DE69923470T2

DE69923470T2 - Kombinationsimpfstoff gegen hav und masernvirus und verfahren zu seiner produktion

Info

Publication number: DE69923470T2
Application number: DE1999623470
Authority: DE
Inventors: Pengfu Wang; Jingye Liu; Guangpu Li; Yifan Nan; Meihua Wang; Wei Wang; Jianjun Guo; Baosheng Xie; Zongming Song; Cuibo Qu; Lisha Liu; Jinfeng Huang; Zongju Wan
Original assignee: Changchun Institute of Biological Products
Current assignee: Changchun Institute of Biological Products
Priority date: 1998-11-12
Filing date: 1999-10-13
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2019-10-14
Also published as: EP1129723A4; CN1062770C; ATE287726T1; AU6323599A; US6562350B1; CN1217212A; DE69923470D1; KR20010101005A; EP1129723A1; EP1129723B1

Description

Gegenstand der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Kombinationsimpfstoff, seine Herstellung und seine Verwendung, insbesondere auf kombinierte Impfstoff-Formulierungen für Hepatitis A-Masern, die prophylaktisch wirksame Titer des Hepatitis A-Virus (HAV) und des Masernvirus (MV) als Virus-Komponenten sowie stabilisierende Komponenten, die die Virus-Komponenten effektiv stabilisieren, enthalten. Der Kombinationsimpfstoff bewirkt keinerlei Störungen des Immunsystems und der Immunogenität der beiden Virus-Arten und besitzt eine hervorragende Lagerfähigkeit, so dass der Kombinationsimpfstoff bei Raumtemperatur über einen langen Zeitraum aufbewahrt werden kann und für die Empfänger, insbesondere für Kleinkinder und jüngere Kinder, zur Vorbeugung gegen diese beiden Krankheiten eingesetzt werden kann. Die vorliegende Erfindung bezieht sich darüber hinaus auf ein Verfahren zur Herstellung der Kombinationsimpfstoffe, die gefriergetrocknet oder nicht gefriergetrocknet vorliegen, durch Vermischen der beiden Virus-Arten oder durch Züchten der zwei unterschiedlichen Virus-Arten auf dem gleichen diploiden Zellsubstrat.
Hintergrund der Erfindung
Es ist wohlbekannt, dass die Immunisierung eine der erfolgreichsten und kostengünstigsten Methoden der modernen Medizin ist, um vor einer übertragbaren Krankheit zu schützen. Um eine vollkommene Kontrolle der gesamten Schutzimpfungskette zu erreichen und zu einer wachsenden sozialen Akzeptanz und einem zunehmenden Einsatz von Impfstoff in allen Ländern und Regionen, insbesondere den Entwicklungsländern und Entwicklungsgebieten, zu kommen, müssen Maßnahmen ergriffen werden, welche die Bereitstellung von neuen, polyvalenten, stabileren und kostengünstigeren Impfstoffen umfassen. Mit diesem Ziel wurden seit der Gründung von „Children's Vaccine Initiative" (CVI) durch das Kinderhilfswerk der Vereinten Nationen (UNICEF) und die Weltgesundheitsorganisation (WHO) im Jahre 1991 in vielen Laboratorien weltweit enorme Entwicklungsanstrengungen zur Entwicklung neuer Impfstoffe sowie Impfstoffe mit einer größeren Stabilität unternommen. Dabei wurde ein Hauptaugenmerk darauf gerichtet, Impfstoffe durch die Entwicklung von Kombinationsimpfstoff und die Einführung von weniger aggressiven Impfverfahren benutzerfreundlicher zu machen.
Die Verbreitung von Kombinationsimpfstoffen hat die Anzahl der Impfstoffe und deren Herstellungskosten reduziert und das Immunitätsniveau gegenüber Krankheiten erhöht; so wurde die Versorgung mit Impfstoff weltweit, insbesondere in den Entwicklungsländern einschließlich China, stark erhöht.
Viele Kombinationsimpfstoffe sind zugelassen worden und werden für Verfahren zur Immunisierung eingesetzt, beispielsweise umfasste in den letzten Jahrzehnten ein routinemäßiges Programm zur Impfung von Kleinkindern und Kindern die Immunisierung mit einem abgeschwächten lebenden Dreifachimpfstoff (MMR) für Masern, Mumps und Röteln sowie mit einem abgeschwächten lebenden Dreifachimpfstoff (DTP) für Diphtherie, Tetanus und Keuchhusten und so weiter. Neuerdings wurde ein Haemophilus B-Ergänzungsimpfstoff, der beim Wiederaufbau mit Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden und nichtzellularem Keuchhusten-Impfstoff (DTaP-Hib) kombiniert wurde, als Vierfachpräparat für den Einsatz bei Impfserien für Kinder von der Zulassungsbehörde für Lebensmittel und Arzneimittel (FDA) in den Vereinigten Staaten freigegeben. Auch wird TriHIBit (Schutzmarke) der erste Impfstoff sein, der in den USA als Kombinationsimpfstoff freigegeben wurde, der PTaP mit einem Haemophilus B-Ergänzungsimpfstoff kombiniert. Jedoch gibt es keine Berichte über Kombinationsimpfstoffe, die den Hepatitis A-Virus und den Masernvirus umfassen, sowie über Verfahren zur Herstellung von Kombinationsimpfstoffen durch Züchten von zwei oder mehreren verschiedenen Virusarten auf demselben Zellsubstrat.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern (HM) zur Verfügung, der prophylaktisch wirksame Titer eines abgeschwächten lebenden Hepatitis A-Virus und prophylaktisch wirksame Titer eines abgeschwächten lebenden Masernvirus enthält und mit dessen Hilfe, mit oder ohne Stabilisatoren für die Virusarten, die Infektion durch einen Hepatitis A-Virus und einen Masernvirus verhindert werden kann, ohne dass irgendeine gegenseitige Beeinflussung der Fähigkeit der beiden Virusarten, als Antigen zu wirken, durch das Vermischen oder gemeinsame Züchten bewirkt wird.
Bei dem erfindungsgemäße Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern betragen die lebenden Titer des Hepatitis A-Virus nicht weniger als 10^6.0 CCID₅₀/ml (50% infektiöse Dosis Zellkultur pro ml Virus-Bestand) und die lebenden Titer des Masernvirus nicht weniger als 10^3.5 CCID₅₀/ml.
Von der vorliegenden Erfindung wird umfasst, dass der Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern sowohl in gefriergetrockneter Form als auch in nicht gefriergetrockneter Form zur Verfügung gestellt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus einen stabilisierten Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern zur Verfügung, der Virus-Bestandteile und Stabilisator-Bestandteile enthält, wobei die Virus-Bestandteile prophylaktisch wirksame Titer eines lebenden Hepatitis A-Virus und eines lebenden Masernvirus umfassen und die Stabilisator-Bestandteile im Wesentlichen aus 0 bis 2% (Gew./Vol.) eines Humanserumalbumin (HSA), 0.5 bis 1.1% (Gew./Vol.) Gelatine, 5 bis 10% (Gew./Vol.) Trehalose, 0.75 bis 1.5% (Gew./Vol.) Natriumglutamat, 0.05 bis 0.55% (Gew./Vol.) Ascorbinsäure, 0.5 bis 2.8% (Gew./Vol.) Harnstoff, 5 bis 10% (Gew./Vol.) Mannitol oder Sorbitol oder einer 1:1-Mischung aus beiden und aus 0.5 bis 1% (Gew./Vol.) Inositol, bezogen auf die Konzentrationen in der stabilisierten Impfstoff-Formulierung vor der Gefriertrocknung, bestehen, wobei der stabilisierte Kombinationsimpfstoff wahlweise gefriergetrocknet oder nicht gefriergetrocknet ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Kombinationsimpfstoffes für Hepatitis A-Masern zur Verfügung gestellt, das das Vermischen eines Vorratsmaterials eines abgeschwächten lebenden Hepatitis A-Virus, der lebende Titer von nicht weniger als 10^7.0 CCID₅₀/ml aufweist, mit einem Vorratsmaterial eines abgeschwächten lebenden Masernimpfstoffes, der lebende Titer von nicht weniger als 10^4.5 CCID₅₀/ml aufweist, in einem geeigneten Verhältnis umfasst, um auf diese Weise eine Vorratssuspension eines Kombinationsimpfstoffes zu erhalten, in der die lebenden Titer des besagten Hepatitis A-Virus nicht weniger als 10^6.5 CCID₅₀/ml und die lebenden Titer des besagten Masernvirus nicht weniger als 10^4.0 CCID₅₀/ml betragen.
Der so hergestellte Kombinationsimpfstoff ist ein brauchbarer Impfstoff, der ohne irgendeine Verringerung seiner immunogenen Wirkung und ohne irgendeine Verschlechterung seiner Eigenschaften eingesetzt werden kann, um Infektionen sowohl mit Hepatitis A als auch mit Masern zu verhindern. Darüber hinaus verursachte der Kombinationsimpfstoff aufgrund des Vermischens nie eine Störung der Fähigkeiten der Viren als Antigen zu wirken, was häufig beobachtet wird, insbesondere im Falle von Kombinationsimpfstoffen für Tiere.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Erfinder in der Lage, eine weitere Methode zur Herstellung des Kombinationsimpfstoffes für Hepatitis A-Masern zur Verfügung zu stellen, die die folgenden Schritte umfasst:

a) die Bereitstellung von Keim-Viren des jeweils zuvor hergestellten Hepatitis A-Virus bzw. Masernvirus;
b) Injizieren des aus Schritt (a) erhaltenen Keim-Virus des Hepatitis A-Virus in eine diploide Fibroblastenzellkultur einer menschlichen fötalen Lunge und das anschließende Züchten der Zellen, um den Virus fortzupflanzen;
c) Injizieren des im Schritt (b) erhaltenen Masernvirus auf die gleichen Zellschichten, auf denen sich der Hepatitis A-Virus fortgepflanzt hat, sobald die mit Hepatitis A positiv infizierten Zellen mehr als 75% betragen, wobei die Zellen kontinuierlich weiter gezüchtet werden;
d) zu dem Zeitpunkt, zu dem die mit Hepatitis A positiv infizierten Zellen mehr als 90% ausmachen, was über die Immunofluoreszenz (IF) bestimmt wird, und die mit Masernvirus positiv infizierten Zellen mehr als 90% ausmachen, was anhand des zytopathogenen Effektes (CPE) nachgewiesen wird, werden die mit den beiden Virusarten infizierten Zellen gewonnen und das Impfstoffstammmaterial, das die beiden Virusarten enthält, wird gesammelt, um auf diese Weise den gewünschten Kombinationsimpfstoff zu erhalten.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die positiven Infektionsraten der diploiden Zellen und die lebenden Titer des Hepatitis A-Virus über HAV-spezifische Bestimmungssysteme, die Immunofluoreszenz und die Bestimmung Enzym-gebunder Antikörper umfassen, bestimmt.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das oben definierte Verfahren zusätzlich ein geeignetes Vermischen des oben erhaltenen Vorratsmaterials des Kombinationsimpfstoffes für Hepatitis A-Masern mit einem Stabilisator für abgeschwächte lebende Impfstoffe im Verhältnis von ca. 1:1 und das anschließende Gefriertrocknen der erhaltenen Formulierung, um auf diese Weise ein gefriergetrocknetes Präparat des Kombinationsimpfstoffes für Hepatitis A-Masern zu erhalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht der besagte Stabilisator aus 0 bis 2% (Gew./Vol.) Humanserumalbumin, 0.5 bis 1.1% (Gew./Vol.) Gelatine, 5 bis 10% (Gew./Vol.) Trehalose, 0.75 bis 1.5% (Gew./Vol.) Natriumglutamat, 0.05 bis 0.55% (Gew./Vol.) Ascorbinsäure, 0.5 bis 2.8% (Gew./Vol.) Harnstoff, 5 bis 10% (Gew./Vol.) Mannitol oder Sorbitol oder einer 1:1-Mischung aus beiden und 0.5 bis 1% (Gew./Vol.) Inositol, bezogen auf die Konzentrationen in der gefriergetrockneten lebenden Impfstoff-Formulierung.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus noch ein Verfahren zur Herstellung von gefriergetrocknetem Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern zur Verfügung, das die folgenden Schritte umfasst:

a) die Bereitstellung von Stammmaterialien, die jeweils prophylaktisch wirksame Titer eines abgeschwächten lebenden Hepatitis A-Virus bzw. eines abgeschwächten lebenden Masernvirus enthalten, und ihr anschließendes Vermischen, um einen gemischten Impfvorrat zu erhalten;
b) Zugabe einer Stammlösung eines Stabilisators zu dem gemischten Impfstamm aus Schritt a) in einem Verhältnis von etwa 1:1 und ihr Vermischen, um eine Kombinationsimpfstoff-Formulierung zu erhalten:
c) Gefriertrocknen der in Schritt b) erhaltenen Kombinationsimpfstoff-Formulierung.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Gefriertrocknungsschritt c) ein Vorkühlen der Kombinationsimpfstoff-Formulierung in Form einer wässerigen Suspension unterhalb der Temperatur des eutektischen Punktes der Suspension für 3 bis 6 Stunden und anschließend eine schrittweise Erhöhung der Temperatur von –35°C bis zu 35°C über 8 bis 20 Stunden, um das Wasser aus der gekühlten Suspension durch Sublimation zu entfernen.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betragen in dem gefriergetrockneten Kombinationsimpfstoff die prophylaktisch wirksamen Titer des abgeschwächten lebenden Hepatitis A-Virus nicht weniger als 10^6.0 CCID₅₀/ml und die prophylaktisch wirksamen Titer des abgeschwächten lebenden Masern-Virus nicht weniger als 10^3.5 CCID₅₀/ml.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird im Wesentlichen ein Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern, bestehend aus prophylaktisch effektiven Titern des abgeschwächten lebenden HAV und des abgeschwächten lebenden MV, zur Verfügung gestellt, der keine Unverträglichkeiten oder gegenseitige Störungen zwischen den beiden virusförmigen Antigenen in Bezug auf das Immunsystem und die Fähigkeit zur Immunisierung hervorruft und der wahlweise einen Stabilisator oder eine schützende Substanz für das Gefriertrocknen enthält.
Masern ist die am meisten ansteckende Krankheit für den Menschen, die hervorgerufen wird durch den Masernvirus (MV). Die Immunität gegenüber Masern, die nach einer Ansteckung mit der Krankheit eintritt, scheint lebenslang zu bestehen. Nach einer Masernimpfung besteht die Immunität auf ähnliche Weise für eine Zeitdauer von vielen Jahren und möglicherweise lebenslang. Die größte Anzahl der Masernfälle betrifft Personen, die nicht gegen Masern immunisiert wurden, und es gibt eine geringe Anzahl von Menschen, die auf eine einzelne Behandlung mit Masernimpfstoff nicht reagieren. Aus diesem Grund wird seit 1989 die Empfehlung für zwei Behandlungen mit Masernimpfstoff abgegeben. Deshalb sollten alle kleinen Kinder im Alter von einem Jahr oder mehr eine Masernimpfung erhalten und die zweite Masernimpfung sollte vor dem Schuleintritt (im Alter von 4–6 Jahren) oder im Alter von 10 bis 11 Jahren verabreicht werden. Zusätzlich sollten Personen, die in ein College, den Militärdienst oder Schulen zur Ausbildung im Gesundheitsdienst eintreten oder solche, denen die Krankheitsgeschichte in der Kindheit oder die Immunisierung fehlt, eine zweite Masernimpfung erhalten. Im Hinblick auf die Altersverschiebung bei den Maserninfektionen ist es besonders wichtig, dass Heranwachsende, die zur Schule zurückkehren, in diesem Fall eine zweifache Masernimpfung zur Auffrischung erhalten.
Hepatitis A (HA) ist eine weltweit verbreitete akut ansteckende Krankheit, die durch Infektion mit dem Hepatitis A-Virus (HAV) hervorgerufen wird. Wie andere enterale Krankheiten, die hauptsächlich über eine fäkale/orale Route übertragen werden, ist Hepatitis A eine typische Infektion in der Kindheit, die mit ärmlichen und übervölkerten Umständen einhergeht. Auch wenn die Hepatitis A bei Kindern im Allgemeinen sehr leicht ist, spielen kleine Kinder doch eine bedeutende Rolle bei der Übertragung des Hepatitis A-Virus, denn ein Kind mit einer subklinischen Infektion kann den Virus auf nicht immune Personen übertragen. Während verbesserte sanitäre Einrichtungen und Lebensbedingungen bei einigen Bevölkerungsgruppen zu einem Rückgang der Verbreitung des Virus geführt haben, sind jüngere Generationen weiterhin anfällig für Infektionen und können als Herde für den Ausbruch von Hepatitis A fungieren. Die Impfung von Kindern, die Kindertagesstätten besuchen und in Gegenden mit einer erhöhten Anti-HAV Seroprävalenz leben, hat sich als vorteilhaft herausgestellt und es wird vermutet, dass ein routinemäßiges Impfprogramm für Hepatitis A die wirksamste Maßnahme zur Kontrolle der Hepatitis A Infektion ist.
Im Hinblick auf erkennbare Ähnlichkeiten von HAV und MV unter epidemiologischen Aspekten und einem ähnlichen Ablaufplan zur Immunisierung in zwei Schritten sowohl für den Hepatitis A- als auch für den Masern-Impfnug sind der Wunsch nach einem Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern sowie die Möglichkeit seiner Verfügbarkeit offensichtlich.
Bis heute wurde der in China allgemein eingesetzte Masernimpfstoff aus isolierten Chang-47 und Hu-191 Bakterienstämmen, welche angepasst waren, in vitro auf Primärkulturen von embryonalen Zellen von Hühnern übertragen zu werden. Allerdings haben Untersuchungen der Erfinder der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass Monoschichten von diploiden menschlichen fötalen Lungenzellen oder Zellsuspensionen, die als Zellsubstrate eingesetzt werden, sich vorteilhaft für die Vermehrung des Virus und die Erhaltung der virusförmigen Antigene auswirken und auch die Kontaminierung aufgrund exogener Faktoren, wie z.B. durch Ei-Protein und ähnliches, verhindern.
Andererseits wurde der Hepatitis A Lebendimpfstoff aus dem weit verbreiteten HAV-Stamm L-A-1, der von den Erfindern der vorliegenden Erfindung aus dem Stuhl eines Patienten durch das serienmäßige Passieren von menschlichen diploiden Fibroblastenzellen isoliert wurde, entwickelt und für die praktische Anwendung und die Produktion im industriellen Maßstab für China lizenziert. Mehr als 80 Millionen Einzelpersonen, die mit einem hohen Risiko für einen Kontakt mit Hepatitis A behaftet sind, erhielten eine Impfung mit dem so gewonnenen Impfstoff und die Ergebnisse der nachfolgenden Untersuchungen zeigten eine Seroprotektionsrate von 85% und nach einer einzigen Wiederholungsimpfung eine Seroprotektion von 100%.
Während ihren Langzeit-Untersuchungen und ihrer Produktionspraxis haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass die diploiden Fibroblastenzellen einer menschlichen fötalen Lunge (Stamm 2BS) hervorragende Gastzellen sind nicht nur für den Hepatitis A-Virus, sondern auch für den Masernvirus, und dass der Masernvirus eine schnellere Vermehrungsrate auf diesen Zellsubstraten zeigt. Insbesondere haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung überraschend gefunden, dass nach dem Injizieren eines Viruskeims von HAV in die diploide Zellkultur und dem Züchten der Zellen in einem Nährmedium für 2–3 Wochen, eine zusätzliche Injektion und Züchtung des Masernvirus durchgeführt werden kann, während das Infektionspotential des HAV ein ausreichend hohes Niveau erreicht hatte. Nach einer weiteren Woche konnten die beiden Virus-Arten nahezu simultan in einer hohen Ausbeute und mit einem hohen Infektionspotential geerntet werden. Dieser Befund bildete die Basis zur Herstellung des erfindungsgemäßen HM-Kombinationsimpfstoffes über die Vermehrung der zwei abgeschwächten lebenden Virus-Arten auf demselben Gastzellsubstrat.
Im Falle der Herstellung eines Stammmaterials für HAV und MV kann das jeweilige Stammmaterial des lebenden Virus verdünnt und in einem geeigneten Volumenverhältnis vermischt werden, um auf diese Weise einen kombinierten Lebendimpfstoff in Form einer wässerigen Suspension zu erhalten, die prophylaktisch wirksame Titer von HAV und MV enthält. Dabei beziehen sich die prophylaktisch wirksamen Titer auf ein Viruspotential von nicht weniger als 10^6.0 CCID₅₀ für HAV und auf nicht weniger als 10^3.5 CCID₅₀ für MV.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines Kombinationsimpfstoffes für Hepatitis A-Masern zur Verfügung, das die folgenden Schritte umfasst:

a) die Bereitstellung von Keim-Viren des jeweils abgeschwächten Hepatitis A-Virus und Masernvirus;
b) Injizieren des aus Schritt a) erhaltenen Keim-Virus des Hepatitis A-Virus in eine diploide Fibroblastenzellkultur einer menschlichen fötalen Lunge und anschließendes Züchten der Zellen, um den Virus zu vermehren;
c) Injizieren des im Schritt b) erhaltenen Masernvirus auf die gleichen Zellschichten, auf denen sich der Hepatitis A-Virus fortgepflanzt, sobald die mit Hepatitis A positiv infizierten Zellen mehr als 75% betragen, wobei die Zellen kontinuierlich weiter gezüchtet werden;
d) Zu dem Zeitpunkt, wenn die mit Hepatitis A positiv infizierten Zellen mehr als 90% ausmachen, was über die Immunofluoreszenz (IF) bestimmt wird, und die mit Masernvirus positiv infizierten Zellen mehr als 90% ausmachen, was über die zytopathogene Wirkung (CPE) bestimmt wird, werden die mit den beiden Virus-Arten infizierten Zellen gewonnen und das Impfstoffstammmaterial, das die beiden Virus-Arten enthält, wird gesammelt, um auf diese Weise den gewünschten Kombinationsimpfstoff zu erhalten.

Für die Herstellung des erfindungsgemäßen Kombinationsimpfstoffes kann der Impfstoffstamm für HAV aus HAV-Stämmen L-A-1, die in dem CN-Patent No. 92 114 998.0 beschrieben werden, und der Impfstoffstamm für MV aus MV-Stämmen Chang-47 über ein konventionelles Verfahren gemäß den „Requirements for Measles Vaccine, live" in den Chinese Requirements for Biological Products hergestellt werden.
Ein aus klinischen Ausgangsstoffen isolierter HAV kann in vielen Arten von Zellkulturen wachsen und sich vermehren und kann, wenngleich der relative Vermehrungskoeffizient geringer ist, nicht zu morphologisch sichtbaren zytopathogenen Veränderungen führen. Im Gegensatz dazu kann MV in vielen Arten von primären Zellkulturen oder Subkulturen in einem vergleichsweise kürzeren Replikationszyklus wachsen und sich vermehren und es können die typischen mehrkernigen Riesenzellen ebenso wie andere ähnliche zytomorphologische Veränderungen bei einer Untersuchung mit dem Mikroskop festgestellt werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, dass menschliche diploide Zellen hervorragend empfängliche Gastzellen sind sowohl für HAV als auch für MV, so dass die diploide Zelllinie 2BS als bevorzugte übliche Gastzelle eingesetzt wird für die Herstellung des erfindungsgemäßen Kombinationsimpfstoffes.
Um den Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern herzustellen und dabei eine dichte konfluente einzelne Zellschicht in einer Vorrichtung zum Rollen von Flaschen auszubilden, wird eine menschliche diploide Zelllinie 2BS für das Wachstum und den Erhalt der Zellen kultiviert. Dann wird ein Keimvirus für HAV in die Zellkultur mit einer Infektionsvielfalt (m.o.i.) von 0.02–10 injiziert und anschließend erfolgt eine Züchtung bei 32–35°C. Während des Züchtens des Virus wächst der Bereich der infizierten Zellen schrittweise entsprechend der Vermehrung des Virus und der prozentuale Bereich der positiv infizierten Zellen wird über Immunofluoreszenz beobachtet.
Nach etwa 2–3 Wochen, als mehr als 75% der HAV-infizierten Zellen eine positive Immunofluoreszenz zeigten, wurde von dem Medium zu einem Nährmedium gewechselt, das 10% fötales Kalbsserum (FCS) oder 0.01–0.25% (Gew./Vol.) HSA enthielt, und es wurde ein Keimvirus aus dem MV-Stamm zusätzlich in dieselbe Zellkultur mit einem m.o.i von 0.01 bis 10 injiziert. Anschließend wurde die menschliche diploide Zellkultur, die sowohl mit HAV als auch mit MV infiziert war, kontinuierlich gezüchtet, wobei das Medium im Interval von 3–5 Tagen erneuert wurde und die morphologischen Veränderungen der Zellen jeden Tag untersucht wurden. Die spezifischen morphologischen Veränderungen der MV-infizierten Zellen sind als der sogenannte zytopathogene Effekt (CPE) bekannt, so dass auf diese Weise das Ausmaß des Viruswachstums bestimmt werden kann. Zu dem Zeitpunkt, wenn der CPE fast über den gesamten Bereich der einschichtigen Zellkultur (ca. 90%) zu sehen ist und die positiv HAV-infizierten Zellen mehr als etwa 90% betragen, wird die Züchtung des Virus beendet. Danach wird die Zellkultur für 1–3 Tage bei 2–8°C aufbewahrt, um die Viren in der Kälte freizusetzen, und anschließend können die infizierten Zellen gesammelt und gefroren unter –20°C aufbewahrt werden.
Nach dem Auftauen der Zellen wird die erhaltene Zellsuspension drei Gefrier-Tau-Zyklen ausgesetzt und anschließend einer Ultraschallbehandlung in einem Eiswasserbad zur Zerstörung der Zellen unterzogen, gefolgt von einer Zentrifugalbehandlung, um die Zellteile zu entfernen und die überstehende Flüssigkeit von der Suspension abzutrennen. Die überstehende Flüssigkeit, die HAV und MV enthält, wird zusammengefasst, um ein Stammmaterial für den Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern zu erhalten.
Es ist offensichtlich, dass der kombinierte HM-Impfstoff, wie oben erwähnt ist, durch einen einfachen Mischvorgang erhalten werden kann. Für die Herstellung des gemischten Impfstoffes werden die jeweiligen Stammmaterialen der lebenden Impfstoffe verdünnt und vermischt, so dass die Dosierniveaus der einzelnen Viren eine im Wesentlichen festgelegte antigene Aktivität behalten, die angewendet wird, um eine Immunreaktion gegen die Infektion mit den Viren zu hervorzurufen.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus auch ein Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Kombinationsimpfstoffes für Hepatitis A-Masern zur Verfügung, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellung von Stammmaterialien, die prophylaktisch wirksame Titer eines abgeschwächten lebenden Hepatitis A-Virus bzw. eines abgeschwächten lebenden Masernvirus enthalten, und Ihr Vermischen, um einen gemischten Impfstoffstamm zu erhalten
b) Zugabe einer Stammlösung eines Stabilisators zu dem gemischten Impfstoffstamm aus Schritt a) in einem Verhältnis von etwa 1:1 und ihr Vermischen, um eine Kombinationsimpfstoff-Formulierung zu erhalten:
c) Gefriertrocknen der in Schritt b) erhaltenen Kombinationsimpfstoff-Formulierung.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform können die Stammmaterialien für HAV und MV und der Stabilisator für den gefriergetrockneten Kombinationsimpfstoff auf geeignete Weise verdünnt und in einem Verhältnis von etwa 1:1 (Vol./Vol.) vermischt werden und anschließend können die erhaltenen wässerigen Formulierungen, die prophylaktisch wirksame Titer für HAV und MV sowie einen Stabilisator, der in der Impfstoff-Formulierung in einer Konzentration enthalten ist, die ausreicht, um die Viren gegen eine Inaktivierung durch Wärme zu stabilisieren, umfassen, gefriergetrocknet werden, so dass der so erhaltene kombinierte HM-Impfstoff bei Raumtemperatur über einen langen Zeitraum aufbewahrt werden kann, ohne sein infektiöses Potential zu verlieren, wodurch mehr Komfort, eine bessere Verfügbarkeit und geringere Verwaltungskosten geboten werden können.
Der Stabilisator eines abgeschwächten lebenden Impfstoffes kann durch einfaches Vermischen der einzelnen Komponenten, mit Ausnahme von HSA, miteinander und Vorerwärmen der erhaltenen Mischung auf etwa 37°C für 24–48 Stunden, anschließendes Abkühlen der Lösungsmischung auf etwa 32°C und Hinzufügen von HSA, das durch eine Reihe von Ultrafiltrationen sterilisiert wurde, in die Lösungsmischung erhalten werden.
Danach kann der so erhaltene Stabilisator mit dem Virusstamm für den kombinierten HM-Impfstoff in einem geeigneten Verhältnis, z.B. einem Verhältnis von etwa 1:1 (Vol./Vol.), vermischt werden.
Allerdings wird sich der Fachmann sehr wohl darüber im Klaren sein, dass ein Verändern des Volumenverhältnisses des Stabilisators zum Impfstoff im Rahmen der Anwendung der beanspruchten Erfindung liegt, was andererseits Veränderungen bei den Konzentrationen der Komponenten des Stabilisators erfordert. Die Erfindung ist nicht auf die spezifizierte 1:1 Stabilisator/Virus-Kombination begrenzt, um die endgültige Formulierung für die Gefriertrocknung zu generieren. Daher kann der Fachmann verschiedene Verhältnisse auswählen oder das Stammpräparat für den Virus mit einer unterschiedlichen Konzentration der chemischen Komponenten, die zur Herstellung des Stabilisators eingesetzt werden, einsetzen.
Nachdem die Formulierung des Impfstoffs fertiggestellt ist, kann die erhaltene wässerige Suspension des Kombinationsimpfstoffes durch Gefriertrocknung getrocknet werden. In Kürze ausgeführt, umfasst die Gefriertrocknung den Schritt des Vorkühlens der wässerigen Suspension unterhalb der Temperatur des eutektischen Punktes der wässerigen Suspension (unter –30°C) für 3–6 Stunden sowie das anschließende Entfernen des Wassers aus der gekühlten Suspension durch Sublimation, um den gefriergetrockneten Impfstoff zu bilden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proben der formulierten Impfstoffsuspension einer Gefriertrocknungsprozedur in mehreren Schritten in einer Gefrierkammer des Gefriertrockners während eines Zeitraums von 8–20 Stunden mit einer schrittweisen Erhöhung der Temperatur von –35°C auf 35°C ausgesetzt.
Um die auf der Anwesenheit des Stabilisators beruhende Verbesserung der thermischen Stabilität und der Lagerstabilität des Lebendimpfstoffes zu demonstrieren, wird die vorliegende Erfindung beispielhaft am HM-Impfstoff erläutert, beispielsweise durch Bestimmung der Virus-Titer des kombinierten HM-Impfstoffes vor und nach der Gefriertrocknung, um die Wirksamkeit des Stabilisators auf die Lagerstabilität des lebenden Kombinationsimpfstoffes zu beobachten. Die Ergebnisse zeigen, dass der in der erfindungsgemäßen Impfstoff-Formulierung enthaltende Stabilisator bei einer ausreichenden Konzentration, um den lebenden Virus-Impfstoff gegen die Inaktivierung durch Hitze zu stabilisieren, die thermische Stabilität des Impfstoffes, der gefriergetrocknet wurde, deutlich im Vergleich zu einem Kontrollimpfstoff ohne Stabilisator der verbesserte, wie durch CCID₅₀ gemessen wurde.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Stabilisator im Wesentlichen zusammengesetzt aus 0 bis 2% (Gew./Vol.) Humanserumalbumin, 0.5 bis 1% (Gew./Vol.) Gelatine, 5 bis 10% (Gew./Vol.) Trehalose, 0.75 bis 1.5% (Gew./Vol.) Natriumglutamat, 0.05 bis 0.55% (Gew./Vol.) Ascorbinsäure, 0.5 bis 2.8% (Gew./Vol.) Harnstoff, 5 bis 10% (Gew./Vol.) Mannitol oder Sorbitol oder einem Gemisch davon mit 1:1 und 0.5 bis 1% (Gew./Vol.) Inositol, bezogen auf die Konzentrationen in der gefriergetrockneten Lebendimpfstoff-Formulierung.
In einem Vergleichsversuch haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass ein analoges Resultat beobachtet wird, wenn eine Stabilisator-Lösung, die die HSA-Komponente nicht enthält, in einer Impfstoff-Formulierung mit lebenden Viren (insbesondere einige Viren ohne Hülle, wie z.B. HAV, MV und Polioviren) eingesetzt wird, wenn die Parameter der Gefriertrocknungszyklen entsprechend eingestellt werden konnten.
Es kann experimentell gezeigt werden, das der erfindungsgemäße Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern eine hervorragende Spezifität aufweist, wie in vitro durch den Serum-Neutralisationstest oder den Virus-Identifikationstest für MV und HAV gezeigt wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass die in dem erfindungsgemäßen Kombinationsimpfstoff enthaltenen HAV- und MV-Viren bei einer identifizierbaren infektiösen Dosis vollständig durch das entsprechende spezifische Antiserum neutralisiert werden können.
Darüber hinaus wird der Kombinationsimpfstoff eingesetzt, um Rhesusaffen zu impfen und es wurden Versuchsreihen in vivo durchgeführt, um seine Sicherheit und Immunogenität bei diesen höheren Primaten zu zeigen. Es hat sich gezeigt, dass die Tiere, die den Impfstoff erhielten, vollkommen frei sind von Paralyse oder irgendwelchen anderen lokalen Symptomen des Zentralnervensystems (CNS), und keines der Tiere zeigte histopathologische Veränderungen im CNS und im Gewebe der Leber. Ebenso wichtig ist, dass es keine histologischen Veränderungen gibt, welche temporär durch Serokonversion in infizierten Tieren bedingt sind, und auch keine abnormale Erhöhung lebender Enzyme, die der Impfsubstanz zuzuordnen sind. Auf der anderen Seite wurde gezeigt, dass alle fünf sowohl mit HAV als auch mit MV infizierten Tiere IgM Anti-HAV und IgM Anti-MV entwickelten, das durch ein Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) in den Wochen 2 und 4 nach der Impfung nachweisbar ist, und die Antikörper zum Serum sind in den Wochen acht und neun verschwunden.
Darüber hinaus hat die Hälfte der Tiere sowohl einen spezifischen Anti-HAV Antikörper als auch einen Anti-MV Hämagglutinationshemmungs(IH)-Antikörper in der Woche zwei entwickelt und die Serokonversionsraten (Serumprävalenzen) sowohl des Anti-HAV als auch des Anti-MV betragen 100% in der Woche vier nach der Impfung. Letztendlich wurde ein klinischer Test durchgeführt, um darüber hinaus die Wirksamkeit und klinische Brauchbarkeit des bivalenten lebenden Kombinationsimpfstoffes für Hepatitis A-Masern aufzuzeigen, bei dem der lebende Hepatitis A-Impfstoff zusammen mit dem lebenden Masern-Impfstoff verabreicht wurde und mit der Einzelverabreichung des monovalenten Hepatitis A-Impfstoffs und des monovalenten Masern-Impfstoffs, die für den allgemeinen Vertrieb in China lizenziert sind, verglichen wurde.
Eine Gesamtzahl von 275 gesunden Kindern im Alter zwischen 8 und 12 Monaten wurden in drei Gruppen aufgeteilt und es wurde ihnen eine Dosis Hepatitis A-Impfstoff mit Masern-Impfstoff, eine Dosis Hepatitis A-Impfstoff allein bzw. eine Dosis Masern-Impfstoff allein verabreicht, um die klinischen und Antikörper-Reaktionen auf diese drei Impfsysteme zu vergleichen. Während der 72 Stunden der Beobachtungsphase nach der Impfung zeigte keines dieser Testobjekte weder eine lokale noch eine allgemeine Reaktion und es gibt keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf Gegenreaktionen zwischen den Gruppen mit der simultanen oder der einzelnen Administration von HA-Impfstoff und Masern-Impfstoff. Insbesondere zwischen den beiden Gruppen, die entweder HA-Impfstoff oder Masern-Impfstoff bzw. HM-Kombinationsimpfstoff erhalten hatten, wurden keine signifikanten statistischen Unterschiede bei den positiven Serokonversionsraten für Anti-HAV und Anti-MV sowie den geometrischen mittleren Titern (GMTs) für Anti-HAV- und Anti-MV-Antikörpern, die durch eine modifizierte ELISA-Versuchsanordnung gemessen wurden, beobachtet.
Zusammenfassend kann man festhalten, dass sowohl der lebende Hepatitis A-Impfstoff als auch der lebende Masern-Impfstoff nicht nur ähnliche Impfschemas für Kleinkinder und Jugendliche aufweisen, sondern auch ohne gegenseitige Störungen des Immunreaktion und der Immunogenität vorliegen, was unter Einsatz einer identischen Methode zur Bestimmung der Immunogenität gezeigt werden konnte. Die Ergebnisse, die in den Beispielen 4 und 5 der Anmeldung beschrieben werden, bestätigen die außerordentliche Sicherheit und Immunogenität des HM-Kombinationsimpfstoffes und stützen seinen Einsatz zur vorbeugenden Behandlung gegen die beiden Virus-Infektionen. Es wird daher erwartet, dass der Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern aus Virusstämmen von HAV und MV hergestellt werden kann nach den Verfahren, wie sie oben ausgeführt wurden, die einiges mehr an Technik beinhalten als einfaches Mischen von existierenden Virus-Antigenen, wie z.B. die gemeinsame Züchtung von zwei oder mehreren abgeschwächten lebenden Virus-Arten auf derselben Zellkultur, selbst wenn es viele mögliche Probleme gibt, die von den genetischen Eigenschaften des Virus herrühren, und die Molekularbiologie noch gelöst werden muss, und es wird erwartet, dass dass er bei der „Children's Vaccine Initiative" zur Vereinfachung der Verabreichung, Erhöhung der Akzeptanz und Verbesserung der Kontrolle der beiden Krankheiten eingesetzt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung könnte der lebende Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern als erste Dosierung Kleinkindern zwischen 10 und 13 Monaten verabreicht werden, um einen dualen Schutz gegen Hepatitis A und Masern bereitzustellen, oder als erhöhte Dosis Kindern nach dem Schuleintritt (4 Jahre und mehr) oder mit 10 bis 11 Jahren. Zusätzlich sollten Personen die in ein Kollege, beim Militär oder in Schulen zur Ausbildung im Gesundheitsdienst eintreten, oder diejenigen, denen die Krankheitsgeschichte in der Kindheit oder die Immunisierung fehlt, eine zweite Dosis des Kombinationsimpfstoffes erhalten. Im Hinblick auf die Altersverschiebung bei den Masern- und Hepatitis-Infektionen ist es besonders wichtig, das Heranwachsende mit einer Zweifachimpfung mit dem Kombinationsimpfstoff zur Schule zurückkehren.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird darüber hinaus ausführlicher unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt. Es ist jedoch selbstverständlich, dass die Beispiele nicht dazu herangezogen werden sollten, um den Umfang der Erfindung einzuschränken.
Beispiel 1
Herstellung eines Kombinationsimpfstoffes für Hepatitis A-Masern
Diploide Fibroblastenzellen einer menschlichen fötalen Lunge (2BS) wurden bei 37°C unter Einsatz von Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) sowohl für das Wachstum als auch die Erhaltung der Zellen kultiviert. Nach fünf Tagen wurde ein Keimvirus des in dem CN-Patent No. 92114998.0 beschriebenen Hepatitis A-Virusstammes L-A-1 auf die konfluenten Monoschichten der diploiden Zellen bei einem m.o.i. von etwa 4.5 aufgetragen, gefolgt von einem kontinuierlichen Züchten für 3 Wochen unter Einsatz eines Nährmediums für die Erhaltung (EMEM, 2–5% FCS enthaltend), das in wöchentlichen Intervallen erneuert wird, und die positiv infizierten HAV-Zellen wurden periodisch mittels der indirekten Immunofluoreszenz-Bestimmung (IFA) beobachtet. Nach drei Wochen, zu dem Zeitpunkt als etwa 75% der HAV-infizierten Zellen eine positive Immunofluoreszenz zeigten, wurde der Nährboden durch einen frischen Nährboden, der mit 10% FCS ergänzt war, ausgewechselt und ein Keimvirus des Masern-Virusstammes Chang-47 wurde zusätzlich auf dieselbe Zellkultur bei einem m.o.i. von etwa 4.5 aufgeimpft.
Anschließend wurde die sowohl mit HAV als auch mit MV infizierte diploide menschliche Zellkultur kontinuierlich bei 33–35°C gezüchtet, einhergehend mit einer Erneuerung des Nährbodens an jedem fünften Tag und einer täglichen Probenahme für die morphologischen Untersuchungen am Mikroskop. Sobald der typische zytopathische Effekt (CPE) bei etwa 50% der MV-infizierten Zellen beobachtet wird (mehrkernige Riesenzelle), wird das Nährmedium aus dem Zuchtbehälter entfernt und das restliche FCS wird mit einer im Gleichgewicht befindlichen Salzlösung herausgewaschen. Anschließend werden die Zellen in Eagle's MEM-Medium ohne FCS erneut suspendiert und kontinuierlich gezüchtet. Zu dem Zeitpunkt, wenn die HAV-infizierten Zellen mehr als 90% betragen und die MV-infizierten Zellen etwa 95% erreicht haben, wird die Züchtung des Virus beendet und die Zellen werden bei 2–8°C für 72 Stunden aufbewahrt, um das zellgebundene HAV und MV freizusetzen, und dann bei unter –20°C kältekonserviert.
Die gefroren gelagerten Zellen wurden drei Einfrier-Auftau-Zyklen und einer Ultraschallbehandlung (10~15 min) zur Zerstörung der Zellen unterzogen, gefolgt von einer Zentrifugalbehandlung zur Klärung des Zellschlamms (2,000 rpm, 4°C, 15 min), und dann wurde die überstehende Flüssigkeit aufgefangen, um einen Virusstamm zu erhalten, der lebenden HAV und MV enthält.
Beispiel 2
Herstellung von gefriergetrocknetem Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern
Der Stabilisator für gefriergetrockneten Kombinationsimpfstoff kann wie folgt hergestellt werden:
0.8 g gereinigte Gelatine wird in 30 ml gekochtem destilliertem Wasser gelöst und die resultierende Lösung wird in einem Autoklaven bei 116°C für 40 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur, werden 1.0 g HSA, welches durch eine Reihe von Ultrafiltrationen über einen 0.22 μm Porenfilter sterilisiert wurde, zu der Gelatine-Lösung gegeben, um eine Gelatine-HSA-Lösung zu erhalten. In der Zwischenzeit wurden 8.0 g Trehalose, 1.0 g Natriumglutamat, 0.1 g Ascorbinsäure, 2.5 g Harnstoff, 8.0 g Sorbitol und 0.6 g Inositol in dieser Reihenfolge to 50 ml destilliertem Wasser gegeben und die erhaltene Mischung wird für 24 Stunden unter Rühren auf 37°C vorgeheizt. Am nächsten Tag wird die Mischung zu der Gelatine-HSA-Lösung gegeben und anschließend wird destilliertes Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erreichen. Der pH der erhaltenen Lösungsmischung wird mit 0.1 N HCl auf etwa 7.0 eingestellt und die Mischung wird einer Sterilisierung durch Ultrafiltration unterzogen, um die gewünschte Vorratslösung für den Stabilisator zu erhalten.
Die Stammlösung für den Stabilisator wird mit der Stammsuspension des Kombinationsimpfstoffes, die in Beispiel 1 hergestellt wurde, etwa im Verhältnis 1:1 (Vol./Vol.) vermischt, um die fertige Kombinationsimpfstoffformulierung zu erhalten. Darin ist der Stabilisator in einer ausreichend hohen Konzentration vorhanden, um die Virus-Arten gegen Inaktivierung durch Erhitzen zu schützen.
Anschließend werden Proben der Impfstoffformulierung in 2 ml Glasfläschchen (1.2 ml/Fläschchen) gegeben und die Fläschchen werden in einen Gefriertrockner (Modell FS 150-SS 20C, Hull Co., USA) für einen mehrstufigen Gefriertrockenzyklus gegeben: Vorkühlen bei –40°C für 4 Stunden, anschließend wird die Schranktemperatur schrittweise auf 32°C erhöht und es wird unter Vakuum für 15 Stunden getrocknet, um dabei einen gefriergetrockneten Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern zu erhalten.
Beispiel 3
Prüfung der Lagerungsstabilität von gefriergetrocknetem lebendem Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern
Der Versuch wird unter Einsatz von fünf aufeinanderfolgenden Produktionschargen des lebenden Kombinationsimpfstoffes durchgeführt, wobei die Proben des Impfstoffes bei 2–8°C, 25°C und 37°C für verschiedene Perioden gelagert werden und anschließend jeweils der Virus-Titer von HAV bzw. MV in dem bivalenten Kombinationsimpfstoff bestimmt wird.
Wegen des Auftretens eines zytopathischen Effekts (CPE) in diploiden Zellen, der durch den Masern-Virus hervorgerufen wird, muss der Masernvirus vor der Bestimmung der Virus-Titer von HAV neutralisiert werden. Zu diesem Zweck werden die Proben des Kombinationsimpfstoffes, der gefriergetrocknet werden soll, serienmäßig auf das Zehnfache verdünnt, wobei die Probe (0.1 ml) in einer Verdünnung von 10^–2 zu einem verdünnten spezifischen Anti-MV-Serum (0.9 ml) gegeben wird und anschließend wird die erhaltene Mischung über Nacht bei 2–8°C gezüchtet. Am nächsten Tag werden die neutralisierten Impfstoffproben serienmäßig auf das Zehnfache verdünnt und die Probe wird mit einer Verdünnung von 10^–3 bis 10^–8 auf die konfluenten diploiden Zell-Einzelschichten aufgetragen und anschließend werden die Zellen gezüchtet. Nach 4 Wochen werden die Zellen geerntet und nach den oben beschriebenen Verfahren zerstört. Die durch Zentrifugalabscheidung aufgefangene überstehende Flüssigkeit wird genommen, um die Virus-Titer von HAV über eine ELISA-Untersuchung zu bestimmen. Die Werte (Log CCID₅₀/ml) werden gemäß dem Verfahren von Reed und Muench (Reed, L. J. und Muench, H., Am. J. Hyg. 27: 493–497, 1938) bestimmt.
Andererseits werden, um die Virus-Titer des in dem lebenden Kombinationsimpfstoff vorhandenen Masern-Virus zu bestimmen, jeweils Proben des Kombinationsimpfstoffes und des Standards vom Masern-Virus (geliefert vom Nationalen Institut für die Kontrolle von Pharmazeutischen und Biologischen Produkten, Bejing, China) serienmäßig auf das Zehnfache verdünnt und die Probe wird mit einer Verdünnung von 10–2 bis 10–6 auf eine in vitro Zellkultur aufgeimpft und die Zellen werden bei 34°C für eine Woche gezüchtet.
Nach Beendigung der Züchtung werden die Virus-Titer über das oben beschriebene konventionelle Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse werden in den folgenden Tabellen 1 und 2 gezeigt. Tabelle 1 Vergleich der Virus-Titer von HAV und MV im Kombinationsimpfstoff vor und nach der Gefriertrocknung

* Die in der Tabelle angegebenen Werte geben die Virus-Titer, ausgedrückt im logarithmischen Wert von 50% der infektiösen Dosis der Zellkultur pro ml Stammvirus, wieder (log CCID₅₀/ml).

* Die in der Tabelle angegebenen Werte geben die Virus-Titer, ausgedrückt im logarithmischen Wert von 50% der infektiösen Dosis der Zellkultur pro ml Vorratsvirus, wieder (log CCID₅₀/ml).

Aus den Werten, die in den Tabellen 1 und 2 wiedergegeben werden, ist ersichtlich, dass in Gegenwart eines Stabilisators für die Gefriertrocknung, auch wenn die fünf Chargen des HM-Kombinationsimpfstoffes eine leichte Abnahme des als log CCID₅₀ gemessenen Virus-Titer bei der Lagerung nach der Gefriertrocknung bei den angegebenen Temperaturen für die angegebenen Zeiträume zeigen, diese Abnahmen weniger als 0.5 log im Vergleich mit dem Impfstoff in seinem Anfangszustand nach der Gefriertrocknung (gelagert bei 2–8°C für 0 Tage) betragen. Darüber hinaus zeigten die Proben des gefriergetrockneten erfindungsgemäßen HM-Kombinationsimpfstoffes, die bei 2–8°C für 12 Monate, bei Raumtemperatur (25°C) für 3 Monate bzw. bei 37°C für 7 Tage gelagert wurden, wobei sowohl HAV als auch MV im Kombinationsimpfstoff enthalten war, eine hervorragende Lagerbeständigkeit, die durch den Stabilisator nach der Gefriertrocknung ermöglicht wird.
Beispiel 4
Tierversuche, um die Sicherheit und die Immunogenität des bivalenten Kombinationsimpfstoffes zu demonstrieren
In diesem Beispiel wurden willkürlich Rhesusaffen als Empfängertiere ausgesucht. Immunisierte Tiere wurden in vivo eingesetzt, um die Sicherheit und die Immunogenität des HM-Kombinationsimpfstoffes zu bestimmen. Der gefriergetrocknete Formulierung des Kombinationsimpfstoffes, der gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wurde den Rhesusaffen intravenös (0.1 ml) und intrakranial (0.5 ml) verabreicht (wobei jede Gruppe 5 Tiere umfasste). Bei den Versuchen wurde sowohl monovalenter Hepatitis A-Impfstoff als auch monovalenter Masernimpfstoff als Kontrollimpfstoff verwendet.
Nach der Impfung wurde die lokale und die allgemeine Reaktion, einschließlich Paralyse und andere ernste Gegenreaktionen, die einer durch die Infektion mit MV hervorgerufenen Störung des CNS zuzuordnen sind, beobachtet und für insgesamt 21 Tage täglich registriert. Histologische Sektionen, präpariert aus den seriellen Leberbiopsien, die durch intrahepatische Punktur von den Tieren erhalten wurden, wurden auf histologische Veränderungen untersucht. Die Veränderungen der Enzym-Werte der Leber (Glutamat-Pyruvat-Transaminase, GTP) wurden zur Bestimmung der Schädigung der Leber aufgrund der Infektion mit HAV genutzt.
Die biochemischen und histologischen Untersuchungen der zeigen, dass keiner der Rhesusaffen eine Erhöhung der Leberenzyme aufweist, die der Impfung mit dem HM-Kombinationsimpfstoff zuzuordnen wäre, und dass keines der Tiere aus den Untersuchungsgruppen Anzeichen von histologischen Veränderungen im Hirngewebe und im Gewebe der Leber über das in den Biopsien vor der Impfung oder in einer parallelen Impfgruppe mit monovalentem Impfstoff beobachtete Maß hinaus zeigte. Ebenso gibt es keine biochemischen oder histologischen Veränderungen, die temporär in Relation stehen mit einer Serokonversion im Gehirn und den hepatischen Geweben der mit HM-Impfstoff geimpften Tiere.
Das Blutserum der immunisierten Tiere wird mittels Hämagglutinationshemmungs- (HI), Neutralisations- (TN) und Enzymimmununtersuchungs-Verfahren (EIA) untersucht. Für den Neutralisationstest wird das zu testende Blutserum in verschiedenen Verdünnungen in Nährlösungen aufgelöst und für 30 Minuten bei 56°C in einem Wasserbad inaktiviert. 100 μl einer jeden Verdünnung wird mit dem gleichen Volumen einer 100 CCID₅₀/ml enthaltenden HAV- oder MV-Suspension vermischt. Die Serum-Virus-Mischung wird über Nacht bei 4°C gezüchtet, um die Neutralisationsreaktion durchzuführen. Danach werden je 100 μl der neutralisierten Produkte auf die diploiden Zellmonoschichten geimpft. Sämtliche Blutsera werden parallel getestet. Nach 2 Stunden bei 35°C, um die Adsorption zu ermöglichen, werden jeweils 15 μl des Nährmediums zugegeben. Die Platten werden bei 35°C für 28 Tage gezüchtet. An den Tagen 7, 14 und 28 werden die Platten auf unter –20°C gefroren und wieder getaut, um den Virus in der Kälte abzulösen.
Anschließend werden 100 μl einer jeden Zellkultur auf andere Platten zur Bestimmung des HAV und MV durch ein Immununtersuchungsverfahren (Groen, et al., J. Virological Methods 23: 195–203, 1989) übertragen. HI und EIA werden durchgeführt und die jeweiligen Serokonversionsraten für Anti-HAV und Anti-MV werden paarweise durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in den unten aufgeführten Tabellen 3 und 4 zusammengefasst. Die in der Tabelle 3 wiedergegebenen Daten zeigen die GTP-Enzym-Werte des Blutserums in den Wochen 0, 2, 4 nach der Impfung mit dem HM-Kombinationsimpfstoff aus den Chargen 1, 3 und 5. Ein GPT-Wert des Blutserums (SGPT) von > 25 U/ml wird als abnormale Erhöhung der Leberenzyme angesehen und die Serokonversionsraten der zwei Antikörpern werden als Serokonversionsraten der 5 Tiere in den Wochen 0, 2 und 4 nach der Impfung angegeben. Tabelle 3 abnormale SGPT-Erhöhung und Serokonversionsraten für Anti-HAV und Anti-MV in den Wochen 0, 2, 4 nach der Impfung bei anfänglich seronegativen Tieren.

* Wochen nach den Impfung
** Die Werte geben die positiven Raten für jeweils eine Gruppe von 5 Tieren wieder

* Verdünnungen der Anti-HAV oder Anti-MV Blutsera.

Beispiel 5
Klinische Beobachtung zur Demonstration der Sicherheit und Immunogenität des HM-Kombinationsimpfstoffes.
Der vorausschauende klinische Versuch wurde gemäß den chinesischen Anforderungen für biologische Produkte durchgeführt, um die Sicherheit und die Immunogenität des Kombinationsimpfstoffes für Hepatitis A-Masern zu bestimmen.
275 gesunde Kinder im Alter von 8 bis 12 Jahren wurden willkürlich in drei Gruppen aufgeteilt und es wurden jeweils die folgenden Impfstoffe verabreicht: Monovalenter Hepatitis A-Impfstoff (Gruppe H), monovalenter Masernimpfstoff (Gruppe M) und Hepatitis A-Impfstoff zusammen mit Masernimpfstoff (simultan oder sukzessiv unter Einsatz von zwei Spritzen injiziert) (Gruppe HM). Die Stammsuspensionen für HAV und MV, die in diesem Beispiel eingesetzt wurden, wurden aus dem HAV-Virus-Stamm L-A-1 und dem MV-Stamm Change-47 und die infektiöse Stärken (Virus-Titer) betrugen mehr als 10^6.5 bzw. 10^4.0 CCID₅₀/ml. Die Impfstoffe wurden subkutan im deltoiden Bereich mit einer 1.0 ml Dosis für HA-Impfstoff und einer 0.2 ml Dosis für Masernimpfstoff geimpft.
Abwehrreaktionen wurden unter Benutzung der täglichen Karte für lokale klinische Reaktionen (Schmerzen, Rötung und Schwellung an der Impfstelle) in den nach der Impfung folgenden 72 Stunden und für die allgemeinen klinischen Reaktionen (Fieber) in den nach dem Impfung folgenden 42 Stunden aufgezeichnet. Rötung und Schwellung wurden mit Grad 1 (gering) (Durchmesser < 30 mm), Grad 2 (mäßig) (> 30 mm) und Grad 3 (stark) (> 30 mm und mehr als 24 Stunden andauernd) bewertet. Das Fieber wurde ebenfalls als gering (37.5–38°C), mäßig (> 38.0–39.0°C) und stark (> 39°C) eingeteilt.
Anti-HAV und Anti-MV Antikörper sowie das GPT-Enzym wurden vor der Impfung und in den Wochen 4 und 8 nach der Impfung getestet. Das GTP-Enzym wurde in dem Labor des Erfinders unter Einsatz einer automatischen Enzym-Versuchsanordnung gemessen.
Die Bestimmung von Anti-HAV Antikörpern wurde mit dem ELISA-Gerät durchgeführt (kommerziell erhältlich von Abbott Co., Ltd.) und die Bestimmung von Anti-MV HI-Antikörpern wurde nach Rosen (Rosen, L. Virology 13: 139–141, 1961) unter Einsatz eines kommerziell erhältlichen ELISA-Geräts durchgeführt.
Ein X²-Test wurde durchgeführt, um die Indizes der lokalen und allgemeinen Reaktionen der Gruppen untereinander zu vergleichen. Für den Vergleich der Immunogenität wurden die Serokonversions- und der Seroprotektionsraten sowie die geometrischen Titer (GTMs) der Anti-HAV und Anti-MV für jede Gruppe berechnet. Die Unterschiede zwischen den GMTs wurden über den T-Test nach Student bestimmt.
Die Beobachtungsergebnisse zeigten, dass 2 von 103 geimpften Personen, die simultan HAV und MV Impfstoff erhielten (1.94%) eine geringe allgemeine Reaktion zeigten und sich nur bei einer geimpften Person (0.97%) eine mäßige Reaktion zeigte.
In der Woche 8 nach der Impfung simultan mit HAV- und MV-Impfstoff sowie einzeln mit HAV-Impfstoff waren 92.27% der geimpften Personen in der Gruppe HM seropositiv für Anti-HAV Antikörper und 93.66% in der Gruppe H; es bestehen somit keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (X² = 0.19, p > 0.05). Darüber hinaus betrugen die GMTs sowohl gegen HAV als auch gegen MV in der Gruppe HM und der GMT gegen HAV in der Gruppe H 5.005 ± 2.538 bzw. 4.886 ± 2.610, es wurden somit keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen gefunden (t = 0.86, p > 0.05).
Ähnlich waren in der Woche 8 nach der Impfung simultan mit HAV- und Masern-Impfstoff sowie einzeln mit Masern-Impfstoff 98.05% der geimpften Personen in der Gruppe HM seropositiv für Anti-MV Antikörper und 96.66% in der Gruppe M; es bestehen somit keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (X² = 0.204, p > 0.05). Darüber hinaus betrugen die GMTs sowohl gegen HAV als auch gegen MV in der Gruppe HM und der GMT gegen MV in der Gruppe M 16.22 ± 2.29 bzw. 13.93 ± 2.59; es wurden somit keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen gefunden (t = 0.86, p > 0.05).

Claims

Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern, dadurch gekennzeichnet, daß er einen prophylaktisch wirksamen Titer eines abgeschwächten lebenden Hepatitis A-Virus und einen prophylaktisch wirksamen Titer eines abgeschwächten lebenden Masernvirus umfaßt.
Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern nach Anspruch 1, wobei der prophylaktisch wirksame Titer von Hepatitis A nicht weniger als 10^6,0 CCID₅₀/ml beträgt und der prophylaktisch wirksame Titer des Masernvirus nicht weniger als 10^3,5 CCID₅₀/ml beträgt.
Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern nach Anspruch 1, wobei der Kombinationsimpfstoff in gefriergetrockneter Form bereitgestellt wird.
Kombinationsimpfstoff für Hepatitis A-Masern nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der ferner einen Stabilisator umfaßt, wobei der Stabilisator aus 0 bis 2% (Gew./Vol.) Humanserumalbumin, 0,5 bis 1% (Gew./Vol.) Gelatine, 5 bis 10% (Gew./Vol.) Trehalose, 0,75 bis 1,5% (Gew./Vol.) Natriumglutamat, 0,05 bis 0,55% (Gew./Vol.) Ascorbinsäure, 0,5 bis 2,8% (Gew./Vol.) Harnstoff, 5 bis 10% (Gew./Vol.) Manitol oder Sorbitol oder einem Gemisch davon mit 1:1 und 0,5 bis 1% (Gew./Vol.) Inositol, bezogen auf die Konzentrationen im stabilisierten lebenden Impfstoff vor dem Gefriertrocknen, besteht.
Verfahren zur Herstellung eines Kombinationsimpfstoffs für Hepatitis A-Masern nach Anspruch 1, welches umfaßt: (a) Bereitstellen von Impfviren eines abgeschwächten lebenden Hepatitis A-Virus bzw. eines abgeschwächten lebenden Masernvirus; (b) Beimpfen einer diploiden Fibroblastenzellkultur einer menschlichen fötalen Lunge mit dem Impfvirus des lebenden Hepatitis A-Virus, der im Schritt (a) erhalten worden ist, und anschließende Züchtung der Zellen, damit der Virus wächst; (c) wenn die positiv mit dem Hepatitis A-Virus infizierten Zellen mehr als 90% betragen, Beimpfen der gleichen Zellmonoschichten, auf denen der Hepatitis A-Virus gewachsen ist, mit dem Impfvirus des Masernvirus, der im Schritt (a) erhalten worden ist, und gleichzeitiges Züchten dieser Zellen; (d) zu dem Zeitpunkt, zu dem die positiv mit dem Hepatitis A-Virus infizierten Zellen mehr als 90% betragen, was anhand der Immunofluoreszens nachgewiesen wird, und die positiv mit dem Masernvirus infizierten Zellen mehr als 90% betragen, was anhand des zytopathogenen Effektes nachgewiesen wird, werden die Zellen, die mit den beiden Viren infiziert sind, gewonnen, und die Impfstammaterialien, die die beiden Viren enthalten, werden aufgefangen, wodurch der gewünschte Kombinationsimpfstoff erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Verfahren ferner das Mischen des Stammaterials des Kombinationsimpfstoffs für Hepatitis A-Masern mit einem Stabilisator für den abgeschwächten lebenden Impfstoff in einem Volumenverhältnis von etwa 1:1 und das anschließende Gefriertrocknen der entstehenden Formulierung umfaßt, wodurch ein gefriergetrocknetes Präparat des Kombinationsimpfstoffs für Hepatitis A-Masern erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Stabilisator für den gefriergetrockneten lebenden Impfstoff besteht aus: 0 bis 2% (Gew./Vol.) Humanserumalbumin, 0,5 bis 1% (Gew./Vol.) Gelatine, 5 bis 10% (Gew./Vol.) Trehalose, 0,75 bis 1,5% (Gew./Vol.) Natriumglutamat, 0,05 bis 0,55% (Gew./Vol.) Ascorbinsäure, 0,5 bis 2,8% (Gew./Vol.) Harnstoff, 5 bis 10% (Gew./Vol.) Manitol oder Sorbitol oder einem Gemisch davon mit 1:1 (Vol./Vol.) und 0,5 bis 1% (Gew./Vol.) Inositol, bezogen auf die Konzentrationen im stabilisierten lebenden Impfstoff vor dem Gefriertrocknen.