CN106318914B - 一种人肠道病毒株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人肠道病毒株及其应用，本发明提供了一种EV71病毒减毒株，可在沙鼠原代肌肉细胞上获得稳定较高的病毒滴度。病毒减毒株157‑11‑2具有较好的免疫保护效果，为今后疫苗的研发提供良好的候选毒株。

Description

一种人肠道病毒株及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种肠道病毒EV71型减毒株及其应用。
(二)背景技术
近年来，我国手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)疫情呈蔓延上升趋势，手足口病报告发病例与死亡人数均居丙类传染病首位，2014年我国手足口病发病数达约282万余例，死亡人数508人，比2013年增长了近一倍，手足口病已成为中国主要的公共卫生安全威胁之一。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属肠道病毒A型，是手足口病的主要病原之一，EV71病毒感染可以引发心肌炎、脑干脑炎、无菌性脑膜炎、肺炎和类似于小儿麻痹的急性迟缓性麻痹等多种与神经系统相关的疾病，并且这些由EV71引起的神经系统并发症比其他肠道病毒引发的要严重，在台湾，由EV71感染导致的手足口患者重症病例中，有10％-25.7％的病例死亡，可见由EV71病毒感染引起的手足口病危害是相当大的。
我国虽然已经批准EV71疫苗上市，但市面上流通不广，长期大量人群的疫苗保护性和安全性有待观察；上市疫苗均为全灭活疫苗，需接种两次才能起到有效免疫保护效果，同时至今市面上也没有应用EV71减毒株作为其疫苗生产的报道。减毒活疫苗由于其显著的疫苗保护作用而被广泛的应用，目前大多数的病毒性疫苗都是减毒的活疫苗，如脊髓灰质炎，麻疹等减毒活疫苗，在全球病毒性传染病的防制中发挥重要作用。减毒活疫苗的研发也可以为增加目前上市疫苗的可靠性和安全性方面提供新的思路。近年来发现沙鼠对EV71的敏感性较强，21日龄的沙鼠对EV71亦完全敏感，可以作为较好的病毒感染动物模型，目前尚没有人应用沙鼠制备EV71病毒减毒株。
(三)发明内容
本发明的目的之一在于提供一株新的人肠道病毒株EV71/157-11-2(简称减毒株157-11-2)。
本发明的目的之二为提供一种利用减毒株157-11-2制备减毒活疫苗的应用。
本发明提供的减毒株157-11-2在原代沙鼠肌肉细胞中具有最佳的生长特性和适应特性，可以在较短时间内获得较高稳定的病毒滴度；同时利用该菌株制备的减毒活疫苗在动物体内具有良好的免疫保护效果。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株-人肠道病毒株(Enterovirus)EV71/157-11-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年8月9日，保藏编号CCTCC NO：V201614，保藏地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述人肠道病毒株EV71/157-11-2在制备EV71病毒减毒活疫苗中的应用，所述减毒活疫苗是指将人肠道病毒株EV71/157-11-2接种沙鼠肌肉细胞，共培养获得的培养液离心后的上清液。
进一步，所述减毒活疫苗制备方法为：待沙鼠肌肉细胞贴壁后弃培养液，接种人肠道病毒株EV71/157-11-2，轻轻摇动培养瓶使病毒与原代肌肉细胞接触均匀，37℃吸附2h后弃培养液，加入含3％血清的MEM培养液，37℃培养72-96h，待50％以上细胞出现细胞皱缩、变圆或脱落后，收集培养液，反复冻融3次，1000-2000×g离心20分钟，取上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液与疫苗佐剂混合，即为减毒活疫苗。所述疫苗佐剂为终浓度0.6mg/ml氢氧化铝和终浓度0.5-1％(W/V)人血白蛋白。先在滤液中加入终浓度为0.6mg/ml氢氧化铝，轻摇溶解1h，按0.5-1％(W/V)比例加入人血白蛋白，即为减毒活疫苗。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种EV71病毒减毒株，可在沙鼠原代肌肉细胞上获得稳定较高的病毒滴度。病毒减毒株157-11-2具有较好的免疫保护效果，为今后疫苗的研发提供良好的候选毒株。
(四)附图说明
图1为肌肉细胞显微图(100倍)，其中A：沙鼠原代肌肉细胞；B：沙鼠原代肌肉细胞感染减毒株157-11-2(MOI＝1)24h后的情况；C:Vero细胞感染减毒株157-11-2(MOI＝1)24h后的情况。
图2为减毒株157-11-2在不同批次原代肌肉细胞增殖后的病毒滴度。
图3为EV71病毒与减毒株157-11-2接种沙鼠后的存活率。
图4为减毒株157-11-2的免疫保护后沙鼠存活率。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1沙鼠原代肌肉细胞的分离与培养
选取10-15日龄沙鼠10只，人道麻醉处死后用碘酒及75％酒精灭菌，剪取后肢肌肉，破碎，用含2倍双抗的MEM培养液(购自Gibco公司)洗涤3遍，0.2％(w/v)胶原酶和0.25％(w/v)胰蛋白酶混合置4℃消化过夜。消化液用10倍(w/v)的MEM液反复吹打成悬液，先后过100目与200目分子筛，收集滤液，1000×g离心5-10min，细胞沉淀吹匀，调pH至5-7，置37℃，5％CO2培养箱中，含10％胎牛血清的MEM中培养3～4天，更换培养液，贴壁细胞即为原代沙鼠肌肉细胞，分离到的原代沙鼠肌肉细胞的显微图见图1中A，可见细胞排列紧密，已经完全贴壁展开成梭形或纺锤形。
实施例2减毒株157-11-2的分离
待实施例1中沙鼠肌肉原代细胞铺满培养瓶，弃培养液，接种EV71病毒(GenbankID:KX639820)，轻轻摇动培养瓶使病毒与原代肌肉细胞接触均匀，37℃吸附2h后弃病毒液，加入含3％血清的MEM培养液培养72-96h，待50％以上细胞出现病变(表现为细胞皱缩、变圆和脱落)后(图1中B)，收集培养液，反复冻融3次，1000-2000×g离心20分钟，上清即为EV71病毒液，采用35℃低温连续培养法接种EV71病毒液，反复传代10-20代，通过蚀斑法分离得到减毒株157-11-2，分别以感染复数MOI＝1.0感染沙鼠原代肌肉细胞和Vero细胞，结果见图1中B和C。
将减毒株157-11-2接种于实施例1方法不同批次制备的沙鼠原代肌肉细胞，按上述方法收集上清液液即为减毒株157-11-2病毒液，并用Reed-Muench法测定不同批次的减毒株157-11-2病毒液的滴度，结果见图2。
图1中B为减毒株157-11-2以感染复数MOI＝1.0感染沙鼠原代肌肉细胞24小时后，细胞出现细胞皱缩、变圆和脱落等典型的细胞病变症状，证明原代肌肉细胞对减毒株157-11-2敏感。
图1中C为减毒株157-11-2以感染复数MOI＝1.0感染Vero细胞，24小时后细胞同样出现细胞病变，证明Vero细胞对减毒株157-11-2亦敏感。
图2为用不同批次沙鼠原代肌肉细胞制备的减毒株157-11-2病毒液滴度，可见不同批次间病毒滴度在7-8之间，滴度较高并且稳定。
实施例3减毒株157-11-2结构蛋白核苷酸序列的测定
Qiagen Rneasy Mini Kit试剂盒(购自QIAGEN公司)提取减毒株157-11-2的总RNA，实验步骤根据试剂盒提供的方法，如下：
a)取200μl病毒液，加入600μl体积的RLT，振荡器振荡1min。
b)加入600μl预冷的-20℃无水乙醇混匀。
c)分2次各取约600μl混合液加入分离柱中，12000rpm离心30s，弃滤液；
d)取700μl RW1洗液洗柱，12000rpm离心30s；
e)取500μl RPE洗液洗柱，12000rpm离心30s；
f)取500μl RPE再洗一次，12000rpm离心30s；
g)柱子12000rpm空离2min；
h)换一新EP管，在柱中加30μl DEPC水，静置2min后12000rpm离心1min，DEPC水洗脱RNA，-70℃保存备用。
采用Takara公司PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒把提取到的总RNA反转成cDNA，-20℃保存备用。
合成3对引物(F表示上游引物，R表示下游引物)，序列如下：
RT157-1F GCCCGAGATGGAGTGTTTGAC
RT157-1R ATCTAAGGATACCACCGCAATCACC
RT157-2F CGGTACAGGGACGGAAGATAC
RT157-2R TGCTGGTAGAGCGTGAGTGAG
RT157-3F ATGGTCCATTTCGCCCAGGAT
RT157-3R CCACAGCAGGCAAACAGAGTC
通过PCR反应进行序列扩增，PCR产物交由上海生工股份有限公司测序，用DNAstarSeqman软件进行拼接得全长为2586bp的编码病毒结构蛋白VP1-VP4的核苷酸序列(SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)，提交Genbank数据库(Genbank ID:KX588235)。
实施例4生物信息学法分析蛋白关键位点突变
通过将减毒株157-11-2编码的VP1-VP4氨基酸序列与2株EV71病毒(Genbank ID:KX639820，Genbank ID:KX588236)编码的氨基酸序列进行比对，发现存在氨基酸突变，分别得到2个和6个氨基酸突变位点，如下表1所示。菌株可通过VP1-VP4核苷酸序列相似性比对鉴定，通过PCR扩增测序，扩增的三对引物为实施例3中的RT157-1F/R，RT157-2F/R和RT157-3F/R，如VP1-VP4核苷酸序列100％与SEQ ID NO.1相同，即为减毒株EV71/157-11-2。
表1：氨基酸突变位点
实施例5减毒株157-11-2攻毒实验
选取21日龄沙鼠3组，8只每组，分别为PBS组，EV71病毒组，减毒株157-11-2组，采用腹腔注射方式接种PBS，EV71病毒液(实施例2方法制备)和减毒株157-11-2病毒液(实施例2方法制备)，攻毒量为1*105TCID50/只，每天观察其存活率至20天。图3表示沙鼠攻毒后存活率，可见沙鼠在接种EV71病毒后6天之内全部死亡，沙鼠接种减毒株157-11-2的20天之后仍有100％存活率。
实施例6减毒株免疫保护效果的评价
采用7日龄沙鼠动物模型对制备得到的减毒株157-11-2病毒液(实施例2方法制备)进行免疫保护效果评价。选取7日龄沙鼠3组，8只每组，分别为PBS组，105.0组和104.0组，每组采用腹腔接种，分别接种PBS，1*105.0和1*104.0TCID50/只减毒株157-11-2病毒液，14天后采用105TCID50/只EV71病毒液攻毒，20天内观察沙鼠的体重及存活率。由图4可见105.0组沙鼠在EV71病毒攻毒20天后有87.5％存活，104.0组沙鼠的存活率为62.5％，而PBS组沙鼠在攻毒6天后全部死亡，表明减毒株157-11-2对沙鼠有较强的免疫保护效果。
实施例7减毒活疫苗半成品的制备
减毒株157-11-2病毒液(实施例2方法制备)经0.22μm滤膜过滤除菌后加入终浓度为0.6mg/ml氢氧化铝佐剂，轻摇溶解1h，按0.5-1％(W/V)比例加入人血白蛋白，即为减毒活疫苗半成品。半成品疫苗进行外观检查，无菌试验，pH值测定，效力测定，防腐剂试验，毒性试验，检查方法按《中华人民共和国药典三部》2010年版规定的检查项目进行。

Claims (5)

1.人肠道病毒株(Enterovirus)EV71/157-11-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年8月9日，保藏编号CCTCC NO：V201614，保藏地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述人肠道病毒株EV71/157-11-2在制备EV71病毒减毒活疫苗中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述减毒活疫苗是指将人肠道病毒株EV71/157-11-2接种沙鼠肌肉细胞，共培养获得的培养液离心后的上清液。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述减毒活疫苗制备方法为：待沙鼠肌肉细胞贴壁后弃培养液，接种人肠道病毒株EV71/157-11-2，轻轻摇动培养瓶使病毒与原代肌肉细胞接触均匀，37℃吸附2h后弃培养液，加入含3％血清的MEM培养液，37℃培养72-96h，待50％以上细胞出现细胞皱缩、变圆或脱落后，收集培养液，反复冻融3次，1000-2000×g离心20分钟，取上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液与疫苗佐剂混合，即为减毒活疫苗。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于向所述滤液中加入终浓度为0.6mg/ml氢氧化铝，轻摇溶解1h，按0.005-0.01g/ml的量加入人血白蛋白，即为减毒活疫苗半成品。
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