚に５ｍｌの前述のバクテリンを３週の
間隔で２回筋肉内投与した。対抗は研究Ｎｏ．１に記載
するものと同一であった。
２室の１０匹のワクチン接種しない対照に分割した。ワ
クチン接種した豚に５ｍｌの前述のバクテリンを３週の
間隔で２回筋肉内投与した。対抗は研究Ｎｏ．１に記載
するものと同一であった。
５種類の研究は合計１０５匹のワクチン接種した豚およ
び３６匹の対照を含んだ。５種類の研究の結果を表３お
よび４に要約する： 菌株ＡＴＣＣ ３１２１２を用いる胃内の対抗後、臨床
学的赤痢はワクチン接種した豚の１７．２％（６４匹の
うち１１匹）および対称の豚の７１．４％（２１匹のう
ち１５匹）において観察された。これはワクチン接種し
た豚のうちの臨床学的赤痢の実際の場合の７５．９％の
減少を表わす。対抗後の２８日の観測の全期間について
計算した累積臨床学的指数（ＧＣＣＩ）はワクチン接種
した豚について１０．４であり、これに対してワクチン
接種しない豚について８３．２であった。これは臨床学
的指数により測定して合計の臨床学的症候（下痢、赤
痢、やせること、死）の８７．５％の減少を表わす。死
はワクチン接種した豚において観察されず、こに対して
２１匹の対称のうち５匹は対抗後に死んだ（２３．８
％）。臨床学的赤痢の開始はワクチン接種した豚におい
て遅延され、そして臨床学的病気の期間は減少した。無
食欲は認められるようにワクチン接種した豚において減
少した。
び３６匹の対照を含んだ。５種類の研究の結果を表３お
よび４に要約する： 菌株ＡＴＣＣ ３１２１２を用いる胃内の対抗後、臨床
学的赤痢はワクチン接種した豚の１７．２％（６４匹の
うち１１匹）および対称の豚の７１．４％（２１匹のう
ち１５匹）において観察された。これはワクチン接種し
た豚のうちの臨床学的赤痢の実際の場合の７５．９％の
減少を表わす。対抗後の２８日の観測の全期間について
計算した累積臨床学的指数（ＧＣＣＩ）はワクチン接種
した豚について１０．４であり、これに対してワクチン
接種しない豚について８３．２であった。これは臨床学
的指数により測定して合計の臨床学的症候（下痢、赤
痢、やせること、死）の８７．５％の減少を表わす。死
はワクチン接種した豚において観察されず、こに対して
２１匹の対称のうち５匹は対抗後に死んだ（２３．８
％）。臨床学的赤痢の開始はワクチン接種した豚におい
て遅延され、そして臨床学的病気の期間は減少した。無
食欲は認められるようにワクチン接種した豚において減
少した。
菌株ＡＴＣＣ ３１２８７を用いる胃内の対抗後、臨床
学的赤痢はワクチン接種した豚の３５．４％（４１匹の
うち１４匹、１匹の豚±）および対称の豚の７０．０％
（１５匹のうち１０匹、１匹の豚±）において観察され
た。これはワクチン接種した豚のうちの臨床学的赤痢の
実際の場合の４９．４％の減少を表わす。累積臨床学的
指数（ＧＣＣＩ）はワクチン接種した豚について１８．
６であり、これに対してワクチン接種したしない豚につ
いて７３．５であった。これは合計の臨床学的症候の７
４．７％の減少を表わす。死はワクチン接種した豚にお
いて観察されず、こに対して１５匹の対称のうち２匹は
対抗後に死んだ（１３．３％）。臨床学的赤痢の開始は
ワクチン接種した豚において有意に遅延され、そして臨
床学的病気の期間は減少した。
学的赤痢はワクチン接種した豚の３５．４％（４１匹の
うち１４匹、１匹の豚±）および対称の豚の７０．０％
（１５匹のうち１０匹、１匹の豚±）において観察され
た。これはワクチン接種した豚のうちの臨床学的赤痢の
実際の場合の４９．４％の減少を表わす。累積臨床学的
指数（ＧＣＣＩ）はワクチン接種した豚について１８．
６であり、これに対してワクチン接種したしない豚につ
いて７３．５であった。これは合計の臨床学的症候の７
４．７％の減少を表わす。死はワクチン接種した豚にお
いて観察されず、こに対して１５匹の対称のうち２匹は
対抗後に死んだ（１３．３％）。臨床学的赤痢の開始は
ワクチン接種した豚において有意に遅延され、そして臨
床学的病気の期間は減少した。
臨床学的赤痢の病原性因子としてＴ．ｈｙｏｄｙｓｅｎ
ｔｅｒｉａｅの確認は、スペクチノマイシン血液寒天平
板上のレクタル・スワブ（ｒｅｃｔａｌ ｓｗａｂ）の
平板培養後に、すべての場合において達成された。サル
モネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種の選択的培地上の同
時の平板培養は陰性の結果を与えた。
ｔｅｒｉａｅの確認は、スペクチノマイシン血液寒天平
板上のレクタル・スワブ（ｒｅｃｔａｌ ｓｗａｂ）の
平板培養後に、すべての場合において達成された。サル
モネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種の選択的培地上の同
時の平板培養は陰性の結果を与えた。
死んだ豚の結腸の内容物は血液を含みかつ水っぽく、そ
して結腸自体は総体的に炎症しかつ絨毛を欠いていた。
剖検時に内壁から取ったレクタル・スワブ（ｒｅｃｔａ
ｌ ｓｗａｂ）は、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ
について陽性でありかつサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ）種について陰性であった。対抗後２８日に保護し
たワクチン接種した豚から取ったレクタル・スワブ（ｒ
ｅｃｔａｌ ｓｗａｂ）は、スペクチノマイシン血液寒
天平板上で４２℃において継代培養後、すべての場合に
おいて陰性であった。
して結腸自体は総体的に炎症しかつ絨毛を欠いていた。
剖検時に内壁から取ったレクタル・スワブ（ｒｅｃｔａ
ｌ ｓｗａｂ）は、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ
について陽性でありかつサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ）種について陰性であった。対抗後２８日に保護し
たワクチン接種した豚から取ったレクタル・スワブ（ｒ
ｅｃｔａｌ ｓｗａｂ）は、スペクチノマイシン血液寒
天平板上で４２℃において継代培養後、すべての場合に
おいて陰性であった。
すべての１４１匹のワクチン接種した豚および対照の豚
を考慮すると、５種類の対抗研究を通して臨床学的応答
の要約する表５を構成することができる。１０５匹のワ
クチン接種した豚のうち２５．５匹は臨床学的赤痢を発
現し（２４．３％）、これに対して３６匹のワクチン接
種しない豚のうち２５．５匹は臨床学的赤痢を発現した
（７０．８％）。これはすべてのワクチン接種した豚の
うちの臨床学的赤痢の６５．７％の減少を表わす。３６
匹の対照の豚の７匹は対抗後に死に（１９．４％）、こ
れに対してワクチン接種した豚は死ななかった。すべて
の１０５匹のワクチン接種した豚についての群の累積臨
床学的指数は１３．６であり、そして３６匹のワクチン
接種しない豚についてＧＣＣＩは７９．２であった。こ
れはすべてのワクチン接種した豚のうちの合計の臨床学
的症候（下痢、赤痢、やせること、死）の８２．８％の
減少を表わす。
を考慮すると、５種類の対抗研究を通して臨床学的応答
の要約する表５を構成することができる。１０５匹のワ
クチン接種した豚のうち２５．５匹は臨床学的赤痢を発
現し（２４．３％）、これに対して３６匹のワクチン接
種しない豚のうち２５．５匹は臨床学的赤痢を発現した
（７０．８％）。これはすべてのワクチン接種した豚の
うちの臨床学的赤痢の６５．７％の減少を表わす。３６
匹の対照の豚の７匹は対抗後に死に（１９．４％）、こ
れに対してワクチン接種した豚は死ななかった。すべて
の１０５匹のワクチン接種した豚についての群の累積臨
床学的指数は１３．６であり、そして３６匹のワクチン
接種しない豚についてＧＣＣＩは７９．２であった。こ
れはすべてのワクチン接種した豚のうちの合計の臨床学
的症候（下痢、赤痢、やせること、死）の８２．８％の
減少を表わす。
５種類の個々の研究からのワクチン接種／対抗の結果を
考慮すると、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅバクテ
リンは、豚の赤痢の予防の条件下で表面するとき、明確
な効能の程度を示であろうと結論することができる。
考慮すると、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅバクテ
リンは、豚の赤痢の予防の条件下で表面するとき、明確
な効能の程度を示であろうと結論することができる。
Claims (5)
- 【請求項１】細胞をバクテリンで引続き使用するために
トレポネマ・ハイオジセンテリアエ(Treponema hyodyse
nteriae)を適当な栄養培地で生育させる方法において、 前記栄養培地が、次の工程 （ａ）液状のコレステロールを含有するウシの血漿また
は血清あるいはその分画をシリカの吸着剤と接触させて
コレステロールを吸着させ、 （ｂ）吸着されたコレステロールを残りの液状の血漿ま
たは血清から分離し、 （ｃ）吸着されたコレステロールを凍結しかつ融解し、 （ｄ）吸着されたコレステロールをpH９．０〜１１．５
において溶離し、 （ｅ）溶離されたコレステロール溶液を限外濾過により
濃縮し、 （ｅ）濃縮されたコレステロール溶液のpHを１１．０〜
１１．４の範囲内の値に調節し、 （ｇ）濃縮されたコレステロール溶液を順番に炭酸ナト
リウムおよび水に対して透析し、 （ｈ）透析したコレステロール溶液を限外濾過により５
０〜３００ｍｇ／ｄｌのコレステロール水準にさらに濃
縮し、 (i)濃縮されたコレステロール溶液のpHを７．０〜１
１．０の範囲内の値に調節し、 （ｊ）濃縮されたコレステロール溶液を５０〜１００℃
に３０分〜２４時間加熱し、そして （ｋ）精製されたコレステロールに富んだウシ分画をそ
れから回収すること、 からなる方法によって調製されたコレステロールに富ん
だウシ分画を含むことを特徴とする前記方法。 - 【請求項２】栄養培地が０．１〜５．０容量％の前記コ
レステロールに富んだウシ分画を含有する特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】栄養培地が１〜２．５容量％の前記コレス
テロールに富んだウシ分画を含有する特許請求の範囲第
２項記載の方法。 - 【請求項４】栄養培地が２．５容量％の前記コレステロ
ールに富んだウシ分画を含有する特許請求の範囲第３項
記載の方法。 - 【請求項５】栄養培地が１〜２．５容量％のコレステロ
ールに富んだウシ分画を含有し、前記コレステロールに
富んだウシ分画が、次の工程： （ａ）液状のコレステロールを含有するウシの血漿また
は血清あるいはその分画をシリカの吸着剤と接触させて
コレステロールを吸着させ、 （ｂ）吸着されたコレステロールを残りの液状の血漿ま
たは血清から分離し、 （ｃ）吸着されたコレステロールを凍結しかつ融解し、 （ｄ）吸着されたコレステロールをpH１０．４〜１０．
６において溶離し、 （ｅ）溶離されたコレステロール溶液を限外濾過により
出発容量の１５〜５０％の容量に濃縮し、 （ｅ）濃縮されたコレステロール溶液のpHを１１．２の
値に調節し、 （ｇ）濃縮されたコレステロール溶液を順番に炭酸ナト
リウムおよび水に対して透析し、 （ｈ）透析したコレステロール溶液を限外濾過により１
０００〜２０００ｍｇ／ｄｌのコレステロール水準にさ
らに濃縮し、 （ｉ）濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを７．６の
値に調節し、 （ｊ）濃縮されたコレステロール溶液を８０℃に３０分
〜６０分間加熱し、そして （ｋ）精製されたコレステロールに富んだウシ分画をそ
れから回収すること、 からなる方法によって調製される特許請求の範囲第３項
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US73287285A | 1985-05-10 | 1985-05-10 | |
| US732872 | 1991-07-19 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5203727A Division JPH08785B2 (ja) | 1985-05-10 | 1993-07-27 | トレポネマ・ハイオジセンテリアエのバクテリン |
Publications (2)
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|---|---|
| JPS6211090A JPS6211090A (ja) | 1987-01-20 |
| JPH069505B2 true JPH069505B2 (ja) | 1994-02-09 |
Family
ID=24945290
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61105004A Expired - Lifetime JPH069505B2 (ja) | 1985-05-10 | 1986-05-09 | トレポネマ・ハイオジセンテリアエの生育方法 |
| JP5203727A Expired - Lifetime JPH08785B2 (ja) | 1985-05-10 | 1993-07-27 | トレポネマ・ハイオジセンテリアエのバクテリン |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5203727A Expired - Lifetime JPH08785B2 (ja) | 1985-05-10 | 1993-07-27 | トレポネマ・ハイオジセンテリアエのバクテリン |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (2) | JPH069505B2 (ja) |
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| AT (1) | ATE74159T1 (ja) |
| BR (1) | BR8602091A (ja) |
| CA (1) | CA1279277C (ja) |
| DE (1) | DE3684503D1 (ja) |
| DK (1) | DK217486A (ja) |
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| GR (1) | GR861135B (ja) |
| HU (1) | HU201114B (ja) |
| PL (1) | PL156487B1 (ja) |
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| US9149693B2 (en) | 2009-01-20 | 2015-10-06 | Nike, Inc. | Golf club and golf club head structures |
| US9192831B2 (en) | 2009-01-20 | 2015-11-24 | Nike, Inc. | Golf club and golf club head structures |
| US9089747B2 (en) | 2010-11-30 | 2015-07-28 | Nike, Inc. | Golf club heads or other ball striking devices having distributed impact response |
| US9101808B2 (en) | 2011-01-27 | 2015-08-11 | Nike, Inc. | Golf club head or other ball striking device having impact-influencing body features |
| US9409073B2 (en) | 2011-04-28 | 2016-08-09 | Nike, Inc. | Golf clubs and golf club heads |
| US9433845B2 (en) | 2011-04-28 | 2016-09-06 | Nike, Inc. | Golf clubs and golf club heads |
| US9375624B2 (en) | 2011-04-28 | 2016-06-28 | Nike, Inc. | Golf clubs and golf club heads |
| US9433844B2 (en) | 2011-04-28 | 2016-09-06 | Nike, Inc. | Golf clubs and golf club heads |
| US8956238B2 (en) | 2011-04-28 | 2015-02-17 | Nike, Inc. | Golf clubs and golf club heads |
| WO2013028889A1 (en) | 2011-08-23 | 2013-02-28 | Nike International Ltd. | Golf club head with a void |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| GB8405530D0 (en) * | 1984-03-02 | 1984-04-04 | Lysons R J | Vaccine for swine dysentery |
| ATE74159T1 (de) * | 1985-05-10 | 1992-04-15 | Mobay Corp | Treponema hyodysenteriae-bacterin und verfahren fuer dieses. |
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-
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|---|
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