CN102839159A - 一种CoxA16病毒株和人用CoxA16灭活疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CoxA16病毒株，该病毒株分类命名为Cox病毒A16型（GX-20K-D株），保藏编号为CGMCCNo.6350，其包括原始种子、主种子和工作种子三个库；所述的病毒具有SEQNo1所示的核苷酸序列。本发明具有以下明显的有益效果：1.提供了一种可用于制备人CoxA16灭活疫苗的病毒株，具有有效的免疫原性和在细胞上较好的生长复制能力。2.提供了一种使用KMB17人二倍体细胞基质制备的人CoxA16灭活疫苗的生产制备方法，该疫苗制品具有良好的免疫原性和安全性。3.提供了一种混悬吸附技术方法，以保证CoxA16灭活疫苗病毒株在KMB17细胞上的有效感染及在该基质上的良好生长。
Description
技术领域
本发明涉及一种CoxA16病毒株和人用CoxA16灭活疫苗，属于生物技术领域。
背景技术
柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A 16 Strain, CoxA16）是引起儿童手足口病（Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD）的主要病原之一。CoxA16作为肠道病毒成员之一，在结构上具有典型的核糖核酸病毒特征，包括其表现为单股正链的RNA基因组，VP1和VP2、VP3、VP4所构成的衣壳蛋白结构等。该病毒感染人体后通常通过肠道排泄物→口传播，在一定情况下，也可经呼吸道传播。该病毒所导致的感染与肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）感染相似，通常表现为手足口出现特征性的疱疹，并伴有一定程度的发热感冒症状。在感染人群中也有一定比例的重症患者，重症时可以引起神经系统、呼吸系统的病变，在发病人群中具有一定的死亡率。目前，已知由该病毒和EV71病毒感染所导致的手足口病在全世界范围内存在。上世纪90年代以前，在发达国家由于公共卫生条件的改善，该病毒感染已几乎绝迹。但90年代以后，该病毒在全球各地区的发病率渐有上升。同时，由于该病毒的高传播率和其感染的重症病人可出现严重的神经系统及呼吸系统症状，因而它同时受到了作为生物恐怖因子的相应关注。在上世纪90年代后期和二十一世纪初始，该病毒感染在我国台湾地区和英国曾出现大范围的流行，并导致了一定的感染死亡率，从而受到了人们的进一步关注。2008年，我国安徽省阜阳地区亦出现了较大规模的流行，而且感染者主要出现在婴幼儿，因此引起了社会各界的严重关切。对此，我国卫生部自2008年5月起，将手足口病正式列入法定报告的传染病种类之中。2009年，我国手足口病的病原体流行特征，由2008年的以EV71感染为主，逐渐转变为EV71和CoxA16的共流行，并且这样的流行特征趋势有增无减。
现有的分子流行病学分析表明，迄今已根据CoxA16不同毒株VP1的结构基因，将现有毒株划分为三个基因型，分别是A、B、C。但其作为特定病原如何感染人体，并引起相应的病理过程这一系列的事件尚无系统的研究。另外，CoxA16病毒感染还可以导致心肌、心包疾病，并与扩张性心肌病的发生有着直接的关系。迄今为止，尽管CoxA16病毒感染在我国各地区均已引起较多的发病，但仍无有效的特异性疫苗应用。因此，在强调提高我国人口健康质量的前提下，相应疫苗的研究显得更为迫切与重要。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种CoxA16病毒株和人用CoxA16灭活疫苗。
本发明的CoxA16病毒株，于2012年7月17日在位于中国北京市朝阳区北辰西路的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，分类命名为柯萨奇病毒A16型（GX-20K-D株），拉丁文名Coxsackie A virus type 16，保藏编号为CGMCCNo.6350，其包括原始种子、主种子和工作种子三个库；所述的病毒核苷酸序列如SEQ No1所示。本发明完成了病毒全基因组序列分析，并将其翻译为蛋白质的氨基酸序列。完成了在GenBank中的登记注册，GenBank登录号为Jn590244 。
本发明提供了所述病毒株的制备方法，该方法采用下述顺序的步骤：
1）分离于手足口病患者的CoxA16病毒株，来至于患者咽拭子以及少量的疱疹分泌液，经无菌PBS溶液稀释过滤后，以混悬吸附方式接种于单层KMB17细胞，在8～10天发生病变后，继续以KMB17细胞传代4代，同时以RT-PCR方法获得病毒全基因组序列，将其翻译为蛋白质的氨基酸序列。
2）该病毒株接种人二倍体细胞株KMB17，出现细胞病变后收获病毒，并继续在KMB17单层细胞上进行两轮蚀斑克隆纯化过程，最终挑选蚀斑克隆GX-20K-D作为该病毒毒株。根据对该毒株几个代次生物学性状的综合比较，并按照国家药监局有关疫苗病毒株的管理规定，将在KMB17细胞中适应克隆筛选并连续传代至第10、12、14代分别确定为原始种子、主种子和工作种子代次。
3）对原始种子、主种子、工作种子三个代次的病毒株分别进行了鉴别试验、滴度测定、无菌试验、支原体检测、外源因子检测和免疫原性检定等，证明其具有良好的免疫原性及在KMB17细胞上的良好繁殖能力，最终形成了CoxA16病毒的三级病毒株库。
本发明提供了一种含有CoxA16病毒的人用CoxA16灭活疫苗，所述的疫苗由下列成分组成：
CoxA16病毒灭活纯化抗原 10μg / ml
蛋白载体 5 ug/ml
氢氧化铝 1mg / ml
甘氨酸 3mg / ml 。
本发明提供了CoxA16灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1）根据KMB17细胞生产检定规程，挑选生长致密的第28代KMB17细胞，弃去培养液，以0.1%胰酶消化细胞后，弃去胰酶液，以原培养液体积的4%体积，DMEM悬浮细胞。
2）在上述细胞悬液中加入本发明的第14代的CoxA16病毒液，接种量moi 0.02～0.1。混匀后置于37℃，适时轻轻摇动。30min后，将该混悬液转至培养瓶中，加入定量细胞生长培养液，置37℃3～4天，待细胞贴壁并完全病变后，收集收获液。
3）病毒收获液按1:4000比例加入甲醛37℃ 3天灭活病毒，灭活完成的病毒液，利用超滤浓缩仪（Watson-MARLOWBREDEL- PM-MPS- 630.3A24.OGA）浓缩至适当体积，经Sapharose 6FF排阻层析柱纯化，其纯化产物以Lowry法测定蛋白含量，并以免疫电镜检测其灭活的病毒形态，继以SDS-PAGE电泳检测其纯度。
4）将上述灭活病毒原液过滤除菌后，以磷酸缓冲液调整稀释至10μg/ml，同时加入Al(OH)3至终浓度为1mg / ml, 甘氨酸 3mg / ml 及具有佐剂效应的蛋白载体5ug/ml该产品即为所需的CoxA16灭活疫苗成品。
本发明技术方案的提出基于下述思路：CoxA16作为肠道病毒成员，其疫苗的研制具有多种类似的例子可循，主要的疫苗可能形式包括减毒活疫苗和灭活疫苗，但减毒活疫苗存在着回复突变、毒力返祖，以及引起其它尚未知晓的疫苗相关疾病潜在的可能性。因此，作为一种具有安全性和疾病防控应急意义的疫苗，灭活疫苗具有相对的优势。但其要求该疫苗毒株具有较强的免疫原性和较好的生长复制能力。同时，作为新型的预防性疫苗，使用合适的细胞基质可提升该疫苗的质量品质。目前已广泛使用于灭活疫苗生产制备的传代细胞基质主要包括两类：一是来自非洲绿猴肾的Vero细胞，二是来自人胚肺的二倍体成纤维细胞。前者对病毒疫苗具有较快的生产增殖能力，但因属于异源物种细胞，因此在疫苗的纯化制备方面具有较高的质量要求。后者尽管在病毒疫苗的生长复制支持能力方面相对较Vero细胞稍差，但其作为来源于人的细胞，具有更好的安全性。在上述前提下，本发明所描述的CoxA16毒株为来源于CoxA16感染重症病人的分离株，具有较强的组织培养生长能力，同时在动物体内表现了较好的免疫原性。而且，已适应生长于人源二倍体细胞株，在保证具有较高安全性的同时，也具有较好的增殖复制能力。
与现有技术相比，本发明具有以下明显的有益效果：
1）提供了一种可用于制备人CoxA16灭活疫苗的疫苗病毒株，该病毒株 至今尚无同类品问世，而且，该病毒株具有有效的免疫原性和在细胞上较好的生长复制能力。
2）提供了一种使用KMB17人二倍体细胞基质制备的人CoxA16灭活疫苗
的生产制备方法，该疫苗制品具有良好的免疫原性和安全性。由于本发明中CoxA16病毒株及所建立的毒种种子库系采用人二倍体细胞株KMB17分离培养并建立的，在制备用于人类预防疾病的疫苗时，比采用异源物种细胞来制备疫苗具有更高的安全性，也更加符合国家有关对预防性疫苗研发及生产用菌毒种的条例和规定。
3）提供了一种混悬吸附技术方法，以保证CoxA16灭活疫苗病毒株在KMB17细胞上的有效感染及在该基质上的良好生长。
附图说明
图1为该CoxA16病毒病毒株经混悬吸附方法接种人二倍体细胞KMB-17后3-4天即可出现典型细胞病变现象，表现为细胞变圆、折光性增强、肿胀等。
图2为该CoxA16病毒病毒株在KMB17细胞上的增殖动力学曲线。将第10、12、14、18代次的CoxA16病毒以0.01MOI接种单层KMB-17细胞后，在不同时间点取样和滴度分析表明，这四个代次的病毒均有着类同的生长动力学特征，其均在第46～72小时之间达到增殖高峰。
图3 为不同代次的该CoxA16灭活病毒纯化产物的免疫原性检测。结果显示，四个代次的灭活病毒在以相同剂量接种小鼠时所诱导的中和抗体效价无明显差异。
图4 小鼠在两次免疫两周后让其所交配所产的乳鼠进行脑内活毒攻击实验表明，与未免疫小鼠所产的乳鼠相比较。经该毒株四个代次灭活纯化病毒抗原免疫的小鼠所产的乳鼠均无死亡，其免疫保护率为100%。这些结果证明该毒株在不同代次的病毒灭活抗原均具有免疫原性和免疫保护性。
具体实施方式
通过借助以下实施例将更加详细地说明本发明的特点。需要指出的是，以下实施例仅仅是说明性的，本发明的保护范围并不受这些实施例的限制。
实施例1 制备CoxA16灭活疫苗病毒株 GX-20K-D
（一）CoxA16灭活疫苗病毒株 GX-20K-D的制备方法，包括以下步骤：
1、分离于手足口病患者的CoxA16病毒株，来至于患者咽拭子以及少量的疱疹分泌液，经无菌PBS溶液稀释过滤后，以混悬吸附方式接种于单层KMB17细胞，在8～10天发生病变后，继续以KMB17细胞传代4代。首先取病毒液1ml，按常规方法进行RT-PCR，分段获取病毒基因的cDNA序列，并按常规方法连接该片段进入puc-18载体中，进行常规的核苷酸测序分析，并以此序列在同类基因库中进行比对确证其结果。
2、该病毒株接种人二倍体细胞株KMB17，出现细胞病变后收获病毒，并继续在KMB17单层细胞上进行两轮蚀斑克隆纯化过程，最终挑选蚀斑克隆GX-20K-D作为该病毒毒株。根据对该毒株几个代次生物学性状的综合比较，并按照国家药监局有关疫苗病毒株的管理规定，将在KMB17细胞中适应克隆筛选并连续传代至第10、12、14代分别确定为原始种子、主种子和工作种子代次。
3、对原始种子、主种子、工作种子三个代次的病毒株分别进行了鉴别试验、滴度测定、无菌试验、支原体检测、外源因子检测和免疫原性检定等，证明其具有良好的免疫原性及在KMB17细胞上的良好繁殖能力，最终形成了CoxA16病毒的三级病毒株库。
（二）对CoxA16灭活疫苗病毒株 GX-20K-D进行检测，检测方法及检测结果如下：
1、该病毒株经混悬吸附方法接种人二倍体细胞株KMB17后3-4天即可出现典型细胞病变（CPE）现象，表现为细胞变圆、折光性增强、肿胀等，如图1所示。利用抗CoxA16特异性血清，按1：4稀释后，与该病毒10倍稀释液等量混合，37℃放置1小时，再接种Vero细胞或KMB17细胞，37℃培养一周后观察病变结果，与无特异血清对照相比较，抗体中和应完全抑制细胞出现病变。
2、该病毒株在KMB17细胞上的生长动力曲线表明，当该病毒以混悬形式接种于KMB17细胞时, 在12小时内接种细胞即可出现初步的典型病变, 同时, 该病变可在46-72小时内出现增殖高峰, 对此时的病毒收获液进行滴度检测表明, 其滴度通常为6.5 ± 0.25Log CCID50 。
3、该病毒株按4.0-4.5 Log CCID50 /只乳鼠的剂量接种2日龄乳鼠时，可引起乳鼠在4-5天内出现典型的四肢迟缓型麻痹症状，用抗CoxA16特异性血清中和该病毒后，可以去除此病毒株 致乳鼠麻痹的能力。
4、该病毒株经1:4000的甲醛灭活后，不再具有感染性，但能够保留其免疫原性。当其以10μg/ml抗原蛋白量皮下一次接种小鼠后，可引起小鼠出现滴度可能为16～32的特异性中和抗体，二次接种后可引起小鼠出现滴度可能更高的特异性中和抗体反应。
5、该病毒株在不同代次的病毒均具有类同的生长动力学特征，将第10、12、14、18代次的CoxA16病毒以0.01MOI接种单层KMB-17细胞后，在不同时间点取样和滴度分析表明，这四个代次的病毒均有着类同的生长动力学特征，其均在第46～72小时之间达到增殖高峰，如图2所示。
6、该病毒株在不同代次的病毒灭活抗原均具有免疫原性。如图3所示的不同代次的该CoxA16灭活病毒纯化产物的免疫原性检测。结果显示，四个代次的灭活病毒在以相同剂量接种小鼠时所诱导的中和抗体效价无明显差异。
7、该病毒株在不同代次的病毒灭活抗原均具有免疫保护性。如图4所示，小鼠在两次免疫两周后让其所交配所产的乳鼠进行脑内活毒攻击实验表明，与未免疫小鼠所产的乳鼠相比较。经该毒株四个代次灭活纯化病毒抗原免疫的小鼠所产的乳鼠均无死亡，其免疫保护率为100%。
以上结果显示了本发明的 CoxA16病毒株的生物学特征。
实施例2 制备CoxA16灭活疫苗
本实施例的CoxA16灭活疫苗的制备方法，包括下列步骤：
1、根据KMB17细胞生产检定规程，挑选生长致密的第28代KMB17细胞，弃去培养液，以0.1%胰酶消化细胞后，弃去胰酶液，以原培养液体积的4%体积，DMEM悬浮细胞。
2、在上述细胞悬液中加入本发明的第14代的CoxA16病毒液，加入0.2-0.5ml病毒液，其moi为 0.02～0.1，混匀后置37℃孵育30分钟，并于其中加以轻摇，随后将该混悬液体转入培养瓶中，加入适量细胞生长培养液，37℃培养3～4天,待细胞贴壁后并出现完全病变收获。
3、病毒收获液按1:4000比例加入甲醛37℃ 3天灭活病毒，灭活完成的病毒液，利用超滤浓缩仪（Watson-MARLOWBREDEL- PM-MPS- 630.3A24.OGA）浓缩至适当体积，经Sapharose 6FF排阻层析柱纯化，其纯化产物以Lowry法测定蛋白含量，并以免疫电镜检测其灭活的病毒形态，继以SDS-PAGE电泳检测其纯度。
4、将上述灭活病毒原液过滤除菌后，以磷酸缓冲液调整稀释至10μg/ml，同时加入Al(OH)3至终浓度为1mg / ml, 甘氨酸 3mg / ml 及具有佐剂效应的蛋白载体5ug/ml该产品即为所需的CoxA16灭活疫苗成品。
在制备过程中，进行如下检测，病毒收获物、病毒原液、半成品均为无异物、无沉淀的澄清液体，无菌检测、支原体检测均应为阴性，无异常毒素，PH7.2-8.0（见表1）。
表1：病毒收获物、病毒原液、半成品的检测结果
病毒收获液进行滴度检定时，其滴度应在6.5-7.0logCCID50/ml。
疫苗半成品加入Al(OH)3至1mg/ml经混合后，皮下注射小鼠两次（0、28），可在实验动物体内产生抗CoxA16中和抗体，与此同时，佐剂对照组并不能引发相应的抗体产生。
制备的疫苗由下列成分组成：CoxA16病毒灭活纯化抗原10μg/ml、氢氧化铝1mg/ml、甘氨酸3mg/ml及蛋白载体5ug/ml。
CoxA16病毒灭活纯化抗原 10μg / ml
蛋白载体 5 ug/ml
氢氧化铝 1mg / ml
甘氨酸 3mg / ml
实施例3 CoxA16灭活疫苗成品的安全性检测
疫苗成品按0.5ml/只量注射体重为18-20g小鼠腹腔，共20只，一月内应无死亡(常规异常毒性检测: 疫苗成品按0.5ml/只量注射体重为18-20g的20只小鼠,饲养7天,无死亡,体重增加(约为1-10克);豚鼠2只,腹腔注射5ml疫苗成品,饲养7天, 无死亡,体重增加(约为1-40克)判为合格)，小鼠体重增加应同于正常生理盐水对照组（见表2）。
疫苗成品甲醛含量应不高于50μg/剂，细菌内毒素不高于100EU/剂。应在无菌检测中为阴性（见表3）。
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<110> OrganizationName : 江苏康淮生物科技有限公司
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<120> Title : 一种CoxA16病毒株和人用CoxA16灭活疫苗
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1.一种CoxA16病毒株，其特征在于，所述的病毒株于2012年7月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，分类命名为Cox病毒A16型，保藏编号为CGMCC No.6350，其包括原始种子、主种子和工作种子三个库；所述的病毒核苷酸序列如SEQ No1所示，所述的病毒全基因和蛋白序列的GenBank登录号为Jn590244。
2.如权利要求1所述的CoxA16病毒株的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
1）分离于手足口病患者的CoxA16病毒株，来自于患者咽拭子以及少量的疱疹分泌液，经无菌PBS溶液稀释过滤后，以混悬吸附方式接种于单层KMB17细胞，在8～10天发生病变后，继续以KMB17细胞传代4代，同时以RT-PCR方法获得病毒全基因组序列，将其翻译为蛋白质的氨基酸序列;
2）该病毒株接种人二倍体细胞株KMB17，出现细胞病变后收获病毒，并继续在KMB17单层细胞上进行蚀斑克隆纯化，最终挑选蚀斑克隆GX-20K-D作为该病毒毒株;根据对该毒株几个代次生物学性状的综合比较，并按照国家药监局有关疫苗病毒株的管理规定，在KMB17细胞中适应克隆筛选并连续传代至第10、12、14代分别确定为原始种子、主种子和工作种子代次;
3）对原始种子、主种子、工作种子三个代次的病毒株分别进行了鉴别试验、滴度测定、无菌试验、支原体检测、外源因子检测和免疫原性检定等，证明其具有良好的免疫原性及在KMB17细胞上的良好繁殖能力，最终形成了CoxA16病毒的三级病毒株库。
3.一种含有如权利要求1所述的CoxA16病毒的人用CoxA16灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述的人用CoxA16灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗由下列成分组成：
CoxA16病毒灭活纯化抗原 10μg / ml
蛋白载体 5 ug/ml
氢氧化铝 1mg / ml
甘氨酸 3mg / ml 。
5.一种制备权利3或4的CoxA16灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）根据KMB17细胞生产检定规程，挑选生长致密的第28代KMB17细胞，弃去培养液，以0.1%胰酶消化细胞后，弃去胰酶液，以原培养液体积的4%体积，DMEM悬浮细胞；
2）在上述细胞悬液中加入本发明的第14代的CoxA16病毒液，接种量moi 0.02～0.1;混匀后置于37℃，适时轻轻摇动;30min后，将该混悬液转至培养瓶中，加入定量细胞生长培养液，置37℃3～4天，待细胞贴壁并完全病变后，收集收获液；
3）病毒收获液按1:4000比例加入甲醛37℃ 3天灭活病毒，灭活完成的病毒液，利用超滤浓缩仪浓缩至适当体积，经Sapharose 6FF排阻层析柱纯化，其纯化产物以Lowry法测定蛋白含量，并以免疫电镜检测其灭活的病毒形态，继以SDS-PAGE电泳检测其纯度；
4）将上述灭活病毒原液过滤除菌后，以磷酸缓冲液调整稀释至10μg/ml，同时加入Al(OH)3至终浓度为1mg / ml, 甘氨酸 3mg / ml 及具有佐剂效应的蛋白载体5ug/ml该产品即为所需的CoxA16灭活疫苗成品。
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