CN106282129A - 用bhk21‑c13传代细胞制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法 - Google Patents

用bhk21‑c13传代细胞制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用BHK21‑C13传代细胞制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法。本发明基于现有的免疫原性良好的山羊痘弱毒AV41，于异源性BHK21细胞培养25‑28代病毒液，再添加适宜的耐热冻干保护剂，得到耐热型山羊痘弱毒活疫苗。本发明的传代细胞疫苗在病毒产量、均一性、纯粹等方面都优于原代细胞疫苗，不仅可确保疫苗应有的效力水平，具有较好的耐热保护效果，还可确保纯种孕羊的安全性。因目前BHK21细胞已具备成熟的悬浮培养工艺，贴壁培养各项参数的摸索，为下步悬浮工艺推广奠定坚实基础。

Description

用BHK21-C13传代细胞制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域中疫苗的制备方法，特别是涉及一种用BHK21-C13传代细胞制备山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液，并在制品中添加耐热保护剂，获得兽用耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法。
背景技术
山羊痘(Goat Pox)是由山羊痘病毒(Goat Pox Virus，GPV)引起的山羊的一种高度接触性传染病。病羊表现为体温升高、无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹或结节、水疱、内脏痘性病变、妊娠母羊发生流产、死亡率较高。山羊痘是世界动物卫生组织(OIE)规定的法定报告传染病，我国将其列为一类动物疾病。
现预防山羊痘的疫苗主要是弱毒活疫苗，国内、外文献多有报导。灭活疫苗(OIETerrestrial Manual 2010,CHAPTER 2.7.14,SHEEP POX AND GOAT POX)虽安全性好，但存在免疫保护期短的缺陷，目前仍未得到广泛应用。现有报道使用BHK21传代细胞制备山羊痘灭活疫苗的方法(专利文献CN104958760A)，而无制备弱毒活疫苗的方法。基于不同细胞，所用培养温度、接毒维持液种类、pH均有所不同，现制备山羊痘病毒液，常规使用羊睾丸细胞时，接毒工序液维持液多用乳汉液或MEM溶液；而在专利文献CN104958760A中使用BHK21细胞(Baby Hamster Syrian Kidney，乳仓鼠肾细胞)制备山羊痘灭活疫苗的方法中，接毒工序的维持液使用乳欧液，在病毒培养阶段，需每日据维持液pH降低程度，用碱液进行校正至7.1-7.4；以上提到的维持液中，均要加入1-2％或3-5％不同含量的血清，培养温度37℃。因山羊痘免疫机制的影响，灭活疫苗普遍存在免疫持续期短的缺陷，因此，灭活疫苗未得到全面推广应用。
预防山羊痘的活疫苗多采用羔羊睾丸细胞(LT)和羔羊肾细胞(LK)等原代细胞制备,使用原代细胞的明显不足是各生产山羊痘活疫苗的厂家对羊同源性外源病毒(如蓝舌病毒(BTV)、羊流产衣原体等)的检测技术不完善，导致活疫苗对孕羊存在一定的安全隐患。山羊痘病毒在原代细胞的增殖周期较长，一般5-7天，培养山羊痘病毒需添加一定量的新生牛血清，且原代LT、LK细胞的传代次数多为5-10代，并且采集不同批次的组织制备原代细胞对病毒的敏感性也有所差别，因此，常造成产品质量的不稳定。此外，由于采集羔羊睾丸存在季节性及敏感性的差异，给山羊痘活疫苗的常规生产亦带来很多困扰。尤其近年来，随着人感染布鲁氏菌病比率的增加以及病情的严重性，给采集羔羊睾丸的工作人员带来一定风险。基于上述原因，迫切需要一种创新的山羊痘弱毒活疫苗及其制备方法。
在山羊痘弱毒活疫苗的保护方面通常需要使用保护剂。常规冻干保护剂为含5％(W/V)蔗糖的牛奶，其用于普通山羊痘弱毒活疫苗，具有不耐热的缺点；常规冻干曲线(方法)(不适用于耐热保护剂的冻干，影响冻干制品的物理性状指标)用于普通牛奶保护剂冻干活疫苗为：A、预阶段：常温进箱，1-2h将制品降至-42℃并维持2h；B、升华干燥阶段：1-2h将制品从-42℃升至-8℃并维持10h；0.5-1h将制品从-8℃升至0℃并维持0.5-1h；C、解吸干燥阶段：1-2h将制品从0℃升至28℃并维持7h，冻干结束。
耐热保护剂用于耐热型山羊痘弱毒活疫苗，耐热保护剂与普通冻干保护剂的主要区别是：后者需严格的冷冻保存条件，疫苗稀释后，需尽快使用，易受热环境影响而降低疫苗效价；制品中添加耐热保护剂，可有效缓解适当的热环境对疫苗效价的损失，适当降低了保存条件的影响。已有的耐热保护剂配方一(专利文献CN104800842A)为：海藻糖50g/L，脱脂奶粉20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C 2.5g/L；配方一曾用于山羊痘羊睾丸原代细胞活疫苗，但是成本偏高，未验证其耐热效果；耐热保护剂配方二(猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及冻干工艺研究—王颖：甘肃农业大学2014届硕士学位论文、第三章猪伪狂犬病毒耐热保护剂筛选、第38页)为(W/V)：蔗糖15.2％，酶解酪蛋白7.6％，明胶4.0％，海藻糖1.0％；牛血清白蛋白2.0％，精氨酸盐酸盐2.0％，谷氨酸钠2％，山梨醇2.0％，其余为注射用水；配方二可用于其它病毒(如伪狂犬病毒等)的弱毒活疫苗，目前未用于山羊痘弱毒活疫苗，是否适用也尚未可知。基于上述原因，迫切需要一种成本适中的耐热型山羊痘弱毒活疫苗，以及一种与之相适的冻干保护剂及冻干曲线(方法)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用BHK21-C13传代细胞制备山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液(接毒阶段无血清添加)的方法。
本发明所提供的用BHK21-C13传代细胞制备山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液的方法，包括以下步骤：
1)细胞选用及传代培养：
选取经支原体、外源病毒检测结果均为阴性的BHK21-C13细胞作为种细胞，使用含8-10％(V/V)新生牛血清的MEM培养液，将BHK21细胞贴附方瓶或转瓶细胞培养瓶中，在37℃下，方瓶静置培养，或转瓶10-12rph(转/小时)旋转培养；
2)病毒培养：
培养BHK21贴壁细胞48-72小时至细胞融合度达85-95％，弃去细胞培养液，将山羊痘弱毒AV41种毒按接毒溶液总量5-10％(V/V)含量加入细胞培养瓶，于37℃吸附1小时，然后弃去种毒液，加入含10-20mmol HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)的无血清DMEM作为维持液，在34-36℃下，的方瓶静置继续培养或转瓶10-12rph(转/小时)旋转继续培养；
3)病变观察及毒液收获：
每日观察细胞病变，以细胞呈现间质变宽、细胞圆缩、脱落等病变特征作为观察判断细胞病变指标，至细胞病变率(CPE)达85％，收获病毒液，测定TCID50，选取病毒液每0.1mL病毒含量≥105.5TCID50的为山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液。
在上述山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液的制备方法中，所述步骤1)中的外源病毒主要包括牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、蓝舌病毒(BTV)。
所述步骤2)继续培养中山羊痘弱毒AV41于BHK21细胞传代，所述步骤3)收获病毒液的时间为接毒后继续培养72-120小时。
所述步骤3)收获的病毒液为山羊痘弱毒AV41传代至25-28代时，效价水平为每0.1mL病毒液中病毒含量≥105.5TCID50的山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液。
用上述方法制备得到的山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液也属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法。
本发明所提供的制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法，是向上述山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液中添加耐热冻干保护剂，再经冷冻干燥，得到外观完好、易保存的耐热型山羊痘弱毒活疫苗。
在上述耐热型山羊痘弱毒活疫苗的制备方法中，所述耐热冻干保护剂各成分质量百分含量及配制如下：
甲液：
蔗糖：15％，
酶解酪蛋白：5.8％，
明胶：4.0％，
海藻糖：1.0％，
其余为：注射用水；
甲液116℃高压灭菌20分钟；
乙液：
牛血清白蛋白：2.0％，
精氨酸盐酸盐：2.0％，
谷氨酸钠：1.0％，
山梨醇：2.0％，
其余为：注射用水；
乙液用0.2um过滤器进行过滤除菌；
将甲液与乙液按体积比1：1混合后得到耐热冻干保护剂。
所述山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液的上清液与所述耐热冻干保护剂按体积比1：1混合。
所述冷冻干燥的冻干曲线为：
预冻阶段：常温进冻干箱，于80min内预冻至-42℃，维持160min；
升华干燥阶段：于120min内升温至-5℃，维持750min,于30min内由-5℃升温至-3℃，维持120min；
解吸干燥阶段：于190min内，由-3℃升温至26℃，并于26℃二次干燥维持420min。
用上述方法得到的耐热型山羊痘弱毒活疫苗也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法。本发明具有以下优点：
1)本发明基于现有的免疫原性良好的山羊痘弱毒AV41，于异源性BHK21细胞培养20代以上，其效力水平可稳定达其质量标准，不仅有效规避了原羊睾丸同源性外源病毒的污染，提高了疫苗生产用原材料的可控性，稳定产品质量，降低批间差异，实现了全年产量的均质供应，而不是以前的仅局限于采睾丸季节，并降低了活疫苗毒力返强的风险(返强风险低)，传代细胞疫苗在病毒产量、均一性、纯粹等方面都优于原代细胞疫苗。
2)优化了培养条件：在接毒工序中，优选出一种高效增殖山羊痘病毒的无血清营养液，进行种毒含量、培养时间、培养温度等条件优化试验，获得较高TCID50效价的病毒液，优化结果：培养温度优选至34-36℃，可有效提高毒液效价，使用含缓冲能力较强的HEPES(10-20mmol/L)的无血清DMEM作为维持液,72-120小时收获毒液，缩短了病变时间，且病毒培养阶段溶液的pH始终可达7.0以上，无需中途加碱，减少了操作步骤(生产便捷)，采用无血清培养液，并可有效控制成品疫苗外源病毒感染、降低疫苗使用中因血清引起的热反应、提高了疫苗质量的稳定性及安全性，降低了生产成本。
3)在山羊痘活疫苗的使用中，用户更倾向于使用稀释后存放5-6小时，仍保持较高效价的苗，因此，添加适宜的耐热冻干保护剂，可有效提高山羊痘活疫苗的耐热性，满足用户的需求。本发明向耐热型山羊痘弱毒活疫苗病毒液中添加耐热冻干保护剂，较普通蔗糖奶粉保护剂，可有效缓解疫苗稀释后于室温放置7-8小时，TCID50效价衰减，满足了市场用户在注射使用中，免疫大量羊只，无低温储存条件，便捷使用，具有较高的社会效益。
4)本发明的耐热型山羊痘弱毒活疫苗用于对山羊痘病毒敏感的纯种孕黑山羊，对于较敏感的妊娠2-4月的孕羊，仍可安全使用，无流产。
综上所述，本发明的耐热型山羊痘弱毒活疫苗不仅可确保疫苗应有的效力水平，具有较好的耐热保护效果，还可确保纯种孕羊的安全性，可满足市场用户的需求，具有良好的经济效益及社会效益，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为BHK21传代正常细胞和经山羊痘病毒感染的病变细胞
具体实施方式
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、用BHK21传代细胞制备山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液
本发明通过优化培养条件，提供了一种用BHK21传代细胞制备山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液的方法，即用BHK21传代细胞在接种山羊痘病毒后无血清培养，培养得到的山羊痘病毒液可达较高TCID50效价(每0.1mL病毒液中病毒含量≥104.5TCID50)。
本发明用BHK21传代细胞制备山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液的具体方法包括以下步骤：
1、细胞选用及培养
以往山羊痘活疫苗制备选取常规的牛睾丸或羊睾丸等原代细胞、次代细胞作为种细胞，但无法确保其蓝舌病毒等致孕羊流产的重要外源病毒的检测结果为阴性。本发明选取BHK21细胞，并选取经支原体、外源病毒等项目检测，支原体、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、蓝舌病毒(BTV)等外源病毒检测结果均为阴性的BHK21细胞，该步检测从源头上控制了山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液中的外源病毒污染(存在外源病毒将影响疫苗使用的安全性)。
不同来源BHK21细胞，其山羊痘病毒AV41增殖量差异较大。本发明经过试验筛选、对比检测，优选出山羊痘病毒AV41适应性培养病毒效价较高(每0.1mL病毒液中病毒含量≥104.5TCID50)的BHK21细胞-C13(乳仓鼠肾细胞，购自欧洲细胞培养物保藏中心ECACC)作为本发明用种细胞。
使用含8-10％(V/V)新生牛血清的MEM培养液(购自宜兴赛尔生物科技有限公司)，按传代细胞常规操作方法，将分散密度适宜的BHK21细胞贴附方瓶或转瓶(细胞培养瓶)，置37℃培养，方瓶：静置培养；转瓶：10-12rph(转/小时)旋转培养。
2、病毒培养
培养BHK21贴壁细胞48-72小时，待细胞融合度达85-95％，弃去细胞培养液，将山羊痘弱毒AV41种毒(中国兽药监察所提供)按接毒溶液总量5-10％(V/V)含量加入细胞培养瓶(T175规格细胞培养瓶接毒溶液总量100mL，15000mL(15L)转瓶接毒溶液总量1000mL(1L))，于37℃吸附1小时。然后弃去种毒液，加入含10-20mmolHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，作用：保持pH稳定，pH始终可达7.0以上)的无血清DMEM作为维持液(作用：使细胞停止繁殖，但仍保持代谢)，置34-36℃继续培养，方瓶：静置培养；转瓶：10-12rph(转/小时)旋转培养。
该步培养中优选出了一种高效增殖山羊痘病毒的无血清营养液，进行种毒含量、培养时间、培养温度等条件优化试验以获得较高TCID50效价的病毒液。优化的培养条件中，继续培养温度优选至34-36℃低温(接毒培养温度不宜达37℃)，可延缓BHK21细胞的凋亡速度，可有效提高山羊痘病毒液效价；使用含缓冲能力较强的HEPES(10-20mmol/L)的无血清DMEM作为维持液，能够缩短培养过程中细胞的病变时间有助于后续能在72-120小时收获毒液，且保持病毒培养阶段溶液的pH始终达7.0以上，无需中途加碱，减少了操作步骤使生产更便捷，且不影响细胞的最佳浓度，从而有效提高产量毒，提升产品效价水平；采用无血清培养液，既可避免因血清中热源物质影响导致免疫羊的体温反应及其它过敏反应，有效控制成品疫苗外源病毒感染，降低疫苗使用中因血清引起的热反应，提高了疫苗质量的稳定性及安全性，也可减少近年因血清质量不稳定引起的产品批间差异，还可适度降低成本。
培养120小时的正常细胞形态如图1A所示，可以看出存在散在圆缩细胞，细胞无明显空洞，属于正常细胞。
3、病变观察及毒液收获
每日观察细胞病变，病变细胞判断指标是出现间质变宽、细胞圆缩等病变特征，如图1B所示，存在大量典型圆缩病变细胞，细胞出现明显空洞。作为对照，BHK21贴壁细胞按步骤1条件培养120小时(未接毒培养)的正常细胞形态如图1A所示，可以看出存在散在圆缩细胞，细胞无明显空洞，属于正常细胞。
通过观察可知，一般接毒后继续培养72-120小时，细胞病变率(CPE)可达85％及以上(该收毒标准可获得较高效价的病毒液)，此时收获病毒液。收获的病毒液于-20℃冰箱保存，取样冻融两次，测定TCID50。
步骤3中，山羊痘弱毒AV41在BHK21细胞中传代，通过病变收毒时间稳定性、效检TCID50检测结果稳定性、及后期的纯种孕羊安全性、本地山羊效检结果综合评定，以确定其传代代次。采取本发明优化培养条件，山羊痘弱毒AV41于BHK21稳定传代至28代的TCID50效价如表1所示，可以看出虽然山羊痘病毒对异源传代细胞的适应性有一定过程(较低的培养代次不利于疫苗用毒液的大量扩增，且异源细胞传代次数少，仍容易发生和同源细胞制备活疫苗相同的缺陷：即免疫羊后出现毒力返强现象)，但经BHK21细胞传代至28代的山羊痘病毒液，仍效价稳定、符合其半成品毒液效价标准(每0.1mL毒液中病毒含量≥104.5TCID50，质量标准)，表明使用BHK21细胞传代至28代以内的山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液可稳定用于生产。
考虑到较低的培养代次不利于疫苗用毒液的大量扩增，且异源细胞传代次数少，仍容易发生和同源细胞制备活疫苗相同的缺陷：即免疫羊后出现毒力返强现象；而在传代细胞代次过高时，会影响到毒液的效价及成品苗的免疫性。因此，确定合适的山羊痘病毒于BHK21细胞繁殖代次至关重要，既避免毒力返强，又确保其免疫原性。综合考虑活疫苗的毒力返强及免疫原性，优选使用25-28代病毒液用于生产，这些病毒液每0.1mL中病毒含量≥105.5TCID50，效价高于标准。
表1山羊痘毒液F1-F28 TCID50效价
实施例2、制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗
本发明制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法，是向实施例1获得的山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液中添加耐热冻干保护剂，再经冻干(冷冻干燥)曲线，得到外观完好、易保存的耐热型山羊痘弱毒活疫苗。用常规冻干曲线获得的产品，外观性状不达标，本发明的优化了冻干曲线，获得了外观完好的产品。添加耐热保护剂对冷链要求不严格：据新的质量标准，普通弱毒活疫苗必须在-15℃以下保存，而耐热型山羊痘弱毒活疫苗于2-8℃保存即可。
本发明耐热型山羊痘弱毒活疫苗的制备方法包括以下步骤：
1、疫苗配制、分装
取实施例1获得的用BHK21传代细胞培养25-28代(F25-F28)的山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液，检测TCID50，每0.1mL病毒液中病毒含量≥105.5TCID50，于-20℃冰箱冻融2次后(目的是将细胞内病毒充分释放)，2500-3000rpm、4℃离心10-15min，取上清液备用。
耐热冻干保护剂的作用是对疫苗有效成分在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段实施保护以保证疫苗免疫效果。本发明用于制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的耐热冻干保护剂各成分质量百分含量及配制方法如下，该配方是在已有配方基础上，为获得更好的产品外观及耐热保护性，适当调整个别成分含量获得的：
甲液：
蔗糖：15％，
酶解酪蛋白：5.8％，
明胶：4.0％，
海藻糖：1.0％，
其余为：注射用水；
甲液于116℃高压灭菌20分钟；
乙液：
牛血清白蛋白：2.0％，
精氨酸盐酸盐：2.0％，
谷氨酸钠：1.0％，
山梨醇：2.0％，
其余为：注射用水；
乙液用0.2um过滤器进行过滤除菌；
将甲液与乙液按体积比1：1混合后得到耐热冻干保护剂。
将耐热冻干保护剂与病毒上清液按体积比1：1混合，充分摇匀，得到耐热型山羊痘弱毒活疫苗病毒液。
分装时，每头份疫苗需含山羊痘弱毒活疫苗病毒液(上清液)0.015mL，与耐热冻干保护剂按体积比1：1混合，按3mL(100头份)/瓶分装。
2、疫苗冻干
对耐热型山羊痘弱毒活疫苗病毒液进行冻干(冷冻干燥)，得到耐热型山羊痘弱毒活疫苗(冻干粉剂)。
使用耐热冻干保护剂后，常规的冻干曲线得到的冻干粉剂，其外观性状及稳定性不达标。为获得良好的产品外观及保持疫苗质量稳定，发明人优化冻干过程，确定了以下冻干曲线：
预冻阶段：常温进冻干箱，于80min内预冻至-42℃，维持160min；
升华干燥阶段：于120min内升温至-5℃，维持750min,于30min内由-5℃升温至-3℃，维持120min；
解吸干燥阶段：于190min内由-3℃升温至26℃，并于26℃二次干燥，维持420min。
实施例3、耐热型山羊痘弱毒活疫苗的检测
选取3批实施例1获得的用BHK21传代细胞培养至F28(选用25-28代)的山羊痘病毒液，分别用实施例2的方法制备3批(批号：S001、S002、S003)耐热型山羊痘弱毒活疫苗(规格均为100头份/瓶)，按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验规程文献中记载的方法对3批耐热型山羊痘弱毒活疫苗成品进行常规项目检测，并增加疫苗的纯种孕羊安全性及耐热性检验，具体检验项目及检测结果如表2-表4所示。
耐热型山羊痘弱毒活疫苗的常规检测项目检测结果如表2所示，可以看出经培养条件及冻干优化后的耐热型山羊痘弱毒活疫苗可达该产品质量标准，表明使用BHK21传代细胞制备的耐热型山羊痘弱毒活疫苗可进行产业化。
表2耐热型山羊痘弱毒活疫苗的常规项目检测结果及结论
耐热型山羊痘弱毒活疫苗的纯种孕羊安全性检测结果如表3所示，可以看出3批制品用于纯种敏感孕山羊，无流产现象，表明使用BHK21传代细胞制备的耐热型山羊痘弱毒活疫苗可安全用于敏感的孕山羊，具有良好的安全性。
表3 3批耐热型山羊痘弱毒活疫苗的孕羊安全性检测结果
在山羊痘弱毒活疫苗的使用中，用户更倾向于使用稀释后存放5-6小时，仍保持较高效价的苗，因此，添加适宜的耐热冻干保护剂，可有效提高山羊痘弱毒活疫苗的耐热性，满足用户的需求。据耐热试验标准及用户使用需求进行通用的耐老化试验(37℃环境保存10天),及将耐热型山羊痘弱毒活疫苗稀释后，室温条件(23-25℃)保存7-8小时，耐热型山羊痘弱毒活疫苗与山羊痘普通冻干活疫苗(与耐热保护剂疫苗用同批抗原，同期自行制备，制备方法参见文献《中华人民共和国兽用生物制品规程》：山羊痘活疫苗制造及检验规程)的效价衰减及对比结果如表4所示。由表4可以看出，使用耐热保护剂的疫苗较普通蔗糖牛奶保护剂的冻干苗，耐老化试验及疫苗稀释后的常温保存试验，对活疫苗效力衰减均有明显改善，表明耐热型山羊痘弱毒活疫苗对疫苗保存条件的要求、使用均有明显优越性。
表4耐热型山羊痘弱毒活疫苗与山羊痘普通冻干活疫苗的耐热性对比结果
本发明中涉及到的优势，与专利文献CN104958760A(一种山羊痘灭活疫苗及其制备方法)中的山羊痘灭活疫苗进行比较，主要在免疫持续期、成本、使用的广泛性方面，结果如表5所示，使用专利文献中所述206佐剂、免疫山羊痘灭活疫苗后，保护率达80％以上的持续时间仅达6月左右，而本发明的耐热型山羊痘弱毒活疫苗的免疫保护持续时间可达1年。另外，专利文献中使用206佐剂，价格明显高于现活疫苗，因其灭活苗的免疫持续期较短，目前仍未得到用户青睐，未在市场上获得广泛使用。
表5耐热型山羊痘弱毒活疫苗与山羊痘灭活疫苗的攻毒保护率、免疫持续期对比结果

Claims (10)

1.用BHK21-C13传代细胞制备山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液的方法，包括以下步骤：
1)细胞选用及传代培养：
选取经支原体、外源病毒检测结果均为阴性的BHK21-C13细胞作为种细胞，使用含8-10％(V/V)新生牛血清的MEM培养液，将BHK21细胞贴附方瓶或转瓶细胞培养瓶中，在37℃下，方瓶静置培养，或转瓶10-12rph(转/小时)旋转培养；
2)病毒培养：
培养BHK21贴壁细胞48-72小时至细胞融合度达85-95％，弃去细胞培养液，将山羊痘弱毒AV41种毒按接毒溶液总量5-10％(V/V)含量加入细胞培养瓶，于37℃吸附1小时，然后弃去种毒液，加入含10-20mmol HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)的无血清DMEM作为维持液，在34-36℃下，的方瓶静置继续培养或转瓶10-12rph(转/小时)旋转继续培养；
3)病变观察及毒液收获：
每日观察细胞病变，以细胞呈现间质变宽、细胞圆缩、脱落等病变特征作为观察判断细胞病变指标，至细胞病变率(CPE)达85％，收获病毒液，测定TCID50，选取病毒液每0.1mL病毒含量≥105.5TCID50的为山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液。
2.根据权利要求1所述的山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的外源病毒主要包括牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、蓝舌病毒(BTV)。
3.根据权利要求1或2所述的山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液的制备方法，其特征在于：步骤2)继续培养中山羊痘弱毒AV41于BHK21细胞传代，步骤3)收获病毒液的时间为接毒后继续培养72-120小时。
4.根据权利要求3所述的山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液的制备方法，其特征在于：步骤3)收获的病毒液为山羊痘弱毒AV41传代至25-28代时，效价水平为每0.1mL病毒液中病毒含量≥105.5TCID50的山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液。
5.用权利要求1-4任一所述方法制备得到的山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液。
6.一种制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法，是向权利要求5所述的山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液中添加耐热冻干保护剂，再经冷冻干燥，得到外观完好、易保存的耐热型山羊痘弱毒活疫苗。
7.根据权利要求6所述耐热型山羊痘弱毒活疫苗的制备方法，其特征在于：所述耐热冻干保护剂各成分质量百分含量及配制如下：
甲液：
蔗糖：15％，
酶解酪蛋白：5.8％，
明胶：4.0％，
海藻糖：1.0％，
其余为：注射用水；
甲液116℃高压灭菌20分钟；
乙液：
牛血清白蛋白：2.0％，
精氨酸盐酸盐：2.0％，
谷氨酸钠：1.0％，
山梨醇：2.0％，
其余为：注射用水；
乙液用0.2um过滤器进行过滤除菌；
将甲液与乙液按体积比1：1混合后得到耐热冻干保护剂。
8.根据权利要求7所述耐热型山羊痘弱毒活疫苗的制备方法，其特征在于：山羊痘无血清弱毒活疫苗病毒液的上清液与所述耐热冻干保护剂按体积比1：1混合。
9.根据权利要求6或7或8所述耐热型山羊痘弱毒活疫苗的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥的冻干曲线为：
预冻阶段：常温进冻干箱，于80min内预冻至-42℃，维持160min；
升华干燥阶段：于120min内升温至-5℃，维持750min,于30min内由-5℃升温至-3℃，维持120min；
解吸干燥阶段：于190min内，由-3℃升温至26℃，并于26℃二次干燥维持420min。
10.用权利要求6-9任一所述方法制备得到的耐热型山羊痘弱毒活疫苗。
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