CN108853490A - 一种预防手足口病和甲型肝炎的联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防手足口病和甲型肝炎的联合疫苗及其制备方法，本联合疫苗包含灭活的EV71抗原、灭活的CA16抗原和灭活的HAV抗原；通过分别将肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)以及用甲型肝炎病毒(HAV)通过接种人二倍体细胞经培养、病毒收获、纯化、灭活后制成病毒原液；再将灭活后的EV71、CA16和HAV病毒原液加入含铝佐剂吸附稀配合并，从而制得EV71‑CA16‑HAV预防手足口病和甲型肝炎联合疫苗。本发明提供的EV71‑CA16‑HAV三联疫苗，能同时满足EV71和CA16两种病毒型的手足口病及HAV型甲型肝炎的预防疫苗，解决了现有技术中需要分别注射的问题，通过两针次的接种，能大大减少传统的接种次数，降低了使用成本，有效降低了接种次数带来的风险。

Description

一种预防手足口病和甲型肝炎的联合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗制备领域，特别涉及一种预防手足口病和甲型肝 炎的联合疫苗及制备方法。

背景技术

手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)是长期而且普遍流 行于婴幼儿及学龄前儿童群体中的一种病毒性传染病，近年来在我国 呈暴发流行趋势。手足口病自2008年卫生部已将其纳入丙类传染病 管理至2017年底，发病率及病死率一直居丙类传染病之首。累计发 病1636万余例、死亡3558人，分别占丙类传染病发病及死亡人数的 53.98％及82.49％，发病率为133.33/10万。

引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以肠道病毒71型 (Enterovirus71,EV 71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA16)最为常见。EV71和CA16常交替或共同流行，成为手足口病的 主要病原体。国家CDC对2009年手足口病样品进行分析，确诊普通 病例中EV 71感染占40.63％，CA16感染占37.55％，而EV71感染造 成的重症和死亡病例分别达80.60％和92.80％，占绝对优势。全国不 同省份的监测结果也得出了相似的结论。

另一方面，甲型肝炎疾病仍然在我国存在威胁，1988年上海发 生了一起震惊全国的甲型肝炎大流行，发病人数高达310746例，死 亡47人，直接经济损失超过10亿元人民币，是历史上最大的一次甲 型肝炎大流行，造成了严重的经济损失及社会恐慌。我国1992年开始至1996年在全国第二次病毒性肝炎流行病学调查工作，全国30个 省、市、自治区进行了调查，结果显示甲型肝炎人群总感染率为80.9％， 省、市间最高流行率93％，最低为50％。

1992年中国医学科学院医学生物学研究所研制的甲型肝炎减毒 活疫苗在国内首家获得上市批准，2003年甲型肝炎灭活疫苗获得上 市批准，2007年我国将甲肝疫苗纳入国家免疫规划。随着社会经济 发展和甲肝疫苗的成功应用，使甲肝发病人数从1991年的60余万人 降到2013年的2万余人，降低了96.4％；发病率从1991年的55.69/10 万降到2013年的0.35/10万，降低了99.36％，充分表现出疫苗的有 效性。

目前，联合疫苗是疫苗发展的必然趋势。

联合疫苗开发的目的是在减少疫苗注射次数的同时预防更多种 类的疾病，其意义不仅可以提高疫苗覆盖率和接种率、减少多次注射 给婴儿和父母所带来身体和心理的痛苦、减少疫苗管理上的困难、降 低接种和管理费用，还可减少疫苗生产中必含的防腐剂及佐剂等剂量、 减少了接种次数，因而减低疫苗的不良反应发生机会等，所以联合疫 苗具有明显的优势，是疫苗发展的大趋势。

在我国，新生儿4岁前仅计划免疫就要接种约23剂次疫苗，再 加上自费疫苗，接种次数可达30余剂次，频繁接种，占用了大量医 疗资源，给孩子带来痛苦，给家长带来不便，也增加了不良反应风险 和交叉感染机会。

甲型肝炎是HAV引起的一种肠道传播性肝炎，经粪-口途径传播， HAV感染流行多见于亚洲和非洲地区；HFMD的爆发与流行也呈现出类 似的特征，而且HAV、EV71、CA16的天然宿主都是人类，并且同属小 核糖核酸科，在病毒结构、理化性质、繁殖和感染特性方面均有类似 之处，此外，HAV和EV71灭活疫苗的免疫程序相近，加之三者可以 共享安全性和免疫原性评价的动物模型，因此从理论上说三者的联合 是可能的。目前虽已有EV71-CA16联合疫苗的研究报道，但未见三者 联合的报道。按现行免疫程序，三类灭活疫苗(已批准上市或实验性 疫苗)均采用两针免疫程序，完成全部免疫需要接种6针，若采用HAV-EV71-CA16联合疫苗则只需要接种2针即可，不仅减少了接种次 数，同时也降低了使用成本，其意义不言面喻。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够同时针对预防甲型肝炎和预防手 足口病及其制备方法，且免疫原性良好、安全稳定，能有效减少接种 次数，降低使用成本的三联疫苗。

为解决上述问题，本发明的第一方面提供了一种预防手足口病和 甲型肝炎的联合疫苗，本联合疫苗包含灭活的EV71抗原、灭活的CA16 抗原和灭活的HAV抗原，即本发明提供了一种EV71-CA16-HAV三联疫 苗。

本发明的另一方面，还提供了一种预防手足口病和甲型肝炎的联 合疫苗的制备方法，其制备步骤包括：分别将肠道病毒EV71型、CA16 型以及用甲型肝炎病毒通过接种人二倍体细胞经培养、病毒收获、纯 化、灭活后制成病毒原液；再将灭活后的EV71、CA16和HAV病毒原 液加入含铝佐剂吸附稀配合并，得EV71-CA16-HAV预防手足口病和甲 型肝炎联合疫苗。

进一步的，所述加入含铝佐剂吸附稀配合并的步骤还包括：添加 甘氨酸，并用2mmol/L的PBS稀释至EV71、CA16和HAV病毒原液 按含量配比分别为300～500U/ml、300～500U/ml及600～800EU/ml， 铝含量浓度为0.25～0.45mg/ml、甘氨酸浓度为3.0～4.0mg/ml。

进一步的，所述加入含铝佐剂吸附稀配合并的步骤还包括：吸附 时溶液pH值在6.0～6.50之间，且其上清液中三种病毒抗原含量均 应不高于吸附抗原总量的5％。

进一步的，所述EV71病毒原液的制备还包括：用肠道病毒71型 (EV71)FY-23K-B株接种于人二倍体KMB17细胞，经细胞培养，按 0.05～0.20MOI接种至长成单层的KMB17细胞，置37±0.5℃培养， 培养48～96小时至完全病变时收获EV71病毒液，经浓缩灭活后用柱 色谱法进行病毒纯化，得EV71病毒原液。

进一步的，所述CA16病毒原液的制备还包括：按0.10～0.60MOI 接种CA16病毒至长成单层的KMB17细胞，置37±0.5℃培养，培养3～ 6天至完全病变时收获，得单一病毒液；同一细胞批生产的单一病毒 液合并成为病毒收获液，病毒收获液合并及超滤浓缩：病毒收获液经 0.65μm滤膜过滤澄清后，使用100KD的超滤膜进行50～100倍浓 缩成为浓缩病毒液，用柱色谱法进行病毒纯化收集纯化物即为纯化病 毒液，经灭活后，得CA16病毒原液。

进一步的，所述HAV病毒原液的制备还包括：用甲型肝炎病毒吕 8株接种人二倍体细胞KMB17株，按0.05～1.0MOI接种于KMB17细 胞进行培养，培养到期，收获病毒液，经提取、超滤浓缩后利用层析 纯化后灭活处理，得HAV病毒原液。

进一步的，所述CA16病毒为K168/8毒株。

本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：

1.本发明提供的EV71-CA16-HAV三联疫苗，能同时满足EV71和 CA16两种病毒型的手足口病及HAV型甲型肝炎的预防疫苗，解决了 现有技术中需要分别注射的问题，通过两针次的接种，能大大减少传 统的接种次数，降低了使用成本，有效降低了接种次数带来的风险；

2.本发明提供的EV71-CA16-HAV三联疫苗制备方法工艺稳定， 经过纯化灭活，提高了疫苗的安全性，实现了完全灭活，且吸附效果 明显，制备过程稳定；

3.本发明提供的EV71-CA16-HAV三联疫苗，经一剂免疫后，抗 体阳转率均达到100％，其HAV抗体大于1000mIU/m、EV71中和抗体 效价大于1：32、CA16中和抗体效价大于1：128；各组分抗体水平 与单一抗原成分的对照组之间均无统计学差异；经两剂免疫后，其HAV抗体大于2000mIU/m、EV71中和抗体效价均大于1：128、CA16 中和抗体效价均大于1：1024；各组分抗体水平与单一抗原成分的对 照组之间均无统计学差异。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具 体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示 例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了 对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。若未 特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂盒仪器等均可市售 获得，若未具体指明的，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人 员所熟知的常规手段。

甲型肝炎病毒、肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型在分类上均 同属小核糖核酸科，在病毒结构、理化性质、繁殖和感染特性方面均 有类似之处；其生物学特性、致病机理及免疫机理有许多相似之处， 所以进行此三个抗原成分的联疫苗研究具有科学性。

本发明中所述的肠道病毒71型(EV71)FY-23K-B株，EV71灭活疫 苗原液生产用毒种为EV71病毒经人二倍体细胞KMB17株适应的 FY-23K-B株，属C4基因亚型。为中国医学科学院医学生物学研究所 分离并建立并保存的EV71灭活疫苗生产用毒株，已被批准用于疫苗 生产，且在注册标准及相关论文中已公开；FY-23K-B株为采集自 2008年5月安徽阜阳手足口病暴发流行时一患儿呼吸道分泌物标本， 在Vero细胞上分离，经人二倍体KMB17细胞适应传代、并经过2次 克隆纯化获得。该疫苗生产基于病毒种子批系统，原始种子批、主种子批及工作种子批均在人二倍体细胞KMB17株上传代制备，于 37℃±0.5℃培养3～6天收获病毒液，于-60℃以下冻存。FY-23K-B 株原始种子批为第12代、主种子批为第14代、工作种子批为第16 代。主种子批用于制备工作种子批，工作种子批毒种用于疫苗生产。

本发明中所用CA16病毒，CA16灭活疫苗原液生产用毒种为CA16 病毒经人二倍体细胞KMB17株适应的K168/8株，属B1b基因亚型。 由中国医学科学院医学生物学研究所分离并建立保存，K168/8株为 采集自昆明市手足口病患儿咽试子标本，经人二倍体KMB17细胞株适 应传代、并经过2次蚀斑克隆纯化获得。由中国医学科学院医学生物 学研究所分离及保存。疫苗生产基于病毒种子批系统，原始种子批、 主代种子批及工作种子批均在不超过32代的人二倍体细胞KMB17株 上传代制备；于37℃±0.5℃培养3～6天收获病毒液，于-60℃以下 冻存。K168/8株原始种子批毒种为第10代、主代种子批毒种为第13 代、工作种子批毒种为第16代；工作种子批毒种用于疫苗生产。现 已在相关论文中充分记载及公开；

本发明中所述人二倍体KMB17细胞为中国医学科学院医学生物 学研究所建立的人二倍细胞细胞株，已被批准用于疫苗生产，并由《中 国药典》收载，现已公开。为另建立并存存的人二倍体细胞；

本发明中所述的甲型肝炎病毒吕8株，分离自1998年上海甲肝暴 发流行时一患儿临床标本，由中国医学科学院医学生物学研究所分离 及保存。现已公开，且被《中国药典》收载。疫苗生产基于病毒种子 批系统，原始种子批为第24代，主种子批为第25代，工作种子批为 第30代。取原始种子批毒种接种于KMB17细胞，于35℃±0.5℃培 养22～26天，至病毒增殖高峰期收集病毒，于-60℃以下冻存。按上 述过程分别制备主种子批和工作种子批。

实验例1：EV71疫苗原液的制备

用于三联疫苗制备的EV71疫苗原液，系用肠道病毒71型 (EV71)FY-23K-B株接种于人二倍体KMB17细胞，经培养、病毒收获、 灭活、纯化制成。用于预防EV71感染引起的手足口病。

1)病毒收获液制备

细胞培养液：使用含5％～10％新生牛血清的MEM作为细胞生长培 养液，其中含有终浓度为100U/ml的硫酸卡那霉素、0.06％的谷氨酰 胺；接种病毒后的细胞维持液为含有0.06％谷氨酰胺的MEM培养液, 不含新生牛血清及任何抗生素；

细胞培养容器为细胞工厂，用于病毒培养的细胞代次为32代；

取工作种子批毒种按0.05～0.20MOI接种至长成单层的KMB17 细胞，置37±0.5℃培养，培养48～96小时至完全病变时收获病毒 液，同一细胞批生产的病毒液合并为病毒收获液。

2)病毒灭活

在病毒收获液中加入甲醛溶液(甲醛终浓度至250μg/ml)，于 37.0℃灭活72小时，病毒灭活到期后成为灭活病毒液；灭活病毒液 经0.65μm滤膜过滤澄清后，使用100KD的超滤膜进行浓缩、并用10 mmol/L PBS冲洗滤膜，浓缩倍数为40～70倍成为浓缩灭活病毒液。

3)病毒纯化

采用柱色谱法进行病毒纯化，凝胶介质为Sepharose 6FF，浓缩 灭活病毒液上样量为800ml，缓冲液为2mmol/L的PBS、流速为 200ml/min，在280nm紫外光监测下，收集纯化物即为纯化病毒液； 纯化病毒液经0.2μm滤膜除菌过滤即为原液，待用。

实验例2：CA16灭活疫苗原液制备

1)病毒收获液制备

细胞培养：使用细胞工厂为培养容器，按10±3万/ml细胞浓度 接种于细胞工厂(培养液为200ml±10ml/层)，于37℃±0.5℃静置 培养，经传代扩增至32代用于疫苗的生产。

培养液：细胞生长液为含5％～10％新生牛血清的MEM培养液， 其中含有终浓度100U/ml的硫酸卡那霉素、0.06％的谷氨酰胺；接种 病毒后的细胞维持液为含有0.06％谷氨酰胺的MEM培养液，不含新生 牛血清及任何抗生素。

病毒收获液制备：取工作种子批毒种按0.10～0.60MOI接种至 长成单层的KMB17细胞，置37±0.5℃培养，培养3～6天至完全病 变时收获为单一病毒液；同一细胞批生产的单一病毒液合并成为病毒 收获液。

病毒收获液合并及超滤浓缩：病毒收获液经0.65μm滤膜过滤澄 清后，使用100KD的超滤膜进行50～100倍浓缩成为浓缩病毒液。

2)病毒纯化

采用柱色谱法进行病毒纯化。凝胶介质为Sepharose 6FF，总柱 长为85±5cm，缓冲液为2mmol/L PBS，流速为5ml/min，上样后收 集纯化物即为纯化病毒液。

3)病毒灭活

在纯化病毒液中加入甲醛溶液，使甲醛终浓度至100μg/ml，于 37.0±0.5℃灭活6天，病毒灭活到期后即为病毒原液；灭活后的病 毒液中加入20％的亚硫酸氢钠，使其终浓度为4.0mg/ml以中和甲醛， 即为病毒原液，待用。

实验例3：HAV病毒原液制备

HAV原液系用甲型肝炎病毒吕8株接种人二倍体细胞KMB17株， 经培养、病毒收获、纯化、灭活后制成。

1)病毒收获液制备

细胞培养液：细胞培养液为MEM，其中含有5％～10％新生牛血清、 终浓度为100IU/ml的硫酸卡那霉素、0.06％的谷氨酰胺；细胞维持液 为MEM，其中含有1％～5％新生牛血清、终浓度为100IU/ml的硫酸卡 那霉素、0.06％的谷氨酰胺。新生牛血清的质量除符合现行版《中国 药典》的规定外，甲肝抗体还应为阴性。

生产用细胞：生产用细胞为人二倍体KMB17细胞，培养温度为 37℃；用于病毒培养的细胞为P32代。

病毒接种：取工作种子毒种经超声破碎细胞释放病毒，按0.05～ 1.0MOI接种于KMB17细胞，35℃培养至9～12天更换细胞维持液， 继续于35℃培养至24～26天收获病毒。

病毒收获液：培养到期，用0.125～0.25％胰蛋白酶消化液消化 细胞，用10mmol/LPBS收集细胞悬液，以每分钟2500转的转速离 心20分钟沉淀细胞，用6.2mmol/L PBS悬浮并收集细胞，成为病毒 收获液。同一细胞批生产的病毒收获物，可合并为1个病毒收获液批。

2)病毒纯化

病毒提取液制备：病毒收获液在冰浴条件下经超声破碎细胞释放 病毒，加入30～50％(V/V)三氯甲烷，振摇20分钟，每分钟4000 转的转速离心20分钟，弃去上层水相；再用6.2mmol/L PBS同法抽 提蛋白相4次，将提取的病毒液进行合并即为病毒抽提液。

超滤浓缩：提取的病毒液经截留分子量为100kD的超滤膜超滤浓 缩30～60倍。

层析纯化：采用柱色谱法进行病毒纯化，柱高30cm，柱直径5cm， 介质为Phenylsepharose 6FF。每次上样800～1500ml，上样缓冲液 为1mol/L PBS，使用1mol/L PBS与0.02mol/L PBS缓冲液进行梯度 洗脱，流速为15～20ml/min，监测波长为280nm，收集病毒峰，经除 菌过滤即为纯化病毒液。

3)病毒灭活

将纯化后病毒液用2mmol/L PBS稀释至抗原含量为6400EU/ml， 加入终浓度为250μg/ml的甲醛，于37℃±1℃灭活12天，病毒灭 活到期后的病毒液即为原液，待用。

实施例：EV71-CA16-HAV三联疫苗半成品制备

1)抗原配比

半成品中HAV、EV71及CA16抗原配制点含量分别为600～800 EU/ml、300～400U/ml及300～400U/ml；

2)佐剂研究

研究结果表明，氢氧化铝是三联疫苗理想的佐剂，其铝含量为 0.25～0.45mg/ml。

3)半成品配制

将实验例1～3制得的病毒原液，根据病毒原液抗原含量测定值， 计算稀配终体积。可采用先吸附方式进行吸附，即在原液中加入氢氧 化铝室温吸附后，加入甘氨酸，用2mmol/L PBS稀释至终体积，使 其抗原含量的理论推算值HAV、EV71及CA16抗原配制点含量分别为 600～800EU/ml、300～400U/ml及300～400U/ml、铝含量终浓度为 0.25～0.45mg/ml、甘氨酸终浓度为3.0～4.0mg/ml，即为半成品。

吸附时pH值是重要的影响因素，研究表明pH在6.0～6.50时吸 附最佳。其上清液中三种病毒抗原含量均应不高于吸附抗原总量的 5％。

4)成品制备

按现行版《中国药典》三部通则“生物制品分批规程”规定进行 分批，分装规格为每瓶(支)0.5ml。

实施例2：合理性与免疫原性评价

申请人研制的甲型肝炎灭活疫苗、EV71灭活疫苗及CA16灭活疫 苗其细胞基质均为人二倍体细胞KMB17细胞，与其它细胞相比具有明 显的优越性；目前，申请人是国内唯一同时拥有用人二倍体细胞生产 的甲型肝炎灭活疫苗、EV71灭活疫苗及CA16灭活疫苗自主知识产权 的生产单位，无其他技术壁垒限制，以此为基础进行三联疫苗的研究， 无疑更具有合理性。

申请人生产的甲型肝炎灭活疫苗、EV71灭活疫苗及CA16灭活疫 苗生产工艺相似(组织培养工艺、病毒浓缩工艺、灭活工艺、纯化工 艺、均含有铝佐剂等)，成分单一、质量可控，此三个疫苗的联合更 具有科学性及可行性。

HAV-EV71-CA16联合的方式，将避免同一个抗原成分在不同的联 合疫苗中，给使用带来重复或难以选择，会给计划免疫的实施带来更 大的方便及可操作性。

经研究发现，将福尔马林灭活的EV71疫苗(C2型)与含灭活脊 髓灰质炎、百日咳杆菌、b型嗜血杆菌、白喉、破伤风的一种五价疫 苗共免疫，结果发现该五价疫苗能有效诱导与单价疫苗相当的针对每 个组分的抗体，而孕鼠接种该疫苗后产下的乳鼠能够抵御EV71感染， 而且组织中的病毒载量低，表明灭活EV71疫苗与其他疫苗的联合是 可能的；将EV71和CA16灭活疫苗进行免疫，发现单针免疫不能有效 诱导中和抗体，而两针免疫则能诱导与单价疫苗相当的中和抗体水平， 从细胞因子的检测结果来看，双价疫苗诱导的TH2类细胞因子反应强 于单价疫苗；将EV71和CA16VLP制成双价疫苗进行免疫，结果发现 该双价疫苗的抗血清能有效中和EV71和CA16，说明两种抗原在诱导 中和抗体方面不存在免疫干扰；申请人之前进行过灭活EV71与HAV 联合免疫的实验研究，发现该双价疫苗能够诱导与单价疫苗相当的中 和抗体水平。从以上研究可以看出，HAV-EV71-CA16的联合疫苗是合 理的。

免疫原性评价实验

1)免疫程序：经研究，注射途径为肌肉注射；基础免疫为两剂， 以0、1个月两剂免疫程序有最佳的抗体应答。

2)抗体水平：

经一剂免疫后，抗体阳转率均达到100％，其HAV抗体大于1000 mIU/m、EV71中和抗体效价大于1：32、CA16中和抗体效价大于1： 128；各组分抗体水平与单一抗原成分的对照组之间均无统计学差异。

经两剂免疫后，其HAV抗体大于2000mIU/m、EV71中和抗体效 价均大于1：128、CA16中和抗体效价均大于1：1024。各组分抗体 水平与单一抗原成分的对照组之间均无统计学差异。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明 或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本 发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均 应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵 盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内 的全部变化和修改例。

Claims (10)

1.一种预防手足口病和甲型肝炎的联合疫苗，其特征在于，本联合疫苗包含灭活的EV71抗原、灭活的CA16抗原和灭活的HAV抗原。

2.如权利要求1所述的联合疫苗，其中灭活的EV71抗原、灭活的CA16抗原和灭活的HAV抗原分别为300～400U/ml、600～800EU/ml及300～400U/ml。

3.如权利要求1所述的联合疫苗，其中还包含佐剂，所述佐剂包含氢氧化铝，其中含量以铝计0.25～0.45mg/ml。

4.一种如权利要求1～3的预防手足口病和甲型肝炎联合疫苗的制备方法，其特征在于，包括：

分别将EV71、CA16型以及HAV病毒通过接种人二倍体细胞经培养、病毒收获、纯化、灭活后制成病毒原液；

将灭活后的EV71、CA16和HAV病毒原液加入含铝佐剂吸附、稀释配制，得EV71-CA16-HAV预防手足口病和甲型肝炎的联合疫苗。

5.如权利要求4所述的制备方法，所述加入含铝佐剂吸附稀配的步骤还包括：添加甘氨酸作为保护剂，并用2mmol/L的PBS稀释至EV71、CA16和HAV病毒原液按含量配比分别为300～500U/ml、300～500U/ml及600～800EU/ml，铝含量浓度为0.25～0.45mg/ml、甘氨酸浓度为3.0～4.0mg/ml。

6.如权利要求4所述的制备方法，所述加入含铝佐剂吸附稀配合并的步骤还包括：吸附时溶液pH值在6.0～6.50之间。

7.如权利要求4所述的制备方法，所述EV71病毒原液的制备还包括：用EV71 FY-23K-B株接种于人二倍体KMB17细胞，经细胞培养，按0.05～0.20MOI接种至长成单层的KMB17细胞，置37±0.5℃培养，培养48～96小时至完全病变时收获EV71病毒液，经浓缩灭活后用柱色谱法进行病毒纯化，得EV71病毒原液。

8.如权利要求4所述的制备方法，所述CA16病毒原液的制备还包括：按0.10～0.60MOI接种CA16病毒至长成单层的KMB17细胞，置37±0.5℃培养，培养3～6天至完全病变时收获，得单一病毒液；同一细胞批生产的单一病毒液合并成为病毒收获液，病毒收获液合并及超滤浓缩：病毒收获液经0.65μμm滤膜过滤澄清后，使用100KD的超滤膜进行50～100倍浓缩成为浓缩病毒液，用柱色谱法进行病毒纯化，收集纯化物即为纯化病毒液，经灭活后，得CA16病毒原液。

9.如权利要求4所述的制备方法，所述HAV病毒原液的制备还包括：用甲型肝炎病毒吕8株接种人二倍体细胞KMB17株，按0.05～1.0MOI接种于KMB17细胞进行培养，培养到期，收获病毒液，经提取、超滤浓缩后利用层析纯化后灭活处理，得HAV病毒原液。

10.如权利要求8所述的制备方法，所述CA16病毒为K168/8毒株。