CN117757892A

CN117757892A - 预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用

Info

Publication number: CN117757892A
Application number: CN202410195512.1A
Authority: CN
Inventors: 李振华; 王宏华; 尚玉珍; 辛瑞祥; 曹阳; 鲁爱玲; 王辉; 张勇; 徐婷婷; 刘杰
Original assignee: Changle County Animal Husbandry Development Center; Weifang Jiyin Biotechnology Co ltd; Weifang Huazhuo Biotechnology Co ltd; Weifang Huaying Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Changle County Animal Husbandry Development Center; Weifang Jiyin Biotechnology Co ltd; Weifang Huazhuo Biotechnology Co ltd; Weifang Huaying Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2024-02-22
Filing date: 2024-02-22
Publication date: 2024-03-26

Abstract

本申请公开了一种预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用，其属于微生物技术领域，通过血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HI）反向高通量筛选可分泌鸡新城疫病毒免疫类似物的益生菌，即为天然靶向新城疫病毒的功能性益生菌。将筛选出来的功能性益生菌制备成多种产品，用于高效预防养殖中鸡新城疫病毒的感染，高效且生产成本低、无副反应，具有重要的临床应用价值。

Description

预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用

技术领域

本申请属于微生物技术领域，尤其是涉及一种预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用。

背景技术

鸡新城疫（Newcastle Disease，ND）严重危害养鸡业的健康发展，引起该病的病原为鸡新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV），临床主要表现为呼吸道症状和肠道症状，比如呼吸困难、下痢、黏膜或浆膜出血、神经症状等；鸡新城疫传播迅速、死亡率高，给全球养鸡业带了巨大的经济损失，世界动物卫生组织将其列为法定报告的疫病。

鸡新城疫病毒含有血凝素，可进行血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HI），其中血凝抑制试验常用于鸡新城疫病毒疫苗免疫后的抗体水平检测，测得的抗体水平与免疫攻毒保护试验具有高度的相关性，显示鸡新城疫病毒的血凝素具有良好的免疫原性，可作为新城疫病毒防控药物开发的靶蛋白；益生菌在发酵过程中常分泌多种胞外多糖、脂肽、多肽等，具有多种免疫学功能。目前筛选防控新城疫病毒的功能性益生菌方法基本都是正向筛选方法，即筛选可以直接杀灭或者抑制新城疫病毒复制的益生菌，从而达到防控新城疫病毒的目的；但该方法由于只直接杀灭或者抑制病毒，所以对病原的防护期相对较短，需要短期多次添加功能性益生菌才能有效，因此使用成本普遍偏高，临床应用不经济。

基于血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HI），本发明建立了一种高通量的反向筛选方法，可以从益生菌发酵液快速高效的找到新城疫病毒的血凝素类似物，也就是免疫类似物，给动物口服后可高效刺激动物肠道分泌新城疫病毒的黏膜抗体，从而可以长效、特异的预防鸡的新城疫病毒。同时本发明筛选的天然靶向新城疫病毒的功能性益生菌具有生产成本低、制造流程简单以及易于产业化等多种优势。

发明内容

本申请提供了一种预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用，以天然的益生菌发酵液为目标，利用血凝试验与血凝抑制试验快速高效的筛选出分泌新城疫病毒免疫类似物的功能性益生菌，并用于鸡新城疫病毒的预防。

本申请实施例提供了一种预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法，具体包括：

（1）候选益生菌测试液制备：将候选益生菌接入液体培养基中活化，得到候选益生菌培养液，将所述候选益生菌培养液离心，收集上清得到候选益生菌测试液；

（2）血凝试验：筛选候选益生菌测试液凝集鸡红细胞的益生菌作为具有血凝性的益生菌；

（3）血凝抑制试验：筛选具有血凝性的益生菌与新城疫病毒标准阳性血清发生反应的益生菌作为天然靶向新城疫病毒的功能性益生菌。

在其中一实施例中，

所述血凝试验具体为：血凝板中加入磷酸缓冲盐溶液、候选益生菌测试液，系列稀释；加入1 %鸡红细胞悬液，并设对照孔，混匀，室温放置；筛选候选益生菌测试液凝集1 %鸡红细胞的益生菌作为具有血凝性的益生菌；所述血凝抑制试验具体为：血凝板中加入PBS，第1孔加入新城疫病毒标准阳性血清，设置血清孔，并设抗原对照孔和PBS对照孔，所述血清孔倍比稀释；所述血清孔和抗原对照孔加入四单位抗原，混匀，室温放置；加入1 %鸡红细胞悬液，混匀，室温放置，筛选出所述具有血凝性的益生菌中能与新城疫病毒标准阳性血清发生反应、特异性的抑制鸡红细胞凝集的益生菌。

在其中一实施例中，

所述候选益生菌为嗜酸乳杆菌，所述液体培养基为MRS液体培养基。

在其中一实施例中，

所述候选益生菌的培养温度为37 ℃，培养时间为18 h，所述候选益生菌培养液离心转速为8000 r/min，离心时间为10 min。

在其中一实施例中，

所述血凝板为V型96孔血凝板。

在其中一实施例中，

所述四单位抗原制备方法为：选择V型96孔血凝板，从第1孔至12孔，用移液器每孔加入PBS 25 μl；将第1孔加入25 μl具有血凝性的益生菌测试液，从第1孔起，依次作2倍系列稀释，至第11孔，弃去移液器内25 μl液体；第12孔不加样品为红细胞对照孔，每孔加入25μl PBS；每孔加入25 μl 1 %鸡红细胞悬液，混匀，置室温20-40 min；当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果，以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点；根据测得的血凝效价将具有血凝性的益生菌测试液稀释至血凝价为2²，即为四单位抗原。

在其中一实施例中，

所述血凝试验中PBS吸取量为25 μl，所述候选益生菌测试液吸取量为25 μl，最后1孔弃去液体量为25 μl，所述1 %鸡红细胞悬液吸取量为25 μl；所述血凝抑制试验中血清孔和抗原对照孔PBS吸取量为25 μl，PBS对照孔PBS吸取量为50 μl，所述新城疫病毒标准阳性血清吸取量为25 μl，所述第1孔血清与PBS充分混匀后移出量为25 μl，所述血清孔最后一孔弃去液体量为25 μl，所述四单位抗原吸取量为25 μl，所述1 %鸡红细胞悬液吸取量为25 μl，所述室温放置时间为20-40 min。

在其中一实施例中，

所述系列稀释为2倍系列稀释。

本申请实施例还提供了一种预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌的应用，为根据上述任一实施例的预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法筛选出的功能性益生菌，用于制备预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌产品。

在其中一实施例中，

所述功能性益生菌产品包括液体产品和针剂产品，所述液体产品为功能性益生菌样品，所述功能性益生菌样品为天然靶向鸡新城疫病毒的功能性益生菌的上清液按比例混合制成，优选的，所述功能性生菌为功能性益生菌A53、A337和A766，功能性益生菌A53、A337和A766上清液混合比例为1 : 1 : 1；所述针剂产品为功能性益生菌疫苗，所述功能性益生菌疫苗为所述功能性益生菌样品与白油佐剂按比例混合制成，优选的，功能性益生菌样品与白油佐剂混合比例为1 : 2。

本申请提供了一种预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用，基于血凝试验与血凝抑制试验，可快速、高效地从益生菌发酵液中筛选出分泌鸡新城疫病毒免疫类似物的功能性益生菌，效率高、成果显著；本申请筛选得到的功能性益生菌A53、A337和A766可以制备成多种功能性益生菌产品，有效预防临床养殖中鸡新城疫病毒，显著降低肉鸡死亡率，并且功能性益生菌可以通过高通量发酵进行大量制备，相比传统新城疫病毒灭活疫苗的鸡胚生产方式生产成本更低，操作更简便，可实现产业化，为鸡新城疫病毒的高效防控提供一种新的工具，具有重要的市场应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请，应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围；下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本实施例中使用的候选益生菌菌株均来自潍坊华卓生物科技有限公司菌株资源库，新城疫病毒基因VIId强毒（SD株）来自潍坊华卓生物科技有限公司毒株资源库；鸡新城疫病毒标准阳性血清购自青岛立见生物科技有限公司；新城疫病毒标准强毒株（保藏号：CVCCAV1611）购自中国兽医药品监察所菌毒种室；商业化新城疫灭活疫苗购自吉林正业生物制品股份有限公司，批号为20230101；临床试验养殖场为青岛平度某罗斯308肉鸡养殖场。

实施例1

功能性益生菌反向筛选方法

1-1 液体培养基配制

称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乙酸钠2g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2g、K₂PO₄•3H₂O 2.6 g、MgSO₄•7H₂O 0.1g、MnSO₄0.05g和半胱氨酸盐酸盐0.5g，去离子水溶解，再加入1ml吐温80，定容至1L，121 ℃高压灭菌15 min，待冷至常温，备用；

1-2 方法

步骤1 候选益生菌培养液制备

本次实验随机选择嗜酸乳杆菌860株，编号为A1-A860；分别将冻存于-80 ℃冰箱的嗜酸乳杆菌接入MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养18 h进行活化，得到候选益生菌培养液，用于后续试验。

步骤2 候选益生菌测试液制备

将步骤1得到的候选益生菌培养液8000 r/min离心10 min，收集发酵上清液，得到候选益生菌测试液。

步骤3 血凝试验（HA）

选择V型96孔血凝板，从第1-12孔，用移液器每孔加入PBS 25 μl，用移液器吸取步骤（2）不同的候选益生菌测试液25 μl，从第1孔起，依次作2倍系列稀释，至最后1孔，弃去移液器内25 μl液体；每孔加入1 %鸡红细胞悬液25 μl，并设不加样品的红细胞对照孔，混匀，置室温20-40 min，当对照孔中红细胞呈显著纽扣状时判定结果，使红细胞完全凝集的最高稀释倍数作为判定的终点；血凝价不低于2⁶的益生菌即为具有血凝性的益生菌。

步骤4 四单位抗原制备

选择V型96孔血凝板，从第1-12孔，用移液器每孔加入PBS 25 μl；将第1孔加入25μl步骤（2）的益生菌测试液，从第1孔起，依次作2倍系列稀释，至第11孔，并弃除第11孔液体25 μl；第12孔不加样品作为红细胞对照孔；1-12孔每孔加入25 μl PBS， 25 μl 1 %鸡红细胞悬液，混匀，置室温20-40 min；当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果，以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点；根据测得的血凝效价将具有血凝性的益生菌测试液稀释至血凝价为2²，即为四单位抗原。

步骤5 血凝抑制试验（HI）

选择V型96孔血凝板，向1-11孔加入25 μl PBS，第12孔加入50 μl PBS；第1孔加入25μl新城疫病毒标准阳性血清；第1孔血清与PBS充分混匀后移出25 μl至第2孔，依次类推，倍比稀释至第10孔，并弃除第10孔液体25 μl；第11孔作为抗原对照，第12孔为PBS对照；第1-11孔各加入25 μl步骤（4）的四单位抗原，混匀，置室温下20 min；第1-12孔各加入25 μl的1 %鸡红细胞悬液，混匀，置室温20-40 min；当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果，以使红细胞凝集被完全抑制的新城疫病毒标准阳性血清最高稀释度作为判定终点；对新城疫病毒标准阳性血清具有血凝抑制的样品，即为筛选获得的天然靶向新城疫病毒的功能性益生菌。

1-3 筛选结果

1-3-1 血凝试验筛选结果

根据1-2中步骤3的方法，共筛选出23株具有血凝性的益生菌，结果见表1。

表1 具有血凝性的益生菌及血凝价

1-3-2 血凝抑制试验筛选结果

根据1-2中步骤5的方法，共筛选出3株靶向新城疫病毒的功能性益生菌，结果见表2。

表2 靶向新城疫病毒的功能性益生菌及血凝价抑制价

通过1.2筛选方法筛选得到功能性益生菌A53、A337和A766。

1-4 功能验证

1-4-1 样品制备

将通过筛选获得的具有血凝性的嗜酸乳杆菌A29、A53、A280、A337、A736和A766按照5 %的接种量分别接种到MRS液体培养基中，于37 ℃下培养，当菌数达10⁸CFU/mL以上时，停止发酵，8000 r/min离心10 min，收集发酵上清液；其中A53、A337和A766发酵上清液按1 :1 : 1比例混合，0.22 μm滤膜无菌过滤，得到功能性益生菌样品；A29、A280、A736发酵上清液按1 : 1 : 1比例混合，0.22 μm滤膜无菌过滤，得到对照菌样品。

1-4-2 样品检验

各样品进行血凝试验与血凝抑制试验，其中功能性益生菌样品的血凝价应不低于2⁸，且与新城疫病毒标准阳性血清的血凝抑制试验为阳性；对照菌样品的血凝价应不低于2⁸，且与新城疫病毒标准阳性血清的血凝抑制试验结果为阴性。

1-4-3 SPF鸡免疫攻毒试验

1-4-3-1 分组

30只21日龄SPF鸡随机分为菌液组、对照菌组和空白对照组；10只/组。

1-4-3-2 方法

菌液组SPF鸡口服功能性益生菌样品，对照菌组SPF鸡口服对照菌样品，两组口服剂量均为0.5 ml/只，7日后攻毒，两组均肌肉注射新城疫病毒标准强毒株，注射剂量为10⁵ELD₅₀/只；空白对照组正常饲养，不进行操作；3组均观察14日，记录各组SPF鸡死亡数，计算保护率。

1-4-3-3 结果

菌液组的SPF鸡攻毒后14日内死亡数为2，其余鸡只全部健活，未见不良临床反应；对照菌组SPF鸡攻毒后全部死亡，空白对照组SPF鸡全部健活，结果见表3。

表3 攻毒试验各组保护率统计表

免疫攻毒试验结果表明功能性益生菌样品对SPF鸡的保护率达到80 %，而对照菌样品的保护率为0；以上结果充分证明，本申请筛选得到的功能性益生菌A53、A337和A766混合后给SPF鸡口服应用，具有显著地预防新城疫病毒的功效，同时说明本申请基于血凝试验和血凝抑制试验的预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌筛选方法具有高效且成功率高的特点。

1-5 功能性益生菌样品饮水应用临床试验

1-5-1 样品制备

功能性益生菌样品和对照菌样品制备同1-4-1。

1-5-2 临床试验

1-5-2-1 分组

将养殖场18万只肉鸡随机分成6个养殖棚，1、3、5号棚为功能性益生菌样品组，2、4、6号棚为对照菌样品组。

1-5-2-2 方法

功能性益生菌样品组：在7、8、17、18日龄饮水时应用功能性益生菌饮水样品，0.5mL/只；

对照菌样品组：在7、8、17、18日龄饮水时应用对照菌饮水样品，0.5 ml/只；

其他按正常药物预防程序。

1-5-3 结果

对照菌样品组：30日龄时，4、6号棚的鸡群出现轻度呼吸道症状，精神不振，随后几天出现个别死亡、拉黄绿粪便等，剖检发现腺胃乳头尖部出血，腺胃与肌胃连接处出血，经送检第三方实验室做荧光PCR病原检测，结果为新城疫病毒；34日龄时2号棚鸡群也出现类似症状；常规抗病毒中药治疗，症状有所缓解，至42日龄出栏，整个养殖期鸡群死亡率为9.5%。功能性益生菌样品组：整个养殖周期，大群稳定，未出现明显异常情况，至42日龄正常出栏，鸡群死亡率为2.6 %。

临床试验数据表明，本发明筛选得到的功能性益生菌A53、A337和A766制备成功能性益生菌饮水，在临床上7、8、17、18日龄饮水应用，可有效预防养殖中肉鸡的新城疫病毒感染，显著降低肉鸡死亡率。

对比例1

功能性益生菌疫苗与商用疫苗的免疫攻毒效果比对试验

1-1 疫苗配制

将实施例1中1-4-1制备的功能性益生菌样品与白油佐剂按1 : 2比例混合乳化，得到功能性益生菌疫苗；将实施例1中1-4-1制备的对照菌样品与白油佐剂按1 : 2比例混合乳化，得到对照菌疫苗；选用商业化新城疫灭活疫苗作为对照疫苗。

1-2 比对实验

1-2-1 分组

40只21日龄SPF鸡随机分为功能性益生菌疫苗组、对照菌疫苗组、对照疫苗组和空白对照组4组，10只/组。

1-2-2 方法

功能性益生菌疫苗组皮下注射功能性益生菌疫苗，对照菌疫苗组皮下注射对照菌疫苗，对照疫苗组皮下注射商业化新城疫灭活疫苗；3组注射剂量均为0.2 ml/只；21日后攻毒，3组均肌肉注射新城疫病毒基因VIId强毒（SD株），注射剂量为10⁵ELD₅₀/只；空白对照组正常饲养，不进行操作；4组均观察14日，记录各组SPF鸡死亡数，计算保护率。

1-3 结果

功能性益生菌疫苗组、对照疫苗组和空白对照组的SPF鸡攻毒后14日鸡只全部健活，未见不良临床反应，对照菌疫苗组SPF鸡攻毒后全部死亡，结果见表4。

表4 比对试验各组保护率统计表

结果表明功能性益生菌疫苗对SPF鸡的保护率达到100 %，与现有商品化新城疫病毒灭活疫苗效果相当，而对照菌疫苗的保护率为0；新城疫病毒基因VIId强毒是当前鸡群养殖中主要的流行毒株，约60 %以上流行的新城疫病毒都是基因VIId，实验证明本申请筛选获得的功能性益生菌制备的疫苗可有效预防。

本申请提供了一种预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法及应用，通过反向筛选方法，基于血凝试验与血凝抑制试验，从860株天然的嗜酸乳杆菌中筛选出A53、A337和A766三株有效的功能性益生菌，为一种高通量筛选方法，可快速、高效、准确地筛选出分泌鸡新城疫病毒免疫类似物的功能性益生菌；本申请采用A53、A337和A766三株功能性益生菌制成的疫苗与现有的商业化鸡新城疫病毒灭活疫苗相比，既可以预防目前流行的基因VII型新城疫病毒强毒感染，又具有生产方便、成本低，无副反应的优势，具有重要的临床应用价值；益生菌A53、A337和A766还可以制备成多种功能性益生菌产品，能有效预防临床养殖中鸡新城疫病毒，显著降低肉鸡死亡率，并且功能性益生菌可以通过高通量发酵进行大量制备，相比传统新城疫病毒灭活疫苗的鸡胚生产方式生产成本更低，制造流程简便，利于工业化生产，为鸡新城疫病毒的高效防控提供一种新的工具，具有重要的市场应用价值。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法，其特征在于，具体包括：

2. 根据权利要求1所述的预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法，其特征在于，所述血凝试验具体为：血凝板中加入磷酸缓冲盐溶液、候选益生菌测试液，系列稀释；加入1 %鸡红细胞悬液，并设对照孔，混匀，室温放置；筛选候选益生菌测试液凝集1 %鸡红细胞的益生菌作为具有血凝性的益生菌；所述血凝抑制试验具体为：血凝板中加入PBS，第1孔加入新城疫病毒标准阳性血清，设置血清孔、抗原对照孔和PBS对照孔，所述血清孔倍比稀释；所述血清孔和抗原对照孔加入四单位抗原，混匀，室温放置；加入1 %鸡红细胞悬液，混匀，室温放置，筛选出所述具有血凝性的益生菌中能与新城疫病毒标准阳性血清发生反应、特异性的抑制鸡红细胞凝集的益生菌。

3.根据权利要求1所述的预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法，其特征在于，所述液体培养基为MRS液体培养基。

4. 根据权利要求1所述的预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法，其特征在于，所述候选益生菌的培养温度为37 ℃，培养时间为18 h，所述候选益生菌培养液离心转速为8000 r/min，离心时间为10 min。

5.根据权利要求2所述的预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法，其特征在于，所述血凝板为V型96孔血凝板。

6. 根据权利要求2所述的预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法，其特征在于，所述四单位抗原制备方法为：选择V型96孔血凝板，从第1孔至12孔，用移液器每孔加入PBS 25 μl；将第1孔加入25 μl具有血凝性的益生菌测试液，从第1孔起，依次作2倍系列稀释，至第11孔，弃去移液器内25 μl液体，第12孔不加样品为红细胞对照孔；每孔加入25 μlPBS；每孔加入25 μl 1%鸡红细胞悬液，混匀，置室温20-40 min；当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果，以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点；根据测得的血凝效价将具有血凝性的益生菌测试液稀释至血凝价为2²，即为四单位抗原。

7. 根据权利要求2所述的预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法，其特征在于，所述血凝试验中PBS吸取量为25 μl，所述候选益生菌测试液吸取量为25 μl，最后1孔弃去液体量为25 μl，所述1 %鸡红细胞悬液吸取量为25 μl；所述血凝抑制试验中血清孔和抗原对照孔PBS吸取量为25 μl，PBS对照孔PBS吸取量为50 μl，所述新城疫病毒标准阳性血清吸取量为25 μl，所述第1孔血清与PBS充分混匀后移出量为25 μl，所述血清孔最后一孔弃去液体量为25 μl，所述四单位抗原吸取量为25 μl，所述1 %鸡红细胞悬液吸取量为25 μl，所述室温放置时间为20-40 min。

8.根据权利要求2所述的预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法，其特征在于，所述系列稀释为2倍系列稀释。

9.预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌的应用，其特征在于，根据权利要求1-8任一所述的预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌反向筛选方法筛选出的功能性益生菌，用于制备预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌产品。

10.根据权利要求9所述的预防鸡新城疫病毒的功能性益生菌的应用，其特征在于，所述功能性益生菌产品包括液体产品和针剂产品，所述液体产品为功能性益生菌样品，所述功能性益生菌样品为天然靶向鸡新城疫病毒的功能性益生菌的上清液按比例混合制成；所述针剂产品为功能性益生菌疫苗，所述功能性益生菌疫苗为所述功能性益生菌样品与白油佐剂按比例混合制成。