CN116115766A - 一种活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法与应用 - Google Patents
一种活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法与应用。通过对耐热冻干保护剂配方和组成的优化，获得了一种效果极佳的耐热冻干保护剂，其可以用以畜禽活疫苗的冻干保护工艺，以猪瘟活病毒为例，冻干后损失率控制在较低的水平，相比传统的5%蔗糖牛奶冻干保护剂，冻干保护率得到了极大的提高；且基于耐老化试验结果可知，本发明耐热冻干保护剂对于猪瘟活疫苗具有相对较好的耐热保护性，在耐老化试验后依然能满足注射疫苗的质量要求。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法与应用。
背景技术
目前，弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物用疫苗中，活疫苗占相当大的比例。在生产过程中，活疫苗通常以真空冷冻干燥的方法进行冻干处理，制苗过程（保存和冻干）抗原损失大，且存在免疫副反应现象等难题，因此，在生产过程中需要使用冻干保护剂，冻干保护剂对活疫苗的效价、储存、运输和使用过程均有至关重要的影响。目前国内疫苗企业常用的保护剂有牛奶蔗糖保护剂、蔗糖明胶保护剂等常规保护剂，传统的冻干保护剂冻干后需要在-15℃保存，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制。在实际的临床使用中，运输和正规供应站可较好执行保存条件，养殖户或养殖企业缺乏必要的冷冻和冷藏设施，多存在室温操作、饮水用苗时间过长等问题，在此过程易造成少部分失效，容易因免疫失败而造成疫病流行。
耐热冻干保护剂相较常规冻干保护剂更周到地考虑了具有生物活性的制品在较高温度和较长保存时间情况下的稳定，一方面，耐热冻干保护剂在冻干过程中为疫苗抗原活性提供了全面保护；另一方面，耐热冻干保护剂可以使疫苗在储存、运输、使用上具有良好的耐高温的特性。使用了耐热冻干保护剂的冻干活疫苗产品一般在2-8℃的环境中可储存相当长的时间也不会导致效价的损失。而且在较高的室温下在数天至数十天内也能保持其有效性。与传统成分的冻干疫苗对比在储存、运输、使用都有极大的优势。然而，我国在耐热冻干保护剂方面的研究起步较晚，且各公司将其作为商业机密，目前国内耐热冻干保护剂市场大量被国外公司占领。畜牧业的快速发展使得对疫苗的使用量和种类迅速增加，对耐热冻干保护剂的需求也日益增加，因而，有必要筛选开发一种耐热冻干保护剂，能够适当提高疫苗保存温度，减少使用过程的损失，且成本低廉，降低养殖成本。
发明内容
为了解决现有活疫苗生产中耐热冻干保护剂选择较少，购买成本高的问题，本发明旨在提供一种活疫苗耐热冻干保护剂，其可以广泛用于畜禽活疫苗的生产。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段。
本发明提供一种活疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述活疫苗耐热冻干保护剂由以下成分组成：蔗糖12-13%、明胶2%、酶解酪蛋白10-11%、海藻糖2-3%、D-山梨醇2%、右旋糖苷1.5-2%、L-谷氨酸钠2%、L-精氨酸盐酸盐2%、乳糖酸钙0.5-1%、甘氨酸2%，余量为注射用水，其中百分含量为质量体积百分含量。
优选地，所述活疫苗耐热冻干保护剂由以下成分组成：蔗糖13%、明胶2%、酶解酪蛋白10%、海藻糖2%、D-山梨醇2%、右旋糖苷2%、L-谷氨酸钠2%、L-精氨酸盐酸盐2%、乳糖酸钙1%、甘氨酸2%，余量为注射用水，其中百分含量为质量体积百分含量。
优选地，所述活疫苗耐热冻干保护剂由以下成分组成：蔗糖12%、明胶2%、酶解酪蛋白11%、海藻糖3%、D-山梨醇2%、右旋糖苷1.5%、L-谷氨酸钠2%、L-精氨酸盐酸盐2%、乳糖酸钙0.5%、甘氨酸2%，余量为注射用水，其中百分含量为质量体积百分含量。
本发明还提供所述活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法为：1）以配制1000mL耐热冻干保护剂为例，按百分含量（w/v）称取各活性成分；2）将称取的蔗糖、明胶、酶解酪蛋白、海藻糖和右旋糖苷于注射用水中加热溶解，冷却至室温后调节pH=7.2并用注射用水定容至800mL，而后121℃ 30 min高压灭菌，得到甲液；3）将称取的D-山梨醇、乳糖酸钙、L-谷氨酸钠、L-精氨酸盐酸盐、甘氨酸用适量注射用水溶解后，调节pH=7.2并定容至200mL，过滤除菌得到乙液；4）使用时，将甲液和乙液混合即得到所述的耐热冻干保护剂。
所述制备方法具体为：
1）按百分含量（w/v）称取除注射用水以外的成分，按照每1000mL活疫苗耐热冻干保护剂称取蔗糖120-130g、明胶20g、酶解酪蛋白100-110g、海藻糖20-30g、D-山梨醇20g、右旋糖苷15-20g、L-谷氨酸钠20g、L-精氨酸盐酸盐20g、乳糖酸钙5-10g、甘氨酸20g；
2）将称取的蔗糖、明胶、酶解酪蛋白、海藻糖和右旋糖苷于注射用水中加热溶解，冷却至室温后调节pH=7.2并用注射用水定容至800mL，而后121℃ 30 min高压灭菌，得到甲液，4℃保存备用；
3）将称取的D-山梨醇、乳糖酸钙、L-谷氨酸钠、L-精氨酸盐酸盐、甘氨酸用适量注射用水溶解后，调节pH=7.2并定容至200mL，过滤除菌得到乙液，4℃保存备用；
4）使用时，将甲液和乙液混合即得到所述的耐热冻干保护剂。
本发明还请求保护所述耐热冻干保护剂在制备畜禽活疫苗中的应用，所述畜禽活疫苗为猪瘟活疫苗。
进一步的，所述应用是指将病毒液与耐热冻干保护剂按照1:1的体积比例混合均匀、分装后进行冷冻干燥。
所述冷冻干燥的冻干曲线包括：产品预冻阶段，常温进箱，1 h内将板层温度降至-42℃并维持3 h；升华干燥阶段，2 h 将板层温度从-42℃匀速升温至0℃并维持15 h；解析干燥阶段，2 h将板层温度从 0℃升至 28℃并维持 8 h；冻干结束，全长约 31 h。
本发明通过对耐热冻干保护剂配方和组成的优化，获得了一种效果极佳的耐热冻干保护剂，其可以用于畜禽活疫苗的冻干保护工艺，以猪瘟活病毒为例，冻干后损失控制在较低的水平，相比传统的5%蔗糖牛奶冻干保护剂，冻干保护率得到了极大的提高；且基于耐老化试验结果可知，本发明耐热冻干保护剂B和C对于猪瘟活疫苗具有相对较好的耐热保护性，耐老化试验后病毒滴度下降均未超过0.35，保持104.5 TCID50/头份以上的病毒滴度，高于疫苗104.5 TCID50/头份的最低要求，在耐老化试验后依然能满足注射疫苗的质量要求。由此可见，本发明基于特定组成的耐热冻干保护剂B和C相对耐热冻干保护剂D具有更好的耐热保护效果，表明保护剂的配比对于其耐热性能是至关重要的，相比耐热冻干保护剂A和E，其表明耐热冻干保护剂的成分组成对于其耐热稳定性也影响很大。进一步证明了本发明特定的保护剂组成取得了预料不到的耐热稳定性效果。本发明中各成分的组合发挥了协调增效的技术效果，极大地提高了耐热稳定性，能够避免产品在短时间的常温储存中失去活性，对于疫苗的销售、流通和使用提供了极大的便利。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围，不以任何方式构成对本发明的限制。如无特殊说明，以下实施例中的材料、试剂等，均可从商业途径购买获得，所采取的试验手段均为兽药、疫苗加工中常规的方法。
在查阅相关专利和期刊文献资料的基础上，根据耐热冻干保护剂的基本组成成分分别选取小分子营养剂、高分子赋形剂及抗氧化剂进行搭配。其中低分子营养物质主要维持病毒存在于相对稳定的液体环境中利于冻干，具有脱水保护作用。赋形剂主要抑制蛋白质聚集，减少表面吸附，起骨架支撑作用。抗氧化剂主要是防止疫苗保存过程中可能出现的氧化反应。根据以上原则，选取具体成分设计了耐热冻干保护剂A –E等5组耐热冻干保护剂配方，具体配方如下表1所示：
| 保护剂A | 保护剂B | 保护剂C | 保护剂D | 保护剂E | |
| 蔗糖 | 15.0% | 13.0% | 12.0% | 15.0% | 14.0% |
| 明胶 | 7.0% | 2.0% | 2.0% | 2.0% | 3.0% |
| 酶解酪蛋白 | 8.0% | 10.0% | 11.0% | 9.5% | 9.0% |
| 海藻糖 | 1.0% | 2.0% | 3.0% | 2.0% | 0.0% |
| D-山梨醇 | 2.0% | 2.0% | 2.0% | 2.0% | 2.0% |
| 右旋糖苷 | 0.0% | 2.0% | 1.5% | 1.5% | 2.0% |
| L-谷氨酸钠 | 2.0% | 2.0% | 2.0% | 2.0% | 2.0% |
| L-精氨酸盐酸盐 | 2.0% | 2.0% | 2.0% | 2.0% | 2.0% |
| 乳糖酸钙 | 1.0% | 1.0% | 0.5% | 0.0% | 2.0% |
| 甘氨酸 | 0.0% | 2.0% | 2.0% | 2.0% | 2.0% |
注：其中百分含量表示质量体积百分含量，如“蔗糖15%”表示相对1000mL冻干保护剂溶液，添加蔗糖150g。
耐热冻干保护剂的配制方法：1）按百分含量（w/v）称取各活性成分；2）将称取的蔗糖、明胶、酶解酪蛋白、海藻糖和右旋糖苷于注射用水中加热溶解，冷却至室温后调节pH=7.2并用注射用水定容至800mL，而后121℃ 30 min高压灭菌，得到甲液；3）将称取的D-山梨醇、乳糖酸钙、L-谷氨酸钠、L-精氨酸盐酸盐、甘氨酸用适量注射用水溶解后，调节pH=7.2并定容至200mL，过滤除菌得到乙液；4）使用时，将甲液和乙液混合即得到所述的耐热冻干保护剂。
2.1毒种和细胞系：
用于耐热冻干保护剂筛选试验的毒种为猪瘟病毒兔化弱毒C株（CVCC AV1412）；效检用强毒为猪瘟病毒石门系（CVCC AV1411），均由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。猪瘟病毒增殖用细胞为猪睾丸（ST）传代细胞，由广东永顺生物制药股份有限公司鉴定、保管和供应。
2.2.1 接种：取已形成良好单层的ST细胞培养瓶，弃去生长液，接种含3%～5%（V/V）生产用细胞毒种的维持液，37℃继续培养。
2.2.2 收获：接毒后5日作第1次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，最高收毒次数不超过5次。
2.2.3 保存：收获的毒液置-15℃以下保存，应不超过3个月。
2.2.4 无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
2.2.5 猪瘟兔化弱毒病毒液病毒含量测定：各代次病毒培养液分别用兔测定，每1.0ml应含病毒≥5×105.0个兔体感染量（即病毒含量≥5×105RID/ml），则可用于配苗。
分别将实施例1中的耐热冻干保护剂A~E的甲液和乙液混合均匀后得到相应的耐热冻干保护剂A~E，而后将病毒液分别与耐热冻干保护剂A~E按照1:1的体积比例混合均匀，同时以常规含5%蔗糖的脱脂牛奶冻干保护剂作为对照组。
定量分装，每瓶3mL，冻干制成疫苗，加盖密封。
其中冻干曲线如下：
产品预冻阶段：常温进箱，1 h内将板层温度降至-42℃并维持3 h；
升华干燥阶段：2 h 将板层温度从-42℃匀速升温至0℃并维持15 h；
解析干燥阶段：2 h将板层温度从 0℃升至 28℃并维持 8 h；
冻干结束，曲线全长约 31 h。
3.1 性状：冻干的疫苗均呈疏松海绵状，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。详见表2。
| 保护剂 | 物理性状 | 溶解性能 |
| 耐热冻干保护剂A | 乳白微黄，外观塌陷，不易与瓶壁脱离 | 溶解性略差 |
| 耐热冻干保护剂B | 淡粉色疏松海绵状，易与瓶壁脱离 | 易溶 |
| 耐热冻干保护剂C | 淡粉色疏松海绵状，易与瓶壁脱离 | 易溶 |
| 耐热冻干保护剂D | 淡粉色疏松海绵状，易与瓶壁脱离 | 易溶 |
| 耐热冻干保护剂E | 淡粉色疏松海绵状，易与瓶壁脱离 | 易溶 |
| 5%蔗糖牛奶 | 淡黄色疏松海绵状，易与瓶壁脱离 | 易溶 |
基于以上结果可知，本发明中耐热冻干保护剂A所制备得到的活疫苗在冻干后的物理性状不符合要求，且溶解性略差，不符合疫苗的制备要求，而其他耐热冻干保护剂均能获得符合要求的物理性状和溶解性能。由此可知，甘氨酸的添加可以避免外观的塌陷，且过高的明胶含量导致了溶解性能降低。
3.2 无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果显示，各实验组均无菌生长。
3.3 支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果显示，各实验组均无支原体生长。
3.4 安全检验：选用4周龄左右健康易感仔猪（猪瘟病毒抗原、抗体均阴性）5头，接种前观察2～3日，每日定时测体温1次，取平均值作为基础体温。每头猪肌肉注射10头份。接种后，每日观察并定时测体温1次，连续观察21日。
冻干的疫苗安全检验结果显示，所有免疫猪精神、食欲均正常，未出现接种疫苗引起的局部或全身不良反应；免疫前试验猪的基础体温均在39.4℃左右，最高没有超过39.8℃，在正常范围内，接种后21天内，所有猪的体温均未明显变化，维持在39.4℃左右，最高体温变化未超过0.4℃。证明冻干的疫苗对仔猪是安全的。
3.5效力检验
将疫苗用无血清MEM细胞培养液稀释为1头份/ml，然后再作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5 3个稀释度，分别接种已长成良好单层、弃去细胞生长液的T25 ST细胞培养瓶，每个稀释度接种6瓶，每瓶1.0 ml，同时设正常细胞对照4瓶。置37℃、含5%CO2培养箱中吸附2小时后，每瓶加含2%新生牛血清MEM细胞维持液6.0 ml，接毒后4日作第1次换液，以后每隔3日收获换液1次，应用ELISA方法检测第4收次毒液。每种耐热冻干保护剂样品重复试验3次，根据Reed-Muench法计算TCID50。
表3冻干前、后猪瘟病毒含量测定结果（lg TCID50/头份）
基于以上试验结果可知，在相同的疫苗原液、采用相同的冻干工艺的情况下，耐热冻干保护剂B和C作为保护剂配制得到的疫苗在冻干后保持了相对较高的病毒滴度，其中耐热冻干保护剂B组仅降低了0.18（lg TCID50/头份）；耐热冻干保护剂C组仅降低了0.20（lgTCID50/头份）；而耐热保护剂A、D和E降低值达到0.42（lg TCID50/头份）以上；5%蔗糖牛奶的冻干保护率最差，其降低值达到0.5（lg TCID50/头份）。
3.5.2 耐老化试验：
将待检疫苗放置在37℃温箱中10日，按3.5.1的方法进行病毒含量测定。具体结果如表4所示。
表4耐老化前、后猪瘟病毒含量测定结果（lg TCID50/头份）
由以上表4可知，本发明耐热冻干保护剂B和C对于猪瘟活疫苗具有相对较好的耐热保护性，耐老化试验后病毒滴度下降均未超过0.35滴度，保持104.5 TCID50/头份以上的病毒滴度，高于疫苗104.5 TCID50/头份的最低要求，在耐老化试验后依然能满足注射疫苗的质量要求。由此可见，本发明基于特定组成的耐热冻干保护剂B和C相对耐热冻干保护剂D具有更好的耐热保护效果，表明保护剂的配比对于其耐热性能是至关重要的，相比耐热冻干保护剂A和E，其表明耐热冻干保护剂的成分组成对于其耐热稳定性也影响很大。进一步证明了本发明特定的保护剂组成取得了预料不到的耐热稳定性效果。
相比耐热冻干保护剂A不添加甘氨酸和右旋糖苷、耐热保护剂D不添加乳糖酸钙以及耐热冻干保护剂E不添加海藻糖的情况下，其耐热稳定性效果都较差，而本发明中各成分的组合发挥了协调增效的技术效果，极大地提高了耐热稳定性，能够避免产品在短时间的常温储存中失去活性，对于疫苗的销售、流通和使用提供了极大的便利。
基于以上试验分析可知，其中耐热冻干保护剂B和C基本能够满足活疫苗的生产需要，而耐热冻干保护剂也具有相对而言较好的效果。因此，采用以上耐热冻干保护剂B，C和D分别制得一批次疫苗，即20150311-B，20150311-C和20150311-D。对于以上批次的疫苗进一步进行保存期的测定，分别测定保存于2~8℃温度下第6个月、12个月、18个月、21个月、24个月和27个月后，以及存放在37℃温箱中7日、10日、13日后的病毒滴度，每组进行3次平行测定，取平均值。具体结果如下表5所示：
表5疫苗经保存后的病毒含量测定结果（lg TCID50/头份）
基于以上结果可知，本发明的耐热冻干保护剂B和C相对耐热冻干保护剂D具有更好的保存效果，在2-8℃、保存期24个月内，平均的病毒滴度保持在104.5 TCID50/头份，而耐热冻干保护剂D（20150311-D）的保存期在2-8℃、保存期12个月时，病毒滴度基本接近104.5TCID50/头份，基本符合疫苗的质量要求（滴度≥104.5 TCID50/头份），然而，随着时间的延长，病毒滴度进一步下降，不再符合疫苗的质量要求。加速试验的结果表明，耐热冻干保护剂B和C可以避免疫苗在高温短时间保存时失活。
以上记载的仅为本发明的优选实施例，不能以此来限定本发明之权利范围，因此，依据本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
Claims (7)
1.一种活疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述活疫苗耐热冻干保护剂由以下成分组成：蔗糖12-13%、明胶2%、酶解酪蛋白10-11%、海藻糖2-3%、D-山梨醇2%、右旋糖苷1.5-2%、L-谷氨酸钠2%、L-精氨酸盐酸盐2%、乳糖酸钙0.5-1%、甘氨酸2%，余量为注射用水，其中百分含量为质量体积百分含量。
2.根据权利要求1所述的活疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述活疫苗耐热冻干保护剂由以下成分组成：蔗糖13%、明胶2%、酶解酪蛋白10%、海藻糖2%、D-山梨醇2%、右旋糖苷2%、L-谷氨酸钠2%、L-精氨酸盐酸盐2%、乳糖酸钙1%、甘氨酸2%，余量为注射用水，其中百分含量为质量体积百分含量。
3.根据权利要求1所述的活疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述活疫苗耐热冻干保护剂由以下成分组成：蔗糖12%、明胶2%、酶解酪蛋白11%、海藻糖3%、D-山梨醇2%、右旋糖苷1.5%、L-谷氨酸钠2%、L-精氨酸盐酸盐2%、乳糖酸钙0.5%、甘氨酸2%，余量为注射用水，其中百分含量为质量体积百分含量。
4.根据权利要求1所述的活疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法为：1）以配制1000mL耐热冻干保护剂为例，按百分含量（w/v）称取各活性成分；2）将称取的蔗糖、明胶、酶解酪蛋白、海藻糖和右旋糖苷于注射用水中加热溶解，冷却至室温后调节pH=7.2并用注射用水定容至800mL，而后121℃ 30 min高压灭菌，得到甲液；3）将称取的D-山梨醇、乳糖酸钙、L-谷氨酸钠、L-精氨酸盐酸盐、甘氨酸用适量注射用水溶解后，调节pH=7.2并定容至200mL，过滤除菌得到乙液；4）使用时，将甲液和乙液混合即得到所述的耐热冻干保护剂。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的活疫苗耐热冻干保护剂在制备畜禽活疫苗中的应用，所述畜禽活疫苗为猪瘟活疫苗。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是指将病毒液与耐热冻干保护剂按照1:1的体积比例混合均匀、分装后进行冷冻干燥。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述冷冻干燥的冻干曲线包括：产品预冻阶段，常温进箱，1 h内将板层温度降至-42℃并维持3 h；升华干燥阶段，2 h 将板层温度从-42℃匀速升温至0℃并维持15 h；解析干燥阶段，2 h将板层温度从 0℃升至 28℃并维持 8 h；冻干结束，全长约 31 h。
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