CN102166362A - 猪繁殖与呼吸综合征活疫苗耐热冻干保护剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征活疫苗耐热冻干保护剂及制备方法,耐热冻干保护剂由下述重量百分比的物质混配而成:明胶1~2%、海藻糖4~6%、胰蛋白胨1~2%、酶解酪蛋白1~2%、聚乙烯吡咯烷酮1~2%、磷酸氢二钾0.164%、磷酸二氢钾0.052%、山梨醇1%、谷氨酸钠1%、精氨酸盐1%,余量为蒸馏水。制备方法:将上述物质配制成二种混合溶液,分别通过除菌再行混配,制得耐热冻干保护剂,使用时按保护剂与病毒抗原液比为1∶1混合,分装后再进行冷冻干燥。冻干前后病毒损失率低,冻干产品耐老化程度高,产品在2~8℃保存24个月,病毒含量不发生改变。本发明解决猪繁殖与呼吸综合征活疫苗仅能在-15℃条件下保存和运输的技术瓶颈。
Description
技术领域
本发明属于农业兽用生物技术领域,涉及生物制品的冷冻干燥技术,特别涉及猪繁殖与呼吸综合征活疫苗耐热冻干保护剂及制备方法。
背景技术
目前,弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一,在我国动物用疫苗中,活疫苗占相当大的比例。国内疫苗企业常用的保护剂主要是蔗糖、牛奶、明胶等,组方简单,保护性能差。如果在2~8℃条件下,保存期只有3~6个月,多需要在-15℃以下保存。而国内传统的动物用疫苗保护剂的研制相对滞后,使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制,加上基层防疫部门缺乏必要的冷冻和冷藏设施,容易造成因冷链系统不完善而导致疫苗的效价降低。发达国家在二十世纪八十年代就已开始进行耐热保护剂的研究,目前已经基本采用耐热保护剂生产活疫苗,但研制方法未见详细报道。我国在耐热保护剂方面的研究虽然起步较晚,但近年来研究非常活跃,已经取得了一定的成果。但是,产品配套还不齐全,且与国外同类产品相比较仍有一定差距,目前针对猪繁殖与呼吸综合征活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法未见报导。因此,本研究针对猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的特性,研制出猪繁殖与呼吸综合征耐热型活疫苗。该疫苗在2~8℃保存24个月,病毒含量不发生改变。依据本研究的工艺进行冻干试验,疫苗产品冻干前后病毒损失率仅为0.2个滴度,冻干的产品在37℃条件下分别保存10d和30d,病毒损失率分别仅为0.4和1.2个滴度之内。本研究解决了猪繁殖与呼吸综合征活疫苗仅能在-15℃条件下保存和运输的技术瓶颈,使该疫苗的储存和运输更方便。
发明内容
本发明的目的是通过对多种冻干保护剂基质与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原进行相溶性研究,找出合适的基质,并由此设计一种冻干保护剂配方,并用与此相适应的冻干曲线对病毒抗原进行冻干。用该保护剂与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原混合,按一定的冻干曲线冻干后所成的活疫苗可在2~8℃条件下长期保存,有望解决我国目前猪繁殖与呼吸综合征活疫苗需在-15℃条件下保存的问题。
本发明的技术方案为:
一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗耐热冻干保护剂,其特征是由下述重量百分比的物质混配而成:明胶1~2%、海藻糖4~6%、胰蛋白胨1~2%、酶解酪蛋白1~2%、聚乙二烯吡咯烷酮1~2%、磷酸氢二钾0.164%、磷酸二氢钾0.052%、山梨醇1%、谷氨酸钠1%、精氨酸盐1%,余量为蒸馏水。
猪繁殖与呼吸综合征活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法,各组分按重量百分比计,其特征在于按以下几个步骤进行:(1)将1~2%明胶、4~6%海藻糖、1~2%胰蛋白胨、1~2%酶解酪蛋白、1~2%聚乙烯吡咯烷酮、0.164%磷酸氢二钾、0.052%磷酸二氢钾溶于部分蒸馏水中,在110~116℃灭菌30分钟;(2)将1%山梨醇、1%谷氨酸钠、1%精氨酸盐溶于剩余的蒸馏水中,并用孔径0.22μm滤膜过滤除菌;(3)将上述第(1)步、第(2)步制得的两种溶液混合,制得耐热冻干保护剂;使用时,按耐热冻干保护剂与病毒抗原液比为1∶1充分混匀,定量分装后立即进行冷冻干燥。
冻干曲线设计:首先将冻干机预冷至-5℃,将分装好的疫苗装入冻干机箱体内,再以1℃/min的速度降温至-45℃,在此温度下维持3~4个小时后,抽真空至1Pa后,再开始缓慢升温,14~18小时内升至0℃,之后以每小时5~8℃的速度升温至25℃,维持4~6小时加塞出箱;冻干全程为25~32小时。
本发明制备的冻干保护剂,冻干前后病毒损失率低,损失率仅为0.2个滴度,冻干产品耐老化程度高,冻干的产品在37℃条件下分别保存10d和30d,病毒损失率分别仅为0.4和1.2个滴度之内,产品在2~8℃保存24个月,病毒含量不发生改变。本发明解决了猪繁殖与呼吸综合征活疫苗仅能在-15℃条件下保存和运输的技术瓶颈,使该疫苗的储存和运输更方便。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明进行详细的说明:
1、疫苗抗原的制备
生产用毒种为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株,由中国动物疫病控制中心鉴定、保管和提供。选取所需数量的细胞(已长成单层的细胞转瓶),弃去生长液,按1%(V/V)接种生产用毒种病毒,加入含2%胎牛血清的DMEM细胞培养液,37℃旋转(9~12转/小时)培养。在显微镜下观察由病毒引起的CPE,当CPE达到70%以上时收获细胞培养物,冻融1次,经离心或过滤除去细胞碎片,冻存-40℃以下。按《中国兽药典》附录对疫苗抗原进行无菌支原体及外源病毒检验,应符合规定。
2、冻干保护剂的配制
附表1.是本发明实施例1~4所用原料及配比。
表1各实施例所用原料及配比 重量百分比:%
猪繁殖与呼吸综合征活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法,按以下步骤进行:(1)按表1中各组分的量取明胶、海藻糖、胰蛋白胨、酶解酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾溶于一半蒸馏水中,110~116℃灭菌30分钟;(2)按表1中各组分的量取山梨醇、谷氨酸钠、精氨酸盐溶于剩余的蒸馏水中,用孔径0.22μm滤膜过滤除菌;将第(1)步、第(2)步制得两种溶液混合,制得耐热冻干保护剂。
3、配苗:将检验合格的病毒抗原,按1∶1的比例加入本发明所设计和制备的冻干保护剂,充分摇匀,定量分装后立即进行冷冻干燥。
4、冻干:首先将冻干机预冷至-5℃,将分装好的疫苗装入冻干机箱体内,再以1℃/min的速度降温至-45℃,在此温度下维持3个小时后,开始抽真空至1Pa后,再开始缓慢升温,18小时内升至0℃,之后以每小时6℃的速度升温至25℃,维持5小时加塞出箱;冻干全程为30小时,冻干后疫苗每头份病毒含量应≥105TCID50。
对上述实施例冻干后产品做以下的技术参数及检测:
1、产品的物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、剩余水分测定和真空度测定按《中国兽药典》附录进行检验,应符合规定。
2、冻干周期不超过35小时。
3、产品的安全性试验
该疫苗按产品使用剂量的10~100倍剂量,对5头28日龄健康断奶猪繁殖与呼吸综合征抗原抗体双阴仔猪进行颈部肌肉注射,每日测温并观察21日,无体温反应和临床症状。
4、病毒含量测定及标准
(1)测定方法:
A.按瓶签注明的头份,用无血清DMEM细胞培养液作10倍系列稀释,取适宜的稀释度,分别接种于已生长良好单层,弃去细胞培养液的96孔Marc-145细胞培养板,每个稀释度接种6孔,每孔0.1ml,同时设正常细胞对照。置37℃、含5%CO2培养箱中吸附1小时后,每孔补加含4%胎牛血清的DMEM培养液0.1ml。置37℃、含5%CO2培养箱中培养观察5日,根据Reed-Muench法计算TCID50。
B.按实含病毒量,用无血清DMEM细胞培养液作10倍系列稀释,取适宜的稀释度,分别接种于已生长良好单层,弃去细胞培养液的96孔Marc-145细胞培养板,每个稀释度接种6孔,每孔0.1ml,同时设正常细胞对照。置37℃、含5%CO2培养箱中吸附1小时后,每孔补加含4%胎牛血清的DMEM培养液0.1ml。置37℃、含5%CO2培养箱中培养观察5日,根据Reed-Muench法计算TCID50。
(2)标准
A.冻干病毒损失率为0.2个滴度以下。
B.冻干后TCID50均≥106.5TCID50/ml。
C.产品在37℃条件下分别保存10d和30d,病毒损失率分别为0.4和1.2个滴度之内。
D.产品在25℃条件下保存30d,病毒损失率在0.4个滴度之内。
E.产品在2~8℃条件下保存24个月,按照A方法测定病毒含量每头份均≥105.0TCID50。
5、效力测定 下列方法任选其一
(1)病毒含量测定 将疫苗用无血清DMEM细胞培养液稀释为1头份/ml,再作10倍系列稀释,取10-3、10-4、10-5、10-6 4个稀释度,分别接种于已生长良好单层,弃去细胞培养液的96孔Marc-145细胞培养板,每个稀释度接种6孔,每孔0.1ml,同时设正常细胞对照。置37℃、含5%CO2小时后,每孔补加含4%胎牛血清的DMEM培养液0.1ml。置37℃、含5%CO2培养箱中培养观察5日,根据Reed-Muench法计算TCID50。每头份病毒含量应不低于105.0TCID50。
(2)免疫攻毒 用4~6周龄猪繁殖与呼吸综合征抗原抗体双阴性健康仔猪10头,随机分为2组,每组5头。一组各肌肉注射疫苗1头份,另一组不接种疫苗,作为对照,在同等条件下隔离饲养。28日后,所有猪各肌肉注射检验用强毒猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株的病毒培养液(104.5TCID50/ml)3ml(由中国动物疫病控制中心提供),每日测温并观察21日。对照猪均发病(发病的判定标准:①至少3日体温在41℃以上;或出现精神食欲下降,眼结膜炎,咳嗽、喘等呼吸道症状。②大体剖检,肺部出现片状实变。符合以上2条,即可判为发病),且至少2头死亡;免疫猪应至少4头保护。
Claims (3)
1.一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗耐热冻干保护剂,其特征是由下述重量百分比的物质混配而成:明胶1~2%、海藻糖4~6%、胰蛋白胨1~2%、酶解酪蛋白1~2%、聚乙烯吡咯烷酮1~2%、磷酸氢二钾0.164%、磷酸二氢钾0.052%、山梨醇1%、谷氨酸钠1%、精氨酸盐1%,余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征疫苗耐热冻干保护剂的制备方法,各组分按重量百分比计,其特征是按以下几个步骤进行:(1)将1~2%明胶、4~6%海藻糖、1~2%胰蛋白胨、1~2%酶解酪蛋白、1~2%聚乙烯吡咯烷酮、0.164%磷酸氢二钾、0.052%磷酸二氢钾溶于部分蒸馏水中,在110~116℃灭菌30分钟;(2)将1%山梨醇、1%谷氨酸钠、1%精氨酸盐溶于剩余的蒸馏水中,并用孔径0.22μm滤膜过滤除菌;(3)将上述第(1)步、第(2)步制得的两种溶液混合,制得耐热冻干保护剂;使用时按耐热冻干保护剂与病毒抗原液比为1∶1混合,分装后再进行冷冻干燥。
3.根据权利要求2的制备方法,其特征是配制好疫苗后,根据以下要求进行冻干:首先将冻干机预冷至-5℃,将分装好的疫苗装入冻干机箱体内,再以1℃/min的速度降温至-45℃,在此温度下维持3~4个小时后,开始抽真空至1Pa后,再开始缓慢升温,14~18小时内升至0℃,之后以每小时5~8℃的速度升温至25℃,维持4~6小时加塞出箱;冻干全程为25~32小时。
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