CN109055255B - 猪肺炎支原体培养基及制备方法和其在疫苗中的应用 - Google Patents
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Abstract
为了解决目前市场上缺乏高效分离和培养猪肺炎支原体的培养基，相关疫苗生产成本高等技术问题，本发明旨在提供一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法，以及探究了其在制备相关猪肺炎支原体疫苗生产中的应用。本发明的猪肺炎支原体培养基能够快速分离和培养猪肺炎支原体，培养猪肺炎支原体的滴度可以达到1010‑1011CCU，培养时间最低可至42h，减少了陈旧菌和老龄菌的产生，能够获得更高的疫苗免疫原性。
Description
技术领域:
本发明涉及生物技术领域，具体涉及猪肺炎支原体培养基及制备方法和其在疫苗中的应用。
背景技术:
近年来，随着经济的不断发展， 养殖业的发展也不断随之进步。对于生猪的养殖业不断产业化、规模化、科学化。生猪的饲养条件有了明显的、大幅度的改善。对于一些烈性传染病的防控已得到人们充分的认识，但对猪支原体病的认识及防控还未能引起广泛的关注。
猪支原体病（Mycoplasmal Diseases）是兽医学临床上一种常见的、危害极大的疾病。猪支原体病主要为由猪肺炎支原体等引发的，以呼吸系统疾病为主的猪支原体肺炎；以及以猪滑液支原体等引发的以关节病为主的猪滑液囊支原体病。早在20世纪60年代美国科学家Mare和Switzer就从患猪支原体肺炎的病猪中提取分离出了猪肺炎支原体。2001年美国国家动物健康检测 部门对全国养殖猪群做了调查，在万头猪场，52.7％架子猪和68％育肥猪感染过支原体相关疾病，超过其中50％的疾病被诊断为猪支原体肺炎。
猪支原体肺炎又称猪地方性流行肺炎，我国俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病，可造成带菌病猪生长发育缓慢、生长率降低、饲料转化率降低以及饲料和人力的浪费。此外，猪肺炎支原体能够引起机体免疫抑制，致使其他疫苗免疫失败。根据初步统计，该病阳性感染率大概为70％-90％，发病率至少40％以上。患猪生长不良，饲料转化率降低13.8％，生产率下降15.9％，极大增加养猪成本，使经济收入下降，估计我国每年由此病损失可达100亿元以上。此外，MPS的病死率虽不高，但其引发的继发性感染可出现严重死亡，造成的经济损失巨大。规模化猪场中MPS常和数种细菌、病毒等病原协同作用，而引起猪呼吸道疾病综合征(PRDC)严重制约着养猪业的发展。长期以来，该病被认为是威胁全球养猪业的主要传染病之一。
然而，我国猪肺炎支原体的分离培养难度很大，传统的培养方式耗时长，并且滴度不高，是目前支原体疫苗规模化生产的技术瓶颈。现有的培养猪肺炎支原体的培养基主要有1975年报道的Friis 培养基、1975年江苏农科院发明的 KM2 培养基、《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二000年版) 中提出的猪肺炎支原体培养基和2006年农业行业标准中提到的A26培养基。随着技术的发展，专利文献中也报道了多种猪肺炎支原体培养基，例如发明专利申请CN201210318816.X公开了一种低血清高效培养猪肺炎支原体培养基，包括(1)基础培养基（2）辅助培养基，主要有MEM、酵母浸出粉、胰蛋白胨，葡萄糖，无机盐等组成，该培养基能够既保证半成品生长滴度高而且稳定，用本发明方法制备的半成品菌液效价高达109CCU/ml;同时该培养基采用降低猪血清培养猪肺炎支原体，减轻了猪血清对猪体的过敏应激反应，既考虑到动物的生物安全，又提高了抗原效价，而且降低了生产成本。发明专利申请CN201510042434.2公开了一种培养猪肺炎支原体培养基，是由基础培养基和辅助培养基制成，采用先配制基础培养基，再配制辅助培养基，然后混合，调整pH，过滤除菌，即得到猪肺炎支原体液体或固体培养基。所述的猪肺炎支原体培养基培养猪肺炎支原体CJ株的生长时间为2-3日，含菌量为1.0×109-10CCU/ml，达到最终含菌量的测定时间为9-10日。发明专利申请CN201710123741.2公开了一种猪肺炎支原体培养基，由基础培养基和辅助培养基组成，其中：基础培养基主要成分有Hank’s液、乳蛋白水解物、酵母提取物、牛心提取物，可以通过高压蒸汽灭菌方式除菌，大大地减少了过滤除菌带来的污染风险；辅助培养基由猪血清、精氨酸、半胱氨酸、酚红溶液、青霉素等组成，猪血清通过钴照射除菌，其余成分过滤除菌后与灭活的猪血清混合。所述培养基培养猪肺炎支原体兔化弱毒株的滴度达到109-1010CCU，培养时间最低可至40h，大大减少了陈旧菌、老龄菌的产生，并且猪血清用量可以低至8％，减少了猪血清带来的过敏应激反应，降低了企业生产成本。然而，尽管专利报道资料很多，但市场上仍未出现相关的培养基产品。基于以上技术问题的存在，本发明人开展了猪肺炎支原体培养基的优化研究。
发明内容：
为了解决目前市场上缺乏高效分离和培养猪肺炎支原体的培养基，相关疫苗生产成本高等技术问题，本发明旨在提供一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法，以及探究了其在制备相关猪肺炎支原体疫苗生产中的应用。本发明的猪肺炎支原体培养基能够快速分离和培养猪肺炎支原体，培养猪肺炎支原体的滴度可以达到1010-1011CCU，培养时间最低可至42h，减少了陈旧菌和老龄菌的产生，能够获得更高的疫苗免疫原性。
为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于，所述猪肺炎支原体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×Hank’s 25-35mL、PPLO肉汤粉 2-3g、酵母提取物2-5g、乳清蛋白水解物0.5-3g、脑心浸液粉3-5g、1%氯化锌溶液0.5-1mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水850-900ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3-4mL、5％半胱氨酸溶液2-3mL、1%牛磺酸溶液1-2mL，5％辅酶Ι1-5mL、10万U/ml青霉素5-10mL和灭活的健康猪血清70-90mL组成。
优选的，所述基础培养基由20×Hank’s 30mL、PPLO肉汤粉 2.5g、酵母提取物3g、乳清蛋白水解物2g、脑心浸液粉4g、1%氯化锌溶液0.75mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水870ml组成。所述辅助培养基由5％精氨酸溶液3.5mL、5％半胱氨酸溶液2.5mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι3mL、10万U/ml青霉素8mL和灭活的健康猪血清75mL组成。
优选的，所述基础培养基由20×Hank’s 35mL、PPLO肉汤粉 3g、酵母提取物2g、乳清蛋白水解物3g、脑心浸液粉3g、1%氯化锌溶液1mL、 0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水850mL组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液4mL、5％半胱氨酸溶液3mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι5mL、10万U/ml青霉素7mL和灭活的健康猪血清70mL组成。
优选的，所述基础培养基由20×Hank’s 25mL、PPLO肉汤粉 2g、酵母提取物5g、乳清蛋白水解物0.5g、脑心浸液粉5g、1%氯化锌溶液0.5mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水880ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3mL、5％半胱氨酸溶液2mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι2mL、10万U/ml青霉素5mL和灭活的健康猪血清90mL组成。
本发明还请求保护所述猪肺炎支原体培养基的制备方法，所述方法包括如下步骤：第一，基础培养基的配制：按配比量取20×Hank’s 25-35mL、PPLO肉汤粉 2-3g、酵母提取物2-5g、乳清蛋白水解物0.5-3g、脑心浸液粉3-5g、1%氯化锌溶液0.5-1mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水850-900ml，搅拌均匀，10M NaOH调pH至7.2-7.4，120℃高压灭菌15min，冷却至室温；第二，辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液3-4mL、5％半胱氨酸溶液2-3mL、1%牛磺酸溶液1-2mL，5％辅酶Ι1-5mL、10万U/ml青霉素5-10mL和56℃Co60辐照灭活的健康猪血清70-90mL；第三，使用前，将辅助培养基添加到冷却的基础培养基中混合均匀，用1M NaOH调pH至7.6，即得到所述的猪肺炎支原体培养基。
本发明还请求保护所述猪肺炎支原体培养基在制备猪肺炎支原体疫苗中的应用，所述培养基能够快速分离和培养猪肺炎支原体，培养猪肺炎支原体的滴度可以达到1010-1011CCU，培养时间最低可至42h。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果:
首先，本发明基于现有猪肺炎支原体培养基研究的基础上，对现有的培养基进行了改进，特别是成分组成的调整，从而优化猪肺炎支原体的分离和培养的效率。在本发明中，发明人经研究发现在猪肺炎支原体培养基中添加微量的氯化锌溶液以及少量牛磺酸溶液，能够显著改善猪肺炎支原体的培养状况，其能极大地促进猪肺炎支原体的增殖和生长，培养猪肺炎支原体的滴度可以达到1010-1011CCU，培养时间最低可至42h。
其次，本发明中采用少量的猪血清，相比现有技术的血清含量，本发明的培养基中血清含量更低，达到8%左右，这一方面降低了企业的生产成本，另一方面也能减少血清的添加所带来的致敏性问题等。
第三，本发明参照现有技术，将培养基中能够耐受高温灭菌的成分作为基础培养基，将不能耐受高温的成分作为辅助培养基，通过不同的灭菌方式，保证了培养基的无菌特性，保证了其作为疫苗生产用培养基的安全性。
综上所述，本发明的猪肺炎支原体培养基能够极大地促进猪肺炎支原体的增殖，且相比现有技术的血清含量，本发明的培养基中血清含量更低，达到8%左右，这一方面降低了企业的生产成本，另一方面也能减少血清的添加所带来的致敏性问题等。
具体实施例：
实施例1：一种猪肺炎支原体培养基，所述猪肺炎支原体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×Hank’s 30mL、PPLO肉汤粉 2.5g、酵母提取物3g、乳清蛋白水解物2g、脑心浸液粉4g、1%氯化锌溶液0.75mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水870ml组成。所述辅助培养基由5％精氨酸溶液3.5mL、5％半胱氨酸溶液2.5mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι3mL、10万U/ml青霉素8mL和灭活的健康猪血清75mL组成。
所述猪肺炎支原体培养基的制备方法，所述方法包括如下步骤：第一，基础培养基的配制：按配比量取20×Hank’s 、PPLO肉汤粉、酵母提取物、乳清蛋白水解物、脑心浸液粉、1%氯化锌溶液、0.25% 酚红溶液和去离子水，搅拌均匀，10M NaOH调pH至7.2-7.4，120℃高压灭菌15min；第二，辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液、5％半胱氨酸溶液、1%牛磺酸溶液，5％辅酶Ι、10万U/ml青霉素和56℃Co60辐照灭活的健康猪血清；第三，使用前，将辅助培养基添加到冷却的基础培养基中混合均匀，用1M NaOH调pH至7.6，即得到所述的猪肺炎支原体培养基。
其中，所述20×Hank′s液的制备方法为：
1)20×Hank′s1：称取NaCl 16g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCl 1.0g、MgCl··6H2O 0.5g，各成分逐一溶解于去离子水90ml，称取CaCl2 0.5g溶解于10ml去离子水，二者混匀；
2)20×Hank′s2：称取Na2HPO4·12H2O 0.4g、KH2PO4 0.35g、葡萄糖5g，逐一溶解于去离子水100ml。
5％精氨酸溶液配制方法为：称取L-精氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
5％半胱氨酸溶液配制方法为：称取L-半胱氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
5％辅酶Ι配制方法为：称取辅酶Ι5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
1%牛磺酸溶液配制方法为：称取牛磺酸1g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
1%氯化锌溶液配制方法为：称取氯化锌0.1g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
实施例2：一种猪肺炎支原体培养基，所述猪肺炎支原体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×Hank’s 35mL、PPLO肉汤粉 3g、酵母提取物2g、乳清蛋白水解物3g、脑心浸液粉3g、1%氯化锌溶液1mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水850mL组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液4mL、5％半胱氨酸溶液3mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι5mL、10万U/ml青霉素7mL和灭活的健康猪血清70mL组成。
所述猪肺炎支原体培养基的制备方法，所述方法包括如下步骤：第一，基础培养基的配制：按配比量取20×Hank’s 、PPLO肉汤粉、酵母提取物、乳清蛋白水解物、脑心浸液粉、1%氯化锌溶液、0.25% 酚红溶液和去离子水，搅拌均匀，10M NaOH调pH至7.2-7.4，120℃高压灭菌15min；第二，辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液、5％半胱氨酸溶液、1%牛磺酸溶液，5％辅酶Ι、10万U/ml青霉素和56℃Co60辐照灭活的健康猪血清；第三，使用前，将辅助培养基添加到冷却的基础培养基中混合均匀，用1M NaOH调pH至7.6，即得到所述的猪肺炎支原体培养基。
实施例3：一种猪肺炎支原体培养基，所述猪肺炎支原体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×Hank’s 25mL、PPLO肉汤粉 2g、酵母提取物5g、乳清蛋白水解物0.5g、脑心浸液粉5g、1%氯化锌溶液0.5mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水880ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3mL、5％半胱氨酸溶液2mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι2mL、10万U/ml青霉素5mL 和灭活的健康猪血清90mL组成。
所述猪肺炎支原体培养基的制备方法，所述方法包括如下步骤：第一，基础培养基的配制：按配比量取20×Hank’s 、PPLO肉汤粉、酵母提取物、乳清蛋白水解物、脑心浸液粉、1%氯化锌溶液、0.25% 酚红溶液和去离子水，搅拌均匀，10M NaOH调pH至7.2-7.4，120℃高压灭菌15min；第二，辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液、5％半胱氨酸溶液、1%牛磺酸溶液，5％辅酶Ι、10万U/ml青霉素和56℃Co60辐照灭活的健康猪血清；第三，使用前，将辅助培养基添加到冷却的基础培养基中混合均匀，用1M NaOH调pH至7.6，即得到所述的猪肺炎支原体培养基。
实施例4：猪肺炎支原体培养试验一
（一）猪肺炎支原体菌株和培养条件
采用猪肺炎支原体 ATCC 25934(J株)，分别接种本发明的猪肺炎支原体培养基、KM2培养基、A26培养基和PPLO支原体培养基等4种培养基，种子继代复壮后，分别按10%（V/V）的比例接种，37℃培养，当培养基的颜色变黄、pH由7.6降至6.5时，无菌取出培养物。（二）活菌滴度（CCU） 测定每个培养基实验组取13只无菌试管，每管装4.5ml相应的猪肺炎支原体培养基，在第1管加入0.5mL生长良好的猪肺炎支原体培养物，混合均匀后，吸取0.5ml加入第2根管，如此进行10倍系列稀释至最末1管，同时设未加菌液的猪肺炎支原体培养基作为阴性对照。试验管设三个重复。之后，将试管放置37℃恒温箱中静止培养，每日观察1次，主要观察培养基的颜色变化，连续观察时间为12天，最后发生颜色变化的小管稀释度即为该培养物的CCU滴度。此试验共进行了3次。 试验结果如下表1所示：
表1 猪肺炎支原体ATCC 25934(J株)在不同配方培养基中的生长情况
猪肺炎支原体 ATCC 25934(J株)在本发明实施例1支原体培养基中培养2天后均观察到颜色变化，且CCU滴度为1010-1011，在KM2培养基培养3-4天变色，CCU滴度仅为104-105，在A26培养基培养3-4天变色，CCU滴度仅为104-106，在PPLO培养基培养4-5天变色，CCU滴度仅为103-105。可见，本发明的培养基非常适合猪肺炎支原体的生长，10%的接种比例传代，一般培养42h左右培养基pH从7.6降至6.5左右，培养的菌液CCU为1010-1011。其效果远优于现有技术的多种培养基。
实施例5：猪肺炎支原体培养试验二
（一）猪肺炎支原体菌株和培养条件
采用猪肺炎支原体 ATCC 25934(J株)，分别接种本发明实施例1的猪肺炎支原体培养基、以下对照组1-2的培养基，种子继代复壮后，分别按10%（V/V）的比例接种，37℃培养，当培养基的颜色变黄、pH由7.6降至6.5时，无菌取出培养物。
其中对照组1的培养基（不添加氯化锌）：由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×Hank’s 30mL、PPLO肉汤粉 2.5g、酵母提取物3g、乳清蛋白水解物2g、脑心浸液粉4g、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水870ml组成。所述辅助培养基由5％精氨酸溶液3.5mL、5％半胱氨酸溶液2.5mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι3mL、10万U/ml青霉素8mL和灭活的健康猪血清75mL组成。
其中对照组2的培养基（不添加牛磺酸）：由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×Hank’s 30mL、PPLO肉汤粉 2.5g、酵母提取物3g、乳清蛋白水解物2g、脑心浸液粉4g、1%氯化锌溶液0.75mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水870ml组成。所述辅助培养基由5％精氨酸溶液3.5mL、5％半胱氨酸溶液2.5mL、5％辅酶Ι3mL、10万U/ml青霉素8mL和灭活的健康猪血清75mL组成。
（二）活菌滴度（CCU） 测定每个培养基实验组取13只无菌试管，每管装4.5ml相应的猪肺炎支原体培养基，在第1管加入0.5mL生长良好的猪肺炎支原体培养物，混合均匀后，吸取0.5ml加入第2根管，如此进行10倍系列稀释至最末1管，同时设未加菌液的猪肺炎支原体培养基作为阴性对照。试验管设三个重复。之后，将试管放置37℃恒温箱中静止培养，每日观察1次，主要观察培养基的颜色变化，连续观察时间为12天，最后发生颜色变化的小管稀释度即为该培养物的CCU滴度。 试验结果如下表2所示：
表2猪肺炎支原体ATCC 25934(J株)在不同配方培养基中的生长情况
猪肺炎支原体 ATCC 25934(J株)在本发明实施例1支原体培养基中培养2天后均观察到颜色变化，且CCU滴度为1010-1011，在对照组1培养基培养2-3天变色，CCU滴度为108-109，在对照组2培养基培养3天变色，CCU滴度为108-109。可见，本发明的培养基相比对照组1、2的培养基更适合猪肺炎支原体的生长，发明人经研究发现在猪肺炎支原体培养基中添加微量的氯化锌溶液以及少量牛磺酸溶液，两者之间存在一定的协同增效作用，能够显著改善猪肺炎支原体的培养状况，其能极大地促进猪肺炎支原体的增殖和生长，培养猪肺炎支原体的滴度可以达到1010-1011CCU。
Claims (5)
1.一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于，所述猪肺炎支原体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×Hank’s 25-35mL、PPLO肉汤粉 2-3g、酵母提取物2-5g、乳清蛋白水解物0.5-3g、脑心浸液粉3-5g、1%氯化锌溶液0.5-1mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水850-900ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3-4mL、5％半胱氨酸溶液2-3mL、1%牛磺酸溶液1-2mL，5％辅酶Ι1-5mL、10万U/ml青霉素5-10mL和灭活的健康猪血清70-90mL组成；
所述的猪肺炎支原体培养基的制备方法包括如下步骤：
第一，基础培养基的配制：按配比量取20×Hank’s 25-35mL、PPLO肉汤粉 2-3g、酵母提取物2-5g、乳清蛋白水解物0.5-3g、脑心浸液粉3-5g、1%氯化锌溶液0.5-1mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水850-900ml，搅拌均匀，10M NaOH调pH至7.2-7.4，120℃高压灭菌15min，冷却至室温；
第二，辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液3-4mL、5％半胱氨酸溶液2-3mL、1%牛磺酸溶液1-2mL，5％辅酶Ι1-5mL、10万U/ml青霉素5-10mL和56℃Co60辐照灭活的健康猪血清70-90mL；
第三，使用前，将辅助培养基添加到冷却的基础培养基中混合均匀，用1M NaOH调pH至7.6，即得到所述的猪肺炎支原体培养基。
2.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体培养基，其特征在于，所述基础培养基由20×Hank’s 30mL、PPLO肉汤粉 2.5g、酵母提取物3g、乳清蛋白水解物2g、脑心浸液粉4g、1%氯化锌溶液0.75mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水870ml组成；所述辅助培养基由5％精氨酸溶液3.5mL、5％半胱氨酸溶液2.5mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι3mL、10万U/ml青霉素8mL和灭活的健康猪血清75mL组成。
3.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体培养基，其特征在于，所述基础培养基由20×Hank’s 35mL、PPLO肉汤粉 3g、酵母提取物2g、乳清蛋白水解物3g、脑心浸液粉3g、1%氯化锌溶液1mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水850mL组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液4mL、5％半胱氨酸溶液3mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι5mL、10万U/ml青霉素7mL和灭活的健康猪血清70mL组成。
4.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体培养基，其特征在于，所述基础培养基由20×Hank’s 25mL、PPLO肉汤粉 2g、酵母提取物5g、乳清蛋白水解物0.5g、脑心浸液粉5g、1%氯化锌溶液0.5mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水880ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3mL、5％半胱氨酸溶液2mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι2mL、10万U/ml青霉素5mL和灭活的健康猪血清90mL组成。
5.根据权利要求1-4任一项所述的猪肺炎支原体培养基在生产猪肺炎支原体疫苗中的应用，所述培养基能够快速分离和培养猪肺炎支原体，培养猪肺炎支原体的滴度可以达到1010-1011CCU，培养时间最低可至42h。
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