CN101144062B - 一种干酪乳杆菌菌株及其制品在禽类免疫中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)菌株及其制品在禽类免疫中的应用，所述干酪乳杆菌菌株是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株；该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.1697。该干酪乳杆菌菌株用于制备鸡新城疫疫苗H5和禽流感病毒油乳剂灭活疫苗协同免疫制剂的制备方法，包括收集菌株、培养菌株、试验筛选、菌液制备、菌体肽聚糖制备、肽聚糖佐剂、鸡新城疫疫苗的制备和试验菌的死菌液制备。本发明的干酪乳杆菌具有较强的耐性和耐酸生长特性、能够耐受人工胃肠消化液，尤其在脱脂乳液中能够耐受pH2.0的人工胃液；该干酪乳杆菌对细胞免疫、体液免疫和肠黏膜局部免疫功能有增强作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种干酪乳杆菌(L.casei Zhang)，以及该菌株及其菌体成分在鸡新城疫疫苗和禽流感疫苗的协同免疫方面的应用。
技术背景
新城疫是由病毒引起的鸡和火鸡急性高度接触性传染病，也称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，常呈败血症症状。主要特征是呼吸困难，下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血。本病1926年首次发现于印尼，同年发现于英国新城，据此命名为新城疫。本病分布于世界各地，1928年我国已有本病的记载。国际动物卫生组织和我国将本病列为A(一)类动物传染病之一。新城疫是危害我国养鸡业最严重的传染病。
新城疫疫苗有弱毒疫苗和灭活疫苗两大类，鸡新城疫弱毒疫苗有B1天然弱毒株，F天然弱毒株，LaSota天然弱毒株和适用于热带、亚热带地区的V4株。灭活疫苗主要有用白油和硬脂酸铝等化学试剂为佐剂的新城疫油乳剂灭活苗，蜂胶为免疫增强剂制备的新城疫蜂胶灭活疫苗，以氢氧化铝为佐剂的新城疫氢氧化铝灭活苗等。虽然疫苗种类多，但免疫后免疫失败或抗体水平低等导致新城疫的流行和非典型新城疫时有发生。
禽流感(Avian Influenza，AI)又称欧洲鸡瘟、真性鸡瘟，是由正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的禽类感染和/或疾病综合症。现在在全世界各种家禽和野生禽类中，已发现了上千种属于不同抗原亚型的流感病毒。更为甚者是在短短的几年时间里，先后发生禽流感H5N1、H7N7、H9N2病毒跨越种属屏障直接感染人类的病例，引起世界各地流感专家们的高度关注。虽然目前还没有发现禽流感H5N1、H7N7、H9N2病毒具有人传人的能力，但它们均属甲型流感病毒，而甲型流感病毒变异性非常大，就有可能通过抗原变异或通过与人流感病毒发生基因重配，形成重配株，从而具备人传人的能力。因此，禽流感给人类带来了严峻的挑战，它具有极其重要的公共卫生意义。
国内外的禽流感防制实践表明，疫苗免疫是防止禽流感暴发和造成巨大损失的主要措施、关键环节和最后防线。禽流感防治中应用的疫苗主要为灭活全病毒疫苗
灭活全病毒疫苗一般是用甲醛灭活，禽流感病毒鸡胚增殖的尿囊液，辅以佐剂制成的油乳剂疫苗。我国已经研制成功H5、H7亚型禽流感灭活疫苗，并取得了良好的免疫效果。目前禽流感的流行仍很严重，因此提高禽流感灭活疫苗的免疫效力是关键，而免疫效力与免疫佐剂关系密切。
目前疫苗接种结合抗生素化学药物的综合措施仍为养殖业疾病防控的主要手段，但由于部分疫苗免疫力不强，免疫保护期短等原因致使对某些病原性疾病的预防效果一直不甚理想，还出现了抗生素、激素和兴奋剂类等残留问题并对人类健康造成严重的威胁，针对这些问题科学家们将动物药品添加剂、免疫增强剂的研究方向投向了具有生长促进作用和增强免疫效果的微生态制剂以及中草药。
乳酸菌制剂在免疫协同作用方面国内外学者做了许多研究，如嗜酸乳杆菌对寄主的免疫系统有较强的调节作用。王会娟等人用乳酸菌培养后分别稀释为0.5％、0.1％和0.5％的剂量给雏鸡饮水，攻毒大肠杆菌后，在以后的成活率和日增重上，试验组与对照组相比均有不同程度的提高，尤其0.1％的处理效果最好。肽聚糖(peptidoglycan，PG)是革兰氏阳性菌细胞壁的主要组成成分。其具有多种免疫学活性，如可激活补体、调节免疫反应、刺激淋巴细胞增殖、激活吞噬细胞，从而抑制体内肿瘤细胞生长和增强机体抗感染的能力。细菌细胞壁(PG)是一种免疫增强剂，主要通过诱导各种免疫调空物质的释放来刺激免疫系统发挥其免疫功能。
近年来发现，多种细菌DNA对高等动物免疫系统具有强烈的免疫刺激作用，其免疫活性部位为非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核甘酸的特定结构，即以CpG为核心，5’端紧接2个嘌呤，3’端紧接2个嘧啶，简写为5’-PuPuCpGpPyPy-3’。据报道，CpG-DNA可直接激活巨噬细胞分泌IL-12与TNF-α。人单核细胞受细菌DNA刺激后，IL-6、IL-12和TNF-α等细胞因子分泌增加，MHC-I与MHC-II类抗原表达增加，共刺激信号CD86与CD40表达增加，抗原提呈功能增强。CpG-DNA还可延长抗原提呈细胞的存活期。细菌DNA可直接或间接地促进NK细胞的功能。CpG基序(CpG motif)刺激动物DC、单核巨噬细胞、NK细胞等多种免疫细胞的分化增殖，诱导细胞表面分子的表达及细胞因子的释放，协同调节机体的先天性防御反应与获得性免疫反应。
发明内容
本发明针对上述课题，从内蒙古传统功能性发酵乳——酸马奶中分离乳杆菌，采用体外耐酸性试验、耐胆酸盐试验、降胆固醇试验等一系列试验筛选一株具有潜在益生作用的干酪乳杆菌(L.casei Zhang)，并通过动物实验证实了对鸡新城疫疫苗(新城疫油乳剂灭活苗和LaSota弱毒苗)和禽流感病毒(H5)油乳剂灭活疫苗的协同免疫作用。
本发明的目的是提供一种干酪乳杆菌(L.casei Zhang)的新菌株及其菌体成分在鸡新城疫疫苗和禽流感病毒(H5)油乳剂灭活疫苗协同免疫作用方面的应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种干酪乳杆菌菌株，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)菌株是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株；所述菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCCNo.1697，保藏时间：2006年4月21日，地址：中国北京市海淀区中关村北一条13号。
一种干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei Zhang)的应用，所述干酪乳杆菌菌株在鸡新城疫疫苗和禽流感病毒H5油乳剂灭活疫苗协同免疫方面的应用。
一种干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei Zhang)用于制备鸡新城疫疫苗H5和禽流感病毒油乳剂灭活疫苗协同免疫制剂的制备方法，包括收集菌株、培养菌株、试验筛选、菌液制备、菌体肽聚糖制备、肽聚糖佐剂、鸡新城疫疫苗的制备和试验菌的死菌液制备。
所述的干酪乳杆菌菌株用于制备鸡新城疫疫苗H5和禽流感病毒油乳剂灭活疫苗协同免疫制剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法步骤为：
a.收集菌株：
以酸马奶为乳杆菌分离样品，取2mL所述酸马奶放入灭菌小试管中，再取1mL所述酸马奶放入装有灭菌CaCO3粉的无菌容积为2mL的采样瓶中，作为备用样品放在冰箱内，在4℃条件下冷藏；
b.培养菌株：
用灭菌吸管吸取1mL所述酸马奶样品并接种于10mL石蕊牛乳培养基中；将所述接种的培养基置于30～37℃恒温箱中增菌培养至酸化凝固并呈现粉红色时取出，用灭菌接种环挑取划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基中，将其放入gaspak厌氧培养罐中，置于30～37℃条件下培养48～72小时；
c.试验筛选：
(1)形成菌落后，用接种环挑取菌落，接种于MRS培养液中，再置于30～37℃条件下培养24～48小时，待菌株生长良好后，再次划线接种于BL琼脂培养基中，置于30～37℃条件下培养24～48小时；
(2)观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行过氧化氢酶试验，分离出在所述试验中呈阴性的杆菌，所述杆菌为干酪乳杆菌，将所述干酪乳杆菌进行真空冷冻干燥保存；
d.菌液制备：
(1)将所述干酪乳杆菌菌株接种于MRS培养液，在37℃条件下培养18小时，经离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％灭菌脱脂牛乳液，并调整其菌数为2.0×1010cfu/mL，混匀后倾注培养；
(2)将菌株培养物的1％接种于MRS培养液，在37℃条件下培养18小时，再接种10％的脱脂乳，在37℃条件下培养8小时，调整其菌数为3×109cfu/mL，pH值为4.4～4.6，置于4℃条件下备用；
(3)将L.casei Zhang菌体接种于500毫升MRS液体培养基中，在37℃条件下静止深层培养48小时，培养完毕后，迅速降温至4℃，离心收集细菌，置于100℃沸水水浴箱中灭活20分钟，在4℃条件下保存备用；
e.菌体肽聚糖PG制备：
(1)超声破碎：将2g湿菌体悬浮于蒸馏水中，进行超声处理20分钟，重复3次进行物理破碎，再以1000r/min离心15分钟，去除未破碎的菌体，将上清液以10000r/min离心20分钟，收集粗细胞壁；
(2)SDS处理：取适量以1000r/min离心15分钟，分离得到的粗细胞壁0.7～1.1g，加10g/dLSDS，沸水浴10分钟，以10000r/min离心20分钟，将沉淀物用灭菌蒸溜水洗涤4次，用无水乙醇脱水；
(3)胰蛋白酶处理：将经过SDS处理的经证实未失活的粗细胞壁洗净后溶于0.1g/dLTrypsin0.1mol/LTris缓冲液pH＝7.5中，在37℃条件下水浴振荡20小时，以OD620不再下降为准，以10000r/min离心20分钟，将沉淀用蒸馏水洗涤4次，获得酶处理粗细胞壁，用无水乙醇脱水；
(4)三氯乙酸TCA去除共价结合的磷壁酸：将酶处理沉淀物悬浮在10g/dL TCA溶液中，沸水浴20分钟后冷却，以10000r/min离心20分钟，用蒸馏水洗涤3次，用无水乙醇脱水，在70℃条件下干燥后，置于4℃条件下保存备用；
f.肽聚糖佐剂、新城疫疫苗的制备：把乳酸菌肽聚糖与鸡新城疫苗、禽流感病毒H5油乳剂灭活疫苗在乳钵中研磨混匀，最终制成肽聚糖PG含量为100ug/ml、300ug/ml、3000ug/ml油包水型制剂，在4℃条件下保存备用；
g.死菌液制备：把活菌液在60℃水浴1小时，再接种于MRS固体培养基上培养24～48小时无菌生长，获得死菌液。
本发明的干酪乳杆菌(L.casei Zhang)具有较强的耐性和耐酸生长特性、能够耐受人工胃肠消化液，尤其在脱脂乳液中能够耐受pH2.0的人工胃液；能耐受的胆盐浓度达1.8％。同时对其影响小鼠外周血T淋巴细胞亚群、其血清IgG水平及肠黏膜SIgA水平进行分析，证明了该菌对细胞免疫、体液免疫和肠黏膜局部免疫功能有增强作用。
通过以下各个实验内容来更详细的说明本发明。以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实例的限制。
具体实施方式
本发明中干酪乳杆菌(L.casei Zhang)的分离纯化过程如下：
以内蒙古传统功能性发酵乳——酸马奶为乳杆菌分离样品，将牧民家庭自然发酵制作的酸马奶，在其发酵容器中充分搅拌后，用带有灭菌吸头的移液器，吸取2mL放入带有胶塞的灭菌小试管(15mm×150mm)中封口，再吸取1mL于放入带螺旋帽装有灭菌CaCO3粉的无菌容积为2mL的采样瓶中，拧紧螺旋帽作为备用样品。将收集的样品放入冰盒内冷却，间隔一定时间更换冰袋，保持较低温度状态下带回实验室转放4℃冰箱，尽快进行乳酸菌的分离。
乳杆菌分离时，用灭菌吸管吸取1mL酸马奶样品接种于10mL灭菌石蕊牛乳培养基中，置30℃恒温箱增菌培养至酸化凝固，培养基颜色变为粉红时取出，用灭菌接种环挑取划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基(日本荣研株式会社制品)上，放入
gaspak厌氧培养罐中，置30℃，培养48h～72h。待菌落形成后，用接种环或接种针挑取菌落，接种于MRS培养液中，置30℃，培养24h～48h。待菌株生长良好后，再次划线接种于BL琼脂培养基，置30℃，培养24h～48h，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验。将革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性的杆菌，进一步鉴定为干酪乳杆菌，并真空冷冻保存。
该干酪乳杆菌(L.casei Zhang)的生物学特性见表1。
表1 L.casei Zhang的生物学特性
应用实施例1：L.casei Zhang活菌液和发酵乳对鸡新城疫HI抗体效价影响。
1.试验动物和新城疫疫苗：
1日龄的迪卡雏鸡：购自内蒙古畜牧科学院种鸡场。
新城疫疫苗：LaSota(IV)系弱毒苗，批号：5544003，购自内蒙古金宇集团生物制药厂。
新城疫种毒(ND)：内蒙古农业大学动物科学与医学学院家畜传染病学教研室保存。
饲料：正大公司的小鸡、中鸡颗粒饲料。
2.动物试验方法
(1)试验动物分组和饲喂方式
将1日龄的迪卡雏鸡70只，随机的分成7组，每组10只。分组与饲喂方式见表2。
表2 分组与饲喂方式
(2)试验菌的活化、悬浮液与发酵乳的制作
试验菌液的制备：将菌株接种于MRS培养液，37℃培养18h，经离心(3,000r/min、10min)收集菌体，用灭菌生理盐水离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％灭菌脱脂乳液，并调整其菌数为2.0×1010cfu/mL，混匀后倾注培养，计活菌数确认后备用。
发酵乳的制备：将菌株1％接种MRS培养液，37℃培养18h，再接种10％的脱脂乳(加入了5％的蔗糖)活化三代，按2％接种10％脱脂乳(加入了5％的蔗糖)，37℃培养8h(凝乳)，调整其菌数为3×109cfu/mL，pH值为4.4～4.6放于4℃备用。
(3)鸡新城疫疫苗的免疫与HI效价的检测
在10日龄时，将200羽/份的冻干疫苗用生理盐水稀释为100mL，按每鸡0.5mL的量进行滴鼻点眼首次免疫，在28日龄时按同样的方法进行第二次加强免疫，在二免后的第7天(35日龄)和二免后的第14天(42日龄)时，随机抽取每组6羽鸡，翅静脉采血，分离血清，按郑明球主编.“家畜传染病学试验指导”(中国农业出版社，1999)的有关方法测定血凝抑制(HI)效价。以下均同此方法。
(4)数据统计方法
应用SAS6.0系统统计软件对各试验数据进行方差分析和显著性检验。
3.结果分析
L.casei zhang活菌制剂和发酵乳对鸡新城疫疫苗免疫后HI抗体效价影响测定结果，如表3所示。
表3 饲喂L.casei Zhang的菌体制剂鸡新城疫疫苗免疫后HI效价 (单位：log2)
注：小写字母不同表示差异显著(p<0.05)大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)
在第二次免疫后的第7天，测定各实验组鸡群新城疫血凝抑制效价(HI)结果显示：
1.L.casei Zhang活菌液高剂量组显著高于对照组(p<0.05)，
2.其它组极显著的高于对照组(p<0.01)，
3.试验组与对照组相比，可提高抗体水平0.77～1.77(log2)，
4.在发酵乳组L.casei Zhang的中剂量组显著的高于菌液L.caseiZhang各剂量组(p<0.05)，
5.其它各组差异不显著。
在第二次免疫后的第14天时，试验鸡群鸡新城疫血凝抑制效价(HI)测定结果显示：
1.菌液组L.casei Zhang的中、高剂量组以及发酵乳组L.casei Zhang的低、高剂量组显著的高于对照组(p<0.05)，
2.其它各组均极显著的高于对照组(p<0.01)，同对照组相比，试验组可提高抗体水平0.61～1.77(log2)，
3.在试验组中，L.casei Zhang的菌液低剂量组、L.casei Zhang发酵乳的中剂量组极显著的高于L.casei Zhang的菌液高剂量组和发酵乳的中、高剂量组(p<0.01)，
4.L.casei Zhang的菌液低剂量组、L.casei Zhang发酵乳的中剂量组显著的高于L.casei Zhang菌液的中、高剂量组。
应用实施例2：L.casei Zhang菌液和死菌液对鸡新城疫HI抗体效价影响。
1.试验动物和新城疫疫苗
1日龄的迪卡雏鸡：购自内蒙古畜牧科学院种鸡场。
新城疫疫苗：LaSota(IV)系弱毒苗，批号：5544003，购自内蒙古金宇集团生物制药厂。
新城疫种毒(ND)：内蒙古农业大学动物科学与医学学院家畜传染病学教研室保存。
饲料：正大公司的小鸡、中鸡颗粒饲料。
2.动物试验方法
(1)试验动物分组和饲喂方式
将1日龄的迪卡雏鸡140只，随机的分成7组，每组20只。分组与饲喂方式见表4。
表4 分组与饲喂方式
(2)试验菌的活菌液的制备
试验菌液的制备：将菌株接种于MRS培养液，37℃培养18h，经离心(3,000r/min、10min)收集菌体，用灭菌生理盐水离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％灭菌脱脂乳液，并调整其菌数为2.0×1010cfu/mL，混匀后倾注培养，计活菌数确认后备用。
(3)试验菌的死菌液的制备：把活菌液在60℃水浴1h，再接种MRS固体培养基上培养24～48h无菌生长为获得死菌液。
(4)鸡新城疫疫苗的免疫与HI效价的检测
在10日龄时，将200羽/份的冻干疫苗用生理盐水稀释为100mL，按每鸡0.5mL的量进行滴鼻点眼首次免疫，在28日龄时按同样的方法进行第二次加强免疫，在二免后的第7天(35日龄)和二免后的第14天(42日龄)时，随机抽取每组12羽鸡，翅静脉采血，按照分离血清的有关方法测定血凝抑制(HI)效价。
(5)数据统计方法
应用SAS6.0系统统计软件对各试验数据进行方差分析和显著性检验。
3.结果分析
L.casei zhang活菌液和死菌液对鸡新城疫疫苗免疫后血凝抑制抗体效价测定结果，如表5所示。
表5 灌服活菌液和死菌液对鸡新城疫疫苗HI抗体效价测定结果 (单位：log2)
注：小写字母不同表示差异显著(p<0.05)大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)
二免后第七天试验鸡群鸡新城疫血凝抑制效价(HI)测定结果显示：
1.除L.casei Zhang死菌中剂量组其它实验组均极显著高于对照组(p<0.01)；
2.L.casei Zhang活菌组各组之间无显著性差异；活菌组各组高于死菌组(L.casei Zhang死菌高除外)。
二免后第十四天试验鸡群鸡新城疫血凝抑制效价(HI)测定结果显示：
1.L.casei Zhang活菌高、中、低剂量组极显著高于对照组；
2.L.casei Zhang活菌高、中、低剂量组极显著高于L.casei.zhang死菌各组(p<0.01)；
3.L.casei Zhang死菌各组与对照组无显著性差异。
应用实施例3：L.casei Zhang DNA佐剂对鸡新城疫油乳剂灭活苗免疫雏鸡后抗体效价的影响。
1.试验动物和新城疫疫苗：
试验动物：1日龄的迪卡雏鸡，购自内蒙古畜牧科学院种鸡场。
新城疫油乳剂灭火疫苗：批号：s48002，购自内蒙古金宇集团生物制药厂。
饲料：正大公司的小鸡、中鸡颗粒饲料。
2.L.casei Zhang菌DNA制备：
(1)菌体的制备：将菌种活化后接种于MRS培养液，37℃培养18h，离心(3,000r/min、10min)收集菌体，用灭菌生理盐水洗涤，离心后，收集菌体，-20℃保存备用。
(2)细菌DNA的提取：将收集的菌体液氮冷冻迅速研磨成粉末；将粉末转到离心管，加裂解缓冲液，混匀，65℃作用1~2小时后加等体积酚:氯仿:异戊醇，混合后10000r/min离心10min；取上清液，加等体积氯仿，混合，静置5min后，10000r/min离心6min；取上清液，加0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，静置30min，1200r/min快速离心5min，70％乙醇洗2次，待干；干燥的DNA溶于1*TE，加Rnase37℃作用1小时；加等体积酚:氯仿:异戊醇，轻轻混匀后离心，取上清液，加等体积氯仿，轻轻混匀，离心；取上清液，加1/10倍体积3mol/L NaCl和2倍体积预冷无水乙醇，10000r/min离心6min，70％乙醇洗2次，待干，紫外分光光度计法测定DNA的纯度(OD值在1.8-2.0为宜)和含量，合格制品-20℃冻存备用。
3.L.casei Zhang DNA佐剂新城疫疫苗的制备：
把乳酸菌DNA与新城疫油乳剂灭活疫苗在乳钵中研磨混匀，最终制成DNA含量为100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml油包水型制剂，4℃保存备用。
4.分组及免疫剂量
将1日龄的雏鸡80只，随机分成4组，每组20只。分组与免疫剂量如表6。
表6 分组与免疫剂量
15日龄时首免，首免两周后加强免疫，在二免后的第7天和第14天时，每组随机抽取12只鸡，翅静脉采血分离血清的有关方法进行HI抗体滴度检测。
5.数据统计方法
应用SAS6.0系统统计软件对各试验数据进行方差分析和显著性检验。
6.结果分析
L.caseiZhang DNA佐剂鸡新城疫油乳剂灭活苗免疫雏鸡后抗体效价如表7所示。
表7 L.casei Zhang的DNA鸡新城疫油乳剂灭活疫苗免疫雏鸡后抗体效价(单位：log2)
注：小写字母不同表示差异显著(p<0.05)大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)
二免后的第7天血凝抑制效价(HI)：
1.L.casei Zhang DNA高、中、低剂量组极显著高于对照组(p<0.01)；
2.试验组与对照组相比，可提高抗体水平20.16~22.23。
二免后的第14天血凝抑制效价(HI)：试验组与对照组相比，可提高抗体水平20.66~22.16；L.casei Zhang DNA高、中、低剂量组极显著高于对照组(p<0.01)；L.caseiZhang DNA高剂量组极显著高于对照组、L.caseiZhang DNA中、低剂量组(p<0.01)。
应用实施例4：L.casei Zhang肽聚糖佐剂对鸡新城疫油乳剂灭活苗免疫雏鸡后抗体效价的影响
1.试验动物和新城疫疫苗：
试验动物：1日龄的迪卡雏鸡，购自内蒙古畜牧科学院种鸡场。
新城疫油乳剂灭火疫苗：批号：s48002，购自内蒙古金宇集团生物制药厂。
饲料：正大公司的小鸡、中鸡颗粒饲料。
2.L.casei Zhang菌体肽聚糖制备
将L.casei Zhang接种于MRS液体培养基中，37℃静止深层培养48h。培养完毕后，迅速降温至4℃(冰浴)。2000r/min，10min，4℃离心收集细菌。于4℃生理盐水反复洗涤细菌至白色，2000r/min，10min，4℃离心收集细菌，置于100℃沸水水浴箱中灭活20min，4℃保存备用。
肽聚糖的提取：
超声破碎：将2g湿菌体悬浮于蒸馏水中，超声处理20min进行物理破碎3次。1000r/min离心15min去除未破碎的菌体，上清液10000r/min离心20min，收集粗细胞壁。
SDS处理：取适量差速1000g离心15min离心分离得到的粗细胞壁(约0.9g)，加10g/dLSDS，沸水浴10min，10000r/min离心20min，沉淀物用灭菌蒸溜水洗4次，无水乙醇脱水。
胰蛋白酶处理：SDS处理过的经证实未失活的粗细胞壁，洗净后溶于0.1g/dL Trypsin 0.1mol/LTris缓冲液(pH7.5)中，37℃水浴振荡20h(以OD620基本不再下降为准)。10000r/min离心20min沉淀用蒸馏水洗涤4次，获得酶处理粗细胞壁，无水乙醇脱水。
三氯乙酸(TCA)去除共价结合的磷壁酸：将酶处理沉淀物悬浮在10g/dL TCA溶液中，沸水浴20min冷却。10000r/min离心20min蒸馏水洗3次，无水乙醇脱水，70℃干燥后，4℃保存备用。
3.L.casei Zhang肽聚糖佐剂新城疫疫苗的制备：
把乳酸菌肽聚糖与新城疫油乳剂灭活疫苗在乳钵中研磨混匀，最终制成PG含量为100ug/ml、300ug/ml、3000ug/ml油包水型制剂，4℃保存备用。
4.分组及免疫剂量
将1日龄的雏鸡80只，随机分成4组，每组20只。分组及免疫剂量如表8。
表8 分组与免疫剂量
15日龄时首免，首免两周后加强免疫，在二免后的第7天和第14天时，每组随机抽取12只鸡，翅静脉采血分离血清的有关方法进行抗体滴度检测。
5.数据统计方法
应用SAS6.0系统统计软件对各试验数据进行方差分析和显著性检验。
6.结果与分析
L.casei Zhang肽聚糖佐剂鸡新城疫油乳剂灭活苗免疫雏鸡后抗体效价如表9所示。
表9 L.casei Zhang肽聚糖佐剂鸡新城疫油乳剂灭活苗免疫雏鸡后抗体效价单位：(log2)
注：小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)
二免后的第7天血凝抑制效价(HI)：
1.试验组极显著的高于对照组(p<0.01)；
2.试验组与对照组相比，可提高抗体水平21..33~22.50；
3.L.casei Zhang肽聚糖高剂量组极显著的高于L.casei Zhang肽聚糖低剂量组(p<0.01)。
二免后的第14天血凝抑制效价(HI)：
1.试验组极显著高于对照组(p<0.01)；
2.试验组与对照组相比，可提高抗体水平21.33~22.33；
3.L.casei Zhang肽聚糖高剂量组极显著高于L.casei Zhang肽聚糖中、低剂量组(p<0.01)。
应用实施例5：L.casei Zhang菌液和死菌液对禽流感病毒(H5)油乳剂灭活疫苗HI抗体效价影响。
1.试验动物和禽流感疫苗
1日龄的迪卡雏鸡：购自内蒙古畜牧科学院种鸡场。
禽流感(H5)油乳剂灭火疫苗：批号：2005054，购自成都精华生物制品有限公司。
禽流感抗原：内蒙古自治区兽医站提供。
饲料：正大公司的小鸡、中鸡颗粒饲料。
2.动物试验方法
(1)试验动物分组饲喂及免疫方式
将1日龄的迪卡雏鸡140只，随机的分成7组，每组20只。分组与饲喂方式见表10。
表10 分组饲喂及免疫方式
28日龄时首免，每只鸡0.5mL颈部皮下注射，两周后按同样的方法进行第二次加强免疫。在二免后的第7天和第14天时，随机抽取每组12只鸡，翅静脉采血分离血清的有关方法进行抗体滴度检测。
(2)试验菌的活菌液的制备：
试验菌液的制备：将菌株接种于MRS培养液，37℃培养18h，经离心(3,000r/min、10min)收集菌体，用灭菌生理盐水离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％灭菌脱脂乳液，并调整其菌数为2.0×1010cfu/mL，混匀后倾注培养，计活菌数确认后备用。
(3)试验菌的死菌液的制备：
把活菌液在60℃水浴1h，再接种MRS固体培养基上培养24～48h无菌生长为获得死菌液。
(4)数据统计方法：
应用SAS6.0系统统计软件对各试验数据进行方差分析和显著性检验。3.结果与分析
L.casei Zhang活菌液和死菌液对禽流感病毒(H5)油乳剂灭活疫苗HI抗体效价测定结果如表11。
表11 灌服L.casei Zhang活菌液和死菌液后禽流感(H5)油乳剂灭活疫苗HI抗体效价单位：log2
注：小写字母不同表示差异显著(p<0.05)大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)
二免后第7天抗体水平检测结果：
1.所有实验组的平均值均高于对照组；
2.L.casei Zhang活菌中剂量组显著高于对照组(p<0.05)；
3.其它各组无显著性差异；
4.活菌液高、中、低剂量组高于相应L.casei Zhang死菌液高、中、低剂量组的值，但无显著性差异。
二免后第14天抗体水平检测结果：
1.L.casei Zhang活菌组平均值均高于对照组；
2.L.casei Zhang活菌组平均值均高于L.casei Zhang死菌组，但差异不显著。
应用实施例6：L.casei Zhang DNA佐剂禽流感病毒(H5)油乳剂灭活疫苗抗体效价的影响。
1.试验动物和禽流感病毒(H5)油乳剂灭活疫苗
试验动物：1日龄的迪卡雏鸡，购自内蒙古畜牧科学院种鸡场。
禽流感病毒(H5)油乳剂灭活疫苗：批号：2005054，购自成都精华生物制品有限公司。
禽流感抗原：内蒙古自治区兽医站提供。
饲料：正大公司的小鸡、中鸡颗粒饲料。
2.L.casei Zhang菌DNA制备：
(1)菌体的制备：将菌种活化后接种于MRS培养液，37℃培养18h，离心(3,000r/min、10min)收集菌体，用灭菌生理盐水洗涤，离心后，收集菌体，-20℃保存备用。
(2)细菌DNA的提取：将收集的菌体液氮冷冻迅速研磨成粉末；将粉末转到离心管，加裂解缓冲液，混匀，65℃作用1~2小时后加等体积酚:氯仿:异戊醇，混合后10000r/min离心10min；取上清液，加等体积氯仿，混合，静置5min后，10000r/min离心6min；取上清液，加0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，静置30min，1200r/min快速离心5min，70％乙醇洗2次，待干；干燥的DNA溶于1*TE，加Rnase37℃作用1小时；加等体积酚:氯仿:异戊醇，轻轻混匀后离心，取上清液，加等体积氯仿，轻轻混匀，离心；取上清液，加1/10倍体积3mol/L NaCl和2倍体积预冷无水乙醇，10000r/min离心6min，70％乙醇洗2次，待干，紫外分光光度计法测定DNA的纯度(OD值在1.8-2.0为宜)和含量，合格制品-20℃冻存备用。
3.L.casei Zhang DNA佐剂禽流感病毒(H5)油乳剂灭活疫苗的制备：
把乳酸菌DNA与禽流感病毒(H5)油乳剂灭活疫苗在乳钵中研磨混匀，最终制成DNA含量为100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml油包水型制剂，4℃保存备用。
4.分组及免疫剂量
将1日龄的雏鸡80只，随机分成4组，每组20只。分组与免疫剂量如表12。
表12 分组与免疫剂量
28日龄时首免，每只鸡0.5mL颈部皮下注射，两周后按同样的方法进行第二次加强免疫。在二免后的第7天和第14天时，随机抽取每组12只鸡，翅静脉采血分离血清的有关方法进行抗体滴度检测。
5.结果与分析
L.casei Zhang DNA佐剂禽流感(H5)油乳剂灭活疫苗免疫雏鸡后抗体效价如表13所示。
表13 L.casei Zhang DNA佐剂禽流感(H5)油乳剂灭活疫苗免疫雏鸡后抗体效价单位：log2
注：小写字母不同表示差异显著(p<0.05)大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)
二免后的第7天血凝抑制效价(HI)：
1.L.casei Zhang DNA高、中剂量组极显著高于对照组(p<0.01)；
2.L.casei Zhang DNA低剂量显著高于对照组(p<0.05)；
3.L.casei Zhang DNA高剂量组显著高于L.casei Zhang DNA中、低剂量(p<0.05)。4。所有试验组均高于对照组，可提高抗体水平21.33~22.67。
二免后的第14天血凝抑制效价(HI)：
1.L.casei Zhang DNA高、中、低剂量组极显著高于对照组(p<0.01)；
2.试验各组均高于对照组试验各组与对照组比可提高抗体水平21.17~22.08。
应用实施例7：L.casei Zhang肽聚糖佐剂对禽流感(H5)油乳剂灭活苗免疫雏鸡后抗体效价的影响
1.试验动物和禽流感(H5)油苗：
试验动物：1日龄的迪卡雏鸡，购自内蒙古畜牧科学院种鸡场。
禽流感(H5)油乳剂灭火疫苗：批号：2005054，购自成都精华生物制品有限公司。
禽流感抗原：内蒙古自治区兽医站提供。
饲料：正大公司的小鸡、中鸡颗粒饲料。
2.L.casei Zhang菌体肽聚糖制备
将L.casei Zhang接种于2MRS液体培养基中，37℃静止深层培养48h。培养完毕后，迅速降温至4℃(冰浴)。2000r/min，10min，4℃离心收集细菌。于4℃生理盐水反复洗涤细菌至白色，2000r/min，10min，4℃离心收集细菌，置于100℃沸水水浴箱中灭活20min，4℃保存备用。
肽聚糖的提取：
超声破碎：将2g湿菌体悬浮于蒸馏水中，超声处理20min进行物理破碎3次。1000g离心15min去除未破碎的菌体，上清液10000r/min离心20min，收集粗细胞壁。
SDS处理：取适量差速1000r/min离心15min离心分离得到的粗细胞壁(约0.9g)，加10g/dLSDS，沸水浴10min，10000r/min离心20min，沉淀物用灭菌蒸溜水洗4次，无水乙醇脱水。
胰蛋白酶处理：SDS处理过的经证实未失活的粗细胞壁，洗净后溶于0.1g/dL Trypsin0.1mol/LTris缓冲液(pH7.5)中，37℃水浴振荡20h(以OD620基本不再下降为准)。10000r/min离心20min沉淀用蒸馏水洗涤4次，获得酶处理粗细胞壁，无水乙醇脱水。
三氯乙酸(TCA)去除共价结合的磷壁酸：将酶处理沉淀物悬浮在10g/dL TCA溶液中，沸水浴20min冷却。10000r/min离心20min蒸馏水洗3次，无水乙醇脱水，70℃干燥后，4℃保存备用。
3.L.casei Zhang肽聚糖佐剂禽流感(H5)油苗的制备：
把乳酸菌肽聚糖按所须剂量称取，与禽流感(H5)油苗油乳剂灭活疫苗在乳钵中研磨混匀，最终制成PG含量为100ug/ml、300ug/ml、3000ug/ml油包水型制剂，4℃保存备用。
4.分组及免疫剂量
将1日龄的雏鸡80只，随机分成4组，每组20只。分组及免疫剂量如表14。
表14 分组与免疫剂量
28日龄时首免，首免两周后加强免疫。在二免后的第7天和第14天时，随机抽取每组12只鸡，翅静脉采血分离血清的有关方法进行抗体滴度检测。
5.结果与分析
L.casei Zhang肽聚糖佐剂对鸡接种禽流感(H5)亚型油乳剂灭活疫苗抗体效价的影响，如表15。
表15 L.casei Zhang的肽聚糖对鸡接种禽流感(H5)亚型油乳剂灭活疫苗后HI效价单位：log2
注：小写字母不同表示差异显著(p<0.05)大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)
二免后的第7天血凝抑制效价(HI)：
1.试验组极显著高于对照组(p<0.01)；可提高抗体水平21.33~22.33；
2.L.casei Zhang肽聚糖高、低剂量组显著高于L.casei Zhang肽聚糖。
中剂量(p<0.05)二免后的第14天血凝抑制效价(HI)：
1.试验各组与对照组比，可提高抗体水平20.33~22.17；
2.L.case Zhang肽聚糖高、中剂量组极显著高于对照组(p<0.01)；
3.L.caseiZhang肽聚糖高、中剂量组极显著高于L.casei Zhang肽聚糖低剂量(p<0.01)；
4.L.casei Zhang肽聚糖高剂量组极显著高于L.casei Zhang肽聚糖中、低剂量组(p<0.01)；
5.L.casei Zhang肽聚糖低剂量组与对照组无显著性差异。
Claims (1)
1.一种干酪乳杆菌菌株在制备鸡新城疫疫苗或禽流感病毒H5油乳剂灭活疫苗协同免疫制剂中的应用，其特征在于：所述干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）Zhang菌株是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株；所述菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.1697。
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Families Citing this family (11)
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Citations (1)
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Non-Patent Citations (2)
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| 徐杰，等，.酸马奶中干酪乳杆菌发酵特性的研究.中国乳品工业34 7.2006,34(7),23-27. |
| 徐杰,等,.酸马奶中干酪乳杆菌发酵特性的研究.中国乳品工业34 7.2006,34(7),23-27. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106635932A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-05-10 | 遵义医学院 | 一种益生菌群及其制备方法 |
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