CN1724069A

CN1724069A - 禽传染性鼻炎疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN1724069A
Application number: CN 200510027331
Authority: CN
Inventors: 刘永德; 叶陈梁; 吴祖立; 汪毅
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2005-06-30
Publication date: 2006-01-25

Abstract

一种生物工程领域的禽传染性鼻炎疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)将副鸡嗜血杆菌CVCC258和CVCC269复苏后连续传代接种鸡胚，分离鉴定细菌作菌种；2)将菌种通过液体培养基增殖细菌，使培养物的含菌量高达10¹¹CFU/ml；3)菌体灭活后，加入盐酸左旋咪唑和亚硒酸钠维生素E注射液，制成油乳剂苗。本发明疫苗免疫鸡后7天产生坚强免疫力，免疫期6个月，免疫期内攻毒保护率100％。本发明适用于各养禽场对禽类的免疫接种，安全可靠。

Description

禽传染性鼻炎疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种疫苗的制备方法，具体地说，是一种禽传染性鼻炎疫苗的制备方法。属于生物工程领域。

背景技术

鸡传染性鼻炎是鸡的一种呼吸道疾病，是当前危害养鸡业发展的重要传染病之一，其病由副鸡嗜血杆菌引起。副鸡嗜血杆菌CVCC258和CVCC269是《中国菌种目录》在编菌种(英文版，1992年10月机械工业出版社出版，中国微生物菌种保藏管理委员会编著)，中国兽医微生物保藏中心作为中国微生物菌种保藏管理委员会下设机构保证常年为国内外教学、科研、生产单位提供《中国菌种目录》中的微生物，列入《中国菌种目录》的微生物将长期保存，一直对外供应，公众能从中国兽医微生物保藏中心买到的微生物菌种(CVCC：中国兽医微生物保藏中心，该中心20多年来为生产、科研、教学提供了6万多株各类兽医微生物菌种)。副鸡嗜血杆菌CVCC258和CVCC269是禽传染性鼻炎的病源。CVCC258是1984年从发病鸡中分离，血清型C型；CVCC269是从发病鸡中分离，血清型A型。目前，繁殖副鸡嗜血杆菌用的培养基一般使用固体的巧克力培养基，也有使用心脑浸汤、鸡胚或细胞培养，该菌是一种需要有V因子才能在体外生长的微生物。该病病程较长，虽然抗菌药物能控制本病，但治疗期间仍有死亡，停药后极易复发，而且不能消除带菌状态，因此疫苗的应用仍十分必要。目前灭活疫苗主要为油乳剂苗和氢氧化铝疫苗。疫苗注射后14天才能产生坚强免疫力；近期平均保护率可达80％。

经对现有技术的文献检索发现，张知良等人在《中国禽业导刊》1998年14卷6期上发表的“鸡传染性鼻炎油乳剂灭活疫苗的研究”一文中，将鸡传染性鼻炎A型和C型菌株接种自制的鸡肉汤(鸡血清、血红素)和琼脂培养基，用甲醛灭活，选择矿物油制备成油乳剂疫苗。该苗免疫期内的攻毒保护率为84％-91.6％。该苗制备过程中培养液中菌体含量低，以至于免疫后攻毒保护率较低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种禽传染性鼻炎疫苗的制备方法，使其提供副作用小、免疫力强、免疫期长的疫苗。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

1)将副鸡嗜血杆菌CVCC258和CVCC269复苏后连续传代接种鸡胚，分离鉴定细菌作菌种；

2)将副鸡嗜血杆菌通过鸡肉汤裂解血液体培养基增殖细菌，使培养物的含菌量高达10¹¹CFU/ml(CFU为菌落形成单位)；

3)菌体灭活后，按水相总量5％加入盐酸左旋咪唑和按水相总量20％加入亚硒酸钠维生素E注射液；

4)在高压乳化泵中将水相与油相按1∶1比例混合乳化，即成鸡传染性鼻炎疫苗，每0.5ml含菌体1亿。

所述的副鸡嗜血杆菌，是标准菌株，血清型为A型和C型。

所述的的鸡肉汤裂解血液体培养基，是指取鸡胸肌肉100克，洗净绞碎，加入800毫升蒸馏水，煮沸10分钟，过滤去除肉渣，将鸡肉汤调整容量至900毫升，在无菌的条件下，取绵羊血(或鸡血)100毫升，放入-40℃冰箱冻融3次即成裂解血，在900毫升鸡肉汤中加入蛋白胨5克，酵母浸膏2克，葡萄糖5克，氯化钠10克，溶解后调pH值为7.4，在高压灭菌器中121℃灭菌20分钟，冷却后加入无菌动物裂解血100毫升，即成鸡肉汤裂解血液体培养基。

本发明的基本原理是，左旋咪唑和硒在免疫调节上有重要作用，能提高免疫原的抗体效价。在本苗中同时加入左旋咪唑和亚硒酸钠维生素E，通过提高机体的细胞免疫功能，激活辅助性T细胞，产生B细胞活化因子，协助B细胞产生抗体，依靠细胞免疫和体液免疫，使机体在免疫早期产生高滴度抗体。

本发明采用标准的副鸡嗜血杆菌，经液体培养基培养，灭活后加入免疫增强剂盐酸左旋咪唑和亚硒酸钠维生素E，制成油乳剂疫苗。疫苗免疫鸡后7天产生坚强免疫力，免疫期6个月，免疫期内攻毒保护率100％。疫苗免疫后，鸡群副作用小、免疫产生时间早、免疫力强、免疫期长。本疫苗适用于各养禽场，安全可靠。

具体实施方式

实施例1

副鸡嗜血杆菌标准株A或C复苏后作为菌种，接种于液体培养基培养36小时后，加入福尔马林液使含量达0.5％。摇匀后37℃灭活18小时。在菌体灭活前，按部颁标准进行培养物细菌总数测定，含菌量一般为10^10-11CFU/ml。取灭活菌液接种于巧克力培养基培养48小时，无细菌生长时备用。在灭菌液中加入无菌4％吐温-80，按5％加入无菌盐酸左旋咪唑，20％加入亚硒酸钠维生素E注射液，调pH7.0为水相；在10号白油中加入6％司本-80，再加入2％硬脂酸铝，灭菌后为油相。在高压乳化泵中将水相与油相按1∶1比例混合乳化，即成鸡传染性鼻炎疫苗，每0.5ml含菌体1亿。

该疫苗经性状测定和安全性试验表明，为油包水类型，稳定性良好，粘度适中，安全可靠。该疫苗在20℃保存3个月，4℃保存6个月不出现分层。试验鸡接种本疫苗后7天产生坚强的免疫力，免疫期6个月，免疫期内的攻毒保护率为100％。

实施例2

副鸡嗜血杆菌标准菌株血清型A和C型接种于液体培养基培养36小时后，加入福尔马林液使含量达0.5％。摇匀后37℃灭活18小时。取灭活菌液接种于巧克力培养基培养48小时，无细菌生长时备用。在灭菌液中加入无菌4％吐温-80，按5％加入无菌盐酸左旋咪唑，20％加入亚硒酸钠维生素E注射液，调pH7.0为水相；在10号白油中加入6％司本-80，再加入2％硬脂酸铝，灭菌后为油相。在高压乳化泵中将水相与油相按1∶1比例混合乳化，即成鸡传染性鼻炎疫苗，每0.5ml含菌体1亿。

本苗适用于各养禽场对禽类的免疫接种，安全可靠。疫苗免疫鸡后7天产生坚强免疫力，免疫期6个月，免疫期内攻毒保护率100％。

Claims

1、一种禽传染性鼻炎疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)将副鸡嗜血杆菌CVCC258和CVCC269复苏后连续3次传代接种11日龄鸡胚，分离鉴定细菌作菌种；

2)将菌种通过鸡肉汤裂解血液体培养基增殖细菌，使培养物的含菌量高达10¹¹CFU/ml；

3)菌体灭活后，加入盐酸左旋咪唑和亚硒酸钠维生素E注射液，制成油乳剂苗；

4)在高压乳化泵中将水相与油相混合乳化，即成鸡传染性鼻炎疫苗。

2、根据权利要求1所述的禽传染性鼻炎疫苗的制备方法，其特征是，所述的的鸡肉汤裂解血液体培养基，是指：取鸡胸肌肉100克，洗净绞碎，加入800毫升蒸馏水，煮沸10分钟，过滤去除肉渣，将鸡肉汤调整容量至900毫升，在无菌的条件下，取绵羊血或鸡血100毫升，放入-40℃冰箱冻融3次即成裂解血，在900毫升鸡肉汤中加入蛋白胨5克，酵母浸膏2克，葡萄糖5克，氯化钠10克，溶解后调pH值为7.4，在高压灭菌器中121℃灭菌20分钟，冷却后加入无菌动物裂解血100毫升，即成鸡肉汤裂解血液体培养基。

3、根据权利要求1所述的禽传染性鼻炎疫苗的制备方法，其特征是，所述的副鸡嗜血杆菌，是标准菌株，CVCC269血清型为A型，CVCC258为C型。

4、根据权利要求1所述的禽传染性鼻炎疫苗的制备方法，其特征是，所述的盐酸左旋咪唑的浓度是按水相总量5％，所述的亚硒酸钠维生素E注射液的浓度是按水相总量20％。

5、根据权利要求1所述的禽传染性鼻炎疫苗的制备方法，其特征是，所述的水相与油相的比例是1∶1。

6、根据权利要求1所述的禽传染性鼻炎疫苗的制备方法，其特征是，所述的鸡传染性鼻炎疫苗所含抗原量是每0.5ml含菌体1亿。