CN104800842B - 一种山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗，有效成分包括山羊痘病毒细胞传代致弱毒以及绵羊痘病毒细胞传代致弱毒；其中，山羊痘病毒细胞传代致弱毒为山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN‑XY2010F43株CCTCC V201503，绵羊痘病毒细胞传代致弱毒为绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS‑WW 2010 F44株CCTCC V201504。本发明的山羊痘、羊口疮病毒二联细胞弱毒疫苗安全，且能够产生有效的免疫保护力。本发明对于研制安全高效的弱毒疫苗以及用本发明公开的弱毒株规模化生产山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗来防控山羊痘和绵羊痘具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
羊痘病毒(Capripox virus,CPV)是最重要的动物痘病毒,在分类地位上属于痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxrinae)中的羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员,包括山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)、绵羊痘病毒(Sheep poxvirus,SPPV)和牛结节疹病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)。羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、接触性传染病，被世界动物卫生组织(FAO/OIE)列为93种必须报告的动物疫病之一，我国将其列为一类传染病。其发病率可达75％以上，死亡率可达50％以上，羔羊死亡率可达100％，同时还可导致母羊流产。羊痘是古老的疾病之一，1879年Hansen首次报道了挪威的山羊痘。后来，陆续在世界其他地区报道了该病。广泛分布于非洲、中东、印度次大陆、北欧、地中海各国及德国、澳大利亚、美国等,特别是非洲北部、中东和亚洲的部分国家流行较为严重。与我国接壤的周边国家，如印度、孟加拉、尼伯尔、巴基斯坦、俄罗斯、蒙古等不少国家均有本病的流行。近几年我国的江苏、广东、贵州、山东、浙江、广西、甘肃、黑龙江等地均有本病流行。该病的爆发和流行使家畜的生产力下降，活畜及畜产品贸易停滞，给养羊业的发展造成极大的经济损失。
山羊痘(Goatpox)是山羊的一种高度接触性传染病；绵羊痘病毒(Sheep pox)是绵羊的一种高度接触性传染病。自然状况下,羊痘病毒具有高度的宿主特异性,山羊痘只引起山羊发病；绵羊痘只引起绵羊发病。但这种宿主特异性常随分离株的不同而变化。Davies及Kitehingand Taylor报道,肯尼亚、也门和阿曼的绵羊分离株可同时感染山羊和绵羊。另外，山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)在血清上呈交叉反应。近年来，国内外山羊痘、绵羊痘频繁爆发，而山羊痘、绵羊痘尚无有效的治疗方法，免疫接种是预防山羊痘、绵羊痘唯一行之有效的措施。目前尚无一种能够一针防两病的山羊痘、绵羊痘二联细胞弱毒疫苗。目前羊痘、绵羊痘疫苗的研发和应用主要集中在常规疫苗，如灭活疫苗和细胞弱毒疫苗，以及新型疫苗，如囊膜亚单位疫苗、核酸疫苗和重组疫苗上。但是目前，羊痘、绵羊痘新型疫苗的研制还处于试验阶段，且新型疫苗往往制备过程繁琐、技术要求高，应用于临床还有很长一段路要走。羊痘、绵羊痘灭活疫苗虽然国内外学者均有研究，但其免疫效果有限，从未真正应用于临床。目前，在临床上应用较为广泛的仍然是羊痘弱毒疫苗，因为它具有用量少，能诱导机体产生较强的细胞免疫和体液免疫能力，且产生免疫保护力的时间持久的特点。山羊痘弱毒疫苗在国内几家疫苗厂家均有生产，但该疫苗生产过程需要羊睾丸原代细胞，冻干保护剂不耐热等工艺问题，使该疫苗生产、运输及保存成本过高。山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗研究，尚属空白。因此，研制一种抗原谱广、免疫原性好、制苗工艺简单的山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗，对预防国内山羊痘、绵羊痘爆发和流行具有一加一大于二的现实意义。
发明内容
本发明针对现有羊痘、绵羊痘弱毒疫苗的不足，提供一种山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗及其制备方法，以实现用简单实用的制备方法生产出产量高、抗原谱广、稳定性好、成本低、安全可靠的疫苗。
本发明选用自行分离获得的山羊痘病毒(GTPV)河南信阳市分离毒株(Goatpoxvirus HN2010株)和绵羊痘病毒(SPPV)甘肃武威株(Sheeppox Virus GS-WW 2010)株作为疫苗研制的候选毒株，利用羊睾丸支持细胞系和鸡胚成纤维原代细胞传代致弱，培育出符合“兽用新生物制品质量标准”的GTPV和SPPV弱毒疫苗株，配比一定比例的耐热冻干保护剂制备冻干弱毒疫苗。攻毒保护试验结果显示所制备的山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗能够产生有效的免疫保护力。因此，本发明利用GTPV、SPPV流行毒株研制安全、高效的弱毒疫苗对于山羊痘、绵羊痘的防治具有重要的现实意义。
本发明用羊睾丸原代细胞对河南株山羊痘病料进行适应分离的Goatpox virusHN2010株病毒传代至16代，GTPV毒价lgTCID50≥3.5时，将该细胞毒接种鸡胚成纤维原代细胞进行传代致弱，传代至36代时进行本动物安全试验发现，该细胞毒在传代至28代时已致弱。然后继续在羊睾丸原代细胞传代至56代(弱毒适应羊睾丸原代细胞从零代次记)，分别取传代致弱毒21代、25代、30代、35代、40代、45代、50代7代次细胞毒(各代次细胞病毒TCID50不小于103.5/0.1mL)进行本动物安全试验，证实接种各代次Goatpox virus HN-XY2010株致弱毒株的羊只组在观察期内，各试验组羊只在口腔粘膜均出现红点，在接种后3天自行消失。对照羊正常。证明致弱毒株Goatpox virusHN-XY2010株对绵羊、山羊均安全、无致病性，是一株安全的疫苗弱毒株。选择Goatpox virus HN-XY2010株第43代致弱毒株作为羊痘病毒弱毒疫苗株，命名为山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox virus HN-XY 2010F43株，分类命名为山羊痘病毒细胞传代致弱毒，并于2015年1月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO：V201503，保藏地址在武汉大学。
用羊睾丸原代细胞对甘肃武威株绵羊痘病阳性病料进行适应分离的SheeppoxVirus GS-WW 2010株病毒传代至17代，GTPV毒价lgTCID50≥3.5时，将该细胞毒接种鸡胚成纤维原代细胞进行传代致弱，传代至37代时进行本动物安全试验发现，该细胞毒在传代至26代时已致弱。然后继续在羊睾丸原代细胞传代至58代(弱毒适应羊睾丸原代细胞从零代次记)，分别取传代致弱毒25代、30代、35代、40代、45代、50代、55代7代次细胞毒(各代次细胞病毒TCID50不小于103.5/0.1mL)进行本动物安全试验，证实接种各代次Sheeppox VirusGS-WW 2010株致弱毒株的羊只组在观察期内，各试验组羊只，在口腔粘膜均出现红点，在接种后3天自行消失。对照羊正常。证明致弱毒株Sheeppox Virus GS-WW2010株对绵羊、山羊均安全、无致病性，是一株安全的疫苗弱毒株。选择Sheeppox Virus GS-WW 2010株第44代致弱毒株作为绵羊痘病毒弱毒疫苗株，命名为绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株SheeppoxVirus GS-WW 2010株，分类命名为绵羊痘病毒细胞传代致弱毒，并于2015年1月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO：V201504，保藏地址在武汉大学。
本发明提供一种山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗，所述弱毒疫苗的有效成分包括山羊痘病毒细胞传代致弱毒以及绵羊痘病毒细胞传代致弱毒；其中，所述山羊痘病毒细胞传代致弱毒为山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株CCTCCV201503，所述绵羊痘病毒细胞传代致弱毒为绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株SheeppoxVirus GS-WW 2010F44株CCTCC V201504。
所述山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株CCTCCV201503与绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010F44株CCTCCV201504的体积比为1:1。
本发明的第二个目的是提供上述山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)病毒抗原的制备
选生长良好布满单层的新生羊睾丸原代细胞，倾去营养液，按原营养液体积的1-10％分别接种山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株CCTCCV201503和绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010F44株CCTCCV201504，吸附5-15分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养；培养40～72h，细胞病变达到75％以上时收获病毒，置-20℃冰箱反复冻融两次，检验合格且病毒滴度不低于10-3.5TCID50/0.1ml，得到山羊痘、绵羊痘病毒细胞传代致弱毒抗原；
(2)疫苗的配制
将步骤(1)制备的山羊痘、绵羊痘病毒细胞传代致弱毒抗原以体积比1：1混合，再与耐热冻干保护剂以体积比1︰1的比例混匀后，低温冷冻冻干，得到疫苗。
优选地，所述耐热冻干保护剂的配方为：海藻糖30～70g/L，脱脂奶粉10～30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L，明胶5～15g/L，精氨酸0.5～4g/L，维生素C 1～5g/L，剩余成分为超纯水。
该冻干保护剂具有耐热性好、可有效保护抗原成分的降解，配方成分及制备方法简单，可在任何生物制品厂实现大规模生产等优点。
最优选地，所述耐热冻干保护剂的配方为：海藻糖50g/L，脱脂奶粉20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C 2.5g/L，剩余成分为超纯水。
其中，所述耐热冻干保护剂的制备方法为：
(1)将海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脱脂奶粉、明胶按各自比例溶于超纯水中，加热至50～60℃溶解后，高温湿热灭菌；
(2)精氨酸、维生素C也按各自比例溶于超纯水中，用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌；
(3)将步骤(1)和(2)中组份混合，得到所述的耐热冻干保护剂。
其中，所述病毒抗原的制备中，是按原营养液体积的5％分别接种山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株CCTCC V201503和绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株CCTCC V201504，吸附10分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养。在此条件下培养细胞产生病变(CPE)良好，收毒整齐。
本发明的第三个目的是提供上述山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗在制备预防山羊痘及绵羊痘疫苗中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种耐热冻干保护剂，所述耐热冻干保护剂的配方为：海藻糖30～70g/L，脱脂奶粉10～30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L，明胶5～15g/L，精氨酸0.5～4g/L，维生素C 1～5g/L，剩余成分为超纯水；优选地，所述耐热冻干保护剂的配方为：海藻糖50g/L，脱脂奶粉20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C 2.5g/L，剩余成分为超纯水。
本发明的第五个目的是提供一种耐热冻干保护剂的制备方法，步骤如下：
(1)将海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脱脂奶粉、明胶按各自比例溶于超纯水中，加热至50～60℃溶解后，高温湿热灭菌；
(2)精氨酸、维生素C也按各自比例溶于超纯水中，用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌；
(3)将步骤(1)和(2)中组份混合，得到所述的耐热冻干保护剂。
本发明的第六个目的是提供上述耐热冻干保护剂在制备山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗中的应用。
相较于现有技术，本发明的优点在于：
1、选用流行毒株的细胞传代致弱毒来制备疫苗，保证了疫苗的免疫保护力；
2、利用本发明研制的针对GTPV和SPPV病毒的耐热冻干保护剂，解决了痘病毒活疫苗仅能在-15℃条件下保存和运输的瓶颈技术，使该疫苗储存、运输更方便。
本发明将为临床上针对山羊痘、绵羊痘的防控以及山羊痘、绵羊痘病毒在羊群中的清除提供了重要的物质基础和技术支撑，具有广阔的应用前景。本发明对于研制安全高效的弱毒疫苗以及用本发明公开的弱毒株规模化生产山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗来防控山羊痘和绵羊痘具有重要的现实意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不多本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明的技术方案和细节形式和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护的范围内。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1山羊痘病毒(Goatpox virus HN-XY 2010)的分离和致弱
1.1山羊痘病毒(Goatpox virus HN-XY 2010)的分离、鉴定
本申请发明人对2010年采自河南信阳的山羊痘阳性病料，进行病毒分离，病例复制，最终得到一株病毒株，该病毒株经病毒理化特性鉴定、针对山羊痘病毒P32基因的特异性PCR检测及测序证明该病毒株为山羊痘病毒病毒(命名为Gotepox Virus HN-XY10株，简称GTPV/HN/2010株)。
1.2山羊痘病毒(Goatpox virus HN-XY2010株)制苗毒株的致弱及毒种种子批建立
用羊睾丸原代细胞对GTPV/HN/2010株病毒传代至16代，GTPV毒价lgTCID50≥3.5，选用9日龄～11日龄的SPF鸡胚，无菌条件剔除鸡胚的头、四肢、内脏后，将其余组织，剪碎后用混合酶消化方法制备成鸡胚成纤维原代细胞。将该传代后的细胞毒接种生长良好无菌无污染的各项指标达到“兽用新生物制品质量标准”的鸡胚成纤维原代细胞，进行传代致弱，并建立致弱毒种种子批。传代至36代(每代次细胞毒致细胞病变(CPE)良好)，毒价均在103.5/0.1mL以上，回归本动物进行本动物安全试验发现，该细胞毒传代至28代已致弱。将用鸡胚成纤维细胞致弱的山羊痘病毒(Goatpox virus HN-XY2010株F36)接种羊睾丸原代细胞进行传代培养至56代，建立毒种种子批。
1.3毒种纯净性检验
分别取传代致弱毒21代、25代、30代、35代、40代、45代、50代7代次细胞毒，按现行《中国兽药典》，2010版，附录42页进行无菌检验。各代次细胞毒无菌落生长；按现行《中国兽药典》，2010版，附录49页进行支原体检验。各代次细胞毒无支原体生长；按现行《中国兽药典》，2010版，附录40页进行外源病毒检验。各代次细胞毒无外源病毒污染；证明各代次致弱细胞毒纯净、无污染。
1.4山羊痘致弱毒株安全性检验
分别取传代致弱毒21代、25代、30代、35代、40代、45代、50代7代次细胞毒(各代次细胞病毒TCID50不小于103.5/0.1mL)，将每代次细胞毒，以山羊痘病毒不小于10000个TCID50免疫剂量，接种(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)1年龄左右健康山羊、绵羊和3月龄左右的山羊羔羊、绵羊羔羊(从未患过羊痘、也未注射过羊痘疫苗的符合实验动物标准的健康山羊和绵羊)各4只，共接种4组。随机挑选绵羊、山羊各一只以1mL剂量接种生理盐水(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)做对照。口腔粘膜划线接种后每日测定接种羊和对照羊的体温和口腔粘膜的病变情况，观察15日，进行致弱毒株安全性评价。
结果：
接种各代次Goatpox virus HN-XY2010株致弱毒株的羊只组在观察期内，各试验组羊只在口腔粘膜均出现红点，在接种后3天自行消失。对照羊正常。证明致弱毒株Goatpoxvirus HN-XY2010株对绵羊、山羊均安全、无致病性，是一株安全的疫苗弱毒株。
选择Goatpox virus HN-XY2010株第43代致弱毒株作为羊痘病毒弱毒疫苗株，命名为羊痘病毒细胞传代致弱毒Goatpox Virus HN-XY2010F43，并于2015年1月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO：V201503，保藏地址在武汉大学。
实施例2绵羊痘病毒(Sheeppox Virus GS-WW 2010株)的分离和致弱
2.1绵羊痘病毒(Sheeppox Virus GS-WW 2010株)的分离、鉴定
本申请发明人对2010年采自甘肃武威的绵羊痘阳性病料，进行病毒分离，病例复制，最终得到一株病毒株，该病毒株经病毒理化特性鉴定、针对绵羊痘病毒P32基因的特异性PCR检测及测序证明该病毒株为绵羊痘病毒病毒命名为(Sheeppox Virus GS-WW 2010，简称SPPV/GS/2010株)。
2.2绵羊痘病毒(Sheeppox Virus GS-WW 2010株)制苗毒株的致弱及毒种种子批建立
用羊睾丸原代细胞对SPPV/GS/2010株病毒传代至17代，GTPV毒价lgTCID50≥3.5，选用9日龄～11日龄的SPF鸡胚，无菌条件剔除鸡胚的头、四肢、内脏后，将其余组织，剪碎后用混合酶消化方法制备成鸡胚成纤维原代细胞。将该传代后的细胞毒接种生长良好无菌无污染的各项指标达到“兽用新生物制品质量标准”的鸡胚成纤维原代细胞，进行传代致弱，并建立致弱毒种种子批。传代至58代(每代次细胞毒致细胞病变(CPE)良好)，毒价均在103.5/0.1mL以上，回归本动物进行本动物安全试验发现，该细胞毒传代至30代已致弱。将用鸡胚成纤维细胞致弱的绵羊痘病毒(Sheeppox Virus GS-WW 2010株F36)接种羊睾丸原代细胞进行传代培养至56代，建立毒种种子批。
2.3毒种纯净性检验
分别取传代致弱毒25代、30代、35代、40代、45代、50代、55代7代次细胞毒，按现行《中国兽药典》，2010版，附录42页进行无菌检验。各代次细胞毒无菌落生长；按现行《中国兽药典》，2010版，附录49页进行支原体检验。各代次细胞毒无支原体生长；按现行《中国兽药典》，2010版，附录40页进行外源病毒检验。各代次细胞毒无外源病毒污染；证明各代次致弱细胞毒纯净、无污染。
2.4绵羊痘致弱毒株安全性检验
分别取传代致弱毒25代、30代、35代、40代、45代、50代、55代7代次细胞毒(各代次细胞病毒TCID50不小于103.5/0.1mL)，每代次细胞毒，以绵羊痘病毒不小于10000个TCID50免疫剂量，接种(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)1年龄左右健康绵羊和3月龄左右的绵羊羔羊(从未患过羊痘、也未注射过羊痘疫苗的符合实验动物标准的健康绵羊)各4只；以绵羊痘病毒不小于10000个TCID50免疫剂量(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)接种(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)1年龄左右健康山羊、绵羊和3月龄左右的山羊羔羊、绵羊羔羊(从未患过羊痘、也未注射过羊痘疫苗的符合实验动物标准的健康山羊和绵羊)各4只，共接种4组。随机挑选绵羊、山羊各一只以1mL剂量接种生理盐水(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)做对照。口腔粘膜划线接种后每日测定接种羊和对照羊的体温和口腔粘膜的病变情况，观察15日，进行致弱毒株安全性评价。
结果：
接种各代次Sheeppox Virus GS-WW 2010株致弱毒株的羊只组在观察期内，各试验组羊只，在口腔粘膜均出现红点，在接种后3天自行消失。对照羊正常。证明致弱毒株Sheeppox Virus GS-WW 2010株对绵羊、山羊均安全、无致病性，是一株安全的疫苗弱毒株。
选择Sheeppox Virus GS-WW 2010株第44代致弱毒株作为羊痘病毒弱毒疫苗株，命名为绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010F44，并于2015年1月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO：V201504，保藏地址在武汉大学。
实施例3山羊痘、绵羊痘病毒二联细胞弱毒疫苗实验室试制
3.1山羊痘、绵羊痘病毒弱毒抗原的制备
选生长良好布满单层的新生羊睾丸原代细胞(LT)，倾去营养液，按原营养液体积的5％分别接种山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43(CCTCC NO：V201503)和绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010F44(CCTCC NO：V201504)，吸附10分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养。培养48h，细胞病变(CPE)达到80％时收获，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、安全检验、支原体检验、外源病毒检验合格达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，Reed-Muench法测定Goatpox VirusHN-XY2010F43的病毒滴度(TCID50/0.1ml)为104.0/0.1ml和Sheeppox Virus GS-WW 2010F44的病毒滴度(TCID50/0.1ml)为104.0/0.1ml。各制备山羊痘、绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株3000ml作为制备疫苗的病毒抗原。
3.2疫苗的配制和冻干
先将3.1制备的各项指标都合格的山羊痘、绵羊痘病毒细胞弱毒抗原，以体积比1︰1的比例混匀后，再与耐热冻干保护剂以1︰1的比例混和，搅拌均匀后，以2mL/瓶无菌条件下封装于链瓶内，在低温冷冻干燥机内进行冻干。即为山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗，将其在2℃-8℃下温度保存。共制备弱毒冻干疫苗三批每批1700瓶，批号为：20140211、20140215、20140218。
其中，耐热冻干保护剂的配方为：海藻糖50g/L，脱脂奶粉20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C 2.5g/L，剩余成分为超纯水。
耐热冻干保护剂的制备方法为：(1)对可高压灭菌的物质：海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脱脂奶粉、明胶按各自比例溶于超纯水中，加热至50～60℃溶解后，116℃灭菌30分钟；(2)将不耐高温的物质精氨酸、维生素C也按各自比例溶于超纯水中，用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌：(3)将(1)、(2)两组份混合，得到所述的耐热冻干保护剂。
实施例4山羊痘、绵羊痘病毒二联细胞弱毒疫苗实验室试制
4.1山羊痘、绵羊痘病毒弱毒抗原的制备
选生长良好布满单层的新生羊睾丸原代细胞(LT)，倾去营养液，按原营养液体积的,10％分别接种山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43(CCTCCNO：V201503)和绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010F44(CCTCCNO：V201504)，吸附5分钟后加DMEM维持液，调pH至7.1，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养。培养72h，细胞病变(CPE)达到85％时收获，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、安全检验、支原体检验合格达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，Reed-Muench法测定Goatpox Virus HN-XY2010F43的病毒滴度(TCID50/0.1ml)为103.5/0.1ml和Sheeppox Virus GS-WW 2010F44的病毒滴度(TCID50/0.1ml)为103.5/0.1ml。各制备山羊痘、绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株3000ml作为制备疫苗的病毒抗原。
4.2疫苗的配制和冻干
先将4.1制备的各项指标都合格的山羊痘、绵羊痘病毒细胞弱毒抗原，以体积比1︰1的比例混匀后，再与耐热冻干保护剂以1︰1的比例混和，搅拌均匀后，以2mL/瓶无菌条件下封装于链瓶内，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗，将其在2℃-8℃下温度保存。
其中，耐热冻干保护剂的配方为：海藻糖70g/L，脱脂奶粉10g/L，聚乙烯吡咯烷酮30g/L，明胶5g/L，精氨酸4g/L，维生素C 5g/L，剩余成分为超纯水。
耐热冻干保护剂的制备方法为：(1)对可高压灭菌的物质：海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脱脂奶粉、明胶按各自比例溶于超纯水中，加热至50～60℃溶解后，116℃灭菌30分钟；(2)将不耐高温的物质精氨酸、维生素C也按各自比例溶于超纯水中，用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌：将(1)、(2)两组份混合，得到所述的耐热冻干保护剂。
实施例5山羊痘、绵羊痘病毒二联细胞弱毒疫苗实验室试制
5.1山羊痘、绵羊痘病毒弱毒抗原的制备
选生长良好布满单层的新生羊睾丸原代细胞(LT)，倾去营养液，按原营养液体积的,1％分别接种山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43(CCTCCNO：V201503)和绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010F44(CCTCCNO：V201504)，吸附15分钟后加DMEM维持液，调pH至7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养。培养40h，细胞病变(CPE)达到75％时收获，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、安全检验、支原体检验合格达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，Reed-Muench法测定Goatpox Virus HN-XY2010F43的病毒滴度(TCID50/0.1ml)为104.0/0.1ml和Sheeppox Virus GS-WW2010F44的病毒滴度(TCID50/0.1ml)为104.0/0.1ml。各制备山羊痘、绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株3000ml作为制备疫苗的病毒抗原。
5.2疫苗的配制和冻干
先将5.1制备的各项指标都合格的山羊痘、绵羊痘病毒细胞弱毒抗原，以体积比1︰1的比例混匀后，再与耐热冻干保护剂以1︰1的比例混和，搅拌均匀后，以2mL/瓶无菌条件下封装于链瓶内，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗，将其在2℃-8℃下温度保存。
其中，耐热冻干保护剂的配方为：海藻糖30g/L，脱脂奶粉30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10g/L，明胶15g/L，精氨酸0.5g/L，维生素C 1g/L，剩余成分为超纯水。
耐热冻干保护剂的制备方法为：(1)对可高压灭菌的物质：海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脱脂奶粉、明胶按各自比例溶于超纯水中，加热至50～60℃溶解后，116℃灭菌30分钟；(2)将不耐高温的物质精氨酸、维生素C也按各自比例溶于超纯水中，用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌：将(1)、(2)两组份混合，得到所述的耐热冻干保护剂。
实施例6山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗成品检验
6.1物理性状
产品为微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
6.2无菌检验
从制备保存的20141211、20141220、20141228三批山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录42页进行，疫苗成品无细菌生长。
6.3支原体检验
从制备保存的20141211、20141220、20141228三批山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录49页进行支原体检验。各代次细胞毒无支原体生长。
6.4外源病毒检验
从制备保存的20141211、20141220、20141228三批山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录40页进行外源病毒检验。各代次细胞毒无外源病毒污染；证明各代次致弱细胞毒纯净、无污染。
6.5冻干山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗剩余水分测定
从制备保存的20141211、20141220、20141228三批山山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录38页进行测定，三批疫苗均符合规定。
6.6冻干山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗真空度测定
从制备保存的20141211、20141220、20141228三批山山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录48页进行测定，三批疫苗均符合规定。
实施例7山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗安全试验
将实施例3制备的所有指标都达到“兽用新生物制品质量标准”的三批山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗，随机取样，以山羊痘、绵羊痘病毒不小于10000个TCID50免疫剂量，接种(尾根皮内或股内侧皮内接种)1年龄左右健康绵羊和3月龄左右的绵羊羔羊(从未患过羊痘、也未注射过羊痘疫苗的符合实验动物标准的健康绵羊)各4只；以10000个TCID50的接种剂量(尾根皮内或股内侧皮内接种)分别接种1年龄左右健康山羊和3月龄左右的山羊羔羊(从未患过羊痘、也未注射过羊痘疫苗的符合实验动物标准的健康山羊)各4只，共接种8组。随机挑选绵羊、山羊各一只以1mL剂量接种生理盐水(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)做对照。口腔粘膜划线接种后每日测定接种羊和对照羊的体温和口腔粘膜的病变情况，观察15日，进行致弱毒株安全性评价。
试验结果发现，各批次疫苗的羊只组在观察期内，各试验组羊只，在口腔粘膜均出现红点，在接种后3天自行消失。对照羊正常。证明山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗对绵羊及羔羊、山羊及羔羊均安全、无致病性。同时，也证明山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗对羊只安全。
实施例8山羊痘、绵羊痘病毒二联细胞弱毒疫苗效力试验
8.1从制备保存的20141211、20141220、20141228三批山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按原量稀释混合，用犊牛睾丸原代细胞测定半数感染量(TCID50)，要求羊传染性脓疱病毒TCID50不低于106/0.1mL，山羊痘病毒TCID50不低于103.5/0.1mL。
8.2每批疫苗免疫成年绵羊及羔羊，成年山羊及羔羊各5只，成年羊接种0.4ml(口腔粘膜划线接种0.2ml/只和尾根皮内接种0.2ml/只)，羔羊减半。随机挑选绵羊、山羊各一只以0.4mL剂量接种生理盐水(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)做对照。免疫集中21日后，连同条件相同的对照羊，随机等量分为山羊痘组和绵羊痘组,山羊痘组用山羊痘细胞强毒第16代(Goatpox virus HN-XY 2010F16)细胞强毒；绵羊痘组用绵羊痘细胞强毒第17代(Sheeppox Virus GS-WW 2010F17)，以100个ID50的剂量，进行攻毒试验。观察10～15天，结果如表1和2所示。效力试验证明利用山羊痘弱毒株(Goatpox virus HN-XY 2010F43株CCTCC NO：V201503)和绵羊痘细胞弱毒株(Sheeppox Virus GS-WW 2010F44株CCTCC NO：V201504)所制备的二联细胞弱毒疫苗对绵羊和山羊免疫保护力好，可用临床免疫预防山羊痘、绵羊痘病毒的感染。
表1山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗成年羊效力检验
表2山羊痘、绵羊痘病毒二价细胞弱毒疫苗羔羊效力检验
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗，其特征在于：所述弱毒疫苗的有效成分包括山羊痘病毒细胞传代致弱毒以及绵羊痘病毒细胞传代致弱毒；其中，所述山羊痘病毒细胞传代致弱毒为山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株CCTCC V201503，所述绵羊痘病毒细胞传代致弱毒为绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株CCTCC V201504。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株CCTCC V201503与绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株CCTCC V201504的体积比为1:1。
3.权利要求1所述的山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）病毒抗原的制备
选生长良好布满单层的新生羊睾丸原代细胞，倾去营养液，按原营养液体积的1-10%分别接种山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株CCTCC V201503和绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株CCTCC V201504，吸附5-15分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5%CO2浓度培养箱中进行培养；培养40～72h，细胞病变达到75%以上时收获病毒，置-20℃冰箱反复冻融两次，检验合格且病毒滴度不低于103.5 TCID50/0.1ml，得到山羊痘、绵羊痘病毒细胞传代致弱毒抗原；
（2）疫苗的配制
将步骤（1）制备的山羊痘、绵羊痘病毒细胞传代致弱毒抗原以体积比1：1混合，再与耐热冻干保护剂以体积比1︰1的比例混匀后，低温冷冻冻干，得到疫苗。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述耐热冻干保护剂的配方为：海藻糖30～70g/L，脱脂奶粉10～30 g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30 g/L，明胶5～15 g/L，精氨酸0.5～4 g/L，维生素C 1～5 g/L，剩余成分为超纯水。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述耐热冻干保护剂的配方为：海藻糖50g/L，脱脂奶粉20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C 2.5g/L，剩余成分为超纯水。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述耐热冻干保护剂的制备方法为：（1）将海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、脱脂奶粉、明胶按各自比例溶于超纯水中，加热至50～60℃溶解后，高温湿热灭菌；
（2）精氨酸、维生素C也按各自比例溶于超纯水中，用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌；（3）将步骤（1）和（2）中组份混合，得到所述的耐热冻干保护剂。
7.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于：所述病毒抗原的制备中，是按原营养液体积的5%分别接种山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株CCTCC V201503和绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株CCTCC V201504，吸附10分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5% CO2浓度培养箱中进行培养。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述病毒抗原的制备中，是按原营养液体积的5%分别接种山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株CCTCCV201503和绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株CCTCCV201504，吸附10分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5% CO2浓度培养箱中进行培养。
9.权利要求1所述的山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗在制备预防山羊痘及绵羊痘疫苗中的应用。
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