CN113957012B - 一种鸡滑液囊支原体培养基及其制备方法 - Google Patents

一种鸡滑液囊支原体培养基及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鸡滑液囊支原体培养基及其制备方法，属于兽医生物学技术领域。本发明所述的鸡滑液囊支原体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中：基础培养基主要成分有Hank′s浓缩液、乳蛋白水解物、酵母提取物、牛心浸粉、海藻糖，可以通过高压蒸汽灭菌方式除菌；辅助培养基由精氨酸、丙酮酸钠、辅酶Ι、青霉素和猪血清组成，辅助培养基各成分过滤除菌。本发明培养基培养的鸡滑液囊支原体滴度达1010～1011CCU/ml，培养时间14～24h，猪血清含量低至5％，大大降低了异源体对鸡的应激反应和企业生产成本。用该培养基培养的鸡滑液囊支原体制备的灭活疫苗，其安全性和免疫原性均良好。

Description

一种鸡滑液囊支原体培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及兽医生物学技术领域，具体涉及一种鸡滑液囊支原体培养基及其制备方法。
背景技术
对家禽具有致病性的支原体种类多达28种，其中危害最为严重的是鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)和火鸡支原体。鸡滑液囊支原体可感染鸡与火鸡，可引起关节炎、滑膜炎、气囊炎、鸡蛋尖端综合征等，是造成全球养鸡行业经济损失的主要原因之一。2010年我国广西省和广东省最先发现此病，之后逐渐扩散到全国各地。养殖厂治疗鸡滑液囊支原体引起的相关疾病的方法主要是药物治疗，但是药物治疗容易使鸡滑液囊支原体产生耐药性。随着抗生素使用的限制，疫苗免疫将会成为主要的防控手段。
鸡滑液囊支原体活疫苗、灭活疫苗的有效性，主要是依靠鸡滑液囊支原体的培养滴度和良好的免疫原性。目前分离与培养鸡滑液囊支原体的培养基主要是改良Frey氏培养基，培养滴度在1.0×108～1.0×109CCU/ml，血清含量10％，培养时间24～48h。用该培养基进行禽支原体分离时，生长缓慢，分离时间长，且分离率低。另外，血清含量高不仅增加疫苗的生产成本，而且增加了异源体对鸡的应激反应。为了获得高滴度、高免疫原性的鸡滑液囊支原体，有必要研发一种高效、低成本的培养基。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种培养滴度高、免疫原性好、生产成本低的鸡滑液囊支原体高效液体培养基和固体培养基。本发明的目的之二在于提供一种鸡滑液囊支原体培养基的制备方法。本发明培养基培养的鸡滑液囊支原体滴度达1010～1011CCU/ml，培养时间14～24h，猪血清含量低至5％。培养时间缩短可以减少老龄菌代谢产生的有害物质，并且减少生产耗能；猪血清含量的降低减少了异源物质对鸡的应激反应，提高了疫苗的安全性，同时也大大降低了企业生产成本。用该培养基培养的鸡滑液囊支原体制备的灭活疫苗，其安全性和免疫原性均良好。
本发明一方面提供了一种鸡滑液囊支原体培养基，由基础培养基和辅助培养基组成，其中：基础培养基主要成分有Hank′s浓缩液、乳蛋白水解物、酵母提取物、牛心浸粉、海藻糖，可以通过高压蒸汽灭菌方式除菌；辅助培养基成分有精氨酸、丙酮酸钠、辅酶Ι、青霉素和猪血清，辅助培养基各成分过滤除菌。
进一步的，所述基础培养基包括20×Hank′s浓缩液50～70ml、乳蛋白水解物0.5～3g、酵母提取物1～5g、牛心浸粉5～12g、海澡糖2～6g、去离子水779～883ml；辅助培养基包括5％精氨酸溶液1～5ml、3％丙酮酸钠溶液1～5ml、5％辅酶Ι2～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml和灭活的健康猪血清50～100ml组成。
进一步的，所述20×Hank′s浓缩液由第一浓缩液(20×Hank′s1)和第二浓缩液(20×Hank′s2)组成。20×Hank′s1包括：NaCl 12～16g、MgSO4·7H2O 0.1g～0.5g、KCl 0.4～1.0g、MgCl2·6H2O 0.1～0.5g、CaCl20.2～0.5g、去离子水100ml；20×Hank′s2包括：Na2HPO4·12H2O 0.1～0.4g、KH2PO40.1～0.35g、葡萄糖1～5g、1％酚红溶液2～4ml、去离子水96～98ml。
本发明另一方面还提供了一种鸡滑液囊支原体培养基，由上述的基础培养基和辅助培养基和琼脂糖组成，配制方法是在上述基础培养中加入0.8～1.5％琼脂糖。
所述的一种鸡滑液囊支原体培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)基础培养基的配制：按配比称取乳蛋白水解物0.5～3g、酵母提取物1～5g、牛心浸粉5～12g、海藻糖2～6g，量取20×Hank′s 125～35ml、20×Hank′s 225～35ml，去离子水779～883ml，搅拌均匀，10MNaOH调pH至7.4～7.5，115℃高压灭菌20min；
(2)辅助培养基的添加：向基础培养基中按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、3％丙酮酸钠溶液1～5ml、5％辅酶Ι2～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml、56℃灭活的猪血清50～100ml。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明将培养基中的酵母浸提液和牛心汤改为配制方便、批间差异小的商品化酵母提取物和牛心浸粉，简化了生产工艺，提升了产品稳定性；
(2)本发明培养基中采用20×Hank′s浓缩液，既可以避免由于所需试剂量太少引起称量时的误差，又可以减少每次培养基配制时Hank′s的配制，降低工作量，简化配液工艺，节省时间成本；
(3)本发明培养基中添加了丙酮酸钠，提高了抗原的免疫原性；
(4)本发明固体培养基添加的是琼脂糖，而常规固体培养基添加的是琼脂粉。琼脂糖是线性的多聚物，琼脂粉是由琼脂糖和琼脂果胶组成的。将琼脂粉替换为琼脂糖，大大提高了鸡滑液囊支原体的分离率。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案更加明确，下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但是本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
实施例1本发明不同配方培养基的比较
1不同配方培养基的配制
1.120×Hank′s液的制备：
1.1.120×Hank′s1的配制：称取NaCl 15g、MgSO4·7H2O 0.2g、KCl 0.6g、MgCl2·6H2O 0.3g，各成分逐一溶解于去离子水90ml，称取CaCl20.3g溶解于10ml去离子水，二者混匀。
1.1.220×Hank′s2的配制：称取Na2HPO4·12H2O 0.2g、KH2PO40.20g、葡萄糖2g，逐一溶解于去离子水97ml，并加入1％酚红溶液3ml。
1.2基础培养基的配制
按照表1中的不同配方进行基础培养基的配制，各种成分逐一搅拌溶解，10M NaOH调pH至7.4～7.5，115℃高压灭菌20min。
1.3培养基的配制
按照表1中的不同配方向基础培养基中加入相应的辅助培养基。
表1不同配方的本发明培养基
2不同配方培养基的比较
鸡滑液囊支原体HMS-3株(菌种保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M 2021145)冻干菌种用改良Frey氏培养基溶解，以10％比例接种改良Frey氏培养基，37℃静置培养3天，待培养基颜色变黄，pH降至6.6～6.7时，以2％比例接种实施例1中的5种液体培养基，37℃、120rpm振荡培养，培养不同时间分别取样进行活菌计数，每个样品测定3个重复。不同配方液体培养基比较试验结果见表2，其中配方一、二和三培养16小时，菌液变黄，配方四培养20小时菌液变黄，配方五培养24小时菌液变黄。从表中数据可以看出，不同配方培养的HMS-3株CCU均能达到1010-1011/ml，配方中血清浓度越高，变色时间越短。
表2不同配方培养基培养HMS-3株不同时间的活菌滴度
注：“/”表示没有检测。
实施例2本发明培养基与改良Frey氏培养基培养的抗原免疫原性比较
1不同配方培养基的配制
1.120×Hank′s液的制备：
1.1.120×Hank′s1的配制：称取NaCl 16g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCl 1.0g、MgCl2·6H2O 0.5g，各成分逐一溶解于去离子水90ml，称取CaCl20.5g溶解于10ml去离子水，二者混匀。
1.1.220×Hank′s2的配制：称取Na2HPO4·12H2O 0.4g、KH2PO40.35、葡萄糖5g，逐一溶解于去离子水97ml，并加入1％酚红溶液3ml。
1.2培养基的配制
从表1选取配方五配制两组培养基，其中一组不添加丙酮酸钠，标记为配方五－丙。另外，按照《兽用生物制品规程2000年版》附录配制改良Frey氏培养基。
2不同培养基培养时间和滴度的比较
鸡滑液囊支原体HMS-3株(菌种保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2021145)冻干菌种用改良Frey氏培养基溶解，以10％比例接种改良Frey氏培养基，37℃静置培养3天，待培养基颜色变黄，pH降至6.6～6.7时，以2％比例接种3种液体培养基，37℃、120rpm振荡培养，待pH降至6.6～6.7时收获菌液进行pH和活菌滴度测定，结果见表3。从表中可以看出，配方五和配方五－丙(不含丙酮酸钠的配方五)培养基培养24小时，菌液pH降至6.6～6.7，活菌滴度为1010.33CCU/ml；改良Frey氏培养基需要培养32小时，菌液pH才能降至6.6～6.7，培养时间较本发明培养基长，活菌滴度为108.67CCU/ml，也较本发明培养基低。从培养时间、活菌滴度和血清用量来看，本发明培养基优于改良Frey氏培养基。
表3不同配方培养基培养HMS-3株的比较
注：“配方五-丙”表示按照表1配方五的成分配制，除丙酮酸钠不添加外，其他成分及用量均同配方五。
3不同培养基培养免疫原性的比较
2.3中配方五和配方五－丙培养基培养的抗原经终浓度0.3％甲醛灭活后，离心弃上清，沉淀用pH7.2 PBS重悬，稀释至1.6×1010CCU/ml，改良Frey氏培养的抗原经终浓度0.3％甲醛灭活后，离心弃上清，沉淀用pH7.2 PBS重悬，浓缩至1.6×1010CCU/ml。3种PBS重悬的抗原分别与白油佐剂以3：1比例乳化配苗。
50只42日龄SPF鸡随机分成5组，每组10只。第1～3组分别颈背部皮下注射配方五、配方五－丙、改良Frey氏培养基培养抗原制备的疫苗0.5ml，第4组注射pH7.2 PBS与白油佐剂配制的安慰剂疫苗0.5ml，21日后4组鸡分别足垫攻0.4ml HMS-3菌液(含2.5×105CCU，两个足垫各0.2ml)，第5组不免疫不攻毒，作空白对照。攻毒后每日进行观察，记录足垫肿胀情况，14日后剖杀。各组SPF鸡免疫及足垫肿胀情况见表4。从表中可以看出，4组疫苗免疫后鸡精神状态、食饮欲均正常，未出现不良反应；配方五培养的抗原配制的疫苗免疫后攻毒保护率为90％，配方五－丙和改良Frey氏培养的抗原配制的疫苗免疫后攻毒保护率为70％，安慰剂攻毒对照组发病率为100％，由此可见培养基中添加丙酮酸钠，可以明显提高抗原的免疫原性。
表4不同培养基培养的抗原免疫原性比较
实施例3本发明固体培养基与改良Frey氏固体培养基的比较
1不同配方培养基的配制
1.120×Hank′s液的制备：
1.1.120×Hank′s1的配制：称取NaCl 16g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCl 1.0g、MgCl2·6H2O 0.5g，各成分逐一溶解于去离子水90ml，称取CaCl20.5g溶解于10ml去离子水，二者混匀。
1.1.220×Hank′s2的配制：称取Na2HPO4·12H2O 0.4g、KH2PO40.35、葡萄糖5g，逐一溶解于去离子水97ml，并加入1％酚红溶液3ml。
1.2培养基的配制
从表1选取配方五配制两组培养基，其中一组添加1.5％的琼脂粉，标记为配方五-粉，另一组添加1.5％的琼脂糖，标记为配方五-糖，另外，按照《兽用生物制品规程2000年版》附录配制改良Frey氏固体培养基。
2不同固体培养基培养的比较
取临床发病鸡群中关节肿胀明显的鸡，关节肿胀处用酒精棉球消毒，无菌割开，无菌吸取关节液或渗出物，接种本发明培养基配方一，置37℃静置培养，若不变色则按照10％接种量盲传2代。取培养基变色的菌液进行PCR鉴定并送去测序。测序为鸡滑液囊支原体的菌液稀释103和104倍分别涂布配方五-粉、配方五-糖和改良Frey氏固体培养基，37℃、5％CO2培养箱培养3～7天，显微镜下观察菌落并进行计数，结果见表5。从表中可以看出，配方五－糖组别103稀释度菌液涂布平板菌落数最多，63和71，而添加琼脂粉的配方五-粉和改良Frey氏组别，103稀释度菌液涂布平板菌落数很少，相差近10倍，这说明固体培养基中用琼脂糖代替琼脂粉可大大提高鸡滑液支原体的分离率，加快鸡滑液囊支原体的克隆纯化进程。
表5不同固体培养基培养鸡滑液囊支原体的比较(菌落数)
以上所述实施例仅为更明确地说明本发明的技术特征、实施步骤及优点。但是，本发明的保护范围并不局限于此，本行业内任何技术人员在本发明公开范围内，根据本发明的技术方案所做的各种变化都不脱离本发明的宗旨，都应属于本发明的权利要求保护范围。

Claims (4)

1.一种鸡滑液囊支原体培养基，其特征在于，由基础培养基和辅助培养基组成，所述基础培养基由20×Hank′s浓缩液 50～70ml、乳蛋白水解物0.5～3g、酵母提取物1～5g、牛心浸粉5～12g、海藻糖2～6g、去离子水779～883ml组成，所述辅助培养基由5％精氨酸溶液1～5ml、3％丙酮酸钠溶液1～5ml、5％辅酶Ι 2～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml、灭活的健康猪血清50～100ml组成；
所述20×Hank′s浓缩液由25～35ml第一浓缩液和25～35ml第二浓缩液组成，所述第一浓缩液由NaCl 12～16g、MgSO4·7H2O 0 .1～0 .5g、KCl 0 .4～1 .0g、MgCl2·6H2O 0 .1～0 .5g、CaCl20 .2～0 .5g、去离子水100ml组成；所述第二浓缩液由Na2HPO4·12H2O 0 .1～0 .4g、KH2PO40 .1～0 .35g、葡萄糖1～5g、1％酚红溶液2～4ml、去离子水96～98ml组成。
2.一种鸡滑液囊支原体培养基，其特征在于，由基础培养基、辅助培养基和0.8～1.5％琼脂糖组成，所述基础培养基由20×Hank′s浓缩液 50～70ml、乳蛋白水解物0.5～3g、酵母提取物1～5g、牛心浸粉5～12g、海藻糖2～6g、去离子水779～883ml组成，所述辅助培养基由5％精氨酸溶液1～5ml、3％丙酮酸钠溶液1～5ml、5％辅酶Ι 2～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml、灭活的健康猪血清50～100ml组成；
所述20×Hank′s浓缩液由25～35ml第一浓缩液和25～35ml第二浓缩液组成，所述第一浓缩液由NaCl 12～16g、MgSO4·7H2O 0 .1～0 .5g、KCl 0 .4～1 .0g、MgCl2·6H2O 0 .1～0 .5g、CaCl20 .2～0 .5g、去离子水100ml组成；所述第二浓缩液由Na2HPO4·12H2O 0 .1～0 .4g、KH2PO40 .1～0 .35g、葡萄糖1～5g、1％酚红溶液2～4ml、去离子水96～98ml组成。
3.权利要求1所述的一种鸡滑液囊支原体培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）基础培养基的配制：按配比称取乳蛋白水解物0.5～3g、酵母提取物1～5g、牛心浸粉5～12g、海藻糖2～6g，量取第一浓缩液 25～35ml、第二浓缩液 25～35ml，去离子水779～883ml，搅拌均匀，10M NaOH调pH至7.4～7.5，115℃高压灭菌20min；
（2）辅助培养基的添加：向基础培养基中按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、3％丙酮酸钠溶液1～5ml、5％辅酶Ι 2～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml、56℃灭活的猪血清50～100ml。
4.权利要求2所述的一种鸡滑液囊支原体培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）基础培养基的配制：按配比称取乳蛋白水解物0.5～3g、酵母提取物1～5g、牛心浸粉5～12g、海藻糖2～6g，量取第一浓缩液 25～35ml、第二浓缩液 25～35ml，去离子水779～883ml，搅拌均匀，10M NaOH调pH至7.4～7.5，115℃高压灭菌20min；
（2）辅助培养基的添加：向基础培养基中按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、3％丙酮酸钠溶液1～5ml、5％辅酶Ι 2～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml、56℃灭活的猪血清50～100ml；
（3）琼脂糖的添加：向基础培养基中加入0.8～1.5％琼脂糖。
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