HU201114B

HU201114B - Process for producing treponema hyodysenteriane bacterin

Info

Publication number: HU201114B
Application number: HU861935A
Authority: HU
Inventors: E Richard Parizek
Original assignee: Mobay Chemical Corp
Priority date: 1985-05-10
Filing date: 1986-05-09
Publication date: 1990-09-28
Also published as: GR861135B; HUT44072A; PL156487B1; CA1279277C; JPH069505B2; EP0201796B1; KR860009121A; DE3684503D1; JPH08785B2; DK217486A; JPH06293662A; JPS6211090A; KR940004541B1; ZA863451B; EP0201796A3; BR8602091A; ATE74159T1; DK217486D0; EP0201796A2; ES8706817A1

Description

A találmány tárgya eljárás Treponema hyodysenteriae szaporítására megfelelő táptalajon, majd az így kapott sejtek bakterinben történő alkalmazására, aminek során a táptalajban szarvasmarhából származó, koleszterinben 5 gazdag frakciót alkalmazunk.

A sertések vérhasmegbetegedése (sertés-dizentéria) súlyos, nyálkahártya vérzéssel járó hasmenés, amely elsősorban elválasztás után sújtja a malacokat. E betegség meg- 10 szüntetését általában kemoterápiás szerek és antibiotikumok alkalmazásával érték el; mindeddig azonban nem találtak hatásos, nem-vegyszeres (nem-gyógyszeres) kezelést a betegség megelőzésére. A Treponema hyody- 15 senteriae anaerob spirochéta a sertés-dizentéria elsődleges kórokozója. A 4 100 272 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti olyan vakcina vagy bakterin alkalmazását, amely elölt T. hyodysenteriae 20 sejteket tartalmaz, s amelynek segítségével a sertéseknek dizentériával szembeni ellenállóképessége növelhető.

Ez a megoldás nem terjedt el széles körben, mert az igy kapott bakterin-termék 25 aktivitása viszonylag alacsony. Az ismertetett kezelési eljárás hat intravénás befecskendezésből áll. Kívánatos tehát olyan bakterin előállítása, amely kevesebb intramuszkuláris befecskendezést igényel kezelési eljárásként. 30

Ismert, hogy koleszterinben gazdag frakciók felhasználhatók egyes mikroorganizmusok szaporodásának az előmozdítására.

A J. Bacteriol. 135, 818 (1978) helyen leírják koleszterinben gazdag frakciók alkalmazását 35 Mycoplasma pneumoniae és Mycoplasma arthritidis szaporodásának az elősegítésére. A J. Gén. Microbiology 116, 539 (1980) helyen leírják az Egyesült Államok Gyógyszerkönyve szerinti koleszterin alkalmazását T. hyody- 40 senteriae szaporítására.

Mindeddig nem javasolták koleszterinben gazdag, szarvasmarhából származó frakciók konkrét alkalmazását T. hyodysenteriae sejtek hozamának a növelésére azzal a céllal, 45 hogy ezeket a sejteket sertés-dizentéria leküzdésére alkalmas bakterinbe foglalják.

A találmány szerinti eljárást bármilyen virulens T. hyodysenteriae törzzsel megvalósíthatjuk. Virulens az a törzs, amely típusos 50 sertés-dizentéria-fertózés előidézésére képes.

E célra két különleges törzset (a B204 és B234 törzset) találtunk alkalmasnak; e törzseket az .American Type Culture Collection' gyűjteményben helyeztük el, ahol az ATCC 55 No. 31212 (B204) és az ATCC No. 31287 (B234) sorszámot kapták.

A T. hyodysenteriae törzs olyan táptalajokon szaporítható, amelyek magzati borjúszérummal vagy magzati bárányszérummal, 60 glükóz, L-cisztein-hidrokloriddal, B12 vitaminnal és élesztőkivonattal kiegészített triptikus szójaleveskeveréket (Difco Laboratories) tartalmaznak. A találmány szerinti tökéletesítés abban áll, hogy ezekben a táptala- 65 jókban a T. hyodysenteriae sejtek szaporítása céljából koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót alkalmazunk. A koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakció előnyösen 1,0-2,5 térf.% mennyiségben van jelen a táptalaj térfogatára vonatkoztatva, azonban 0,1-5,0 térf.% mennyiségben is alkalmazható.

A találmány szerinti eljárás végrehajtására alkalmas, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciók számos forrásból beszerezhetők. A Code 82-010 jelzésű koleszterin-koncentrátum beszerezhető a Miles Scientific Division of Miles Laboratories-tól, és szarvasmarha-szérumból állítható elő a 4 290 774 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt és igényelt eljárással. Alkalmas termék továbbá a Biocell Laboratories cégtől beszerezhető List 3200 jelű, szarvasmarhából származó koleszterin-koncentrátum. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható, előnyös, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót az alábbi lépésekből álló eljárással állítjuk elő:

(a) folyékony, koleszterint tartalmazó szarvasmarha-plazmát vagy -szérumot vagy azok frakcióját kovasavas adszorbenssel hozzuk érintkezésbe, és a koleszterint adszorbeéljuk;

(b) az adszorbeált koleszterint a folyékony plazma vagy szérum többi részétől elkülönítjük;

(c) az adszorbeált koleszterint kifagyasztjuk és felengedni hagyjuk;

(d) az adszorbeált koleszterint 9,0-11,5 pH-érték mellett eluáljuk;

(e) az eiuált koleszterinoldatot ultraszűréssel töményitjük;

(f) a tömény koleszterinoldat pH-értékét 11,0-11,4-re állítjuk;

(g) a tömény koleszterinoldatot nátrium-karbonáttal, majd vizzel szemben dializáljuk;

(h) a dializált koleszterinoldatot ultraszűréssel 0,5-30 mg/ml koncentrációig tovább töményitjük;

(i) a tömény koleszterinoldat pH-értékét 7,0-11,0-ra állítjuk;

(j) a tömény koleszterinoldatot 30 perctől 24 óráig terjedő időtartammal 50-100 °C hőmérsékleten melegítjük; és (k) a tisztított, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót elkülönítjük.

Ezt a specifikus frakciót és előállítási eljárást leírjuk és igényeljük az e bejelentéssel egyidőben ugyanazon bejelentő által benyújtott, 732 856 alapszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben.

A koleszterinben gazdag frakció előállítására kiinduló anyagként bármilyen szarvasmarha-vérplazma vagy -szérum vagy annak frakciója alkalmazható, amely koleszterint tartalmaz. Előnyösen alkalmazható kiinduló anyag a szarvasmarha-szérum. Ha a kiinduló anyag szérum, akkor előnyös egy oldható só, például nétrium-citrát hozzáadása

HU 201114 Β amíg az oldat ionerőssége a 0,25-1,0 értéket eléri. E célra más sókat, például nátrium-kloridot, nátrium-foszfátot, kálium-foszfátot, ammónium-szulfátot vagy nátrium-szulfátot is alkalmazhatunk. Az oldható só fenti koncentrációban való hozzáadása növeli a következő lépésben a kovasavon adszorbeált koleszterin mennyiségét. A szarvasmarha-plazmát általában olyan módszerrel gyűjtjük, aminek során antikoagulánsként citrátot adunk hozzá. Az így elért sókoncentráció általában elegendő az adszorpciós lépésben, és további só hozzáadása szükségtelen.

A kiinduló anyagként alkalmazott plazmát vagy szérumot 0-50 °C, elónyösen 20-25 °C hőmérsékleten tartjuk; pH-értékét 5,5-9,0-ra, előnyösen 7,0-8,0-ra állítjuk be.

Az eljárás során alkalmazható kovasav-adszorbens összetétele nem kritikus. E célra alkalmas kovasav a Cabot Corporation cégtől Cabosil márkanéven beszerezhető, mikrofinomságú kovasav és a Cary Company cégtől Aerosil 380 márkanéven beszerezhető, por alakú kovasav. A kovasavat 2-50 g/liter, elónyösen 10-20 g/liter mennyiségben adjuk a folyékony plazmához vagy szérumhoz.

Ezt követően a folyékony plazmával vagy szérummal kapott kovasav-szuszpenziót körülbelül 3-4 órán át keverjük, majd az adszorbeált koleszterint tartalmazó kovasavat a folyékony plazma vagy szérum többi részétől előnyösen centrifugálással elkülönítjük, és a folyadékfázist elöntjük. Ezután a kovasavpasztét -20 °C-ra hűtjük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk legalább egy, előnyösen két hétig. A fagyasztott pasztát ezután 24-48 órán át szobahőmérsékleten (körülbelül 20-25 °C hőmérsékleten) felengedni hagyjuk, és a fölengedett pasztából kipréselt folyadékot elöntjük.

Az így kapott kovasavpasztát a nemkivént fehérjék eltávolítása céljából mossuk. Ezt úgy végezzük, hogy a pasztát mintegy 0,15 mól/liter nátrium-kloridot tartalmazó, vizes sóoldatban szuszpendáljuk; e helyen nátrium-acetátot vagy nátrium-foszfátot is alkalmazhatunk. A sóoldatot a paszta tömegére vonatkoztatva körülbelül kétszeres menynyiségben alkalmazzuk. A pasztát a folyadéktól elválasztjuk. Ezt a sóoldatos mosási műveletet elónyösen kétszer ismételjük az okkludált fehérjék eltávolítása céljából.

A mosott pasztát körülbelül kétszeres térfogatú, ionmentesitett vagy desztillált vízben szuszpendáljuk, és a pH-értéket 9,5-11,5 közé, előnyösen 10,4-10,6 közé állítjuk be megfelelő bázisos anyag, például vizes nátronlúg hozzáadásával. A szuszpenziót körülbelül 2 órán át keverjük, ez alatt a pH-értékét a fenti bázisos anyag időnkénti hozzáadásával a kívánt szinten tartjuk. Ez a kezelés a kívánt koleszterinfrakciót a kovasavról eluálja. A szuszpenziőt ezután 12-24 órán ét, előnyösen 12-18 órán át ülepedni hagyjuk. A koleszterint tartalmazó felülúszót Ιοί vábbi kezelés céljából leszifonozzuk (lehébérezzük). Előnyösen úgy járunk el, hogy csak az első eluálás termékét alkalmazzuk a kivént, koleszterinben gazdag frakció előállítására. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a fenti alkalikus szuszpendálást, eluálást, keverést és ülepitést két vagy több alkalommal ismételjük, és a második és harmadik eluálásból származó felülúszót az első eluélásból származó termékkel egyesítjük. Ezután a kovasavat elvetjük.

A koieszterinoldatot szűréssel, majd centrifugálással mentesítjük a kovasav nyomaitól, majd ultraszűrési eljárással eredeti térfogaténak 15-50 százalékára, előnyösen 20 százalékára koncentráljuk. A pH-t 11,0-11,4, elónyösen 11,2 értékre állítjuk be alkalikus szer hozzáadásával. Ez az eljárás elősegíti minden visszamaradt kovasav szolubilizálását és ezt követő eltávolítását.

A koleszLerin-koncentrátumot ezután olyan módon kezeljük, hogy lényegében valamennyi jelenlévő sót eltávolítsuk. A sók eltávolításának előnyös módszere abban áll, hogy először nátrium-karbonáttal, majd vízzel szemben dialízist végzünk. A só eltávolításénak lépése lényeges az ezután következő hőkezelő lépés szempontjából. Ha só marad jelen jelentős mennyiségben, akkor hevítés során a koleszterin nemkivánt denaturálása következik be.

A dialízált koleszterinoldatot ultraszűréssel tovább koncentráljuk 0,5-30 mg/ml, előnyösen 10-20 mg/ml koleszterin-koncentrációig.

Ezután a koncentrált koleszterinoldat pH-értékét 7,0-11,0-ra, előnyösen 7,6-ra állítjuk be, hogy a szaporító táptalajban való felhasználásra a lehető legalkalmasabbá tegyük.

Az oldatot 30 perctől 24 óráig terjedő időtartamon át, elónyösen 30-60 percig 50-100 °C, előnyösen 80 °C hőmérsékleten melegítjük a koleszterin tárolási stabilitásának növelése céljából. Ezután az oldatot szobahőmérsékletre hűtjük, és sterilre szűrjük; így tisztított, koleszterinben gazdag frakciót kapunk. Ez a termék nem tiszta koleszterin, hanem azonosítatlan anyagok csekély mennyiségét tartalmazza, amelyek a gyártási folyamaton át kísérik.

A tiszta koleszterin a találmány szerinti eljárásban nem alkalmazható, mert nem fejt ki lényeges hatást a T. hyodysenteriae szaporodására olyan módon, mint ahogyan ez koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakció segítségével elérhető.

A koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót tartalmazó táptalajokon a T. hyodysenteriae sejtek a tapasztalt szakember számára jól ismert körülmények között szaporíthatok. Az így kapott sejteket azután közismert módon elöljük, például formaiin, mertiolát vagy béta-propiolakton alkalmazásával. Ezt kővetően a sejteket összegyűjtjük, és

HU 201114 Β megfelelő vivőközegben szuszpendáljuk a kívánt bakterin előállítása céljából.

A bakterin hatékonyságát adjuváns alkalmazásával tovább növelhetjük. A találmány szerinti eljárással előállított T. hyodysenteriae sejtekhez előnyösen alkalmazható adjuváns egy poliallil-szacchariddal térhálósított akrilsav-polimer kombináció és egy speciális emulziós rendszer, amelyet a 3 919 411 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás közöl és igényel. Ilyen adjuvánst Havlogen márkanéven hoz forgalomba a Bayvet Division of Miles Laboratories cég.

Úgy találtuk, hogy a fenti módon előállított T. hyodysenteriae bakterint intramuszkulárisan mindössze két intramuszkuláris dózisban, háromhetes időközökkel befecskendezhetjük, s igy a malacoknak sertés-dizentériával szemben mutatott ellenállása jelentős mértékben növelhető.

A találmányt az alábbi példákban nemkorlátozó jelleggel részletesen ismertetjük.

1. példa

Koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót állítunk elő az alábbi módon.

Friss szarvasmarha-szérumot 20-25 °C hőmérsékleten tartunk, és 14,7 g/liter nátrium-citrétot adunk hozzá (így a szérum ionerőssége 0,5-re áll be). Az így kapott oldatot 30 percig keverjük, és a pH értékét 7,0-ra állítjuk 1 n nátronlúg megfelelő mennyiségének a hozzáadásával. A keverékhez finom eloszlású kovasavat adunk 10 g/liter mennyiségben, és az igy kapott pépet 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az adszorbeált anyagot tartalmazó kovasavat a folyadékfázistól centrifugálással elkülönítjük, és a folyadékot elöntjük. A kovasavpasztát ezután -20 °C-ra fagyasztjuk, és 2 héten át e hőmérsékleten tartjuk. Utána a fagyasztott pasztát szobahőmérsékleten 48 órán át felengedni hagyjuk, és a kipréselt folyadékot elöntjük. Ekkor a kovasavpasztát kétszeres térfogatú, (tömeg/térf.-ra vonatkoztatva) 0,85%-os vizes, 0,146 mólos nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk, majd 15 percig enyhén keverjük, és utána legalább 3 órán át ülepedni hagyjuk. A felülúszó folyadékot leszifonozzuk, és elöntjük. Ezt a mosási műveletet kétszer ismételjük, majd a kimosott pasztát kétszeres térfogatú, ionmentesitett vízben szuszpendáljuk, és pH-értékét 1 n nátronlúg hozzáadásával 10,5-re állítjuk. Az így kapott szuszpenziót szobahőmérsékleten 2 órán át keverjük, s közben a pH értékét mindig 10,5-re szabályozzuk. A keverés leállítása után a szuszpenziőt 18 órán át ülepedni hagyjuk, majd a felülúszót szifonnal eltávolítjuk, és szűréssel és centrifugálással tisztítjuk. A kovasavat elvetjük. A derített oldatot ezután ultraszűréssel eredeti térfogatának 20%-éra töményítjük. A koncentrált pH értékét 1 n nátronlúg hozzáadásával 11,2-re állítjuk, és utána a koncentrált anyagot hatszoros térfogatú 0,01 mólos nátrium-karbonát oldattal szemben 11,2 pH-értéken dializáljuk. Ezt követően hatszoros térfogatú, ionmentesitett vízzel szemben dializáljuk. A koncentrátum koleszterin-koncentrációját ismert módszerrel megállapítjuk, majd ultraszűréssel 10 mg/ml koleszterin-koncentrációig töményitjűk. Ezután a pH értékét 1 n sósav hozzáadásával 7,6-ra állítjuk, és az így kapott oldatot 80 °C hőmérsékleten 1 órán át melegítjük. Ezután az oldatot szobahőmérsékletre hűtjük, és sterilre szűrjük. A szűrt anyagot tisztított, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakcióként kapjuk.

Fagyasztott T. hyodysenteriae ATCC No. 31212 törzsoltóanyagot oltunk olyan üvegcsövekbe, amelyek 13 ml triptikus szójalevest (Difco Laboratories, 27,5 g/liter), 10% magzati borjúszérumot, 0,5% glükózt, 0,05% L-cisztein-hidrokloridot és 0,25 pg/ml B12 vitamint tartalmaznak. Ezután a csöveket lezárjuk, és 10 térfogatszázalék hidrogént, 80 térfogatszázalék nitrogént és 10 térfogatszázalék szén-dioxidot tartalmazó anaerob atmoszférában 37 °C hőmérsékleten 72 órán át inkubáljuk. Az igy kapott tenyészetet ezután két csőbe visszük ót, amelyek ugyanilyen táptalajt tartalmaznak, és 37 °C-on inkubáljuk 24 órán át ugyanilyen körülmények között. A csövek tartalmát összegyűjtjük. E gyűjtött, aktív tenyészet 7 ml-es részletét 500 ml térfogatú edényekbe adjuk, amelyek mindegyike 200 ml triptikus szójalevest, 1% élesztőkivonatot, 5% bórányszérumot, 0,5 % glükózt, 0,05% L-cisztein-hidrokloridot és 0,25 ng/ml B12 vitamint tartalmaz. (A százalékokat tömeg/térfogat-ban adjuk meg). Ezután az edények tartalmát a fentebb leírt anaerob atmoszférában 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk addig, amíg zavarossá nem válnak (körülbelül 24 órán át).

Az ilyen módon szélesztett tenyészeteket ezután két részletre osztjuk, és mindegyik részt felhasználjuk két 14 literes kísérleti fér mentor egyikének az oltására, amelyek mindegyike 7 liter triptikus szójalevest, 1% élesztőkivonatot, 3% bárányszérumot, 1% glükózt, 0,05% L-cisztein-hidrokloridot és 0,25 pg/ml B12 vitamint tartalmaz. A fermentorok egyikébe 2,5 térf.% mennyiséget adunk a fentebb leirt módon előállított, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakcióból. Ezután mindkét fermentort 37 °C-on 44 órán át inkubáljuk a fentebb megadott anaerob atmoszférában. A pH értékét 5 n nátronlúg időnkénti hozzáadásával 6,5-en tartjuk.

A fenti inkubálás befejezése után megfelelő mintákat veszünk mindegyik fermentorból, majd a fermentorok tartalmát 0,15 térf.% formáimnál kezeljük a sejtek inaktiválása céljából. A sejtmintákat mikroszkóposán vizsgáljuk; az összes sejtszámot Petroff-Hauser számolókamrában határozzuk

HU 201114 Β meg; az életképes sejtek számát sorozathígitással állapítjuk meg frissen öntött, 5%-os marhavér-agarlemezeken. A vér-agar-lemezeket 37 °C hőmérsékleten, 59 térf.% hidrogénből és 50 térf.% szén-dioxidból álló anaerob atmoszférában 4 napon ét inkubáljuk. A T. hyodysenteriae kolóniákat egyedi hemolízis-zónákként figyeljük meg. E vizsgálatok eredményét az alábbi 1. táblázatban össze5 geztük.

1, táblázat

T. hyodysenteriae ATCC 31212 sejtek szaporodása koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót tartalmazó és nem tartalmazó táptalajon

Táptalaj	Mikroszkópos vizsgálat	összes sejtszám	Az élő sejtek száma
Koleszterin-	Lazán csavarodó, viszonylag	1,3 x 10⁹/ml	3,7 x 10⁷/ml
-frakció	hosszú, vékonyfalú sejtek;
nélkül	általában inaktívak
Koleszterint	Szorosan csavarodott,	2,6 x 10⁹/ml	1,4 x 10⁹/ml
tartalmazó	rövidebb, vastagabb falú
frakcióval	sejtek; aktívak		---

A fenti adatokból látható, hogy koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakció jelenlétében az összes sejtszám kétszeresére nő, az életképes sejtek száma 100-szorosára növekszik, és a frakció pozitív hatást fejt ki a sejtek morfológiájára is.

2. példa

T. hyodysenteriae ATCC No. 31212 sejtekből az 1. példában leírt módon oltásra alkalmas tenyészetet állítunk elő, amelyet felhasználunk 3, egyenként 500 ml térfogatú edény tartalmának 3 térf.%-os oltására. Mindhárom edény egyenként 200 ml triptikus szójalevest, 1% élesztőkivonatot, 3% bárányszérumot, 1% glükózt, 0,05% L-cisztein-hidrokloridot és 0,25 mg/ml B12 vitamint tartalmaz.

(A százalékokat itt is és a továbbiakban is tömeg/térf.-ban adjuk meg). Az edények egyike (a kontroll) 2,5 térf.% 1. példa szerint ^5 előállított, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót tartalmaz. A második edény 2,5 térf.% Code 82-010 (Miles Laboratories cég) koleszterin-koncentrátumot tartalmaz.

A harmadik edény 2,5 térf.% List 3200 (Bio- ⁵⁰cell Laboratories) szarvasmarha-koleszterín-koncentrátumot tartalmaz. Az oltások elvégzése után az edényeket 10 térf.% hidrogént, térf.% nitrogént és 10 térf.% szén-dioxidot tartalmazó anaerob atmoszférában 37 °C hő- ^aömérsékleten inkubáljuk 38 órán át. A 24. és 31. órában az edény tartalmát 2 n nátronlúg hozzáadásával 7,0 pH-értékre állítjuk be. Mindegyik edény teljes sejtszámát a Petroff-Hauser számolókamrában állapítjuk meg.

Az eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat

T. hyodysenteriae ATTC No. 31212 sejtek szaporodása különböző, koleszterinben gazdag szarvasmar ha-frakciókat tartalmazó táptalajokban

A táptalaj kiegészítője	összes sejtszám
Az előnyös koleszterin-frakció (kontroll)	2,5 x 10⁹/ml
82-010 jelű koleszterin-koncentrátum	2,7 x 10⁹/ml
List 3200 jelű szarvasmarha-koleszterin-koncentrátum	3,0 x 10⁹/ml

A fenti adatok mutatják, hogy a különböző forrásokból származó, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciók felhasználhatók a megkívántán magas T. hyodysenteriae sejtszám képződéséhez.

3. példa

Az 1. példában leírt eljárást általában követtük T. hyodysenteriae ATTC No, 31287 törzs felhasználásával olyan táptalajokon, amelyeket az előnyös koleszterin-frakcióval egészítettünk ki a sejtek nagy koncentrációban való előállítása céljából.

4. példa

Vakcinát vagy bakterint állítottunk elő úgy, hogy az 1. példában leírt módon az előnyös koleszterin-frakció alkalmazásával előál-59

HU 201114 Β lított, elölt T. hyodysenteriae sejteket 10 térf.% Havlogen adjuvánssal (lásd a 3 919 411 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) és 1:10000 mertioláttal alkalmaztuk. A vakcina 2 χ 10⁹ sejtet tartalmaz 1 ml-ben. Ezt a vakcinát azután öt különböző vizsgálatban használtuk a vakcina hatékonyságának a meghatározására a sertés-dizentériában. Minden egyes vakcinálási vizsgálat során a sertéseket olyan állatcsoportból választottuk, amelyben sertés-dizentéria nem fordult elő; általában vegyes nemű Yorkshire, Hampshire vagy Cross eredetű állatokat alkalmaztunk. Az első vakcinálás időpontjában a sertések legalább 3 héttel voltak túl az elválasztáson, testsúlyuk 15-20 kg között volt.

Valamennyi vakcinálási-fertózési vizsgálatot olyan helyiségben végeztük, amely lehetővé tetta a vakcináit és kontrollállatok elkülönítését. A malacokat antibiotikumokat nem tartalmazó, fehérjében dús táplálékkal láttuk el. A fertőzés előtt a sertésekből vastagbélkenetet vettünk, és megfelelő táptalajon végzett vizsgálattal igazoltuk, hogy T. hyodysenteriae-től és Salmonella spp.-től mentesek.

Ezután a sertéseket gyomron át T. hyodysenteriae ATTC No. 31212 vagy 31287 kórokozókkal fertőztük, amelyeket az 1. pél-

Általános állapot	A széklet összetétele	A széklet konszisztenciája
0 - normális	0 - normális	0 - normális
1 - hasmenés	1 - nyálkás	1 - lágy
2 - dizentéria	2 - véres és nyálkás	1,5 - laza
3 - sovány	3 - véres	2 - nyúlós
4 - haldokló		3 - vizes
5 - elpusztult

A klinikai index adatainak kiértékelésére különböző elemző módszereket használtunk, és ezeket az alábbiakban részletezzük.

a) A napi klinikai index (DCI): valamennyi fertőzött malacra vonatkozóan kiszámítottuk a napi klinikai indexet az alábbi három paraméter figyelembevételével: DCI=általános állapot + a széklet összetétele + + a széklet konszisztenciája

b) A csoportos napi klinikai index (DGCI): a vakcináit és kontrollcsoportok csoportos napi klinikai indexét (DGCI értékét) az alábbi képlettel számítottuk ki:

V DCI (a csoport valamennyi tagjára)

DGCI = -—- x 100 a malacok száma egy csoportban

c) Az egyedi kumulatív klinikai index (ICCI): minden egyes malacra vonatkozóan kiszámítottuk a kumulatív klinikai indexet (ICCI értéket) a teljes 28 napos, fertőzés utáni időszakra a következőképpen:

dában leírt eljárással szaporítottunk, azzal a kivétellel, hogy a végtermékként kapott sejteket nem öltük el. A fertőző dózis 100 ml aktív tenyészet volt, amelyet úgy higitot5 tünk, hogy 10®-10⁹ mikroorganizmust tartalmazzon, s amelyet egy-egy malacnak 48 órás éheztetési időszak után gyomorszondán adagoltunk.

Valamennyi fertőzött malacot a fertőzés ) után 28 napon át naponta megfigyeltünk. A klinikai tünetek jelentkezése után a dizentériás malacoktól a kórokozó elkülönítése céljából vastagbélkenetet vettünk. A T. hyodysenteriae fertőzést úgy igazoltuk, hogy a j keneteket Spectinomycin vér-agar-lemezeken szubkulturáztuk, majd 42 °C hőmérsékleten 4-6 napon át inkubáltuk, s utána a hemolitikus agar-plakkokban a spirochéták jelenlétét mikroszkóposán vizsgáltuk. Minden egyes ) malacot felboncoltunk, amely az öt vizsgálat során elpusztult. Feljegyeztük a makroszkóposán megfigyelhető sérüléseket, és keneteket vettünk a vastagbél nyálkahártyájából, amelyeket a fentebb leírt módon szubkultúi ráztunk.

A sertések fertőzéssel kiváltott klinikai válaszát (reakcióját) az alábbi .Klinikai Index alapján mértük:

I i Index

V* DCI (a fertőzés utáni 28 napra)

ICCI = —- X 100 az összes megfigyelések száma (84)

d) A csoportos kumulatív klinikai index (GCCI): a vakcináit és kontrollállatokra vo₅θ natkozó, csoportos kumulatív klinikai indexet úgy kaptuk, hogy az ICCI-értékeket a malacok egy adott csoportjában átlagoltuk:

V* ICCI (egy csoportban lévő összes malacokra) gcci - -A malacok száma egy csoportban

-611

HU 201114 Β

1. vizsgálat:

malacot egyenlő számmal két helyiségbe osztottunk. Öt állatnak egyenként két, ml-es intramuszkuláris dózisban adtuk a 5 fentebb leirt vakcinát 3 hetes időközökben. Külön helyiségben öt nem-vakcináit kontrolimalacot tartottunk. Két héttel ezután valamennyi malacot virulens T. hyodysenteriae ATCC No. 31212 kórokozóval fertőztünk. 10

2. vizsgálat:

malacot úgy osztottunk el, hogy 5 helyiségben tartottunk 23 kezelendő állatot, 15 és 2 helyiségben 6 kontrollállatot. A kezelendő állatok egyedenként két, egyenként 5 ml intramuszkuláris dózisban kapták a fentebb leírt bakterint 3 hetes időközökben. A fertőzést az 1. vizsgálatban leírt módon végeztük. 20

3. vizsgálat:

malacot két helyiségben egyenlően osztottunk el. Öt állatnak egyedenként két, 25 egyenként 5 ml intramuszkuláris dózisban adtunk a fentebb leírt bakterint 3 hetes időközökben; 5 malacot nem-vakcináit kontrollként tartottunk. Ezután 2 héttel az összes malacokat virulens T. hyodysenteriae ATCC 30 No. 31287 kórokozóval fertőztük.

4. vizsgálat:

malacot úgy osztottunk el, hogy 36 35 kezelendő állatot 9 helyiségben helyeztünk el, és 10 kontrollállatot 2 helyiségben tartottunk. A kezelendő malacoknak egyedenként két, egyenként 5 ml intramuszkuláris dózisban adtuk a fentebb leirt bakterint 40 3 hetes időközökben. A fertőzést a 3. vizsgálatban leírt módon végeztük.

5. vizsgálat:

malacot úgy osztottunk el, hogy 36 kezelendő állatot 9 helyiségben és 10 kontrollállatot 2 helyiségben tartottunk. A kezelendő malacoknak egyedenként két, egyenként 5 ml intramuszkuláris dózisban adtuk a 50 fentebb leírt bakterint 3 hetes időközökben.

A fertőzést az 1. vizsgálatban leírt módon végeztük.

Az öt vizsgálat során összesen 105 állatot kezeltünk, és 36 kontrollállatot tartót- 55 tünk. Az őt vizsgálat eredményeit a 3. és 4. táblázatokban foglaltuk össze.

-713

0)

1 a) £ x 5* e Φ a .h oo oo co oo co cm '3

II8

S .S Ό CQ ~ Ü 44 ΐ

Hyodysenteriae ATCC No. 31212 kórokozóval gyomorszondán át kezelt malacok klinikai tünetei >» c

'03 >

O

W '«3

S k

.s ΐ

£ c

Ξ

1	tt
>»	-CO
tt	<0	0
-aj	0	a
>	cö	aj
-fe)	2

I	tt
>»	•aj	Jxí
tt	co	0
-űJ	c	(X
►	aj	cö
44 -w	2	c

xj ε

Q> -aj W N « to

-ü E tu -al <o « Η α

E c aj ai -P to Í! ⁰2 2 *o J2

	44 aj

©	c
©	o
•λ	Jí
cö	0 (X
N	cö
cö	C

c c-S

Ü <0 3

Φ tt ' O -aj -S o

Φ tt C <Ö © Z5 H *<o * £X s g co

Ο XT O

ΙΟ LO lO co co © lO © cm 10

Ο +T LO CM co £ ψ -aj to N W co

Ή 00 CM to co © CM CO

JÖ Cö 'Qj '(tí *CÖ tt tt tt

W W <0

N U N > > >

tö ©

i E a> -nj CQ N ω w >>

c

-ai >

O cfl q

.0 '5 c

φ tű o

u r2

S ε

ε

Φ -03 » 8 W tű § -g to

-aj

- S?* «ο 5 Ό *>

►—ι -aj

-aj C _ O ι2 Λί o IX n aj aj C

	c		‘CŰ 44
X	cö	©	3
Φ	co	©
4-)	0		Jx*
Φ	tt	3	0
c	JÖ	(X
©	Z3	N	cö
É-.	•CŰ	aj	c

ε c? -5 w _Nω w cn © CM 00 ©

0^0 r-1 C··* τ—1 to © o

P *J cö a) cö -aj -aj -aj tt tt tt cö

0)

N

CO tű ©

-815

HU 201114 Β

Az ATCC 31212 törzzsel gyomorszondán át végzett fertőzést követően a vakcináit malacok 17,2%-ában (64 közül 11-ben) és a kontrollmalacok 71,4%-ában (21 közül 15-ben) figyeltük meg a dizentéria klinikai tüneteit. 5 Ez azt jelenti, hogy a vakcináit malacok csoportjában a klinikai dizentéria 75,9%-kal csökkent. A kumulatív klinikai index (GCCI), amelyet a fertőzés utáni teljes, 28 napos megfigyelési időszakra számítottunk, 10,4 volt 10 a vakcináit malacok esetében és 83,2 a nem vakcináit kontrollállatok esetében. Ez azt jelenti, hogy a klinikai index segítségével mért összes klinikai tünetek (hasmenés, dizentéria, soványság és pusztulás) 87,5%-kal csökken- 15 tek. A vakcináit malacok között nem figyeltünk meg pusztulást, 21 kontrollmalac közül viszont a fertőzés után 5 (23,8%) elpusztult.

A dizentéria klinikai tünetei később jelentkeztek a vakcináit malacoknál, és a klinikai 20 betegség időtartama csökkent. Továbbá, a vakcináit malacok esetében csökkent az étvágytalanság.

-917 tű t- 0}

tű X o 44

X

V

Ό c

CM CM r-T 00 CM *-<

(O w

o u

a §

F—1

X

QJ

Ό

CM CO CO CO σ> co x

co rHyodysenteriae ATCC No. 31287 kórokozóval gyomorszondán át kezelt malacok klinikai tünetei 'CQ frQ «

βω c

•cö >

o ω

•2 ·©

0) tQ

Ό

C

F—* tó o

ü ε

<

ε

CQ n

I >>

tű •CÖ >

4J •w tO tű c

CÖ

O β

cö c

tf tf

I

Φ tű tó

Φ

4->

1>

O

Étf

Φ

CO tó

4->

bj cö β

ω

I to
>. -0)	44
W “	O
•«i 5	β
> ,2	3
íí 5	3

tf

TJ· o

M*

CO

O O co

CM tH t-1

E •3

N

Cö

S cö

N

C0 •o

XJ

S -ű
co	X
0	3
to 3	73
	N
-3	3

O β

O CO CO CM

4-J

CO

CM «

o q

q o

cö to o

tű cö

X

X l2

Έ

4-> N •3 3 ‘CÖ <43

O β

X «Ο ι-H CO •’t co

CO co *t

X co ε

•3

N

CŰ

CM

X

CM χ X co

X

TT

3 •3	+4 3 •3	c
to	to	φ
tű	CO	3
IM	N	Φ
>	í>	CQ 3
CQ	xr*	3 ’O

ts •3 t>

o ω

.2 ‘E

-Φ

Φ

N ΐ

CÖ tó

O ü

ε •3 tQ co tó tf

I

4->

Φ w

tó ε

h »0

T5 φ

«3

Etf ε

•cö

CQ «2

CM

CO

O © co

N Η tH ε

•3

N

CM tű

O tO

Cö a

X

X •3

CQ

CM

CÖ β

<Ö

CO

X CO cö co o

tO

Cö

-U •aj

X

-aj l“^1

Cö

N

CÖ ‘3 β

cö co co CO CO o CO x cco co ε

Φ -aj co S tó to

X co γ•3 -3 tO to » CO N N

I -f4 > >

ιο o

1>

co

Φ

CM to tű •O

-1019

HU 201114 Β

Az ATCC 31287 törzzsel gyomorszondán át végzett fertőzést követően a vakcináit malacok 35,4%-ában (41 közül 14-ben, 1 malac ±) és a kontrollmalacok 70,0%-ában (15 közül 10-ben, 1 malac ±) figyeltük meg a 5 dizentéria klinikai tüneteit. Ez azt jelenti, hogy a vakcináit malacok esetében a klinikai dizentéria 49,4%-kaí csökkent. A kumulatív klinikai index a vakcináit malacok esetében 18,6, a nem vakcináit kontrollok esetében 10 73,5-nek adódott. Ez azt jelenti, hogy a vakcináit állatok esetében az összes klinikai tünetek 74,7%-kal csökkentek. A vakcináit malacok között nem figyeltünk meg pusztulást, kontrollmalac közül viszont a fertőzés 15 után 2 (13,3%) elpusztult. A klinikai dizentéria jelentősen később következett be, és a klinikai tünetek időtartama is csökkent a vakcináit malacok esetében.

Az összes esetekben megerősítettük, 20 hogy a klinikai dizentéria kórokozója a T. hyodysenteriae volt; a bizonyítást úgy végeztük, hogy a vastagbélkeneteket spectinomycin vér-agar-lemezeken szubkultúráztuk. Egyidőben Salmonella spp.-re szelektív táp- 25 talajon végzett vizsgálat negatív eredményeket adott.

Az elpusztult malacok vastagbéltartalma véres és vizenyős volt, a vastagbeleik durvan felfúvódtak, és bélbolyhaik hiányoztak. 30 n A boncolás időpontjában a vastagbél faláról vett kenet T. hyodysenteriae-re pozitív, Sál- '2 monella spp.-re negatív volt. A vakcináit állatoktól a fertőzés után 28 nappal vett vastagbélkenetek spectinomycin-vér-agar-ieme- 35 zeken 42 °C hőmérsékleten végzett szubkultu rázás után minden esetben negatívnak adódtak.

Az összes 141 vakcináit és kontrollmalac figyelembevételével az öt fertőzési vizsgálat- 40 bán megfigyelt klinikai válaszokat az 5. táblázatban összegeztük. A 105 vakcináit állat közül 25,5 (24,3%), mig a nem vakcináit 36 kontroll közül 25,5 (70,8%) állaton jelentkeztek a dizentéria klinikai tünetei. Ez azt je- 45 lenti, hogy az összes vakcináit malacokra számítva a klinikai dizentéria 65,7%-kal csökkent. A 36 kontrollmalac közül 7 (19,4%) pusztult el a fertőzés után, a vakcináit malacok közül a fertőzés utón egyetlen állat sem 50 pusztult el. Az összes 105 vakcináit malacra vonatkoztatva a csoportos klinikai index értéke 13,6, a 36 nem vakcináit kontroll esetében ez az érték 79,2. Ez azt jelenti, hogy az összes vakcináit malacokra vonatkoztatva az 55 összes klinikai tünetek (hasmenés, dizentéria, soványság, pusztulás) 82,8%-kal csökkent.

A vakcinálási-fertőzési vizsgálatok öt kísérletben kapott eredményeit figyelembe véve azt következtetjük, hogy a T, hyody- 60 senteriae bakterin szabadföldi körülmények között alkalmazva határozottan hatékony segítséget jelent a sertés-dizentéria megelőzésében.

lő

Φ <o a:

o o

<0 ε

'8 c

Q« .Φ CÖ Ή *73 <o «0 *O to

b. ? 00 £? 'Φ

Ό CQ 4J ‘Φ is φ *

S a •qj

-S < o

Ό ca ü > E.W ε

1) q

Φ

CQ *0 p

ε

0) q

o

Ö,

E'03 q

·§ q

o

N

CQ

Js

O ε

4-5 tO

CQ c

•cö >

o w

.2 ’C

-Φ c

Φ

N *s ’S rí c

o ü

^2

Ί2 cö

S •CÖ

N

CQ l* cö 8 -2 o .£ cfl 33 ü 44

I 00 '2 bű to •cö 5 > -2 ti « •U 4-5

Λ ε

Φ -CÖ M to ω cq ε

-φ tf

H

Φ

Ό

C *0

Ό

4->

•<Ö

cö	X3	c
CQ	-O	0
O		44
bo		O
r2	CQ	CL
	N	cö
-03	cö	C

c cö co o

W)

Cö

X3

Λ 'S

4-5 •<fl u

cö c

•5 o

CL cö c

Φ -Cö « tM tí CQ

CÖ CM

CO 0?

t—< b-

O cO CO w CO co r-4

CM CD rH CM

CO CO

CO

CM

O b4Λ ΙΛ io in

CM CM

O CO

>

I c—í

O c

tf o

cö

-1121

HU 201114 Β

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás Treponema hyodysenteriae szaporítására megfelelő táptalajon, azzal jellemezve, hogy a szaporítást szarvasmarhából 5 származó, koleszterinben gazdag frakciót tartalmazó tápközegben végezzük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhából származó, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakció- 10 ként olyan frakciót alkalmazunk, amelyet úgy állítunk elő, hogy (a, folyékony, koleszterint tartalmazó szarvasmarha-plazmát vagy -szérumot vagy azok frakcióját kovasavas adszorbenssel 15 hozzuk érintkezésbe, és a koleszterint adszorbeáljuk;

(b) az adszorbeált koleszterint a folyékony plazma vagy szérum többi részétől elkülönítjük; 20 (c) az adszorbeált koleszterint kifagyasztjuk és felengedni hagyjuk;

(d) az adszorbeált koleszterint 9,0-11,5 pH-érték mellett eluáljuk;

(e) az eluált koleszterinoldatot ultraszürés- 25 sel töményítjük;

(f) a tömény koleszterinoldat pH-értékét 11,0-11,4-re állítjuk;

(g) a tömény koleszterinoldatot nátriuin-karbonéttal, majd vízzel szemben diali- 30 záljuk;

(h) a dializált koleszterinoldatot ultraszüréssel 0,5-30 mg/ml koncentrációig tovább töményítjük;

(i) a tömény koleszterinoldat pH-értékét 35 7,0-11,0-ra állítjuk;

(j) a tömény koleszterinoldatot 30 perctől 24 óráig terjedő időtartammal 50-100 °C hőmérsékleten melegítjük; és (k) a tisztított, koleszterinben gazdag szar- 40 vasmarha-frakciót elkülönítjük.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szaporítást 0,1-5,0 térfogatszázalék, szarvasmarhából származó koleszterinben gazdag frakciót tartalmazó táp- 45 közegben végezzük.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szaporítást 1-2,5 térfogatszázalék, szarvasmarhából származó, koleszterinben gazdag frakciót tartalmazó tápkö- 50 zegben végezzük.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szaporítást 2,5 térfogatszázalék, szarvasmarhából származó, koleszterinben gazdag frakciót tartalmazó tápkő- 55 zegben végezzük.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szaporítást olyan 1-2,5 térfogatszázalék, szarvasmarhából származó, koleszterinben gazdag frakciót tartalmazó tápközegben végezzük, amelyet úgy állítunk elő, hogy (a) folyékony, koleszterint tartalmazó szarvasmarha-plazmát vagy -szérumot kovasavas adszorbenssel hozunk érintkezésbe, és a koleszterint adszorbeáljuk;

(b) az adszorbeált koleszterint a folyékony plazma vagy szérum többi részétől elkülönítjük;

(c) az adszorbeált koleszterint kifagyasztjuk, és felengedni hagyjuk;

(d) az adszorbeált koleszterint 10,4-10,6 pH-érték mellett eluáljuk;

(e) az eluált koleszterint ultraszűréssel eredeti térfogatának 15-50 százalékára betöményítjük;

(f) a tömény koleszterinoldat pH-értékét

11,2-re állítjuk;

(g) a tömény koleszterinoldatot nátrium-karbonáttal, majd vízzel szemben dializáljuk;

(h) a dializált koleszterinoldatot ultraszűréssel 10-20 mg/ml koncentrációig tovább töményítjük;

(i) a tömény koleszterinoldat pH-értékét 7,6-ra állítjuk;

(j) a tömény koleszterinoldatot 30-60 percen át 80 °C hőmérsékleten melegítjük; és (k) a tisztított, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót elkülönítjük.
7. Eljárás Treponema hyodysenteriae bakterin előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárással szaporított sejteket megfelelő segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás Treponema hyodysenteriae bakterin előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerinti eljárással szaporított sejteket alakítjuk gyógyászati készítménnyé.
9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy milliliterenként 2xl0⁹ sejtet tartalmazó tenyészetet alakítunk gyógyászati készítménnyé.
10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy segédanyagként poliallil-szachariddal térhálósított akrilsav-polimer és egy emulziós rendszer kombinációját tartalmazó adjuvánst alkalmazunk.