CN105497904B - 一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶2‑6％、乳糖0.2‑4％、蔗糖2‑5％、植物多糖0.1‑0.5%、山梨醇1‑3%、L‑谷氨酸1‑1.5％、L‑组氨酸0.1‑1％、维生素C 0.2‑0.5%、维生素E 0.1‑0.3%、无水磷酸二氢钾1‑2%、叔丁醇0.5‑1%、人血清白蛋白0.1‑1％，余量为注射用水。本发明还提供了该伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法。本发明伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂具有能够显著延长疫苗在2‑8℃以及在36℃下的保存期，此外其制备方法简单，便于生产应用。

Description

一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗助剂领域，具体涉及一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法。
背景技术
本发明所涉及重组伪狂犬病毒，保藏于中国典型培养物培养中心、保藏号为：CCTCC-V201408，可用于制备猪伪狂犬病防治用疫苗。
目前，在我国兽用生物制品中，活的冻干疫苗占相当大的比例，国内常用的保护剂主要为牛奶、蔗糖、明胶等，组方简单，保护功能差。如果在 2℃～ 8℃条件下，保存期只有4～6月，多需要在-15℃以下保存。加上国内传统的兽用生物制品保护剂的研制相对滞后，使成品的长期保存和运输受限。所以，耐热冻干保护剂的研究是非常急需的，在20世纪80年代，发达国家就已开始进行耐热冻干保护剂的研究。我国在耐热冻干保护剂方面的研究起步较晚，加上中国市场巨大，国外生物制品涌入，市场竞争加剧。为了本国生物制品业的生存和发展，新型有效的耐热冻干保护剂的研究和应用显得尤为迫切。
中国专利申请201310553466.X公开了一种动物活疫苗耐热冻干保护剂，各成分含量为：乳糖 80-200g/L、水解乳白蛋白 10-40g/L、聚乙烯吡咯烷酮 5-20g/L、甘露醇 0-20g/L、谷氨酸钠 5-20g/L、精氨酸盐酸盐5-15g/L、水解蚕丝蛋白 10-30g/L，制得的疫苗安全无菌、质量稳定，具有耐热、保存时间长的特点，解决了疫苗在运输过程中需要低温冷冻、贮存不便等问题。但该保护剂在36℃温度下保存时间不长。
因此，有必要提供一种在较高温度和低温下保存时间长，病毒损失率低，耐老化程度高的耐热冻干保护剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外观良好，病毒损失率低，耐老化程度高，保存期长的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，相应地，本发明还提供该耐热冻干保护剂的制备方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶2-6％、乳糖0.2-4％、蔗糖2-5％、植物多糖0.1-0.5%、山梨醇1-3%、L-谷氨酸1-1.5％、L-组氨酸0.1-1％、维生素C 0.2-0.5%、维生素E 0.1-0.3%、无水磷酸二氢钾1-2%、叔丁醇0.5-1%和人血清白蛋白0.1-1％，余量为注射用水。
优选地，所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶2％、乳糖0.2％、蔗糖2％、植物多糖0.1%、山梨醇1%、L-谷氨酸1％、L-组氨酸0.1％、维生素C 0.2%、维生素E0.1%、无水磷酸二氢钾1%、叔丁醇0.5%和人血清白蛋白0.1％，余量为注射用水。
优选地，所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶6％、乳糖4％、蔗糖5％、植物多糖0.3%、山梨醇3%、L-谷氨酸1.5％、L-组氨酸1％、维生素C 0.5%、维生素E0.3%、无水磷酸二氢钾2%、叔丁醇1%和人血清白蛋白1％，余量为注射用水。
优选地，所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶4％、乳糖2％、蔗糖3.5％、植物多糖0.5%、山梨醇2%、L-谷氨酸1.5％、L-组氨酸0.5％、维生素C 0.4%、维生素E0.2%、无水磷酸二氢钾1.5%、叔丁醇0.8%和人血清白蛋白0.5％，余量为注射用水。
优选地，所述伪狂犬病病毒为重组伪狂犬病病毒，所述重组伪狂犬病病毒保藏于中国典型培养物培养中心，保藏号为：CCTCC-V201408。
优选地，所述植物多糖由黄芪多糖和香菇多糖按（1-1.5）：（0.5-1）的重量比组成。
优选地，所述保护剂还包括以下重量百分数的组分：天冬氨酸0.5-1%。
相应地，本发明还提供了一种所述伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：
a.取水解明胶、乳糖、蔗糖、植物多糖、山梨醇、无水磷酸二氢钾和叔丁醇溶于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的2/5-4/5，然后在115-125℃的温度下进行灭菌处理15-25min，得到溶液A；
b.取L-谷氨酸、L-组氨酸、维生素C、维生素E以及人血清白蛋溶于剩余部分的注射用水中，用孔径为0.15-0.20μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
c.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B按1:1的体积比混合，即得产品。
优选地，在所述b步骤中加入天冬氨酸。
优选地，所述a步骤中，在115℃的温度下进行灭菌处理15min，所述b步骤中，滤膜孔径为0.20μm。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明耐热冻干保护剂能够使疫苗在 2-8℃下保存期由原来的 1 年提高到2年,保存时间显著延长。
（2）本发明耐热冻干保护剂保护的冻干产品（疫苗），耐热后病毒含量仅下降约0.1-0.2个滴度，现有的耐热冻干保护剂下降0.8个滴度。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
具体实施方式
本发明部分组分的厂家和货号等信息如下：
组分 厂家 CAS号
水解明胶 厦门华烜明胶有限公司 68410-45-7
乳糖 上海鼓臣生物技术有限公司 63-42-3
蔗糖 上海鼓臣生物技术有限公司 57-50-1
黄芪多糖 上海万疆生物技术有限公司 89250-26-0
香菇多糖 陕西斯诺特生物技术有限公司 37339-90-5
山梨醇 上海鼓臣生物技术有限公司 5989-81-1
L-谷氨酸 上海鼓臣生物技术有限公司 56-86-0
L-组氨酸 上海鼓臣生物技术有限公司 71-00-1
维生素C 西安迪诺生物科技有限公司 50-81-7
维生素E 上海鼓臣生物技术有限公司 59-02-9
无水磷酸二氢钾 上海鼓臣生物技术有限公司 14265-44-2
叔丁醇 上海鼓臣生物技术有限公司 75-65-0
人血清白蛋白 上海鼓臣生物技术有限公司 70024-90-7
实施例1 一种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂
所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶2％、乳糖0.2％、蔗糖2％、植物多糖0.1%、山梨醇1%、L-谷氨酸1％、L-组氨酸0.1％、维生素C 0.2%、维生素E 0.1%、无水磷酸二氢钾1%、叔丁醇0.5%和人血清白蛋白0.1％，余量为注射用水，其中，所述植物多糖由黄芪多糖0.05%和香菇多糖0.05%组成。
制备方法：
a.取水解明胶、乳糖、黄芪多糖、香菇多糖、蔗糖、山梨醇、无水磷酸二氢钾和叔丁醇溶于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的2/5，然后在115℃的温度下进行灭菌处理15min，得到溶液A；
b.取L-谷氨酸、L-组氨酸、维生素C、维生素E以及人血清白蛋溶于剩余部分的注射用水中，用孔径为0.20μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
c.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B按1:1的体积比混合，即得产品。
实施例2 一种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂
所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶6％、乳糖4％、蔗糖5％、植物多糖0.3%、山梨醇3%、L-谷氨酸1.5％、L-组氨酸1％、天冬氨酸0.6%、维生素C 0.5%、维生素E0.3%、无水磷酸二氢钾2%、叔丁醇1%和人血清白蛋白1％，余量为注射用水，其中，所述植物多糖由黄芪多糖0.2%和香菇多糖0.1%组成。
制备方法：
a.取水解明胶、乳糖、黄芪多糖、香菇多糖、蔗糖、山梨醇、无水磷酸二氢钾和叔丁醇溶于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射水总量的3/5，然后在115℃的温度下进行灭菌处理15min，得到溶液A；
b.取L-谷氨酸、L-组氨酸、天冬氨酸、维生素C、维生素E以及人血清白蛋溶于剩余部分的注射用水中，用孔径为0.20μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
c.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B按1:1的体积比混合，即得产品。
实施例3一种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂
所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶4％、乳糖2％、蔗糖3.5％、植物多糖0.5%、山梨醇2%、L-谷氨酸1.5％、L-组氨酸0.5％、天冬氨酸1%、维生素C 0.4%、维生素E0.2%、无水磷酸二氢钾1.5%、叔丁醇0.8%和人血清白蛋白0.5％，余量为注射用水，其中，所述植物多糖由黄芪多糖0.3%和香菇多糖0.2%组成。
制备方法如实施例2。
对比例1 一种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂
所述植物多糖为黄芪多糖，其余成分如实施例2。
制备方法参考实施例2。
对比例2一种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂
所述植物多糖由黄芪多糖0.1%和香菇多糖0.2%组成。
制备方法参考实施例2。
对比例3一种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂
所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶6％、乳糖4％、蔗糖5％、植物多糖0.3%、山梨醇3%、L-谷氨酸1.5％、L-组氨酸1％、天冬氨酸0.6%、维生素E0.3%、无水磷酸二氢钾2%、叔丁醇1%、人血清白蛋白1％，余量为注射用水，其中，所述植物多糖由黄芪多糖0.2%和香菇多糖0.1%组成。
制备方法参考实施例2。
性能测试
1.制苗用毒液的制备
1.1材料
1.1.1病毒和细胞
重组伪狂犬病病毒rPRV-ORF2为发明人自主构建与保存，该重组伪狂犬病病毒保藏在中国典型培养物培养中心、保藏号为：CCTCC-V201408；该重组伪狂犬病病毒可有效表达PCV2的ORF2基因，可用于制备PCV2-PRV二联基因工程疫苗。ST细胞购自中国兽药监察所。
1.1.2血清、培养基和胰蛋白酶类试剂
胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司，胰蛋白酶为Sigma公司产品。氯化钠、氯化钾、葡萄糖、NaHCO3、EDTA为分析纯试剂。
1.1.3试验动物与抗体检测试剂盒
35日龄PRV抗体阴性、PCV2抗体阴性断奶仔猪购自新兴某猪场，PRVgB抗体检测试剂盒为IDEXX公司产品，PCV2抗体检测试剂盒为武汉科前公司产品。
1.2制备方法
选用生长良好单层ST细胞，倾去细胞生长液，加入0.3‰重组病毒rPRV-ORF2病毒液，37℃吸附1h后，加入适量细胞维持液(2％FBS的DMEM)，37℃继续培养，当全部细胞出现CPE时，冻融收获病毒，置-80℃以下保存备用。
耐热保护剂配方的确定
取实施例1-3和对比例1-3的耐热冻干保护剂，将各配方保护剂分别与上述rPRV-ORF2病毒悬液以1∶1混合配苗分装，3mL/瓶，按照设计的冻干曲线进行冻干试验，冻干后测定病毒滴度，筛选出最佳的耐热保护剂配方，确定为生产条件。产品在-80℃预冻过夜后，转入CHRIST公司的ALPHA1-4冻干机的冻干箱内，探索主干燥时的真空度及干燥时间，测试结果见表1。
表1 本发明实施例1-3以及对比例1-3冻干前后疫苗的毒价(TCID50/瓶)
结论：各试验组冻干后，疫苗外观良好，微黄色海绵状疏松团块，体积略有萎缩，疫苗脱离瓶壁，无结晶，其中，实施例2效果最好，冻干前疫苗滴度为107.78TCID50/瓶，冻干后疫苗滴度为105.64 TCID50/瓶，冻干后疫苗滴度仅下降了0.2个滴度，对比例1-3组由于缺少了某个成分，其冻干后疫苗滴度与冻干前相比均具有明显下降。同时确定主干燥真空度为0.14-0.16mbar、主干燥时间约为6-7h，冷凝器温度为-55℃。
PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的生产
按上述筛选出的实施例2作为最佳保护剂配方配制保护剂，与rPRV-ORF2病毒悬液按1∶1混合配苗分装，生产3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗，分别批号为：20120501，20120502，20120503。
PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的安全性检验与毒价测定。
3.1.1疫苗的安全性检验：将上述三批疫苗注射35日龄PRV抗体阴性与PCV2抗体阴性的健康断奶仔猪5头，颈部肌肉注射10头份/头，连续观察局部及全身性不良反应21日，连续21如观察临床症状及进行测定体温，所有接种猪均无临床症状及无体温升高。
3.1.2疫苗的毒价测定：以ST细胞按Reed-Muench两氏法测定与计算疫苗滴度TCID50，测得冻干前疫苗滴度为107.58TCID50/瓶。
3.1.3疫苗的耐老化试验和保存期试验。
耐老化试验方法： 在上述3批疫苗中每批随机抽取疫苗5瓶于37℃存放7d后测定其TCID50，并观察物理性状，判断疫苗的热稳定性。
保存期试验方法：在上述3批疫苗中每批随机抽取疫苗5瓶于2℃-8℃保存2年。试验结果如表2
表2 3批疫苗耐老化试验和保存期试验
由上表可知，5瓶疫苗在37℃放置7天的耐老化试验后，物理性状良好，每瓶疫苗的病毒滴度仅下降0.1-0.2个滴度，在于2℃-8℃保存2年，疫苗病毒含量均无明显下降，可见该配方能有效提高疫苗的保存期。
3.1.4 疫苗的效力试验
将3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗，于37℃保存7天后，分别免疫35日龄PRV抗体与PCV2抗体双阴性健康断奶仔猪5头，免疫剂量1头份，颈部肌肉注射，2周后二免，首免后2周与二免后2周分别采血，分离血清，用PRVgB抗体检测试剂盒与PCV2抗体检测试剂盒分别测定PRV抗体与PCV2抗体。PRV gB抗体检测试剂盒判断标准：S/N值大于0.7为阴性，小于0.6为阳性，位于两者之间为可疑；PCV2抗体检测试剂盒判断标准：OD630值大于0.42为阳性，小于0.38为阴性，位于两者之间为可疑。
试验结果：PRV gB抗体检测：3批疫苗免疫猪在首免后2周，除一头可疑外，其它均转阳，二免后2周所有免疫猪全部转阳； PCV2抗体检测：本实验3批疫苗免疫猪在首免后2周，除一头阴性外，其它均转阳，二免后2周所有免疫猪全部转阳，且二免后2周的抗体平均值显著高于一免后2周，结果说明，本发明耐热冻干保护剂中的各种成分及在有效的保存时间内并不影响疫苗的免疫效力，二免后2周，所有免疫猪均能产生高水平的ELISA抗体。
综上所述，本研究筛选到的冻干保护剂配方是一个很好耐热冻干保护剂，可以用于重组伪狂犬病病毒活疫苗产品的冻干。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶2％、乳糖0.2％、蔗糖2％、植物多糖0.1%、山梨醇1%、L-谷氨酸1％、L-组氨酸0.1％、维生素C 0.2%、维生素E 0.1%、无水磷酸二氢钾1%、叔丁醇0.5%和人血清白蛋白0.1％，余量为注射用水，其中，所述植物多糖由黄芪多糖0.05%和香菇多糖0.05%组成。
2.一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶6％、乳糖4％、蔗糖5％、植物多糖0.3%、山梨醇3%、L-谷氨酸1.5％、L-组氨酸1％、天冬氨酸0.6%、维生素C 0.5%、维生素E0.3%、无水磷酸二氢钾2%、叔丁醇1%和人血清白蛋白1％，余量为注射用水，其中，所述植物多糖由黄芪多糖0.2%和香菇多糖0.1%组成。
3.一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶4％、乳糖2％、蔗糖3.5％、植物多糖0.5%、山梨醇2%、L-谷氨酸1.5％、L-组氨酸0.5％、天冬氨酸1%、维生素C 0.4%、维生素E 0.2%、无水磷酸二氢钾1.5%、叔丁醇0.8%和人血清白蛋白0.5％，余量为注射用水，其中，所述植物多糖由黄芪多糖0.3%和香菇多糖0.2%组成。
4.一种根据权利要求2-3任一所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.取水解明胶、乳糖、蔗糖、植物多糖、山梨醇、无水磷酸二氢钾和叔丁醇溶于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的2/5-4/5，然后在115-125℃的温度下进行灭菌处理15-25min，得到溶液A；
b.取L-谷氨酸、L-组氨酸、维生素C、维生素E以及人血清白蛋溶于剩余部分的注射用水中，用孔径为0.15-0.20μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
c.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B按1:1的体积比混合，即得产品。
5.根据权利要求4所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于，在所述b步骤中加入天冬氨酸。
6.根据权利要求4所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述a步骤中，在115℃的温度下进行灭菌处理15min，所述b步骤中，滤膜孔径为0.20μm。
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