JPWO2012121150A1 - 過酸化水素耐性付与遺伝子及びその利用 - Google Patents
過酸化水素耐性付与遺伝子及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2012121150A1 JPWO2012121150A1 JP2013503506A JP2013503506A JPWO2012121150A1 JP WO2012121150 A1 JPWO2012121150 A1 JP WO2012121150A1 JP 2013503506 A JP2013503506 A JP 2013503506A JP 2013503506 A JP2013503506 A JP 2013503506A JP WO2012121150 A1 JPWO2012121150 A1 JP WO2012121150A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- hydrogen peroxide
- microorganism
- protein
- polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 189
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 169
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 33
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 35
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 35
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 claims description 34
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 claims description 34
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 claims description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 33
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 44
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 21
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 21
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 17
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 14
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- -1 hydroxyl radicals Chemical class 0.000 description 11
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 9
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 8
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 7
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108010035210 Iron-Binding Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 102000008133 Iron-Binding Proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 4
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 4
- 108010084238 NAD+ peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 108010079911 Thioredoxin-disulfide reductase Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 235000015140 cultured milk Nutrition 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010007843 NADH oxidase Proteins 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 3
- 102000013090 Thioredoxin-Disulfide Reductase Human genes 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 2-thiobarbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=S)N1 RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 229910016876 Fe(NH4)2(SO4)2 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 2
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 2
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 102000007456 Peroxiredoxin Human genes 0.000 description 2
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 2
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol;phenol Chemical class ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO.OC1=CC=CC=C1 ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 235000019985 fermented beverage Nutrition 0.000 description 2
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 2
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 108030002458 peroxiredoxin Proteins 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- WMYLYYNMCFINGV-CKCBUVOCSA-N (2s)-2-amino-5-[[(2r)-1-(carboxymethylamino)-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O WMYLYYNMCFINGV-CKCBUVOCSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102000000546 Apoferritins Human genes 0.000 description 1
- 108010002084 Apoferritins Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 101150099538 FNR gene Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000214517 Lactobacillus casei group Species 0.000 description 1
- 241000186605 Lactobacillus paracasei Species 0.000 description 1
- 244000185256 Lactobacillus plantarum WCFS1 Species 0.000 description 1
- 241000577554 Lactobacillus zeae Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 239000000524 Thiobarbituric Acid Reactive Substance Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150024831 ahpC gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N chembl432481 Chemical compound OC(=O)[C@@]1(C)CSC(C=2C(=CC(O)=CC=2)O)=N1 OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical class ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 239000012611 container material Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000958 deferoxamine Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000008369 fruit flavor Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-M hydrogenperoxide(1-) Chemical compound [O-]O MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000020191 long-life milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008557 oxygen metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 235000020991 processed meat Nutrition 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/335—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Lactobacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
- A61K2035/115—Probiotics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
微生物に過酸化水素耐性を付与するために有用な遺伝子及びその利用法の提供。以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする過酸化水素耐性付与遺伝子。（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
Description
本発明は、微生物に過酸化水素耐性を付与する遺伝子及びその利用法に関する。
多くの好気性微生物は酸素代謝を司る呼吸鎖を有し、酸素存在下でエネルギーを獲得し、良好な生育が可能である。また、酸素の一部はその代謝の過程で、スーパーオキシドアニオンや過酸化水素を発生するが、それらを消去するスーパーオキシドジスムターゼや、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ等によって、それらを無毒化しその毒性を回避する機構を有している。
嫌気性微生物の中でも有用菌として知られている乳酸菌は通性嫌気性菌に属し、呼吸鎖やカタラーゼを持たないとされているが、多くの乳酸菌は酸素存在下でも生育が可能で、酸素耐性を有している。以前より、乳酸菌の酸素耐性機構についていくつかの研究がなされており、その中で、酸素を代謝する酵素として、NADHオキシダーゼやピルビン酸オキシダーゼ等が知られている。NADHオキシダーゼは、水生成型と過酸化水素生成型の２つの型が報告されており、水生成型は酸素を4電子還元し水へと無毒化する。一方、過酸化水素生成型は2電子還元で過酸化水素を発生するが、ストレプトコッカス・ミュータンス等の乳酸菌ではこの過酸化水素をAlkylhydroperoxide reductaseによって水へと変換し、2成分性のペルオキシダーゼとして機能していることが報告されている。
また、酸素から発生するスーパーオキシドアニオンや過酸化水素を消去する、スーパーオキシドジスムターゼや、カタラーゼ、NADHペルオキシダーゼ等を持つものも報告されている。
また、酸素から発生するスーパーオキシドアニオンや過酸化水素を消去する、スーパーオキシドジスムターゼや、カタラーゼ、NADHペルオキシダーゼ等を持つものも報告されている。
乳酸菌ラクトバチルス・プランタルムWCFS1においては、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子の発現を強めることによって、過酸化水素等の酸化ストレスに対してより抵抗になることから、チオレドキシンレダクターゼが酸化ストレス抵抗性に重要な働きをすることが提案されている（非特許文献１）。
また、嫌気性グラム陰性細菌バクテロイデス・フラジリスにおいては、チオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ系がチオール／ダイサルファイドの酸化還元反応を司る唯一のシステムであると考えられており、チオレドキシンレダクターゼの欠損により、菌は嫌気的環境下にあってもシステインやジチオスレイトールなどの還元剤の添加なくしては生育できないことが報告されている（非特許文献２）。
また、大腸菌においては、細胞内を還元状態へ保つために必須なグルタチオン−グルタチオンレダクターゼ系や、チオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ系が存在しており、それらに関わる遺伝子破壊株は過酸化水素等の酸化ストレスに感受性になることが報告されている。
また、嫌気性グラム陰性細菌バクテロイデス・フラジリスにおいては、チオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ系がチオール／ダイサルファイドの酸化還元反応を司る唯一のシステムであると考えられており、チオレドキシンレダクターゼの欠損により、菌は嫌気的環境下にあってもシステインやジチオスレイトールなどの還元剤の添加なくしては生育できないことが報告されている（非特許文献２）。
また、大腸菌においては、細胞内を還元状態へ保つために必須なグルタチオン−グルタチオンレダクターゼ系や、チオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ系が存在しており、それらに関わる遺伝子破壊株は過酸化水素等の酸化ストレスに感受性になることが報告されている。
一方、乳酸菌ラクトコッカス・ラクチスにおいてはチオレドキシンレダクターゼを破壊することで、好気条件下では生育が阻害されることが報告されているが（非特許文献３）、好気条件下での生育阻害は、ジチオスレイトールの添加で回復すること、また24時間培養すると野生株と同程度の菌体量になることから、酸素耐性との関係は不明である。
また、ストレプトコッカス・ミュータンスではNADHオキシダーゼ、Alkylhydroperoxidereductase(ahpC)をダブルノックアウトした変異株が酸素耐性を有することから、さらに別の鉄結合性を有するタンパク質である遺伝子が酸素耐性に関わる遺伝子であると報告されている（特許文献１）。しかし、これらの遺伝子はすべての微生物が有する遺伝子ではなく、未だ酸素耐性機構は不明な点が多い。またここに挙げた様に、酸素耐性に関わる遺伝子は複数あり、１つの遺伝子のみで酸素耐性能を発揮するものではないことから、簡便に実用に供することは困難であった。
また、本発明者らは、ラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ラムノーサスに存在するfnr遺伝子が、好気条件下での菌の生育に特に必要な遺伝子であり、酸素耐性付与遺伝子であることを報告している（特許文献２）。
しかしながら、酸化ストレスにおいて、代謝の過程で発生する過酸化水素に対する耐性も重要であり、ラクトバチルス属の微生物において、NADHペルオキシダーゼやカタラーゼなど過酸化水素消去に関わる遺伝子は報告があるが、過酸化水素に対して直接抵抗性を示すような遺伝子はこれまでに見出されていない。
しかしながら、酸化ストレスにおいて、代謝の過程で発生する過酸化水素に対する耐性も重要であり、ラクトバチルス属の微生物において、NADHペルオキシダーゼやカタラーゼなど過酸化水素消去に関わる遺伝子は報告があるが、過酸化水素に対して直接抵抗性を示すような遺伝子はこれまでに見出されていない。
L. Mariela Serrano et al. Microbial Cell Factories 6:29(2007)
Edson R. Rocha et al. J. Bacteriol. 189: 8015-8023(2007)
Karin Vido et al. J. Bacteriol. 187: 601-610(2005)
本発明は、微生物に過酸化水素に対する耐性を付与する遺伝子及びその利用法を提供することに関する。
本発明者らは、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029（FERM BP-1366）のゲノム遺伝子について検討したところ、過酸化水素曝露下においてもヒドロキシルラジカルの生成を抑制する遺伝子があり、該遺伝子を利用することにより、微生物に過酸化水素に対する耐性を付与、又は微生物が本来有する過酸化水素に対する耐性を強化できることを見出した。
すなわち、本発明は以下の発明に係るものである。
１）以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする過酸化水素耐性付与遺伝子。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
２）以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる過酸化水素耐性付与遺伝子。
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
３）上記遺伝子を微生物に導入するか又は微生物が有する当該遺伝子を改変することを特徴とする当該微生物に対する過酸化水素耐性の付与又は強化方法。
４）上記遺伝子が導入又は改変されてなる微生物。
５）上記微生物を含有する飲食品。
６）上記微生物を含有する医薬品。
７）上記遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することを特徴とする過酸化水素耐性微生物のスクリーニング方法。
８）上記ポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター。
９）上記組換えベクターを含む宿主微生物。
１０）上記ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする核酸断片。
１１）上記ポリヌクレオチド又はその一部を含むDNAアレイ又はDNAチップ。
１）以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする過酸化水素耐性付与遺伝子。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
２）以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる過酸化水素耐性付与遺伝子。
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
３）上記遺伝子を微生物に導入するか又は微生物が有する当該遺伝子を改変することを特徴とする当該微生物に対する過酸化水素耐性の付与又は強化方法。
４）上記遺伝子が導入又は改変されてなる微生物。
５）上記微生物を含有する飲食品。
６）上記微生物を含有する医薬品。
７）上記遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することを特徴とする過酸化水素耐性微生物のスクリーニング方法。
８）上記ポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター。
９）上記組換えベクターを含む宿主微生物。
１０）上記ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする核酸断片。
１１）上記ポリヌクレオチド又はその一部を含むDNAアレイ又はDNAチップ。
本発明の遺伝子又はポリヌクレオチドを利用することにより、微生物に過酸化水素耐性を付与すること、微生物が有する過酸化水素耐性を強化すること、過酸化水素耐性の微生物をスクリーニングすることができる。当該過酸化水素耐性が付与又は強化された微生物は、過酸化水素曝露下においてもヒドロキシルラジカルの生成が制御され、核酸、タンパク質、脂質等の細胞構成成分の障害が抑制される。
また、本発明の遺伝子が導入又は改変された微生物を用いることにより、所望の酸化ストレスに対して抵抗性を有する飲食品、医薬品の製造が可能となる。また、酸素存在下で生菌数を高く維持することが可能になることから、製品製造時の嫌気装置、製品の嫌気保存容器が不要となり、コストを抑えた製造が可能となる。また、一般に生菌数が高くなるほど、微生物の生理効果は増大することから、微生物が有する生理効果を効果的に発揮させることが可能となる。
また、本発明の遺伝子が導入又は改変された微生物を用いることにより、所望の酸化ストレスに対して抵抗性を有する飲食品、医薬品の製造が可能となる。また、酸素存在下で生菌数を高く維持することが可能になることから、製品製造時の嫌気装置、製品の嫌気保存容器が不要となり、コストを抑えた製造が可能となる。また、一般に生菌数が高くなるほど、微生物の生理効果は増大することから、微生物が有する生理効果を効果的に発揮させることが可能となる。
本明細書において、アミノ酸配列および塩基配列の同一性（相同性）は、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX（ゼネティックス社製）を用いたLipman-Person法(Lipman, D. J. and Pearson,W. R. 1985. Rapid and sensitive protein similarity searches. Science227:1435-1441)によるホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いることが出来る。具体的には、例えばラクトバチルス・カゼイ YIT 9029の遺伝子を既知の遺伝子と相同性比較して解析することにより算出したものであり、パラメーターとしては、Unit Size to compare=2, Pick up Location=5とし、結果を％表示させて行う。
また、遺伝子とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖DNAを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。また、ポリヌクレオチドとしては、RNA、DNAを例示でき、DNAは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAを包含する。
本発明の過酸化水素耐性付与遺伝子は、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029から見出されたCDS2657遺伝子、並びに当該遺伝子から演繹される遺伝子であり、過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするものである。
当該CDS2657遺伝子は、それによりコードされるタンパク質の機能が解明されていない(hypothetical protein)、所謂機能未知の遺伝子である。
当該CDS2657遺伝子は、それによりコードされるタンパク質の機能が解明されていない(hypothetical protein)、所謂機能未知の遺伝子である。
本発明の過酸化水素耐性付与遺伝子は、具体的には、以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
ここで、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はラクトバチルス・カゼイYIT 9029由来のタンパク質である。
配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、1若しくは数個、好ましくは1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、1若しくは数個、好ましくは1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
アミノ酸の欠失、置換、付加は、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が1塩基置換等の天然に生じる変異や、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって遺伝子に人為的に導入される変異等により生じ得るものが包含される。斯かるアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このポリヌクレオチドを常法により発現させる手法が挙げられる。
また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換を挙げることができる。
また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換を挙げることができる。
また、（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号２に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、当該アミノ酸配列と85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。
本発明において、「過酸化水素耐性付与」とは、微生物の過酸化水素に対する感受性を低下させること、すなわち、過酸化水素存在下でも微生物を生育可能ならしめること、及び／又は生育した微生物を過酸化水素存在下においても死滅させないことを意味する。具体的には微生物が内的又は外的に過酸化水素に曝露された場合でも、ヒドロキシルラジカルの生成が制御され、当該ヒドロキシルラジカルによって引き起こされる、核酸、タンパク質、脂質等の細胞構成成分の障害が抑制されることを意味する。
本発明の過酸化水素耐性付与遺伝子は、好適には、以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる遺伝子が挙げられる。
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
ここで、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドはラクトバチルス・カゼイ YIT 9029由来のDNA（CDS2657遺伝子）であり、当該微生物に過酸化水素耐性を付与し、過酸化水素存在下での生育を可能とする。
本発明において、「ストリンジエントな条件下」とは、例えばMolecular cloning - a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、6XSSC（1XSSCの組成：0.15 M 塩化ナトリウム、0.015 M クエン酸ナトリウム、pH7.0）、0.5％ SDS、5Xデンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液に当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
また、（ｄ）の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列としては、配列番号１に示す塩基配列において相当する配列を適切にアライメントした時、当該塩基配列と85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列を意味する。
本発明の遺伝子は、配列番号１の塩基配列を参考にプライマーを作製し、ラクトバチルス・カゼイ YIT9029のDNAをテンプレートとする常法のPCR法で容易に得ることができる。
すなわち、例えば、いずれかの遺伝子のN末端開始コドンを含む配列からなるオリゴヌクレオチドA、及び該遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドBを化学合成し、これらのオリゴヌクレオチドAとBを１セットにし、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行なうことにより得ることができる。また、こうして得られる遺伝子断片を効率よくプラスミドベクター等にクローニングを行なうために、オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端側に制限酵素切断のための配列を付加して用いることもできる。ここで、プライマーとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。当該ヌクレオチドとしては、配列番号１に対応する部分ヌクレオチド配列であって、10〜50個の連続した塩基、好ましくは15〜35個の連続した塩基等が挙げられる。
また、PCRの条件は、例えば2000塩基対の長さのDNA断片を得る場合には、94℃2分、（95℃10秒、52℃10秒、72℃2分）x30サイクル、72℃7分が挙げられる。
すなわち、例えば、いずれかの遺伝子のN末端開始コドンを含む配列からなるオリゴヌクレオチドA、及び該遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドBを化学合成し、これらのオリゴヌクレオチドAとBを１セットにし、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行なうことにより得ることができる。また、こうして得られる遺伝子断片を効率よくプラスミドベクター等にクローニングを行なうために、オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端側に制限酵素切断のための配列を付加して用いることもできる。ここで、プライマーとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。当該ヌクレオチドとしては、配列番号１に対応する部分ヌクレオチド配列であって、10〜50個の連続した塩基、好ましくは15〜35個の連続した塩基等が挙げられる。
また、PCRの条件は、例えば2000塩基対の長さのDNA断片を得る場合には、94℃2分、（95℃10秒、52℃10秒、72℃2分）x30サイクル、72℃7分が挙げられる。
また、その当該塩基配列に従い、DNA合成機により人工的に合成して得ることもできる。
本発明の遺伝子は、過酸化水素耐性付与に関与する遺伝子であることから、これを微生物に導入する、或いは微生物が有する当該遺伝子を改変することにより、当該微生物の過酸化水素に対する耐性を付与、又は微生物が本来有する過酸化水素に対する耐性を強化することができる。
本発明の遺伝子の導入は、当該遺伝子を、元来有しない微生物に導入することにより行うことができる。遺伝子を導入する方法としてはDNAの取り込み能を利用したコンピテンス法、プロトプラストを利用したプロトプラストPEG法及び高電圧パルスを利用したエレクトロポレーション法等を利用すればよく、特にエレクトロポレーション法が好ましい。また、遺伝子を微生物染色体に組み込む場合には、相同組換えを利用した方法、部位特異的に組み込む方法を用いることができる。
本発明の遺伝子の導入は、当該遺伝子を、元来有しない微生物に導入することにより行うことができる。遺伝子を導入する方法としてはDNAの取り込み能を利用したコンピテンス法、プロトプラストを利用したプロトプラストPEG法及び高電圧パルスを利用したエレクトロポレーション法等を利用すればよく、特にエレクトロポレーション法が好ましい。また、遺伝子を微生物染色体に組み込む場合には、相同組換えを利用した方法、部位特異的に組み込む方法を用いることができる。
本発明の遺伝子の改変には、発現増強が挙げられる。
遺伝子の発現を増強するには、本発明の遺伝子を運ぶ組換えプラスミドを対象とする微生物に導入すること、該遺伝子を染色体の別の場所に部位特異的組換えによって組み込むことによって微生物内での該遺伝子のコピー数を増加させること、該遺伝子の発現を制御する制御領域を改変したり、制御遺伝子を改変することによって発現を増加させる方法等によって行えばよいが、特に該遺伝子のコピー数を増加させる方法が好ましい。具体的には、１個の微生物細胞あたり複数個のコピー数を持つプラスミドに、対象とする遺伝子をその遺伝子の本来のプロモーター配列とリボソーム結合部位を含めてクローニングするか、別の遺伝子から分離した、あるいは化学合成によって作成したプロモーターとリボソーム結合部位の下流に該遺伝子のポリペプチドをコードする領域だけをつなげてクローニングした組換えプラスミドを作成し、微生物細胞内にエレクトロポレーション法などによって導入することによって、微生物細胞内での該遺伝子のコピー数を上げることができる。
遺伝子の発現を増強するには、本発明の遺伝子を運ぶ組換えプラスミドを対象とする微生物に導入すること、該遺伝子を染色体の別の場所に部位特異的組換えによって組み込むことによって微生物内での該遺伝子のコピー数を増加させること、該遺伝子の発現を制御する制御領域を改変したり、制御遺伝子を改変することによって発現を増加させる方法等によって行えばよいが、特に該遺伝子のコピー数を増加させる方法が好ましい。具体的には、１個の微生物細胞あたり複数個のコピー数を持つプラスミドに、対象とする遺伝子をその遺伝子の本来のプロモーター配列とリボソーム結合部位を含めてクローニングするか、別の遺伝子から分離した、あるいは化学合成によって作成したプロモーターとリボソーム結合部位の下流に該遺伝子のポリペプチドをコードする領域だけをつなげてクローニングした組換えプラスミドを作成し、微生物細胞内にエレクトロポレーション法などによって導入することによって、微生物細胞内での該遺伝子のコピー数を上げることができる。
また、当該遺伝子を元来有する微生物に対しては、当該遺伝子を発現阻害若しくは発現抑制することにより、当該微生物の過酸化水素耐性を低下させることも可能である。
遺伝子の発現を阻害するには、本発明の遺伝子を破壊、欠損すればよく、この方法としては、全く別のDNA断片を遺伝子の内部に挿入する挿入失活法や段階的な相同組換えによって標的遺伝子の一部又は全部を欠失する段階的二重交叉法を用いればよく、特に段階的二重交叉法が好ましい。
具体的には、標的遺伝子の一部又は全部を欠失する場合には、欠失領域をはさむ両側の領域を染色体DNAから分離するか、あるいはPCR法によって増幅して分離し、例えばpYSSE3のような大腸菌では増殖するが対象とする微生物中では複製が出来ないプラスミドベクターにそれら両DNA断片を本来の向きと同じ向きに並んだ状態でクローニングする。次に、得られる組換えプラスミドDNAを、欠失を起こさせようとする微生物にエレクトロポレーション法等を用いて導入し、生じる抗生物質耐性のクローンから、PCR法等によって目的の欠失領域の上流又は下流のクローニングした領域との相同領域で組換えを起こしてプラスミドが染色体上に挿入したクローンを選択する。こうして得たクローンを、抗生物質を含まない培地で継代培養を繰り返すことによって、プラスミドが再び近接して存在する相同領域間の組換えによって染色体から離脱し、菌の増殖に伴って消失することによって、抗生物質耐性をなくしたクローンを選択する。こうして得たクローンからPCR法等によって標的遺伝子領域を欠失したクローンを分離することができる。
遺伝子の発現を阻害するには、本発明の遺伝子を破壊、欠損すればよく、この方法としては、全く別のDNA断片を遺伝子の内部に挿入する挿入失活法や段階的な相同組換えによって標的遺伝子の一部又は全部を欠失する段階的二重交叉法を用いればよく、特に段階的二重交叉法が好ましい。
具体的には、標的遺伝子の一部又は全部を欠失する場合には、欠失領域をはさむ両側の領域を染色体DNAから分離するか、あるいはPCR法によって増幅して分離し、例えばpYSSE3のような大腸菌では増殖するが対象とする微生物中では複製が出来ないプラスミドベクターにそれら両DNA断片を本来の向きと同じ向きに並んだ状態でクローニングする。次に、得られる組換えプラスミドDNAを、欠失を起こさせようとする微生物にエレクトロポレーション法等を用いて導入し、生じる抗生物質耐性のクローンから、PCR法等によって目的の欠失領域の上流又は下流のクローニングした領域との相同領域で組換えを起こしてプラスミドが染色体上に挿入したクローンを選択する。こうして得たクローンを、抗生物質を含まない培地で継代培養を繰り返すことによって、プラスミドが再び近接して存在する相同領域間の組換えによって染色体から離脱し、菌の増殖に伴って消失することによって、抗生物質耐性をなくしたクローンを選択する。こうして得たクローンからPCR法等によって標的遺伝子領域を欠失したクローンを分離することができる。
遺伝子の発現を抑制するには、本発明の遺伝子のmRNAの5'末端領域と相補的な短いRNAを合成することによる、いわゆるRNA干渉による方法や、該遺伝子の発現を制御する領域又は制御遺伝子を破壊若しくは欠損等して改変する方法を用いることができ、特に該遺伝子の発現を制御する領域の改変が好ましい。具体的には、遺伝子の転写を制御するプロモーターの配列を改変することによって、該遺伝子のmRNAへの転写量を多くしたり、少なくしたりすることができる。
ここで、遺伝子導入又は改変の対象となる微生物は、特に限定されるものではなく、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母等を用いることができるが、グラム陽性細菌を好適に利用することができ、特に生体への安全性が確認されているラクトバチルス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌等の利用が好ましい。ラクトバチルス属細菌の中でも、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ラムノーサス等のラクトバチルス・カゼイグループに属する細菌の利用が好ましく、特にラクトバチルス・カゼイを好適に利用することができる。
ビフィドバクテリウム属細菌は偏性嫌気性菌であり、酸素や低ｐＨ、高酸度に弱く、製造時の増殖や保存時の生残性等、取扱いに困難な点が多い。ビフィドバクテリウム属細菌はヒトにとって有用な生理効果を示すことから、育種改良により過酸化水素に対して耐性を有する変異株を取得したり、酸素不透過性容器を使用する等の工夫をして、飲食品や医薬品への応用が進んでいるが、培養が困難であったり、保存中に生菌数が低下するといった様々な問題がある。ビフィドバクテリウム属細菌は、本願発明の過酸化水素耐性付与遺伝子を有さないことが明らかになっているので、本願発明の遺伝子導入又は改変の対象となる微生物として好適に利用することができる。
斯くして得られる遺伝子導入又は改変された微生物は、過酸化水素耐性が付与又は増強されているため、当該微生物が元来有する種々の生理効果を効果的に発揮する飲食品や医薬品として利用することができる。
遺伝子導入又は改変された本発明の微生物を飲食品や医薬品とする場合、菌体は、生菌又は加熱菌体（死菌体）のいずれでもよく、又凍結乾燥したものであってもよく、あるいはこれら微生物を含む培養物、菌体処理物として利用することもできるが、生菌の状態で利用することが好ましい。
医薬品として使用する場合は、本発明の微生物を固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散在、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
また、遺伝子導入又は改変された本発明の微生物は、上記のような製剤とするだけでなく、飲食品に配合して使用することもできる。飲食品に配合する場合は、そのまま、または種々の栄養成分と共に含有せしめればよい。この飲食品は、過酸化水素耐性が付与又は増強された微生物を含むため、当該微生物が元来有する種々の生理作用を効果的に発揮する保健用食品又は食品素材として利用できる。具体的に本発明の方法により得られた微生物を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、すなわち、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には、動物の飼料も含まれる。
さらに飲食品としては、本発明の微生物を利用した発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液等の発酵飲食品の例が挙げられる。これら発酵飲食品の製造は常法に従えばよい。例えば発酵乳を製造する場合は、まず、殺菌した乳培地に本発明の微生物を単独又は他の微生物と同時に接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで、別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品に仕上げればよい。このようにして得られる発酵乳は、シロップ（甘味料）を含有しないプレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。
本発明の方法により得られた微生物は、高い過酸化水素耐性を有することから、飲食品中での菌の生残性が高いため、保存中の生菌数の低下や死滅速度の増加が抑制され、製品規格の維持が容易となり、ラクトバチルス属細菌等の微生物が有する整腸作用等の一般的な生理効果を効果的に発揮させることができる。また、抗がん作用、ヘリコバクター・ピロリの除菌作用等の特異的な生理効果を元来有するラクトバチルス属細菌やビフィドバクテリウム属細菌に対して、本発明の方法により過酸化水素耐性を付与又は増強することで、該菌株を様々な飲食品に利用することが可能になると共に、該菌株の生残性が改善することで該菌株が有する生理効果を増強させることが可能となる。
また、ビフィドバクテリウム属細菌を利用した飲食品において、保存時の生残性を高める目的で、ガラスやアルミコーティング紙等の酸素不透過性の包剤で構成された容器が主に用いられてきたが、本発明の方法により得られた過酸化水素耐性が付与又は強化されたビフィドバクテリウム属細菌は、高い生残性を有し、厳密な嫌気状態を必要としないため、酸素透過性の高い樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート等）も容器素材として使用できる。これらの樹脂を用いた容器は、酸素不透過性の包剤で構成された容器と比較して、コストが低く、成型の自由度が高いというメリットを有する。
本発明の遺伝子は、過酸化水素耐性微生物のスクリーニングのために使用することもできる。
すなわち、本発明の遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することにより、過酸化水素耐性の微生物をスクリーニングすることができる。
ここで、遺伝子の有無及び／又はその発現量の測定は、本発明の遺伝子や遺伝子由来のmRNAを検出し得るプローブやプライマーを用いて、微生物における標的とする遺伝子の有無、コピー数や発現量をサザーンハイブリダイゼーション法やDNAマイクロアレイやRT-PCR法により行うことができる。そして、標的遺伝子やその発現の有無により、目的の微生物を選択すればよい。
すなわち、本発明の遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することにより、過酸化水素耐性の微生物をスクリーニングすることができる。
ここで、遺伝子の有無及び／又はその発現量の測定は、本発明の遺伝子や遺伝子由来のmRNAを検出し得るプローブやプライマーを用いて、微生物における標的とする遺伝子の有無、コピー数や発現量をサザーンハイブリダイゼーション法やDNAマイクロアレイやRT-PCR法により行うことができる。そして、標的遺伝子やその発現の有無により、目的の微生物を選択すればよい。
（ｄ）〜（ｆ）で示されるポリヌクレオチド又はその一部（断片）を含む本発明の組換えベクターは、大腸菌及び対象とする微生物において該ベクターの導入を選択できるような遺伝子マーカーを有している任意のベクター（例えば、pHY400、pSA1、pYSSE3等）を用いてインビトロライゲーション法等の公知の方法により得ることができる。
また、上記の組換えベクターを含む宿主微生物は、公知の方法、すなわち、当該組換えベクターを宿主微生物に導入する場合はエレクトロポレーション法等の方法により、微生物染色体に組み込む場合は該微生物と相同なDNA領域を持つ組換えベクターをエレクトロポレーション法等により導入した後に相同組換えにより染色体に組み込まれたものをＰＣＲ法等によって確認する等の方法を用いることにより得ることができる。
また、（ｄ）〜（ｆ）で示されるポリヌクレオチド又はその一部（断片）を含む本発明のDNAアレイ又はDNAチップは、フォトリソグラフィー法等の公知の方法により作製することができる。このDNAアレイ又はDNAチップを用いることにより、本発明の遺伝子を発現する微生物をスクリーニングすることができる。
尚、上述した微生物の遺伝子導入又は改変や微生物のスクリーニングを効率よく行うためには、本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター、本発明のポリヌクレオチドの一部断片からなるPCR及びRT-PCR用プライマー、本発明のポリヌクレオチド又はその一部を増幅することができるPCR及びRT-PCR用プライマー、本発明のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド又はその一部からなるハイブリダイゼーション用の核酸断片を用いることが好ましい。
ここで、使用されるプライマー等の核酸断片としては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、当該ヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列に対応する部分ヌクレオチド配列であって、10〜50個の連続した塩基、好ましくは15〜35個の連続した塩基が好ましい。
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明する。
ここで、使用されるプライマー等の核酸断片としては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、当該ヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列に対応する部分ヌクレオチド配列であって、10〜50個の連続した塩基、好ましくは15〜35個の連続した塩基が好ましい。
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明する。
実施例１ 酸素・過酸化水素ストレスによるCDS2657遺伝子発現量の変化
CDS2657遺伝子について、酸素または過酸化水素のストレスを与えたときの発現量をリアルタイムPCRを用いて解析した。
（１）酸化ストレスの付加
酸素ストレスは、100mlの嫌気MRS培地で7時間培養した後2つに分け、一方を300ml容三角フラスコに入れて、タイテック社製振とう恒温槽を用いて160rpmで30分振とうして与えた。過酸化水素ストレスは、100mlのMRS培地を好気静置で7時間培養した後2つに分け、一方には0.5mMとなるよう過酸化水素を添加し30分継続して培養することで与えた。
CDS2657遺伝子について、酸素または過酸化水素のストレスを与えたときの発現量をリアルタイムPCRを用いて解析した。
（１）酸化ストレスの付加
酸素ストレスは、100mlの嫌気MRS培地で7時間培養した後2つに分け、一方を300ml容三角フラスコに入れて、タイテック社製振とう恒温槽を用いて160rpmで30分振とうして与えた。過酸化水素ストレスは、100mlのMRS培地を好気静置で7時間培養した後2つに分け、一方には0.5mMとなるよう過酸化水素を添加し30分継続して培養することで与えた。
（２）RNAの調製
MRS培地で培養した培養液2mlを2倍量のRNAprotect Bacteria Reagent(QIAGEN)に添加して攪拌後室温で5分間インキュベートし、RNAを安定化した。5000 x gで10分間遠心して集菌した後、15mg/mlのリゾチームを含むTEバッファー200μlに懸濁し、1mg/mlのＮ-アセチルムラミデイスSG(生化学工業)10μlを加えて、時々ボルテックスで撹拌しながら室温で10分インキュベートした。RNeasy Mini Kit(QIAGEN)のBuffer RLTを700μl添加して懸濁し、5000 x gで5分間遠心して上清を採取した。以後RNeasy Mini Kit(QIAGEN)、RNAprotect Bacteria Reagent(QIAGEN)に添付のプロトコールに従って精製した。精製途中でRNase-Free DNase Set(QIAGEN)を用いてDNase処理を行い、混入しているDNAを分解した。
調製したRNAは2100 Bioanalyzer(Agilent)を用いて品質を確認した。
MRS培地で培養した培養液2mlを2倍量のRNAprotect Bacteria Reagent(QIAGEN)に添加して攪拌後室温で5分間インキュベートし、RNAを安定化した。5000 x gで10分間遠心して集菌した後、15mg/mlのリゾチームを含むTEバッファー200μlに懸濁し、1mg/mlのＮ-アセチルムラミデイスSG(生化学工業)10μlを加えて、時々ボルテックスで撹拌しながら室温で10分インキュベートした。RNeasy Mini Kit(QIAGEN)のBuffer RLTを700μl添加して懸濁し、5000 x gで5分間遠心して上清を採取した。以後RNeasy Mini Kit(QIAGEN)、RNAprotect Bacteria Reagent(QIAGEN)に添付のプロトコールに従って精製した。精製途中でRNase-Free DNase Set(QIAGEN)を用いてDNase処理を行い、混入しているDNAを分解した。
調製したRNAは2100 Bioanalyzer(Agilent)を用いて品質を確認した。
（３）リアルタイムPCRによる遺伝子発現定量解析
標的遺伝子（CDS2657遺伝子）の発現量を定量するためリアルタイムPCRを行った。1μgのtotal RNAを鋳型とし、PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ）を用いて逆転写反応（30℃ 10min, 42℃ 50min, 95℃ 5min）を行いcDNAを調製した。希釈したcDNA溶液を鋳型とし、SYBR Premix Ex Taq(タカラバイオ)とプライマーを添加し、7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて、95℃ 30secした後 95℃ 5sec, 60℃ 34secを40サイクル反応させた。また、遺伝子の発現量は16SrRNAを内部標準とし、サンプル間の補正を行った。結果は、非ストレスサンプルの発現量に対するストレスサンプルの発現量の相対値で表した。使用したプライマーは表１に示す。
標的遺伝子（CDS2657遺伝子）の発現量を定量するためリアルタイムPCRを行った。1μgのtotal RNAを鋳型とし、PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ）を用いて逆転写反応（30℃ 10min, 42℃ 50min, 95℃ 5min）を行いcDNAを調製した。希釈したcDNA溶液を鋳型とし、SYBR Premix Ex Taq(タカラバイオ)とプライマーを添加し、7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて、95℃ 30secした後 95℃ 5sec, 60℃ 34secを40サイクル反応させた。また、遺伝子の発現量は16SrRNAを内部標準とし、サンプル間の補正を行った。結果は、非ストレスサンプルの発現量に対するストレスサンプルの発現量の相対値で表した。使用したプライマーは表１に示す。
（４）結果
CDS2657遺伝子は、酸素または過酸化水素ストレスにより、発現促進が認められたが、その結果は過酸化水素でより顕著であった（図１）。
図１中の値は3回の独立した実験の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
CDS2657遺伝子は、酸素または過酸化水素ストレスにより、発現促進が認められたが、その結果は過酸化水素でより顕著であった（図１）。
図１中の値は3回の独立した実験の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
実施例２ CDS2657遺伝子破壊株の分離
（１）遺伝子破壊方法
配列番号１内部の配列の５'末端側に制限酵素BamH I切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-cgcggatccggttcttgtgccattggaaa-3'（配列番号７）、及び配列番号１内部の配列と相補的な配列から選択した配列の５'末端側に制限酵素Pst I切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-aaactgcagtgtcatcacgcagagccaac-3'（配列番号８）をプライマーとし、KOD Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製、製品番号KOD-201）を用いて本酵素に添付の方法に従って、ラクトバチルス・カゼイYIT9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行った。こうして増幅されるDNA断片はCDS2657遺伝子のアミノ末端とカルボキシル末端の両側を欠いた部分配列である。生成物を等量のトリス−イーディーティーエー（10mM Tris(pH8.0)−1mM EDTA, TEと呼ぶ）飽和フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール（25：24：1）と混合し、よく攪拌した後、15,000 × g 5分の遠心を行って、2層に分離した。上層の水層を回収し、その10分の1量の3M酢酸ナトリウム溶液（pH5.2）と3倍量の99.5%エタノールを加え、-20℃に30分間以上置いた後に、4℃で15,000 x g 15分間の遠心を行った。上清を捨て、沈殿物に70%エタノールを加えて洗浄し、15,000 x g 5分間の遠心をした後エタノールを捨て、沈殿物を真空乾燥した。
（１）遺伝子破壊方法
配列番号１内部の配列の５'末端側に制限酵素BamH I切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-cgcggatccggttcttgtgccattggaaa-3'（配列番号７）、及び配列番号１内部の配列と相補的な配列から選択した配列の５'末端側に制限酵素Pst I切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-aaactgcagtgtcatcacgcagagccaac-3'（配列番号８）をプライマーとし、KOD Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製、製品番号KOD-201）を用いて本酵素に添付の方法に従って、ラクトバチルス・カゼイYIT9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行った。こうして増幅されるDNA断片はCDS2657遺伝子のアミノ末端とカルボキシル末端の両側を欠いた部分配列である。生成物を等量のトリス−イーディーティーエー（10mM Tris(pH8.0)−1mM EDTA, TEと呼ぶ）飽和フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール（25：24：1）と混合し、よく攪拌した後、15,000 × g 5分の遠心を行って、2層に分離した。上層の水層を回収し、その10分の1量の3M酢酸ナトリウム溶液（pH5.2）と3倍量の99.5%エタノールを加え、-20℃に30分間以上置いた後に、4℃で15,000 x g 15分間の遠心を行った。上清を捨て、沈殿物に70%エタノールを加えて洗浄し、15,000 x g 5分間の遠心をした後エタノールを捨て、沈殿物を真空乾燥した。
この沈殿物を100μlのKバッファー（タカラバイオ社製）反応液中で制限酵素BamH IとPst I（タカラバイオ社製）で切断（37℃で20時間）した後、前述のTE飽和フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール処理（溶媒混合から水層回収まで）を２回繰り返し、回収した水層に10分の1量の3M酢酸ナトリウム溶液（pH5.2）と3倍量の99.5%エタノールを加え、-20℃に30分間以上置いた後に、4℃で15,000 x g 15分間の遠心を行った。上清を捨て、沈殿物に70%エタノールを加えて洗浄し、15,000 x g 5分間の遠心をした後エタノールを捨て、沈殿物を真空乾燥した。
プラスミドベクターとして、プラスミドpUC19に由来する大腸菌用複製領域と、大腸菌とラクトバチルスの両方で機能するプラスミドpAMβ1に由来するエリスロマイシン耐性遺伝子を持つpYSSE3（Yasuda et. al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74:4746-4755.）を用いた。pYSSE3 DNAを100μlのKバッファー（タカラバイオ社製）反応液中で制限酵素BamH IとPst I（タカラバイオ社製）で切断（37℃で20時間）した後、10倍濃度のCIPバッファー（TOYOBO社製）20μlと水を加えて容量を200μlとし、カーフインテスティンフォスファターゼ（TOYOBO社製）3μlを加えて37℃で2時間インキュベートした。その後、前述のTE飽和フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール処理とエタノール沈澱処理を行い、沈殿物を真空乾燥した。
上記CDS2657遺伝子の内部配列からなるDNA断片と制限酵素切断したプラスミドベクターをそれぞれおよそ0.01〜0.1μgずつ混合し、これに等容量のDNAライゲーションキットVer.2.1（タカラバイオ社製）I液を加えて16℃で30分間インキュベートした後、氷中に置いた。
次に、溶解後氷中に置いたJM109コンピテントセル（TOYOBO社製）100μlに上記反応液5μlを加え、軽く混合して氷中で30分間インキュベートした後、42℃に30秒間さらしヒートショックを与え、再び氷中に戻した。この菌液にSOC培地（TOYOBO社製）を1mL加え37℃で1時間培養した後にエリスロマイシン（注射用エリスロマイシン、ダイナボット社製）を500μg／mLの濃度で加えたLB寒天培地（１L中に10g バクトトリプトン、5g バクトイーストエキストラクト、5g 塩化ナトリウム、15g 寒天を含む）に塗布して、37℃でインキュベートした。
生成したエリスロマイシン耐性のコロニーを500μg／mLのエリスロマイシンを添加したＬＢ培地で生育し、ウィザードプラスSVミニプレップDNAピューリフィケーションシステム（プロメガ社製）を用いて組換えプラスミドDNAを抽出した。
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029へのDNA導入には、該微生物をMRS培地（ディフコ社製）に生育し、対数増殖期にある培養液を5,000 x g 4℃で5分間遠心して集菌し、菌体を氷冷した20mM HEPES(pH7.0)と10%グリセロールでそれぞれ1回ずつ洗浄し、洗浄菌体を（初めの培養液のクレット値）x 2μlの10%グリセロールに懸濁した。菌懸濁液40μlと組換えプラスミドDNA溶液2μlを混合し、2mm幅のエレクトロポレーション用キュベットに入れ、ジーンパルサーII（バイオラッド社製）を用いて、1.5kV, 200Ω、キャパシタンス25μFでエレクトロポレーションを行った。この液にMRS培地1mLを加え、37℃で１時間培養後、エリスロマイシンを20μg／mLの濃度で加えたMRS寒天培地に塗布し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて嫌気状態にし、37℃で2日又は3日間インキュベートした。
生育したエリスロマイシン耐性コロニーの一部をとり、50μlのTEに懸濁後、94℃で2.5分間処理し、その一部をテンプレートとして用い、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029染色体のCDS2657遺伝子下流の配列から選ばれたプライマーと、プラスミドベクターにあって、クローニングしたCDS2657遺伝子内部断片の近傍にある配列から選ばれたプライマーを用いて、PCR解析を行うことにより、導入したプラスミドがラクトバチルス・カゼイYIT 9029染色体のCDS2657遺伝子内部の組換えプラスミド上のCDS2657遺伝子断片と相同な領域に組み込まれて、CDS2657遺伝子が分断（破壊）されていることを確認した。こうして得たクローンをラクトバチルス・カゼイ MS105株とした。
実施例３ CDS2657遺伝子破壊株の過酸化水素耐性
（１）実施例２で取得したラクトバチルス・カゼイ MS105株をMRS培地にて一晩培養後、集菌し、50mM リン酸カリウムバッファー（pH6.8）で2回洗浄後、同バッファーに10倍希釈となるように懸濁した。3mlの懸濁液をアルミキャップをした小試験管に注ぎ、終濃度1、3mMとなるよう過酸化水素を添加した。37℃で3時間インキュベート後、菌数を測定し、過酸化水素添加前の菌数に対する生存率を求めた。
（１）実施例２で取得したラクトバチルス・カゼイ MS105株をMRS培地にて一晩培養後、集菌し、50mM リン酸カリウムバッファー（pH6.8）で2回洗浄後、同バッファーに10倍希釈となるように懸濁した。3mlの懸濁液をアルミキャップをした小試験管に注ぎ、終濃度1、3mMとなるよう過酸化水素を添加した。37℃で3時間インキュベート後、菌数を測定し、過酸化水素添加前の菌数に対する生存率を求めた。
（２）結果
ラクトバチルス・カゼイ MS105株は、野生株よりも生存率が2オーダー程度低く、過酸化水素に対する感受性が高まった（図2）。
ラクトバチルス・カゼイ MS105株は、野生株よりも生存率が2オーダー程度低く、過酸化水素に対する感受性が高まった（図2）。
実施例４ CDS2657遺伝子破壊株の過酸化水素消去活性
（１）ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029、ラクトバチルス・カゼイ MS105および、ラクトバチルス・カゼイ MS102(NADH ペルオキシダーゼ破壊株)を使用した。各菌株をMRS培地で7時間培養した後、終濃度0.5mMとなるよう過酸化水素を添加してさらに1時間培養した培養液からOD660 = １で1mlの菌体量となるよう調整して集菌した。菌体を50mM リン酸カリウムバッファー（pH6.8）で2回洗浄後、同バッファー0.1mlに懸濁した。0.1mlの懸濁液と、0.9mlの90%容量で調製した終濃度100mMの過酸化水素溶液を混合した。37℃で1時間インキュベート後、遠心して菌体を除いた上清の残存過酸化水素濃度を測定した。尚、過酸化水素濃度はBIOXYTECH H2O2-560（フナコシ）を用いて測定した。
（１）ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029、ラクトバチルス・カゼイ MS105および、ラクトバチルス・カゼイ MS102(NADH ペルオキシダーゼ破壊株)を使用した。各菌株をMRS培地で7時間培養した後、終濃度0.5mMとなるよう過酸化水素を添加してさらに1時間培養した培養液からOD660 = １で1mlの菌体量となるよう調整して集菌した。菌体を50mM リン酸カリウムバッファー（pH6.8）で2回洗浄後、同バッファー0.1mlに懸濁した。0.1mlの懸濁液と、0.9mlの90%容量で調製した終濃度100mMの過酸化水素溶液を混合した。37℃で1時間インキュベート後、遠心して菌体を除いた上清の残存過酸化水素濃度を測定した。尚、過酸化水素濃度はBIOXYTECH H2O2-560（フナコシ）を用いて測定した。
（２）NADHペルオキシダーゼを破壊したラクトバチルス・カゼイ MS102株は、全く過酸化水素を消去できなかったが、ラクトバチルス・カゼイ MS105株は、野生株と同等の過酸化水素消去活性を示した（図3）。図中、100μM過酸化水素溶液中で菌体を1時間インキュベートした後の残存過酸化水素濃度を示す。値は3回の独立した実験の平均値を示した。
このことから、CDS2657遺伝子は過酸化水素消去とは別の機構で過酸化水素耐性に寄与していることが示唆された。
このことから、CDS2657遺伝子は過酸化水素消去とは別の機構で過酸化水素耐性に寄与していることが示唆された。
実施例５ CDS2657遺伝子のクローニング及びCDS2657タンパク質の発現と精製
（１）pETベクターへのCDS2657遺伝子のクローニング
プライマーセット（2657F:GGAATTCCATATGCAAATCTCAATCAAACC（配列番号９）, 2657R:CGGAATTCTTAGCAAATTTTGCCGCCCA（配列番号１０））を用い、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のゲノムDNAを鋳型として、KOD-plus-DNA Polymerase(TOYOBO)を用いてPCRを行い、CDS2657遺伝子断片を増幅した。得られたPCR産物を電気泳動し、目的とする大きさのDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)で切り出し、抽出、精製した。さらに、DNA断片をNde I, EcoR Iで消化し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pET-28b(+)（メルク）はNde I, EcoR Iで消化しQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pET-28b(+)ベクターとCDS2657のDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2(タカラバイオ)を用いてライゲーションし、このライゲーション反応液をE. coli JM109（TOYOBO）に導入し形質転換した。得られた形質転換体から常法により抽出したプラスミドを、E. coli BL21(DE3)コンピテントセル（メルク）に導入し、形質転換体を得た。
（１）pETベクターへのCDS2657遺伝子のクローニング
プライマーセット（2657F:GGAATTCCATATGCAAATCTCAATCAAACC（配列番号９）, 2657R:CGGAATTCTTAGCAAATTTTGCCGCCCA（配列番号１０））を用い、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のゲノムDNAを鋳型として、KOD-plus-DNA Polymerase(TOYOBO)を用いてPCRを行い、CDS2657遺伝子断片を増幅した。得られたPCR産物を電気泳動し、目的とする大きさのDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)で切り出し、抽出、精製した。さらに、DNA断片をNde I, EcoR Iで消化し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pET-28b(+)（メルク）はNde I, EcoR Iで消化しQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pET-28b(+)ベクターとCDS2657のDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2(タカラバイオ)を用いてライゲーションし、このライゲーション反応液をE. coli JM109（TOYOBO）に導入し形質転換した。得られた形質転換体から常法により抽出したプラスミドを、E. coli BL21(DE3)コンピテントセル（メルク）に導入し、形質転換体を得た。
（２）タンパク質の発現および精製
タンパク質の発現はpET System Manual（メルク）に準じて行った。
E. coli BL21(DE3)の形質転換体を、カナマイシンを終濃度30mg/mlとなるよう添加した3mlのLB培地で振とう培養し、OD600が0.6に達したところで培養液を4℃で保存した。培養液を抗生物質を含む新しい200mlのLB培地に接種し、OD600が0.6に達するまで37℃で振とう培養した。終濃度1mMとなるようにIPTGを添加し、さらに37℃で3時間振とう培養し、目的タンパク質を誘導した。培養液を氷中に5分置き、4℃、5000 x gで5分遠心して集菌した。培養液体積の0.25倍量の冷却した20mM Tris-HCl pH8.0で洗浄し、遠心操作により集菌し、精製を開始するまで-80℃で凍結保存した。
cell lysateの調製はBugBuster Protein Extraction Reagent（メルク）を用い、添付のプロトコールに従って行った。タンパク質の精製は、Ni-NTA Fast Start Kit(QIAGEN)を用い、添付のプロトコールに従って行った。精製度を確認するために、精製の各ステップで5mlずつサンプリングを行い、SDS-PAGEに供した。SDS-PAGEはNuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel（インビトロジェン）を使用し、常法に従って行った。
溶出を2回にわけて行ったところ、1回目の溶出サンプルは僅かなマイナーバンドが検出されたものの、ほぼ単一に精製できていたため、2回目の溶出液と合わせたものを精製タンパク質とし、以下の実験に使用した（図4）。
タンパク質の発現はpET System Manual（メルク）に準じて行った。
E. coli BL21(DE3)の形質転換体を、カナマイシンを終濃度30mg/mlとなるよう添加した3mlのLB培地で振とう培養し、OD600が0.6に達したところで培養液を4℃で保存した。培養液を抗生物質を含む新しい200mlのLB培地に接種し、OD600が0.6に達するまで37℃で振とう培養した。終濃度1mMとなるようにIPTGを添加し、さらに37℃で3時間振とう培養し、目的タンパク質を誘導した。培養液を氷中に5分置き、4℃、5000 x gで5分遠心して集菌した。培養液体積の0.25倍量の冷却した20mM Tris-HCl pH8.0で洗浄し、遠心操作により集菌し、精製を開始するまで-80℃で凍結保存した。
cell lysateの調製はBugBuster Protein Extraction Reagent（メルク）を用い、添付のプロトコールに従って行った。タンパク質の精製は、Ni-NTA Fast Start Kit(QIAGEN)を用い、添付のプロトコールに従って行った。精製度を確認するために、精製の各ステップで5mlずつサンプリングを行い、SDS-PAGEに供した。SDS-PAGEはNuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel（インビトロジェン）を使用し、常法に従って行った。
溶出を2回にわけて行ったところ、1回目の溶出サンプルは僅かなマイナーバンドが検出されたものの、ほぼ単一に精製できていたため、2回目の溶出液と合わせたものを精製タンパク質とし、以下の実験に使用した（図4）。
実施例６ CDS2657タンパク質の鉄結合性
（１）鉄とは結合しないBSA（SIGMA）と鉄結合性タンパク質であるFerritin(apoferritin from equine spleen, SIGMA）をコントロールとした。
＜アポタンパク質の調製＞
精製したCDS2657タンパク質（200μM）を、10mM EDTA、2mM DTTの反応液中で、37℃、１時間インキュベートした。反応後のCDS2657タンパク質を、水で平衡化したPD-10カラム（GE healthcare）で精製し、EDTAと遊離した鉄イオンを除いた。
＜鉄結合アッセイ＞
アポタンパク質（50μM）とFe(NH4)2(SO4)2・6H2O(10、100、1000μM)を2mM DTT存在下で室温5分インキュベートした（total volume 1mlとした）。尚、鉄を1000μM添加したサンプルは反応液が赤褐色に変化したため、測定サンプルから除外した。水で平衡化したPD-10カラム（GE healthcare）にアプライし、遊離の鉄イオンを除いてタンパク質画分を精製した。タンパク質画分は3mlにメスアップし、ICP発光分光分析装置（バリアンテクノロジーズジャパンリミテッド）を用いて鉄濃度を測定した。
（１）鉄とは結合しないBSA（SIGMA）と鉄結合性タンパク質であるFerritin(apoferritin from equine spleen, SIGMA）をコントロールとした。
＜アポタンパク質の調製＞
精製したCDS2657タンパク質（200μM）を、10mM EDTA、2mM DTTの反応液中で、37℃、１時間インキュベートした。反応後のCDS2657タンパク質を、水で平衡化したPD-10カラム（GE healthcare）で精製し、EDTAと遊離した鉄イオンを除いた。
＜鉄結合アッセイ＞
アポタンパク質（50μM）とFe(NH4)2(SO4)2・6H2O(10、100、1000μM)を2mM DTT存在下で室温5分インキュベートした（total volume 1mlとした）。尚、鉄を1000μM添加したサンプルは反応液が赤褐色に変化したため、測定サンプルから除外した。水で平衡化したPD-10カラム（GE healthcare）にアプライし、遊離の鉄イオンを除いてタンパク質画分を精製した。タンパク質画分は3mlにメスアップし、ICP発光分光分析装置（バリアンテクノロジーズジャパンリミテッド）を用いて鉄濃度を測定した。
（２）結果
CDS2657タンパク質は鉄との結合性を示し、鉄を100μM添加した時には、1分子あたり約2分子の鉄と結合した（表２）。
CDS2657タンパク質は鉄との結合性を示し、鉄を100μM添加した時には、1分子あたり約2分子の鉄と結合した（表２）。
実施例７ CDS2657タンパク質によるヒドロキシルラジカル生成の抑制
ヒドロキシルラジカルの生成と検出は、Halliwell（Halliwell, B., and J. M. Gutteridge. 1981. Formation of a thiobarbituric acid reactive substance from deoxyribose in the presence of iron salts. FEBS Lett. 128:347-352.）およびYamamoto（Yamamoto, Y., L. B. Poole, R. R. Hantgan, and Y. Kamio. 2002. An iron-binding protein, Dpr, from Streptococcus mutans prevents iron-dependent hydroxyl radical formation in vitro. J. Bacteriol. 184:2931-2939.）が報告している方法に従って行った。すなわち、2価鉄によって非酵素的にヒドロキシルラジカルを生成させ、このヒドロキシルラジカルによってデオキシリボースを分解し、産生したマロンジアルデヒド様物質を、チオバルビツール酸と反応させることで、赤色物質を生成させ、その蛍光量を測定することによってヒドロキシルラジカル生成量を求めた。
ヒドロキシルラジカルの生成と検出は、Halliwell（Halliwell, B., and J. M. Gutteridge. 1981. Formation of a thiobarbituric acid reactive substance from deoxyribose in the presence of iron salts. FEBS Lett. 128:347-352.）およびYamamoto（Yamamoto, Y., L. B. Poole, R. R. Hantgan, and Y. Kamio. 2002. An iron-binding protein, Dpr, from Streptococcus mutans prevents iron-dependent hydroxyl radical formation in vitro. J. Bacteriol. 184:2931-2939.）が報告している方法に従って行った。すなわち、2価鉄によって非酵素的にヒドロキシルラジカルを生成させ、このヒドロキシルラジカルによってデオキシリボースを分解し、産生したマロンジアルデヒド様物質を、チオバルビツール酸と反応させることで、赤色物質を生成させ、その蛍光量を測定することによってヒドロキシルラジカル生成量を求めた。
（１）方法
0.3ml のbasal reaction mixture （10mM potassium phosphate buffer (pH7.4), 63mM NaCl, 4mM 2-deoxyribose）にサンプルを添加し、終濃度10mMとなるようFe(NH4)2(SO4)2・6H2Oを加え、total 2mlで37℃、15分インキュベートした。加熱融解した0.25mlの１％(w/v)thiobarbituric acidと0.25mlの2.8%(w/v) trichloroacetic acidを加えた後、反応液を10分間煮沸し、急冷した。生成した赤色物質を、蛍光分光光度計(Shimadzu)を用いて、532nmで励起し、553nmの蛍光を測定し、サンプル無添加時の蛍光値からの減少をヒドロキシルラジカル生成反応の阻害度として表した（表３）。
0.3ml のbasal reaction mixture （10mM potassium phosphate buffer (pH7.4), 63mM NaCl, 4mM 2-deoxyribose）にサンプルを添加し、終濃度10mMとなるようFe(NH4)2(SO4)2・6H2Oを加え、total 2mlで37℃、15分インキュベートした。加熱融解した0.25mlの１％(w/v)thiobarbituric acidと0.25mlの2.8%(w/v) trichloroacetic acidを加えた後、反応液を10分間煮沸し、急冷した。生成した赤色物質を、蛍光分光光度計(Shimadzu)を用いて、532nmで励起し、553nmの蛍光を測定し、サンプル無添加時の蛍光値からの減少をヒドロキシルラジカル生成反応の阻害度として表した（表３）。
（２）結果
鉄キレート剤であるdeferoxamine (SIGMA)は、濃度依存的にヒドロキシルラジカル生成を抑制した。CDS2657も同様に濃度依存的にヒドロキシルラジカルの生成を抑制した。一方、鉄結合タンパク質であるferritinはヒドロキシルラジカル生成をほとんど抑制しなかった。
鉄キレート剤であるdeferoxamine (SIGMA)は、濃度依存的にヒドロキシルラジカル生成を抑制した。CDS2657も同様に濃度依存的にヒドロキシルラジカルの生成を抑制した。一方、鉄結合タンパク質であるferritinはヒドロキシルラジカル生成をほとんど抑制しなかった。
以上のことから、CDS2657タンパク質は、細胞内の鉄を除去し、ヒドロキシルラジカルの生成を抑制することで、過酸化水素耐性に関与することが示唆された。
実施例８ CDS2657高発現株の過酸化水素に対する影響
（１）CDS2657高発現株の作製
CDS2657高発現株は、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029中で機能する合成プロモーター配列をマルチクローニングサイトの上流に配置したpLP10ベクター（Yasuda et. al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74:4746-4755.、Kiwaki et. al. 2002. Biosci. Microflora 20:121-129）にCDS2657遺伝子を挿入したプラスミドをラクトバチルス・カゼイ YIT 9029に導入することで作製した。
CDS2657遺伝子の上流のSD配列から、終止コドンまでを増幅し、制限酵素BamH I切断部位、制限酵素Pst I切断部位をそれぞれ含む配列を付加したプライマーを設計した（2657outF: cgcggatccaatagagaggatggttcgga（配列番号１１）, 2657outR:aaactgcagttagcaaattttgccgcc（配列番号１２））。このプライマーセットを用い、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のゲノムDNAを鋳型として、KOD-plus-DNA Polymerase(TOYOBO)を用いてPCRを行い、CDS2657遺伝子断片を増幅した。得られたPCR産物を電気泳動し、目的とする大きさのDNA断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)で抽出、精製した。さらに、DNA断片をBamH I, Pst Iで消化し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pLP10はBamH I, Pst Iで消化しQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pLP10ベクターとCDS2657のDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2.1(タカラバイオ)を用いてライゲーションし、このライゲーション反応液をE. coli JM109コンピテントセル（TOYOBO）に導入し形質転換した。
（１）CDS2657高発現株の作製
CDS2657高発現株は、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029中で機能する合成プロモーター配列をマルチクローニングサイトの上流に配置したpLP10ベクター（Yasuda et. al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74:4746-4755.、Kiwaki et. al. 2002. Biosci. Microflora 20:121-129）にCDS2657遺伝子を挿入したプラスミドをラクトバチルス・カゼイ YIT 9029に導入することで作製した。
CDS2657遺伝子の上流のSD配列から、終止コドンまでを増幅し、制限酵素BamH I切断部位、制限酵素Pst I切断部位をそれぞれ含む配列を付加したプライマーを設計した（2657outF: cgcggatccaatagagaggatggttcgga（配列番号１１）, 2657outR:aaactgcagttagcaaattttgccgcc（配列番号１２））。このプライマーセットを用い、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のゲノムDNAを鋳型として、KOD-plus-DNA Polymerase(TOYOBO)を用いてPCRを行い、CDS2657遺伝子断片を増幅した。得られたPCR産物を電気泳動し、目的とする大きさのDNA断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)で抽出、精製した。さらに、DNA断片をBamH I, Pst Iで消化し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pLP10はBamH I, Pst Iで消化しQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pLP10ベクターとCDS2657のDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2.1(タカラバイオ)を用いてライゲーションし、このライゲーション反応液をE. coli JM109コンピテントセル（TOYOBO）に導入し形質転換した。
得られた形質転換体を500μg／mLのエリスロマイシンを添加したＬＢ培地で生育し、ウィザードプラスSVミニプレップDNAピューリフィケーションシステム（プロメガ社製）を用いて組換えプラスミドDNAを抽出した。
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029へのDNA導入には、該微生物をMRS培地（ディフコ社製）に生育し、対数増殖期にある培養液を5,000 x g 4℃で5分間遠心して集菌し、菌体を氷冷した20mM HEPES(pH7.0)と10%グリセロールでそれぞれ1回ずつ洗浄し、洗浄菌体を（初めの培養液のクレット値）x 2μlの10%グリセロールに懸濁した。菌懸濁液40μlと組換えプラスミドDNA溶液2μlを混合し、2mm幅のエレクトロポレーション用キュベットに入れ、ジーンパルサーII（バイオラッド社製）を用いて、1.5kV, 200Ω、キャパシタンス25μFでエレクトロポレーションを行った。この液にMRS培地1mLを加え、37℃で１時間培養後、エリスロマイシンを20μg／mLの濃度で加えたMRS寒天培地に塗布し37℃で2日又は3日間インキュベートした。
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029へのDNA導入には、該微生物をMRS培地（ディフコ社製）に生育し、対数増殖期にある培養液を5,000 x g 4℃で5分間遠心して集菌し、菌体を氷冷した20mM HEPES(pH7.0)と10%グリセロールでそれぞれ1回ずつ洗浄し、洗浄菌体を（初めの培養液のクレット値）x 2μlの10%グリセロールに懸濁した。菌懸濁液40μlと組換えプラスミドDNA溶液2μlを混合し、2mm幅のエレクトロポレーション用キュベットに入れ、ジーンパルサーII（バイオラッド社製）を用いて、1.5kV, 200Ω、キャパシタンス25μFでエレクトロポレーションを行った。この液にMRS培地1mLを加え、37℃で１時間培養後、エリスロマイシンを20μg／mLの濃度で加えたMRS寒天培地に塗布し37℃で2日又は3日間インキュベートした。
生育したエリスロマイシン耐性コロニーの一部をとり、50μlのTEに懸濁後、94℃で2.5分間処理し、その一部をテンプレートとして用い、pLP10のマルチクローニングサイトの上流と下流の配列のプライマーを用いてPCR解析を行うことにより、CDS2657断片がpLP10に挿入されたプラスミドが、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029に導入されていることを確認した。こうして得たクローンをラクトバチルス・カゼイ MS106株（２０１１年２月２５日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４７６として寄託）とした。
（２）過酸化水素添加による生育への影響
ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029、CDS2657破壊株であるラクトバチルス・カゼイ MS105、pLP10ベクターをラクトバチルス・カゼイ YIT 9029に導入した、ラクトバチルス・カゼイ MS101および、CDS2657を高発現したラクトバチルス・カゼイ MS106を用いた。
各菌株をMRS培地に接種し、好気静置条件下で、37℃で培養した。培養7時間後に、終濃度0、1.5、3mMとなるよう過酸化水素を添加し、好気静置条件下で継続して培養した。7時間から24時間の生育を、Klett-Summerson比色計で測定した濁度の増加量で示した。
ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029、CDS2657破壊株であるラクトバチルス・カゼイ MS105、pLP10ベクターをラクトバチルス・カゼイ YIT 9029に導入した、ラクトバチルス・カゼイ MS101および、CDS2657を高発現したラクトバチルス・カゼイ MS106を用いた。
各菌株をMRS培地に接種し、好気静置条件下で、37℃で培養した。培養7時間後に、終濃度0、1.5、3mMとなるよう過酸化水素を添加し、好気静置条件下で継続して培養した。7時間から24時間の生育を、Klett-Summerson比色計で測定した濁度の増加量で示した。
（３）結果
CDS2657高発現株（MS106）では、過酸化水素を1.5mM、3mM添加しても他の菌株より24時間後の濁度の増加が認められ、過酸化水素を3mM添加した時に、その差は顕著であった（図５）。
CDS2657高発現株（MS106）では、過酸化水素を1.5mM、3mM添加しても他の菌株より24時間後の濁度の増加が認められ、過酸化水素を3mM添加した時に、その差は顕著であった（図５）。
Claims (15)
- 以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする過酸化水素耐性付与遺伝子。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質 - 以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる過酸化水素耐性付与遺伝子。
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド - 請求項１又は２記載の遺伝子を微生物に導入するか又は微生物が有する当該遺伝子を改変することを特徴とする当該微生物に対する過酸化水素耐性の付与又は強化方法。
- 遺伝子の改変が、請求項１又は２記載の遺伝子の発現増強である請求項３記載の方法。
- 請求項１又は２記載の遺伝子が導入又は改変されてなる微生物。
- 微生物がグラム陽性細菌である請求項５記載の微生物。
- グラム陽性細菌がラクトバチルス属細菌である請求項６記載の微生物。
- ラクトバチルス属細菌がラクトバチルス・カゼイである請求項７記載の微生物。
- 請求項５〜８のいずれか１項記載の微生物を含有する飲食品。
- 請求項５〜８のいずれか１項記載の微生物を含有する医薬品。
- 請求項１又は２記載の遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することを特徴とする過酸化水素耐性微生物のスクリーニング方法。
- 請求項２記載のポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター。
- 請求項１２記載の組換えベクターを含む宿主微生物。
- 請求項２記載のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする核酸断片。
- 請求項２記載のポリヌクレオチド又はその一部を含むDNAアレイ又はDNAチップ。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011047841 | 2011-03-04 | ||
| JP2011047841 | 2011-03-04 | ||
| PCT/JP2012/055401 WO2012121150A1 (ja) | 2011-03-04 | 2012-03-02 | 過酸化水素耐性付与遺伝子及びその利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2012121150A1 true JPWO2012121150A1 (ja) | 2014-07-17 |
| JP5901609B2 JP5901609B2 (ja) | 2016-04-13 |
Family
ID=46798114
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013503506A Active JP5901609B2 (ja) | 2011-03-04 | 2012-03-02 | 過酸化水素耐性付与遺伝子及びその利用 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9139837B2 (ja) |
| EP (1) | EP2682465B1 (ja) |
| JP (1) | JP5901609B2 (ja) |
| KR (1) | KR102038714B1 (ja) |
| CN (1) | CN103732742B (ja) |
| ES (1) | ES2626277T3 (ja) |
| WO (1) | WO2012121150A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102067341B1 (ko) * | 2018-07-26 | 2020-01-16 | 전남대학교산학협력단 | 산화적 스트레스에 대한 저항성 및 내성을 증가시키는 바실러스 종 pamc23324 유래 펩타이드 |
| KR102077930B1 (ko) | 2018-07-26 | 2020-02-14 | 전남대학교산학협력단 | 산화적 스트레스에 대한 저항성 및 내성을 증가시키는 바실러스 종 pamc23412 유래 펩타이드 |
| KR102077931B1 (ko) | 2018-07-26 | 2020-02-14 | 전남대학교산학협력단 | 산화적 스트레스에 대한 저항성 및 내성을 증가시키는 바실러스 종 pamc22784 유래 펩타이드 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4010740B2 (ja) | 2000-05-08 | 2007-11-21 | 株式会社奥村組 | シールド掘進機 |
| JP2001327292A (ja) | 2000-05-22 | 2001-11-27 | Meiji Milk Prod Co Ltd | 酸素耐性遺伝子および該遺伝子によりコードされるタンパク質 |
| CN101139557B (zh) | 2006-09-08 | 2010-05-12 | 内蒙古农业大学 | 一种干酪乳杆菌及其在改善血脂代谢和免疫调节中的应用 |
| CN101144062B (zh) * | 2006-09-15 | 2011-11-16 | 内蒙古农业大学 | 一种干酪乳杆菌菌株及其制品在禽类免疫中的应用 |
| US20120021418A1 (en) | 2008-06-13 | 2012-01-26 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Gene that imparts oxygen resistance and application thereof |
-
2012
- 2012-03-02 CN CN201280011277.3A patent/CN103732742B/zh active Active
- 2012-03-02 EP EP12755465.7A patent/EP2682465B1/en active Active
- 2012-03-02 ES ES12755465.7T patent/ES2626277T3/es active Active
- 2012-03-02 KR KR1020137023261A patent/KR102038714B1/ko active IP Right Grant
- 2012-03-02 WO PCT/JP2012/055401 patent/WO2012121150A1/ja active Application Filing
- 2012-03-02 US US14/003,094 patent/US9139837B2/en active Active
- 2012-03-02 JP JP2013503506A patent/JP5901609B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9139837B2 (en) | 2015-09-22 |
| ES2626277T3 (es) | 2017-07-24 |
| EP2682465B1 (en) | 2017-05-10 |
| KR20140114275A (ko) | 2014-09-26 |
| EP2682465A1 (en) | 2014-01-08 |
| CN103732742A (zh) | 2014-04-16 |
| EP2682465A4 (en) | 2014-09-03 |
| KR102038714B1 (ko) | 2019-10-31 |
| JP5901609B2 (ja) | 2016-04-13 |
| WO2012121150A1 (ja) | 2012-09-13 |
| CN103732742B (zh) | 2016-08-10 |
| US20140141437A1 (en) | 2014-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Alcántara et al. | Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance | |
| Bron et al. | Genetic characterization of the bile salt response in Lactobacillus plantarum and analysis of responsive promoters in vitro and in situ in the gastrointestinal tract | |
| An et al. | High-level expression of heme-dependent catalase gene katA from Lactobacillus sakei protects Lactobacillus rhamnosus from oxidative stress | |
| Zhang et al. | Genome shuffling of Lactococcus lactis subspecies lactis YF11 for improving nisin Z production and comparative analysis | |
| US8741622B2 (en) | Stress tolerant Bifidobacteria | |
| Wada et al. | Characterization of four plasmids harboured in a Lactobacillus brevis strain encoding a novel bacteriocin, brevicin 925A, and construction of a shuttle vector for lactic acid bacteria and Escherichia coli | |
| Liu et al. | Bacillus subtilis BS-15 effectively improves plantaricin production and the regulatory biosynthesis in Lactiplantibacillus plantarum RX-8 | |
| JP5901609B2 (ja) | 過酸化水素耐性付与遺伝子及びその利用 | |
| Choi et al. | Antimicrobial peptides (bacteriocins) produced by Lactococcus lactis and Pediococcus pentosaceus strains with activity against clinical and food-borne pathogens | |
| WO2009150856A1 (ja) | 酸素耐性付与遺伝子及びその利用 | |
| JP6412865B2 (ja) | ビフィドバクテリウム・ブレーベ株特異的遺伝子 | |
| KR102333252B1 (ko) | 미생물의 산내성 조절 방법 | |
| ABDULLAHI | PRODUCTION OF BACTERIOCIN BY LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM CHEESE TO ENCHANCE THE SHELF LIFE OF MILLET DOUGH BALL (FURA) | |
| Alcántara et al. | Polyphosphate in Lactobacillus: accumulation and involvement in resistance against stress 2 | |
| Park et al. | Isolation and characterization of some promoter sequences from Leuconostoc mesenteroides SY2 isolated from kimchi | |
| JP4967138B2 (ja) | 乳酸菌用プラスミド | |
| Douglas | Application of Integration Tools for Functional Genomic Analysis of Lactobacilli | |
| Jeong et al. | Characterisation and partial purification of an antimutagenic peptide produced by Lactobacillus plantarum JNU 2116 | |
| O’Sullivan | 10 Genetics of Dairy Starter Cultures | |
| Wang | Physical and Functional Events Involved in Conjugal Transfer of Lactose Utilization in Lactococcus lactis subsp. lactis | |
| WO2002097098A1 (en) | Vector for lactic acid bacteria and method for expressing ferritin in the lactic bacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20141107 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151110 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160112 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160209 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160308 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5901609 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |