CN102210858B - 一种肠道病毒71型与甲型肝炎联合疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肠道病毒71型与甲型肝炎联合疫苗，包括肠道病毒71型灭活病毒以及甲型肝炎灭活病毒，还包括铝佐剂。本发明还提供制备所述肠道病毒71型与甲型肝炎联合疫苗的方法，该方法无需添加明胶等保护剂，无需进行pH调节，所制得的疫苗吸附效果与稳定性均较好。接种本疫苗后，甲肝病毒对肠道病毒71型有佐剂效果，肠道病毒71型的免疫原性得到增强，免疫效果达到或超过单价疫苗的免疫效果。本疫苗具有肠道病毒71型与甲型肝炎的双重免疫性与保护性能，接种本疫苗可以减少接种针次，简化免疫程序，同时有效预防人及动物由肠道病毒71型和甲型肝炎病毒引起的疾病。

Description

一种肠道病毒71型与甲型肝炎联合疫苗

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，涉及一种联合疫苗及其制备方法，特别是涉及肠道病毒71型与甲型肝炎联合疫苗及其制备方法。

背景技术

近年来手足口病发病日益频繁，患病病例及病死人数逐年上升，严重威胁着我国儿童与婴幼儿的健康，给社会造成巨大的经济负担。2008年5月我国将手足口病纳入丙类传染病管理。肠道病毒71型作为手足口病最主要的病原体，常常与手足口病大规模爆发流行、重症和死亡病例相关。甲型肝炎是一种主要的强传染性的肠道传染病，发病率高，流行面广，是我国法定管理的乙类传染病。为有效控制疾病的流行，研究开发用于预防上述两种类肠道病毒引起的疾病的疫苗具有重大意义。

肠道病毒71型(EV71)和甲型肝炎病毒(HAV)均是通过粪-口途径传播的小RNA病毒科病毒，分别属于肠道病毒属和嗜肝病毒属，人类是它们唯一的自然宿主。

肠道病毒71型：手足口病(HFMD)是由多种肠道病毒引起的全球性常见传染病。1958年首次报道了发生于新西兰的病例，同年分离出主要病原CA16，1969年首次确认另一个重要病原体EV71，之后EV71与CA16交替出现，成为HFMD的主要病原体。HFMD的病原还包括其他多种肠道病毒。近年来EV71感染在我国大陆呈现上升趋势，分离的EV71毒株皆属C4基因亚型。

疾病感染：手足口病、中枢神经系统感染及疱疹性咽峡炎是EV71感染引起的常见临床症状，但在EV71流行过程中的表现差异很大。20世纪70年代欧洲爆发的EV71中患者症状主要表现为脑炎和脊髓灰质炎样麻痹，HFMD症状很少见；而同期日本流行的EV71主要表现为HFMD症状。在1998年台湾地区EV71流行中，中枢神经系统感染者中有80％同时患HFMD，而同期澳大利亚的这个比例只有7％。急性咽峡炎在中国香港地区、日本和中国台湾地区的EV71流行中都曾有报道。EV71引起的神经源性肺水肿主要分布于亚太地区EV71流行的大量病例中。发热和急性呼吸道疾病是幼儿EV71感染的又一常见临床症状，在澳大利亚、加拿大和1998年中国台湾的EV71流行中都有报道。

流行病学：(1)全球概况：1975年，保加利亚发生EV71大流行，共有705名患儿受到感染，死亡44例，93％的重症病例和83.8％的死亡病例发生在5岁以下人群。1978年匈牙利发生EV71疫情，出现826例无菌性脑膜炎和724例脑炎病例，死亡45例。1972-1999年日本、澳大利亚与马来西亚均发生多次EV71大流行。2003-2007年越南爆发三次大规模EV71疫情。近30多年间世界发生的HFMD大流行都是由EV71感染引起的，EV71已成为全球范围内最重要的中枢神经毒性病毒病原。(2)中国大陆概况：我国常见的HFMD发病形式有流行和散发两种。1987年在湖北省HFMD流行期间首次发现EV71感染。1995年武汉病毒研究所从HFMD病人中分离出EV71。1998与2000年台湾地区和山东省招远市先后暴发EV71感染引起的HFMD。2002年4-6月上海市发生HFMD。2004年3-7月深圳市发生HFMD聚集性病例10起。2006年我国报告HFMD病例13,637例，死亡6例。2007年报告83,344例，死亡17例；2008年HFMD居全国报告的丙类传染病发病数第二位，死亡数的首位，报告病例489,073例，重症1,165例，死亡126例，重症与死亡病例中EV71感染率分别为81.59％与96.43％。截至2009年9月底，全国累计报告HFMD例970,477例，重症12,861例，死亡317例。

甲型肝炎：甲型肝炎是由HAV引起的肝脏急性，发病率与社会经济发展水平密切相关，不同地区人群抗HAV抗体阳性率不同(15％-100％)。估计每年有150万甲型肝炎临床病例发生。HAV感染后可诱导产生终生免疫。在低度流行区甲型肝炎通常会在高危人群中以单个病例形式出现或呈小规模爆发，在高度流行区多数人在儿童期已获得隐性感染而临床病例较少见。在中、低度流行国家成人病例更为常见。

疾病感染：HAV本身不导致细胞病变，肝细胞损害是由白细胞介导的免疫反应所致。急性甲型肝炎与其他类型的急性病毒性肝炎难以区分，典型症状包括：发热、不适、厌食、呕吐和腹部不适，随后出现尿色加深和黄疸。约有0.01％的临床病例会出现爆发性肝炎，病死率很高。HAV引起的急性肝炎并发症较少，引起的肝外并发症较多。HAV不会引起慢性感染，目前无特异性抗病毒治疗方法。甲型肝炎的病死率为0.015％，感染临床表现与患病年龄有关，5岁以内幼儿90％以上不出现明显症状；15岁左右的青少年约有25％有症状；成年人则90％以上症状和体征明显。大年龄组人群疾病严重程度增加、死亡率增高。

流行病学：(1)全球概况：人体感染HAV后出现抗HAV抗体，血清抗体阳性率可作为人群的病毒传播标志。北欧血清抗体阳性率最低约15％，欧洲其他地区、澳大利亚、日本和美国，40％-70％的成人血清抗体阳性。发展中国家所有成人几乎都有既往感染的血清学证据。(2)中国大陆概况：中国是甲型肝炎的高发区，城市人群感染率＞80％，农村人口感染率＞90％。1990～2009年全国甲型肝炎发病总体呈逐年下降趋势，发病数由584,353例下降至43,841例；发病率由52.58/10万下降至3.28/10万。我国全年均有甲型肝炎发病，呈现春季高发现象，但发病流行高峰不明显。发病年龄主要集中在青壮年和儿童中，男性发病多于女性。2004年爆发26起，2005年爆发33起，2006年爆发43起，发病数依次为2,291例、2,061例和1,808例。

甲型肝炎疫苗已经上市多年，我公司生产的肠道病毒71型灭活疫苗业已获准进行临床试验。

发明内容

本发明旨在提供一种EV71与HAV联合疫苗及其制备方法。

为实现本发明的目的，本发明首先提供一种EV71与HAV联合疫苗，其包含灭活EV71以及灭活HAV。在另一个实施方案中，还包括铝佐剂。

其中所述的灭活EV71抗原含量为25～1600U/ml(EV71抗原含量检测用EV71抗原参比品可购自中国食品药品检定研究院)；灭活HAV抗原含量的半数有效量(指引起50％实验对象出现阳性反应时的药量，ED₅₀)为不高于125u，优选为25～2000u/ml。优选的灭活EV71抗原含量为50～800U/ml，灭活HAV抗原含量为100～1000u/ml。

在本发明的一个实施方案中，所述的铝佐剂优选为氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。联合疫苗中铝含量终浓度为0.125～2.0mg/ml，优选的铝含量终浓度为0.25～1.0mg/ml。本发明所用的铝佐剂，可以市售获得也可以采用已知方法进行制备，该佐剂为本领域技术人员所熟知，易于获得和制备。

本发明中，所述灭活EV71毒株可选用本领域公知的任何适用于本发明的EV71病毒的基因型，优选为A、B、C基因型，病毒培养用细胞为Vero细胞或者2BS细胞；灭活HAV毒株可选用本领域公知的任何适用于本发明的HAV疫苗株，优选为TZ84株、YN5株、HM175株和吕8株，培养用细胞为Vero细胞或2BS细胞。

本发明的另一个目的在于提供所述联合疫苗的制备方法，其包括：将灭活EV71和灭活HAV分别吸附于铝佐剂，将上述两种灭活病毒的吸附产物混合制得EV71与HAV联合疫苗；或者将灭活EV71与灭活HAV混合后再与铝佐剂进行吸附；或者先将灭活EV71与铝佐剂进行吸附以后再加入灭活HAV进行吸附；或者先将灭活HAV与铝佐剂进行吸附以后再加入灭活EV71进行吸附。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明的疫苗可以同时预防由EV71引起的手足口病、中枢神经系统感染及疱疹性咽峡炎、神经源性肺水肿和急性呼吸道疾病及HAV引起的甲型肝炎。动物实验表明，联合疫苗中EV71的免疫原性高于EV71灭活疫苗的免疫原性。EV71与HAV病毒均为单链小RNA病毒，结构不稳定易发生变异，一般RNA病毒变异速度比DNA病毒快一到两个数量级；由于灭活疫苗的安全性较高，因此采用EV71、HAV病毒分别培养、灭活后制备灭活疫苗优于减毒疫苗。EV71与HAV灭活病毒的病毒外壳完整，构象保持较好，可以使机体产生较高的免疫原性诱导出特异性中和抗体，EV71与HAV灭活病毒制备联合疫苗优于重组病毒。

EV71病毒为肠道病毒71型，HAV为肠道病毒72型，由两种肠道病毒制备的联合疫苗具有肠道病毒类疾病更大的保护范围；同时由于两种病毒均采用接种细胞后培养纯化的方式制备，具有相似的生产工艺便于工业生产，同时由于均是灭活病毒，联合疫苗具有更高的安全性。

含有两种及以上的抗原，可以同时预防两种及以上疾病的联合疫苗以其方便多效、成本低成为新一代疫苗研制的热点，与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，减少生产运输储存和销售冷链运作的运输与保存成本，具有显著的优越性。本发明的联合疫苗使用了经充分证明具有良好安全性及免疫原性的HAV灭活疫苗，可大大减低疫苗的生产成本和市场价格。同时该联合疫苗吸附完全，理化性质稳定，相互干扰作用。

动物实验表明，根据本发明EV71与HAV联合疫苗的优选实施方案制备的EV71与HAV联合疫苗可有效诱导机体产生针对EV71和HAV的高滴度、特异性抗体，体外实验证实该联合疫苗所诱导的抗体具有明显的反应性与中和活性；特别的联合疫苗中EV71的与免疫效果不受另一组分的影响与干扰，吸附率大于95％，免疫原性不劣效于EV71灭活疫苗和HAV灭活疫苗的两种单价疫苗。本发明提供的联合疫苗具有与两种单价疫苗相同的免疫原性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：灭活EV71原液的制备

培养待接种Vero细胞至长成致密的单层后进行细胞消化，1∶8稀释传代培养至长成单层后接种病毒，EV71灭活疫苗病毒种子按照1∶10²CCID₅₀/ml接种于长好的Vero细胞，于33±1℃培养15天，根据细胞病变情况收获培养后的细胞病毒上清得到EV71病毒收获液。收获液采用终浓度不超过250μg/ml的甲醛灭活不低于6天，然后通过超滤与柱层析等纯化方式进行纯化，合并层析纯化液超滤浓缩后除菌过滤，得到灭活EV71原液。

实施例2：灭活HAV原液的制备

采用含有新生牛血清的Eagle’s MEM培养基培养2BS细胞，细胞长好后经过细胞消化与稀释传代培养后，接种0.05～1.0MOI的TZ84株、YN5株、HM175株和吕8株的HAV培养，培养期间根据细胞生长情况换维持液，维持液为含有新生牛血清的Eagle’s MEM培养基。培养至病毒增殖高峰期后，采用胰蛋白酶或其他适宜方法消化含有HAV的细胞，经过离心或者过滤的方法收集病毒收获液。采用超滤法浓缩病毒，再用色谱层析法纯化病毒；除菌过滤后用终浓度不超过250μg/ml的甲醛于37±1℃灭活12天，灭活后的病毒液为灭活HAV原液。

实施例3：EV71与HAV联合疫苗制备

吸附方式1：将稀释后的灭活HAV和稀释后灭活EV71分别用铝佐剂吸附后，混合两种灭活病毒的吸附产物，制成EV71与HAV联合疫苗。

吸附方式2：将稀释后的灭活HAV先用铝佐剂吸附后，再加入稀释后的灭活EV71进行吸附，制成EV71与HAV联合疫苗。

吸附方式3：将稀释后灭活EV71先用铝佐剂吸附，再加入稀释后灭活HAV进行吸附，制成EV71与HAV联合疫苗。

吸附方式4：将稀释后的灭活HAV与稀释后灭活EV71先混合，然后将混合液加入铝佐剂进行吸附，制成EV71与HAV联合疫苗。其中EV71抗原含量为400U/ml、200U/ml、100U/ml，HAV抗原含量为500u/ml；铝佐剂终浓度为0.4mg/ml。

检测四种吸附方式制备的EV71与HAV联合疫苗的吸附完全性、解离抗原以及体内效力。EV71与HAV抗原吸附效果与解离抗原分别采用EV71与HAV抗原双抗体夹心酶联免疫法检测，检测灵敏度分别为5U/ml、15.6u/ml；EV71体内效力试验将联合疫苗采用0、14天两针腹腔免疫ICR小鼠，第28天采血，以细胞病变法检测血清中抗EV71中和抗体滴度。HAV体内效力试验将联合疫苗1∶8、1∶32、1∶128稀释后1ml/只腹腔免疫ICR小鼠，第28天采血，用甲肝抗体测定试剂盒检测抗HAV抗体效价，根据抗体阳转率计算ED₅₀。结果见下表。

抗原吸附完全性与ED₅₀、EV71解离抗原回收率计算方法如下：

吸附完全性：

疫苗的吸附完全性反应疫苗中没有被铝佐剂捕获的游离的抗原含量占疫苗中总的理论抗原含量的比值，结果越高显示疫苗的吸附效果越好。

ED₅₀：50％阳转终点对数＝高于50％阳转率稀释对数+距离比例×稀释对数的因数

ED₅₀＝疫苗单位剂量/50％阳转终点疫苗稀释度(阳转终点反对数)

ED₅₀数值越低显示该疫苗使一半数量的小鼠产生抗体所用的抗原量越低，疫苗的免疫原性越好。

EV71解离抗原回收率：疫苗解离后EV71抗原含量的检测值与该疫苗的EV71抗原含量理论值的比值或者百分比。回收率为1时，表明解离后检测到的抗原含量与疫苗理论加入的抗原含量相等。

表1四种吸附方式制备EV71与HAV联合疫苗检测结果

结果可见，四种配制工艺制备的EV71与HAV联合疫苗的吸附效果较好，均超过95％；体外相对效力结果无统计学差异。同时，EV71的体内效力试验与EV71抗原含量具有较高的一致性。

采用磷酸铝与硫酸铝，调整铝凝胶佐剂的铝含量至4.0mg/ml；制备EV71与HAV联合疫苗，联苗中含EV71抗原为1600U/ml，甲型肝炎灭活病毒抗原为50u/ml，铝含量为2.0mg/ml，亦得到相似结果。

实施例4：不同铝凝胶佐剂浓度的研究

将灭活EV71用0.01mol/L PBS稀释后与稀释后的氢氧化铝佐剂混合吸附，EV71抗原含量终浓度分别为：1600U/ml、400U/ml、100U/ml、25U/ml，铝终浓度为0.125mg/ml、0.5mg/ml、2.0mg/ml，比较灭活EV71的吸附效果(吸附完全性)及EV71解离后抗原含量。将灭活HAV用0.01mol/L PBS稀释后与稀释后的铝佐剂混合吸附，使灭活HAV抗原含量分别为：2000u/ml、400u/ml、50u/ml，铝终浓度为0.125mg/ml、0.5mg/ml、2.0mg/ml，比较灭活HAV的吸附效果及HAV解离后抗原含量。

检测方法：EV71与HAV上清抗原含量与解离抗原含量分别采用EV71与HAV抗原含量双抗体夹心酶联免疫法进行检测，试剂盒的检测下限分别为5U/ml与15.6u/ml。结果见下表。

表2不同铝浓度EV71吸附产物与HAV吸附产物吸附效果

结果可见：EV71抗原含量终浓度在25～1600U/ml、铝含量在0.125～2.0mg/ml时，EV71抗原上清中的抗原含量小于该方法的检测灵敏度；在此铝终浓度范围内可吸附的EV71抗原范围为不小于25～1600U/ml；HAV抗原含量在50～2000u/ml、铝终浓度在0.125～2.0mg/ml时，HAV抗原吸附上清中的抗原含量均低于检测方法的检测灵敏度，在此铝终浓度范围内可吸附的HAV抗原范围为不小于50～2000u/ml。

实施例5：EV71与HAV联合疫苗中灭活EV71组分研究

(1)EV71与HAV联合疫苗灭活EV71吸附效果研究

试验方法：联合疫苗和EV71灭活疫苗分别离心后，保留上清，沉淀中加入解离缓冲液解离2小时，然后采用EV71抗原双抗体夹心酶联免疫法检测吸附上清与疫苗解离后的EV71抗原含量。吸附完全性计算公式见实施例3。检测的抗原含量与理论抗原含量的比值即为抗原回收率。

(2)EV71与HAV联合疫苗灭活EV71免疫效果研究

试验方法：将联合疫苗和EV71灭活疫苗分别0、14天二针腹腔免疫ICR小鼠，0.5ml/只，10只/组。第28天采血分离血清，检测血清中的抗EV71中和抗体滴度。统计分析抗EV71抗体滴度，比较联合疫苗与单价疫苗的EV71免疫原性。

结果：(1)EV71与HAV联合疫苗和EV71灭活疫苗吸附效果与解离抗原含量结果与统计分析结果如下：

表3EV71与HAV联合疫苗灭活EV71组分体外相对效力结果

结果可见两种疫苗解离后的EV71抗原含量之间的Z值小于1.96，无显著性差异。联合疫苗与EV71灭活疫苗的吸附效果较高，检测结果均小于试剂盒检测灵敏度。

(2)EV71与HAV联合疫苗灭活EV71免疫效果结果

三个EV71剂量的联合疫苗和EV71灭活疫苗两针腹腔免疫小鼠，第28天均可以使小鼠产生一定水平的抗EV71中和抗体，中和抗体滴度与免疫剂量具有量效关系，符合免疫学的基本规律。采用统计学分析方法比较相同EV71抗原含量时两种疫苗的抗血清对于EV71的中和抗体滴度的GMT值，计算是否存在显著性差异。结果见下表。

表4EV71与HAV联合疫苗和EV71灭活疫苗效力试验抗体滴度结果

上述结果可见，EV71与HAV联合疫苗比EV71灭活疫苗中的EV71中和抗体高，两者的Z值大于2.58，具有显著性差异，说明联合疫苗中的EV71抗体效价增强，分析HAV对其具有佐剂效果。

实施例6：EV71与HAV联合疫苗灭活HAV组分研究

(1)EV71与HAV联合疫苗灭活HAV吸附效果与体外相对效力研究：将联合疫苗和HAV灭活疫苗分别离心后，保留上清，对沉淀进行解离，然后采用HAV抗原双抗体夹心酶联免疫法测定吸附上清与解离后疫苗的HAV体外相对效力。吸附完全性计算公式见实施例3，体外相对效力采用体外相对效力公式计算。

(2)EV71与HAV联合疫苗灭活HAV免疫效果研究

将联合疫苗和HAV灭活疫苗分别1∶8、1∶32、1∶128稀释腹腔免疫ICR小鼠，1ml/只，10只每组，第28天采血，血清采用甲肝抗体测定试剂盒测定抗HAV抗体效价，根据抗体阳转率计算ED50，比较联合疫苗与单价疫苗的HAV免疫原性。

结果：(1)EV71与HAV联苗和HAV灭活疫苗体外相对效力结果，见下表：

5EV71与HAV联合疫苗灭活HAV组分体外相对效力结果

由表5可见，EV71与HAV联苗和HAV灭活疫苗体外相对效力均符合不低于0.75的规定，两者的Z值为0.99，小于1.96，两者无显著性差异。

(2)EV71与HAV联合疫苗与HAV灭活疫苗免疫效果研究

EV71与HAV联合疫苗和HAV灭活疫苗效力试验结果见表6。

表6EV71与HAV联苗和HAV灭活疫苗效力试验结果

由表6可见，联合疫苗和HAV灭活疫苗效力试验的ED₅₀均远远低于125u的规定，EV71与HAV联合疫苗和HAV灭活疫苗中的HAV免疫效果无显著性差异。

上述试验结果表明，不同剂量灭活后的HAV与EV71制备的联合疫苗与单价疫苗吸附效果好，低于检测下限；联合疫苗的HAV免疫原性与HAV灭活疫苗的免疫原性均远小于125u/ml的质量标准；联苗的EV71免疫原性高于EV71灭活疫苗的免疫原性，具有显著性差异；表明联苗对EV71的免疫原性具有增效作用。

实施例7：EV71与HAV联合疫苗的稳定性研究

制备EV71与HAV联合疫苗：EV71抗原200U/0.5ml，HAV250u/0.5ml；EV71抗原100U/0.5ml，HAV 250u/0.5ml；EV71抗原50U/0.5ml，HAV 250u/0.5ml。对其进行2～8℃长期稳定性试验和37℃热加速试验。长期稳定性试验于0、3、6、9个月进行检测。热加速试验于16天与32天检测。考察联合疫苗的理化性质、生物学特性、免疫原性和安全性。

检测方法：按照《中华人民共和国药典》2010年版三部中要求的方法进行样品检测。其中，EV71抗原含量采用EV71抗原含量双抗体夹心酶联免疫法检测，HAV抗原采用HAV抗原含量双抗体夹心酶联免疫法检测。免疫原性试验同实施例5、6。

结果：

1、37℃加速稳定性试验：EV71与HAV联合疫苗经37℃热加速的样品，0天与32天的外观、无菌检查与异常毒性检查均合格，铝含量为0.39～0.40mg/ml，装量为0.55～0.56ml/支，细菌内毒素含量均小于1EU/ml。采用酶联免疫法检测EV71解离抗原含量与HAV体外相对效力，结果均无明显降低。热加速32天时EV71与HAV体内效力均符合规定。结果见表7。

表7EV71与HAV联合疫苗37℃加速稳定性试验结果

2、2～8℃长期稳定性试验结果

EV71与HAV联合疫苗2～8℃放置0天与6个月时外观、无菌检查与异常毒性检查均合格，铝含量为0.39～0.40mg/ml，装量为0.55～0.56ml/支，细菌内毒素均小于1EU/ml。3、6、9个月检测EV71解离抗原计算回收率，检测HAV体外相对效力，结果均无明显降低。6个月时EV71与HAV的体内效力结果均符合规定。详见表8。

表8EV71与HAV联苗2～8℃长期稳定性试验结果

/表示对此项目不进行检定

EV71与HAV联合疫苗在37℃放置32天，EV71解离抗原含量与HAV体外相对效力测定结果均未见明显下降，体内效力试验结果均符合规定，其他各理化检项、生物学指标与安全性指标均无变化，符合规定。2～8℃放置9个月疫苗各项检测指标均符合标准。结果显示，联合疫苗经热加速后稳定好、安全高、有效未发生变化。

实施例8：EV71与HAV联合疫苗保护剂研究

按照确定的生产工艺配制EV71与HAV联合疫苗，同时配制含有0.5～0.7％(W/V)终浓度的明胶的EV71与HAV联合疫苗。EV71理论抗原含量为50U、HAV理论抗原为250u。研究保护剂对联合疫苗的稳定性的作用，确定是否添加保护剂。将两种疫苗进行37℃加速稳定性研究，分别于0、16、32天检测EV71解离抗原含量与HAV体外相对效力，并检测联合疫苗的HAV与EV71的体内效力，这两个检项直接反映疫苗的抗原性与免疫原性。

检测方法：EV71抗原含量检测采用EV71抗原含量双抗体夹心法检测试剂盒，HAV体外相对效力采用HAV抗原含量双抗体夹心法酶联免疫试剂盒。EV71体内效力试验将联合疫苗于0、14天二针腹腔免疫ICR小鼠，0.5ml/只，10只/组。第28天采血分离血清，采用细胞病变法检测血清中的抗EV71中和抗体滴度。HAV体内效力试验将联合疫苗1∶8、1∶32、1∶128稀释腹腔免疫ICR小鼠，1ml/只，10只每组，第28天采血，血清采用甲肝抗体测定试剂盒测定抗HAV抗体效价，根据抗体阳转率计算HAV疫苗的ED50。

结果表明：添加与未添加明胶作为稳定性保护剂的EV71与HAV联合疫苗在37℃进行热加速稳定试验时，放置0、16、32天时甲肝体外相对效力、EV71解离抗原回收率、甲肝效力试验、EV71效力试验结果均在该类试验允许的误差范围内，均无明显下降趋势。添加的疫苗的稳定性未显示出比为添加有明显优势。说明，EV71与HAV联合疫苗稳定性良好；不添加明胶时亦可保持良好的稳定性。

结果详见表9。

表9EV71与HAV联合疫苗37℃加速稳定性试验结果

明胶作为一种常见的稳定性保护剂，曾被广泛添加于各类疫苗中增加疫苗的稳定性。但是明胶作为一种动物源原辅料，对人体会产生一定的副反应，目前国内外的官方机构对于明胶、人血清白蛋白等动物源物质虽未全面禁止，但是均表示不推荐使用。以上结果显示，EV71与HAV联合疫苗不添加明胶类保护剂时稳定性良好，添加明胶后亦未显示出显著优势。因此该联合疫苗配制不添加稳定性保护剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种肠道病毒71型与甲型肝炎联合疫苗，其特征在于，包括灭活肠道病毒71型病毒和灭活甲型肝炎病毒；还包括铝佐剂；

所述的灭活肠道病毒71型病毒的抗原含量为25~1600U/ml；所述的灭活甲型肝炎病毒的抗原含量为25~2000u/ml；所述的铝佐剂的铝含量为终浓度0.125~2.0mg/ml。

2.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述的铝佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。

3.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述的灭活肠道病毒71型病毒为肠道病毒71型病毒A、B或C基因型。

4.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述的灭活甲型肝炎病毒选自甲型肝炎病毒TZ84株、YN5株、HM175株和吕8株。

5.根据权利要求1或2所述的联合疫苗，其特征在于，所述的铝佐剂的铝含量终浓度为0.25~1.0mg/ml。

6.权利要求1~5任一项所述的联合疫苗的制备方法，其特征在于：将灭活肠道病毒71型病毒与灭活甲型肝炎病毒分别吸附于铝佐剂，制备病毒铝吸附产物，然后将铝吸附产物混合制备联合疫苗；或者将灭活肠道病毒71型病毒与灭活甲型肝炎病毒混合后再与铝佐剂进行吸附；或者先将灭活肠道病毒71型病毒与铝佐剂进行吸附以后再加入灭活甲型肝炎病毒进行吸附；或者先将灭活甲型肝炎病毒与铝佐剂进行吸附以后再加入灭活肠道病毒71型病毒进行吸附。

7.权利要求1~5任一项所述的联合疫苗在制备预防或治疗肠道病毒71型病毒和甲型肝炎病毒引起的疾病的药物中的应用。