CN101474410A - 一种动物用活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种动物用冻干活疫苗耐热冻干保护剂，包含：明胶1－3％、乳糖1－8％等等，其中各物质均为干物质组分，百分比剩余份均为蒸馏水。本发明还提供所述保护剂的制备方法。利用本发明的保护剂所制备的ND活疫苗，在放在2－8℃可保存24个月以上。并且经过免疫试验发现：被免疫的鸡的平均抗体水平比用普通保护剂冻干的ND活疫苗免疫的试验鸡的平均抗体水平高1－2个滴度，并且抗体水平均匀整齐。因此本发明的冻干保护剂可广泛用于各种动物用活疫苗制剂的生产及其保存，具有广泛地应用前景。

Description

一种动物用活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及冷冻生物学领域，具体的说是涉及一种动物用冻干活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法。

背景技术

有关冻干保护剂的研究集中于医学、生物学领域，是冷冻生物学分支的主要内容之一。但是耐热冻干保护剂的研究和应用属于专利资料，处于保密状况。国外有关此方面的研究远远领先于我国。

在医学生物制品领域，1951年Fry报道用5-10％葡萄糖作为大肠杆菌的保护剂，所得的活菌数较高。而且在保存过程中的存活率较高，这主要是葡萄糖内含结晶水，活菌不易死亡。Grerff对流感等多种病毒所作的冻干研究证明，用碱盐培养基(BSM)加1％乳糖醛酸钙和1％人白蛋白作保护剂的效果最好。在研究麻疹疫苗稳定性时，比利时Peetermans用蔗糖及4倍的Eagle氏培养基中的氨基酸作保护剂效果最好。其冻干商品名称为“Rimevax”，4℃可保存2年，20-25℃1个月，37℃至少保存14天仍有效，被认为是目前世界上最为稳定的冻干麻疹疫苗之一。在世界卫生组织支持下，英国的Mann等人从事了液体疫苗的保护剂研究。保护剂为蛋白水解物(Hy-Case)、蔗糖及磷酸钠。此种液体疫苗在37℃下保存的半衰期为13小时。麻疹病毒易被热和冻融灭活。吕加平等(1998)用蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糊精、山梨醇、甘油、侧金盏花醇、葡萄糖、甘露醇、三聚磷酸钠、焦磷酸钠、偏磷酸、磷酸甘油二钠、谷氨酸钠、右旋糖昔等材料对乳酸菌的冻干保护效果进行的比较研究表明，海藻糖、侧金盏花醇为最佳保护剂，其次为蔗糖、麦芽糊精、山梨醇、谷氨酸钠、脱脂乳、在以水和增菌液为基质中冻干保护效果显著，对乳球菌的保护效果优于乳杆菌。

科研人员发现，冻干技术在医药方面存在广泛的应用：(1)冻干技术在生物制品方面的应用：活疫苗，其他生物制品，生化制品等；(2)冻干技术在西药生产中的应用：常用冻干法生产的西药为针剂，以抗生素药，循环器官用药，中枢神经用药，维生素类和肿瘤用药为多。例如蛇毒抗栓酶，小牛胸腺肤，氨节青霉素钠，链霉素和利菌沙等；(3)冻干技术在中药生产方面的应用：常用冻干法加工的中草药有人参、鹿茸、鹿鞭、冬虫夏草、山药、灵芝、地黄等。近几年开始用冻干瓶加工中成药，将配制好的中成药，经过浸渍、提取、过滤、浓缩、冻干后再制成粉、片或针剂，解决了吃汤药和中药治急病见效慢的问题。

其中，在疫苗制品的领域中，冻干保护剂及其制备工艺是活疫苗生产中的一项关键技术，对疫苗的保存、运输和使用有很大影响。目前，在我国兽用疫苗中，活的冻干疫苗占相当大的比例，国内常用的保护剂主要为牛奶、蔗糖、明胶等，组方简单，保护功能差。这些传统的保护剂冻干的疫苗，要求保存在-15℃以下，给生产厂家及使用者造成很大不便，使成品疫苗的长期保存和运输受限。且可能由于疫苗保存不当造成疫苗失活，效力降低，达不到防疫目的，造成巨大经济损失。

耐热冻干保护剂比常规的冻干保护剂更周到地考虑了具有生物活性的制品在较高温度和较长保存时间的情况下，冻干物质可能产生的物理和化学变化对活疫苗存活的影响，因而其保护性能要比传统保护剂更为优良，使活疫苗可在有效期内保存在2-8℃条件下，即使是较高的常温甚至37℃也可以保存几十天，因此使活疫苗的储存、运输和使用都更方便、经济。冻干保护剂的保护功能主要跟两个方面的因素有很大的关系。一是微生物因素，微生物的种类和其本身结构差异(如病毒有无囊膜)、培养方法以及疫苗种类等方面决定了不同种类疫苗的保护剂的配方也应不同；二是保护利用的组方因素，如何护剂原料及其性质、配比、冻干曲线。耐热冻干保护剂的组方要根据以上二者主要因素，选择组方，合理搭配，并反复验证，制定合理的冻干曲线。产品冻干以后，对其物理性状进行保存期试验，并将样品放置在不同温度下进行保存期长短及效价测定、安全性检验等对比试验。根据试验结果，不断调整配方及冻干曲线，以达到理想的效果。

目前，在我国兽用疫苗中，活的冻干疫苗占相当大的比例，国内常用的保护剂主要为牛奶、蔗糖、明胶等，组方简单，保护功能差。如果在2℃-8℃条件下，保存期只有4-6月，多需要在-15℃以下保存。加上国内传统的兽用生物制品保护剂的研制相对滞后，使成品疫苗的长期保存和运输受限。所以，耐热冻干保护剂的研究是非常急需的，在20世纪80年代，发达国家就已开始进行耐热冻干保护剂的研究。我国在耐热冻干保护剂方面的研究起步较晚，但现在在这方面的研究取得了一定的成果，傅德霞等(1997)将明胶蔗糖保护剂用于鸡新城疫弱毒冻干苗和鸡传染性支气管炎弱毒冻干苗，其免疫效果等与牛奶蔗糖保护剂基本相同。王仁耕等(1989)对鸡新城疫I系冻干苗的耐热保护剂的研究表明，2-8℃保存24个月能够达到《规程》标准，主要为牛奶、蔗糖、谷氨酸钠、甘露醇等。沈铭强等(1990)对狂犬病冻干苗耐热保护剂进行了研究，以蔗糖、牛奶、EDTA、甘露醇等材料为主，经2-8℃保存有效期为一年。李道义等(1996)进行了猪瘟冻干苗保护剂的研究，主要成分为CHO、谷氨酸钠、牛血清、脱脂牛奶等，4-8℃保存15-24个月，25℃100天，37℃巧夭，经检验，物理性状、真空度、水分、安全效力等测定达部颁标准。王栋等(2002)已经研制出一种耐热冻干保护剂，用此保护剂冻干的疫苗在2℃-8℃条件下，保存24个月以后，病毒滴度无明显下降，但仍未达到全面推广应用。

而国际上发达的国家兽医生物冻干制品几乎全部是2-8℃保存24个月以上，但未见方法的详细报道。中国专利CN1176827A“一种动物用冻干活疫苗的制造方法”提出了采用以聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠，罗望子胶，谷氨酸钠，海藻糖等为主要基质冻干保护剂的配方制成的冻干保护剂，采用与之相适应的冻干曲线与鸡新城疫病毒抗原制成冻干活疫苗的方法，该苗在2-8℃条件下可长期保存。

由于冻干保护剂可影响生物制品的质量、效价和稳定性，改变生物制品的生产工艺，提高产品预测能力并增大产品批次间的稳定性，并且耐热冻干保护剂有免疫活性但无药理活性，可在冻干和保存时维持疫苗的稳定性，初次干燥时在适宜的温度下疫苗不倒塌，企业低成本即可获取。基于这种情况，目前需要提供一种动物用冻干活疫苗耐热冻干保护免疫增强剂及其制备工艺，降低保存条件，延长保存期，降低使用成本及其提高疫苗的免疫效力。

发明内容

本发明第一个发明目的是提供一种动物用活疫苗耐热冻干保护剂，包含：明胶1-3％、乳糖1-8％等等，其中各物质均为干物质组分，百分比剩余份均为蒸馏水。

在一个具体实施方案中，所述的冻干保护剂还包含其它物质。

本发明第二个发明目的是提供一种动物用活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括：

4)对可高压灭菌的明胶、乳糖等组分按各自比例溶于耐热冻干保护剂总量的1/2蒸馏水中，121℃灭菌15分钟；

5)将不耐高压的物质组份按各自的比例溶于耐热冻干保护剂总量的1/2蒸馏水中，用微孔滤膜过滤除菌；

6)分别完成除菌后把两种成分混合，即为耐热冻干保护剂。

在一个具体实施方案中，其中在使用所述的耐热冻干保护剂时，按某种比例加入病毒抗原液中，分装后进行冷冻干燥。其中，所适用的病毒抗原可以是新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原、法氏囊病抗原、禽流感病毒抗原等等。

有益效果

1、保持生物物质活性：防止生物活性物质失去结构水；防止结构水形成，造成生物活性物质的分子损坏；一些含经基的保护剂，能代替部分结构水，与蛋白质中的拨基或氨基结合，保持其三级和四级结构。

2、为活细胞(细菌)提供稳定环境：降低细胞内外的渗透压差，防止细胞膜的损坏；防止因细胞内的水结晶而对细胞膜或其它生物成分产生的应力，以致改变膜或分子的立体结构。

3、如果保护剂系细胞(细菌)的营养物质，还可使细胞在复苏时能迅速修复细胞膜所受的损伤。本发明的耐热冻干保护剂对动物免疫时可以促进抗原提升，提高疫苗的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫应答，显著提高免疫水平。

4、最重要的，本发明的耐热冻干保护剂活疫苗在2-8℃条件下可保存24个月以上，能达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》规定的各项指标。

具体实施方法

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1：耐热冻干保护剂的制备

一种动物用冻干活疫苗耐热冻干保护免疫增强剂，包括常用的明胶、乳糖等，其特征是耐热冻干保护剂的物质组分配比有所改动：明胶1-3％、乳糖1-8％等等；各物质均为干物质组分，百分比剩余份均为蒸馏水。

制备过程如下：

包括将上述耐热保护免疫增强剂的干物质组份按比例混合，其特征是对耐热冻干保护剂的有效物质组份分别进行除菌处理：(1)对可高压灭菌的明胶、乳糖等组分按各自比例溶于耐热冻干保护剂总量的1/2蒸馏水中，121℃灭菌15分钟；(2)将不耐高压的物质组份按各自的比例溶于耐热冻干保护剂总量的1/2蒸馏水中，用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌；分别完成除菌后把两种成分混合，即为耐热冻干保护剂，使用时按某种比例加入病毒抗原液中，分装后进行冷冻干燥。

实施例2：耐热冻干保护剂的无菌测试

将常规培养基采用121℃高压蒸汽灭菌15分钟的方法，然后室温冷却。在无菌操作台上，将耐热冻干保护剂按1:1、1:10、1:100等系列梯度进行接种，而后将全部培养基放入36±1℃恒温箱培养过夜，同时设立对照。

24-72小时后，各梯度的培养基均无菌落产生，而对照培养基上出现大量菌落，说明所制备的耐热冻干保护剂经除菌后，无菌检验呈阴性。

实施例3：耐热冻干保护剂毒理测试

按产品当中含耐热冻干保护剂的10倍量，对7日龄健康雏鸡分别进行饮水、滴鼻、点眼及其皮下注射各10只，观察21天，结果如表1

 

雏鸡(7d)，共40只	死亡或病症	正常	致死率
				饮水/10只	0	10	0％
滴鼻/10只	0	10	0％
				点眼/10只	0	10	0％
皮下注射/10只	0	10	0％

结果发现：雏鸡全部健活，无任何不良反应。

实施例4：耐热冻干保护剂的其它理化参数

所用的保护剂，其冻干周期不超过42小时。

产品的物理性状、无菌检验、支原体检验、鉴别检验、外源病毒检验、安全检验、剩余水分测定和真空度测定均按《中华人民共和国受用生物制品规程》的方法及标准进行。

实施例5：耐热冻干保护剂的免疫活性

(新城疫ND活疫苗为例，根据常规方法，制备含有本发明的耐热冻干保护剂的疫苗制剂，而后测试疫苗的免疫活性

测定方法：

1、用灭菌的生理盐水按实含病毒液的量作10倍系列稀释，取3个适宜的稀释度，分别尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，0.1ml/枚，置37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48-120小时死亡的鸡胚，随时取出，收获鸡胚液，将同一稀释度的鸡胚液等量混合，分别测定红细胞凝集价。至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1∶128(微量法)者判为感染，计算EID₅₀。

2、按瓶签注明的羽份，将疫苗用灭菌的生理盐水稀释至1羽份/0.1ml，再作10倍系列稀释，其它方法同上。

测试结果：

1、冻干后病毒损失率≤0.2个滴度。

2、冻干后每羽份病毒含量≥10^6.5EID₅₀。

3、产品放在37℃保存7天，病毒含量下不超过1个滴度。

4、产品放在2-8℃保存24个月，每羽份病毒含量≥10^6.0EID₅₀。

5、用耐热冻干保护剂冻干的ND活疫苗免疫的试验鸡的平均抗体水平比用普通保护剂冻干的ND活疫苗免疫的试验鸡的平均抗体水平高1-2个滴度，并且抗体水平均匀整齐。

Claims (4)

1、一种动物用活疫苗耐热冻干保护剂，包含：明胶1-3％、乳糖1-8％等等，其中各物质均为干物质组分，百分比剩余份均为蒸馏水。

2、用于制备权利要求1的保护剂的方法。

3、权利要求2的方法，包括：

1)对可高压灭菌的明胶、乳糖等组分按各自比例溶于耐热冻干保护剂总量的1/2蒸馏水中，121℃灭菌15分钟；

2)将不耐高压的物质组份按各自的比例溶于耐热冻干保护剂总量的1/2蒸馏水中，用微孔滤膜过滤除菌；

3)分别完成除菌后把两种成分混合，即为耐热冻干保护剂。

4、权利要求3的方法，其中在使用所述的耐热冻干保护剂时，按某种比例加入病毒抗原液中，分装后进行冷冻干燥。