JP5901609B2 - 過酸化水素耐性付与遺伝子及びその利用 - Google Patents
過酸化水素耐性付与遺伝子及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5901609B2 JP5901609B2 JP2013503506A JP2013503506A JP5901609B2 JP 5901609 B2 JP5901609 B2 JP 5901609B2 JP 2013503506 A JP2013503506 A JP 2013503506A JP 2013503506 A JP2013503506 A JP 2013503506A JP 5901609 B2 JP5901609 B2 JP 5901609B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hydrogen peroxide
- gene
- protein
- amino acid
- lactobacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/335—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Lactobacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
- A61K2035/115—Probiotics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Description
また、酸素から発生するスーパーオキシドアニオンや過酸化水素を消去する、スーパーオキシドジスムターゼや、カタラーゼ、NADHペルオキシダーゼ等を持つものも報告されている。
また、嫌気性グラム陰性細菌バクテロイデス・フラジリスにおいては、チオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ系がチオール/ダイサルファイドの酸化還元反応を司る唯一のシステムであると考えられており、チオレドキシンレダクターゼの欠損により、菌は嫌気的環境下にあってもシステインやジチオスレイトールなどの還元剤の添加なくしては生育できないことが報告されている(非特許文献2)。
また、大腸菌においては、細胞内を還元状態へ保つために必須なグルタチオン−グルタチオンレダクターゼ系や、チオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ系が存在しており、それらに関わる遺伝子破壊株は過酸化水素等の酸化ストレスに感受性になることが報告されている。
しかしながら、酸化ストレスにおいて、代謝の過程で発生する過酸化水素に対する耐性も重要であり、ラクトバチルス属の微生物において、NADHペルオキシダーゼやカタラーゼなど過酸化水素消去に関わる遺伝子は報告があるが、過酸化水素に対して直接抵抗性を示すような遺伝子はこれまでに見出されていない。
1)以下の(a)〜(c)から選ばれるタンパク質をコードする過酸化水素耐性付与遺伝子。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
(c)(a)のアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
2)以下の(d)〜(f)から選ばれるポリヌクレオチドからなる過酸化水素耐性付与遺伝子。
(d)配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
(e)(d)の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f)(d)の塩基配列と85%以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
3)上記遺伝子を微生物に導入するか又は微生物が有する当該遺伝子を改変することを特徴とする当該微生物に対する過酸化水素耐性の付与又は強化方法。
4)上記遺伝子が導入又は改変されてなる微生物。
5)上記微生物を含有する飲食品。
6)上記微生物を含有する医薬品。
7)上記遺伝子の有無及び/又はその発現量を測定することを特徴とする過酸化水素耐性微生物のスクリーニング方法。
8)上記ポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター。
9)上記組換えベクターを含む宿主微生物。
10)上記ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする核酸断片。
11)上記ポリヌクレオチド又はその一部を含むDNAアレイ又はDNAチップ。
また、本発明の遺伝子が導入又は改変された微生物を用いることにより、所望の酸化ストレスに対して抵抗性を有する飲食品、医薬品の製造が可能となる。また、酸素存在下で生菌数を高く維持することが可能になることから、製品製造時の嫌気装置、製品の嫌気保存容器が不要となり、コストを抑えた製造が可能となる。また、一般に生菌数が高くなるほど、微生物の生理効果は増大することから、微生物が有する生理効果を効果的に発揮させることが可能となる。
当該CDS2657遺伝子は、それによりコードされるタンパク質の機能が解明されていない(hypothetical protein)、所謂機能未知の遺伝子である。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
(c)(a)のアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、1若しくは数個、好ましくは1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、pK、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換を挙げることができる。
(d)配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
(e)(d)の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f)(d)の塩基配列と85%以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
すなわち、例えば、いずれかの遺伝子のN末端開始コドンを含む配列からなるオリゴヌクレオチドA、及び該遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドBを化学合成し、これらのオリゴヌクレオチドAとBを1セットにし、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行なうことにより得ることができる。また、こうして得られる遺伝子断片を効率よくプラスミドベクター等にクローニングを行なうために、オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端側に制限酵素切断のための配列を付加して用いることもできる。ここで、プライマーとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。当該ヌクレオチドとしては、配列番号1に対応する部分ヌクレオチド配列であって、10〜50個の連続した塩基、好ましくは15〜35個の連続した塩基等が挙げられる。
また、PCRの条件は、例えば2000塩基対の長さのDNA断片を得る場合には、94℃2分、(95℃10秒、52℃10秒、72℃2分)x30サイクル、72℃7分が挙げられる。
本発明の遺伝子の導入は、当該遺伝子を、元来有しない微生物に導入することにより行うことができる。遺伝子を導入する方法としてはDNAの取り込み能を利用したコンピテンス法、プロトプラストを利用したプロトプラストPEG法及び高電圧パルスを利用したエレクトロポレーション法等を利用すればよく、特にエレクトロポレーション法が好ましい。また、遺伝子を微生物染色体に組み込む場合には、相同組換えを利用した方法、部位特異的に組み込む方法を用いることができる。
遺伝子の発現を増強するには、本発明の遺伝子を運ぶ組換えプラスミドを対象とする微生物に導入すること、該遺伝子を染色体の別の場所に部位特異的組換えによって組み込むことによって微生物内での該遺伝子のコピー数を増加させること、該遺伝子の発現を制御する制御領域を改変したり、制御遺伝子を改変することによって発現を増加させる方法等によって行えばよいが、特に該遺伝子のコピー数を増加させる方法が好ましい。具体的には、1個の微生物細胞あたり複数個のコピー数を持つプラスミドに、対象とする遺伝子をその遺伝子の本来のプロモーター配列とリボソーム結合部位を含めてクローニングするか、別の遺伝子から分離した、あるいは化学合成によって作成したプロモーターとリボソーム結合部位の下流に該遺伝子のポリペプチドをコードする領域だけをつなげてクローニングした組換えプラスミドを作成し、微生物細胞内にエレクトロポレーション法などによって導入することによって、微生物細胞内での該遺伝子のコピー数を上げることができる。
遺伝子の発現を阻害するには、本発明の遺伝子を破壊、欠損すればよく、この方法としては、全く別のDNA断片を遺伝子の内部に挿入する挿入失活法や段階的な相同組換えによって標的遺伝子の一部又は全部を欠失する段階的二重交叉法を用いればよく、特に段階的二重交叉法が好ましい。
具体的には、標的遺伝子の一部又は全部を欠失する場合には、欠失領域をはさむ両側の領域を染色体DNAから分離するか、あるいはPCR法によって増幅して分離し、例えばpYSSE3のような大腸菌では増殖するが対象とする微生物中では複製が出来ないプラスミドベクターにそれら両DNA断片を本来の向きと同じ向きに並んだ状態でクローニングする。次に、得られる組換えプラスミドDNAを、欠失を起こさせようとする微生物にエレクトロポレーション法等を用いて導入し、生じる抗生物質耐性のクローンから、PCR法等によって目的の欠失領域の上流又は下流のクローニングした領域との相同領域で組換えを起こしてプラスミドが染色体上に挿入したクローンを選択する。こうして得たクローンを、抗生物質を含まない培地で継代培養を繰り返すことによって、プラスミドが再び近接して存在する相同領域間の組換えによって染色体から離脱し、菌の増殖に伴って消失することによって、抗生物質耐性をなくしたクローンを選択する。こうして得たクローンからPCR法等によって標的遺伝子領域を欠失したクローンを分離することができる。
すなわち、本発明の遺伝子の有無及び/又はその発現量を測定することにより、過酸化水素耐性の微生物をスクリーニングすることができる。
ここで、遺伝子の有無及び/又はその発現量の測定は、本発明の遺伝子や遺伝子由来のmRNAを検出し得るプローブやプライマーを用いて、微生物における標的とする遺伝子の有無、コピー数や発現量をサザーンハイブリダイゼーション法やDNAマイクロアレイやRT-PCR法により行うことができる。そして、標的遺伝子やその発現の有無により、目的の微生物を選択すればよい。
ここで、使用されるプライマー等の核酸断片としては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、当該ヌクレオチドとしては、配列番号1に示す塩基配列に対応する部分ヌクレオチド配列であって、10〜50個の連続した塩基、好ましくは15〜35個の連続した塩基が好ましい。
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明する。
CDS2657遺伝子について、酸素または過酸化水素のストレスを与えたときの発現量をリアルタイムPCRを用いて解析した。
(1)酸化ストレスの付加
酸素ストレスは、100mlの嫌気MRS培地で7時間培養した後2つに分け、一方を300ml容三角フラスコに入れて、タイテック社製振とう恒温槽を用いて160rpmで30分振とうして与えた。過酸化水素ストレスは、100mlのMRS培地を好気静置で7時間培養した後2つに分け、一方には0.5mMとなるよう過酸化水素を添加し30分継続して培養することで与えた。
MRS培地で培養した培養液2mlを2倍量のRNAprotect Bacteria Reagent(QIAGEN)に添加して攪拌後室温で5分間インキュベートし、RNAを安定化した。5000 x gで10分間遠心して集菌した後、15mg/mlのリゾチームを含むTEバッファー200μlに懸濁し、1mg/mlのN-アセチルムラミデイスSG(生化学工業)10μlを加えて、時々ボルテックスで撹拌しながら室温で10分インキュベートした。RNeasy Mini Kit(QIAGEN)のBuffer RLTを700μl添加して懸濁し、5000 x gで5分間遠心して上清を採取した。以後RNeasy Mini Kit(QIAGEN)、RNAprotect Bacteria Reagent(QIAGEN)に添付のプロトコールに従って精製した。精製途中でRNase-Free DNase Set(QIAGEN)を用いてDNase処理を行い、混入しているDNAを分解した。
調製したRNAは2100 Bioanalyzer(Agilent)を用いて品質を確認した。
標的遺伝子(CDS2657遺伝子)の発現量を定量するためリアルタイムPCRを行った。1μgのtotal RNAを鋳型とし、PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit(タカラバイオ)を用いて逆転写反応(30℃ 10min, 42℃ 50min, 95℃ 5min)を行いcDNAを調製した。希釈したcDNA溶液を鋳型とし、SYBR Premix Ex Taq(タカラバイオ)とプライマーを添加し、7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて、95℃ 30secした後 95℃ 5sec, 60℃ 34secを40サイクル反応させた。また、遺伝子の発現量は16SrRNAを内部標準とし、サンプル間の補正を行った。結果は、非ストレスサンプルの発現量に対するストレスサンプルの発現量の相対値で表した。使用したプライマーは表1に示す。
CDS2657遺伝子は、酸素または過酸化水素ストレスにより、発現促進が認められたが、その結果は過酸化水素でより顕著であった(図1)。
図1中の値は3回の独立した実験の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
(1)遺伝子破壊方法
配列番号1内部の配列の5'末端側に制限酵素BamH I切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-cgcggatccggttcttgtgccattggaaa-3'(配列番号7)、及び配列番号1内部の配列と相補的な配列から選択した配列の5'末端側に制限酵素Pst I切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-aaactgcagtgtcatcacgcagagccaac-3'(配列番号8)をプライマーとし、KOD Plus DNAポリメラーゼ(TOYOBO社製、製品番号KOD-201)を用いて本酵素に添付の方法に従って、ラクトバチルス・カゼイYIT9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行った。こうして増幅されるDNA断片はCDS2657遺伝子のアミノ末端とカルボキシル末端の両側を欠いた部分配列である。生成物を等量のトリス−イーディーティーエー(10mM Tris(pH8.0)−1mM EDTA, TEと呼ぶ)飽和フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール(25:24:1)と混合し、よく攪拌した後、15,000 × g 5分の遠心を行って、2層に分離した。上層の水層を回収し、その10分の1量の3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)と3倍量の99.5%エタノールを加え、-20℃に30分間以上置いた後に、4℃で15,000 x g 15分間の遠心を行った。上清を捨て、沈殿物に70%エタノールを加えて洗浄し、15,000 x g 5分間の遠心をした後エタノールを捨て、沈殿物を真空乾燥した。
(1)実施例2で取得したラクトバチルス・カゼイ MS105株をMRS培地にて一晩培養後、集菌し、50mM リン酸カリウムバッファー(pH6.8)で2回洗浄後、同バッファーに10倍希釈となるように懸濁した。3mlの懸濁液をアルミキャップをした小試験管に注ぎ、終濃度1、3mMとなるよう過酸化水素を添加した。37℃で3時間インキュベート後、菌数を測定し、過酸化水素添加前の菌数に対する生存率を求めた。
ラクトバチルス・カゼイ MS105株は、野生株よりも生存率が2オーダー程度低く、過酸化水素に対する感受性が高まった(図2)。
(1)ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029、ラクトバチルス・カゼイ MS105および、ラクトバチルス・カゼイ MS102(NADH ペルオキシダーゼ破壊株)を使用した。各菌株をMRS培地で7時間培養した後、終濃度0.5mMとなるよう過酸化水素を添加してさらに1時間培養した培養液からOD660 = 1で1mlの菌体量となるよう調整して集菌した。菌体を50mM リン酸カリウムバッファー(pH6.8)で2回洗浄後、同バッファー0.1mlに懸濁した。0.1mlの懸濁液と、0.9mlの90%容量で調製した終濃度100mMの過酸化水素溶液を混合した。37℃で1時間インキュベート後、遠心して菌体を除いた上清の残存過酸化水素濃度を測定した。尚、過酸化水素濃度はBIOXYTECH H2O2-560(フナコシ)を用いて測定した。
このことから、CDS2657遺伝子は過酸化水素消去とは別の機構で過酸化水素耐性に寄与していることが示唆された。
(1)pETベクターへのCDS2657遺伝子のクローニング
プライマーセット(2657F:GGAATTCCATATGCAAATCTCAATCAAACC(配列番号9), 2657R:CGGAATTCTTAGCAAATTTTGCCGCCCA(配列番号10))を用い、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のゲノムDNAを鋳型として、KOD-plus-DNA Polymerase(TOYOBO)を用いてPCRを行い、CDS2657遺伝子断片を増幅した。得られたPCR産物を電気泳動し、目的とする大きさのDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)で切り出し、抽出、精製した。さらに、DNA断片をNde I, EcoR Iで消化し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pET-28b(+)(メルク)はNde I, EcoR Iで消化しQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pET-28b(+)ベクターとCDS2657のDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2(タカラバイオ)を用いてライゲーションし、このライゲーション反応液をE. coli JM109(TOYOBO)に導入し形質転換した。得られた形質転換体から常法により抽出したプラスミドを、E. coli BL21(DE3)コンピテントセル(メルク)に導入し、形質転換体を得た。
タンパク質の発現はpET System Manual(メルク)に準じて行った。
E. coli BL21(DE3)の形質転換体を、カナマイシンを終濃度30mg/mlとなるよう添加した3mlのLB培地で振とう培養し、OD600が0.6に達したところで培養液を4℃で保存した。培養液を抗生物質を含む新しい200mlのLB培地に接種し、OD600が0.6に達するまで37℃で振とう培養した。終濃度1mMとなるようにIPTGを添加し、さらに37℃で3時間振とう培養し、目的タンパク質を誘導した。培養液を氷中に5分置き、4℃、5000 x gで5分遠心して集菌した。培養液体積の0.25倍量の冷却した20mM Tris-HCl pH8.0で洗浄し、遠心操作により集菌し、精製を開始するまで-80℃で凍結保存した。
cell lysateの調製はBugBuster Protein Extraction Reagent(メルク)を用い、添付のプロトコールに従って行った。タンパク質の精製は、Ni-NTA Fast Start Kit(QIAGEN)を用い、添付のプロトコールに従って行った。精製度を確認するために、精製の各ステップで5mlずつサンプリングを行い、SDS-PAGEに供した。SDS-PAGEはNuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel(インビトロジェン)を使用し、常法に従って行った。
溶出を2回にわけて行ったところ、1回目の溶出サンプルは僅かなマイナーバンドが検出されたものの、ほぼ単一に精製できていたため、2回目の溶出液と合わせたものを精製タンパク質とし、以下の実験に使用した(図4)。
(1)鉄とは結合しないBSA(SIGMA)と鉄結合性タンパク質であるFerritin(apoferritin from equine spleen, SIGMA)をコントロールとした。
<アポタンパク質の調製>
精製したCDS2657タンパク質(200μM)を、10mM EDTA、2mM DTTの反応液中で、37℃、1時間インキュベートした。反応後のCDS2657タンパク質を、水で平衡化したPD-10カラム(GE healthcare)で精製し、EDTAと遊離した鉄イオンを除いた。
<鉄結合アッセイ>
アポタンパク質(50μM)とFe(NH4)2(SO4)2・6H2O(10、100、1000μM)を2mM DTT存在下で室温5分インキュベートした(total volume 1mlとした)。尚、鉄を1000μM添加したサンプルは反応液が赤褐色に変化したため、測定サンプルから除外した。水で平衡化したPD-10カラム(GE healthcare)にアプライし、遊離の鉄イオンを除いてタンパク質画分を精製した。タンパク質画分は3mlにメスアップし、ICP発光分光分析装置(バリアンテクノロジーズジャパンリミテッド)を用いて鉄濃度を測定した。
CDS2657タンパク質は鉄との結合性を示し、鉄を100μM添加した時には、1分子あたり約2分子の鉄と結合した(表2)。
ヒドロキシルラジカルの生成と検出は、Halliwell(Halliwell, B., and J. M. Gutteridge. 1981. Formation of a thiobarbituric acid reactive substance from deoxyribose in the presence of iron salts. FEBS Lett. 128:347-352.)およびYamamoto(Yamamoto, Y., L. B. Poole, R. R. Hantgan, and Y. Kamio. 2002. An iron-binding protein, Dpr, from Streptococcus mutans prevents iron-dependent hydroxyl radical formation in vitro. J. Bacteriol. 184:2931-2939.)が報告している方法に従って行った。すなわち、2価鉄によって非酵素的にヒドロキシルラジカルを生成させ、このヒドロキシルラジカルによってデオキシリボースを分解し、産生したマロンジアルデヒド様物質を、チオバルビツール酸と反応させることで、赤色物質を生成させ、その蛍光量を測定することによってヒドロキシルラジカル生成量を求めた。
0.3ml のbasal reaction mixture (10mM potassium phosphate buffer (pH7.4), 63mM NaCl, 4mM 2-deoxyribose)にサンプルを添加し、終濃度10mMとなるようFe(NH4)2(SO4)2・6H2Oを加え、total 2mlで37℃、15分インキュベートした。加熱融解した0.25mlの1%(w/v)thiobarbituric acidと0.25mlの2.8%(w/v) trichloroacetic acidを加えた後、反応液を10分間煮沸し、急冷した。生成した赤色物質を、蛍光分光光度計(Shimadzu)を用いて、532nmで励起し、553nmの蛍光を測定し、サンプル無添加時の蛍光値からの減少をヒドロキシルラジカル生成反応の阻害度として表した(表3)。
鉄キレート剤であるdeferoxamine (SIGMA)は、濃度依存的にヒドロキシルラジカル生成を抑制した。CDS2657も同様に濃度依存的にヒドロキシルラジカルの生成を抑制した。一方、鉄結合タンパク質であるferritinはヒドロキシルラジカル生成をほとんど抑制しなかった。
(1)CDS2657高発現株の作製
CDS2657高発現株は、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029中で機能する合成プロモーター配列をマルチクローニングサイトの上流に配置したpLP10ベクター(Yasuda et. al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74:4746-4755.、Kiwaki et. al. 2002. Biosci. Microflora 20:121-129)にCDS2657遺伝子を挿入したプラスミドをラクトバチルス・カゼイ YIT 9029に導入することで作製した。
CDS2657遺伝子の上流のSD配列から、終止コドンまでを増幅し、制限酵素BamH I切断部位、制限酵素Pst I切断部位をそれぞれ含む配列を付加したプライマーを設計した(2657outF: cgcggatccaatagagaggatggttcgga(配列番号11), 2657outR:aaactgcagttagcaaattttgccgcc(配列番号12))。このプライマーセットを用い、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のゲノムDNAを鋳型として、KOD-plus-DNA Polymerase(TOYOBO)を用いてPCRを行い、CDS2657遺伝子断片を増幅した。得られたPCR産物を電気泳動し、目的とする大きさのDNA断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)で抽出、精製した。さらに、DNA断片をBamH I, Pst Iで消化し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pLP10はBamH I, Pst Iで消化しQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pLP10ベクターとCDS2657のDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2.1(タカラバイオ)を用いてライゲーションし、このライゲーション反応液をE. coli JM109コンピテントセル(TOYOBO)に導入し形質転換した。
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029へのDNA導入には、該微生物をMRS培地(ディフコ社製)に生育し、対数増殖期にある培養液を5,000 x g 4℃で5分間遠心して集菌し、菌体を氷冷した20mM HEPES(pH7.0)と10%グリセロールでそれぞれ1回ずつ洗浄し、洗浄菌体を(初めの培養液のクレット値)x 2μlの10%グリセロールに懸濁した。菌懸濁液40μlと組換えプラスミドDNA溶液2μlを混合し、2mm幅のエレクトロポレーション用キュベットに入れ、ジーンパルサーII(バイオラッド社製)を用いて、1.5kV, 200Ω、キャパシタンス25μFでエレクトロポレーションを行った。この液にMRS培地1mLを加え、37℃で1時間培養後、エリスロマイシンを20μg/mLの濃度で加えたMRS寒天培地に塗布し37℃で2日又は3日間インキュベートした。
ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029、CDS2657破壊株であるラクトバチルス・カゼイ MS105、pLP10ベクターをラクトバチルス・カゼイ YIT 9029に導入した、ラクトバチルス・カゼイ MS101および、CDS2657を高発現したラクトバチルス・カゼイ MS106を用いた。
各菌株をMRS培地に接種し、好気静置条件下で、37℃で培養した。培養7時間後に、終濃度0、1.5、3mMとなるよう過酸化水素を添加し、好気静置条件下で継続して培養した。7時間から24時間の生育を、Klett-Summerson比色計で測定した濁度の増加量で示した。
CDS2657高発現株(MS106)では、過酸化水素を1.5mM、3mM添加しても他の菌株より24時間後の濁度の増加が認められ、過酸化水素を3mM添加した時に、その差は顕著であった(図5)。
Claims (6)
- 以下の(a)〜(c)から選ばれるタンパク質をコードする過酸化水素耐性付与遺伝子をラクトバチルス属細菌に導入するか又はラクトバチルス属細菌が有する当該遺伝子を発現増強するように改変することを特徴とする当該ラクトバチルス属細菌に対する過酸化水素耐性の付与又は強化方法。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
(c)(a)のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質 - 以下の(d)及び(f)から選ばれるポリヌクレオチドからなる過酸化水素耐性付与遺伝子をラクトバチルス属細菌に導入するか又はラクトバチルス属細菌が有する当該遺伝子を発現増強するように改変することを特徴とする当該ラクトバチルス属細菌に対する過酸化水素耐性の付与又は強化方法。
(d)配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
(f)(d)の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド - ラクトバチルス属細菌が、ラクトバチルス・カゼイである請求項1又は2記載の方法。
- 以下の(a)〜(c)から選ばれるタンパク質をコードする過酸化水素耐性付与遺伝子の有無及び/又はその発現量を測定することを特徴とする過酸化水素耐性ラクトバチルス属細菌のスクリーニング方法。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
(c)(a)のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質 - 以下の(d)及び(f)から選ばれるポリヌクレオチドからなる過酸化水素耐性付与遺伝子の有無及び/又はその発現量を測定することを特徴とする過酸化水素耐性ラクトバチルス属細菌のスクリーニング方法。
(d)配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
(f)(d)の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド - ラクトバチルス属細菌が、ラクトバチルス・カゼイである請求項4又は5記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011047841 | 2011-03-04 | ||
JP2011047841 | 2011-03-04 | ||
PCT/JP2012/055401 WO2012121150A1 (ja) | 2011-03-04 | 2012-03-02 | 過酸化水素耐性付与遺伝子及びその利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2012121150A1 JPWO2012121150A1 (ja) | 2014-07-17 |
JP5901609B2 true JP5901609B2 (ja) | 2016-04-13 |
Family
ID=46798114
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013503506A Active JP5901609B2 (ja) | 2011-03-04 | 2012-03-02 | 過酸化水素耐性付与遺伝子及びその利用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9139837B2 (ja) |
EP (1) | EP2682465B1 (ja) |
JP (1) | JP5901609B2 (ja) |
KR (1) | KR102038714B1 (ja) |
CN (1) | CN103732742B (ja) |
ES (1) | ES2626277T3 (ja) |
WO (1) | WO2012121150A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102067341B1 (ko) * | 2018-07-26 | 2020-01-16 | 전남대학교산학협력단 | 산화적 스트레스에 대한 저항성 및 내성을 증가시키는 바실러스 종 pamc23324 유래 펩타이드 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102077930B1 (ko) | 2018-07-26 | 2020-02-14 | 전남대학교산학협력단 | 산화적 스트레스에 대한 저항성 및 내성을 증가시키는 바실러스 종 pamc23412 유래 펩타이드 |
KR102077931B1 (ko) | 2018-07-26 | 2020-02-14 | 전남대학교산학협력단 | 산화적 스트레스에 대한 저항성 및 내성을 증가시키는 바실러스 종 pamc22784 유래 펩타이드 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009150856A1 (ja) * | 2008-06-13 | 2009-12-17 | 株式会社ヤクルト本社 | 酸素耐性付与遺伝子及びその利用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4010740B2 (ja) | 2000-05-08 | 2007-11-21 | 株式会社奥村組 | シールド掘進機 |
JP2001327292A (ja) | 2000-05-22 | 2001-11-27 | Meiji Milk Prod Co Ltd | 酸素耐性遺伝子および該遺伝子によりコードされるタンパク質 |
CN101139557B (zh) | 2006-09-08 | 2010-05-12 | 内蒙古农业大学 | 一种干酪乳杆菌及其在改善血脂代谢和免疫调节中的应用 |
CN101144062B (zh) | 2006-09-15 | 2011-11-16 | 内蒙古农业大学 | 一种干酪乳杆菌菌株及其制品在禽类免疫中的应用 |
-
2012
- 2012-03-02 JP JP2013503506A patent/JP5901609B2/ja active Active
- 2012-03-02 EP EP12755465.7A patent/EP2682465B1/en active Active
- 2012-03-02 ES ES12755465.7T patent/ES2626277T3/es active Active
- 2012-03-02 US US14/003,094 patent/US9139837B2/en active Active
- 2012-03-02 KR KR1020137023261A patent/KR102038714B1/ko active IP Right Grant
- 2012-03-02 WO PCT/JP2012/055401 patent/WO2012121150A1/ja active Application Filing
- 2012-03-02 CN CN201280011277.3A patent/CN103732742B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009150856A1 (ja) * | 2008-06-13 | 2009-12-17 | 株式会社ヤクルト本社 | 酸素耐性付与遺伝子及びその利用 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
JPN7015003079; Database GenBank [online], 09-MAY-2010 uploaded, AccessionNo.FM177140.1,Definition:Lactobacillus cas * |
JPN7015003080; 日本乳酸菌学会誌 Vol.19, No.2, 2008, p.122 * |
JPN7015003081; 日本生物工学会大会講演要旨集 Vol.58, 2006, p.77 * |
JPN7015003082; Journal of Food Science Vol.70, No.8, 2005, pp.M388-M391 * |
JPN7015003083; 腸内細菌学雑誌 Vol.18, 2004, pp.135-140 * |
JPN7015003084; Appl. Environ. Microbiol. Vol.72, No.8, 2006, pp.5143-5149 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102067341B1 (ko) * | 2018-07-26 | 2020-01-16 | 전남대학교산학협력단 | 산화적 스트레스에 대한 저항성 및 내성을 증가시키는 바실러스 종 pamc23324 유래 펩타이드 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103732742A (zh) | 2014-04-16 |
ES2626277T3 (es) | 2017-07-24 |
EP2682465A1 (en) | 2014-01-08 |
JPWO2012121150A1 (ja) | 2014-07-17 |
WO2012121150A1 (ja) | 2012-09-13 |
CN103732742B (zh) | 2016-08-10 |
KR20140114275A (ko) | 2014-09-26 |
EP2682465A4 (en) | 2014-09-03 |
US20140141437A1 (en) | 2014-05-22 |
EP2682465B1 (en) | 2017-05-10 |
KR102038714B1 (ko) | 2019-10-31 |
US9139837B2 (en) | 2015-09-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Alcántara et al. | Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance | |
Bron et al. | Genetic characterization of the bile salt response in Lactobacillus plantarum and analysis of responsive promoters in vitro and in situ in the gastrointestinal tract | |
An et al. | High-level expression of heme-dependent catalase gene katA from Lactobacillus sakei protects Lactobacillus rhamnosus from oxidative stress | |
Zhang et al. | Genome shuffling of Lactococcus lactis subspecies lactis YF11 for improving nisin Z production and comparative analysis | |
US8741622B2 (en) | Stress tolerant Bifidobacteria | |
Wada et al. | Characterization of four plasmids harboured in a Lactobacillus brevis strain encoding a novel bacteriocin, brevicin 925A, and construction of a shuttle vector for lactic acid bacteria and Escherichia coli | |
JP5901609B2 (ja) | 過酸化水素耐性付与遺伝子及びその利用 | |
Liu et al. | Bacillus subtilis BS-15 effectively improves plantaricin production and the regulatory biosynthesis in Lactiplantibacillus plantarum RX-8 | |
WO2009150856A1 (ja) | 酸素耐性付与遺伝子及びその利用 | |
JP6412865B2 (ja) | ビフィドバクテリウム・ブレーベ株特異的遺伝子 | |
EP3081643B1 (en) | Method for regulating acid resistance of microbes | |
ABDULLAHI | PRODUCTION OF BACTERIOCIN BY LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM CHEESE TO ENCHANCE THE SHELF LIFE OF MILLET DOUGH BALL (FURA) | |
Alcántara et al. | Polyphosphate in Lactobacillus: accumulation and involvement in resistance against stress 2 | |
Park et al. | Isolation and characterization of some promoter sequences from Leuconostoc mesenteroides SY2 isolated from kimchi | |
JP4967138B2 (ja) | 乳酸菌用プラスミド | |
Jeong et al. | Characterisation and partial purification of an antimutagenic peptide produced by Lactobacillus plantarum JNU 2116 | |
Douglas | Application of Integration Tools for Functional Genomic Analysis of Lactobacilli | |
Mullekom et al. | Genetic Characterization of the Bile Salt | |
Wang | Physical and Functional Events Involved in Conjugal Transfer of Lactose Utilization in Lactococcus lactis subsp. lactis | |
WO2002097098A1 (en) | Vector for lactic acid bacteria and method for expressing ferritin in the lactic bacteria |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20141107 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151110 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160112 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160209 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160308 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5901609 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |