CN111729091A

CN111729091A - 一种用家兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法

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Publication number: CN111729091A
Application number: CN202010410551.0A
Authority: CN
Inventors: 齐志涛; 陈九连; 路荣; 方建国; 高艳华; 王娥娥; 张云星; 郝苏云; 张燕红; 杜宇荣; 宋庆庆; 赵丽霞; 李雪峰; 毕力格
Original assignee: Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2040-05-15
Also published as: CN111729091B; CN116459355A

Abstract

本发明公开了一种用家兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，属于兽用生物制品领域。本发明包括使用猪塞内卡病毒病灭活疫苗对若干健康易感家兔进行免疫接种；免疫接种28d后，使用塞内卡病毒液对已免疫家兔进行攻毒；攻毒后连续观察15d，当至少4/5的家兔攻毒后未表现临床症状，即可判定猪塞内卡病毒病灭活疫苗保护效力合格。该方法可以有效使用家兔代替实验猪建立塞内卡病毒灭活疫苗效力检验的替代方法，有效缩减成本，并且操作简单易行、安全便捷。

Description

一种用家兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种用家兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，尤其涉及一种可替代猪做免疫攻毒试验的猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的检验方法。

背景技术

塞内卡病毒(Seneca virus A，SVA)，是一种能引起猪水泡样症状的病毒，近年来国内外发病情况比较严重。该病毒为单股正链不分节的RNA病毒，隶属小RNA毒科Senecavirus 病毒属，临床证据表明，该病毒感染猪后可使感染猪出现水泡性病变和新生仔猪死亡，症状与口蹄疫极为相似，容易发生混淆。该病毒最早发现于1998年，2014年在巴西发生大规模暴发后才逐渐被人们所重视。

对该病的防治主要以预防为主，然而，目前我国尚无塞内卡病毒病商品化疫苗，试验苗正处于研发检验阶段。其中塞内卡病毒试验苗的效力检验主要依靠猪体进行，由于非洲猪瘟影响，猪买卖和运输受限，价格升高，而且实验猪的采购十分困难且不再安全可靠，直接导致塞内卡病毒病灭活疫苗的研发工作受阻。因此，建立一种塞内卡病毒病灭活疫苗效力检验的替代方法对塞内卡病毒灭活疫苗的开发至关重要，同时可以大大节省研发费用。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种用家兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，包括以下步骤：

1)使用猪塞内卡病毒病灭活疫苗对若干健康易感家兔进行免疫接种；

2)免疫接种28d后，使用塞内卡病毒液对已免疫家兔进行攻毒；

3)攻毒后连续观察15d，当至少4/5的家兔攻毒后未表现临床症状，即可判定猪塞内卡病毒病灭活疫苗保护效力合格。

上述方法中，步骤1)中所述健康易感家兔的血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价＜1:2。

上述方法中，步骤1)中对家兔免疫接种的剂量为至少1.0ml，接种途径采用腿部肌肉注射。

上述方法中，步骤2)中对已免疫家兔进行攻毒的毒量为至少2×10^8.5TCID₅₀。

上述方法中，步骤2)使用的塞内卡病毒液的毒价为至少10^7.5TCID₅₀/0.1ml，攻毒剂量为至少2.0ml/只。

上述方法中，步骤2)中攻毒的方式包括但不限于滴鼻途径。

上述方法中，步骤3)中所述临床症状为家兔鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起，且症状持续2～3天。

本发明另一方面提供一种用家兔从症状上区分塞内卡病毒与口蹄疫病毒的方法，其包括以下步骤：

a)用病毒液样品接种家兔；

b)连续观察，发现接种后家兔出现临床症状，即判定为含有塞内卡病毒，无临床症状则判定为口蹄疫病毒；其中所述临床症状为家兔鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起。

上述病毒液样品包括猪水泡样病变部位的病毒提取液、口蹄疫病毒疫苗生产原料。

上述病毒液样品的毒价为至少10^7.5TCID₅₀/0.1ml，接种剂量为至少2.0ml/只。

基于以上技术方案提供的用家兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法可以有效使用家兔代替实验猪建立塞内卡病毒灭活疫苗效力检验的替代方法，消除非洲猪瘟等猪传染病带来的影响；同时本发明提供的方法中采用家兔作为实验动物，相对于实验猪，其在饲养成本上相对较低，购买成本也相对较低，可以有效缩减成本，并且操作简单易行、安全便捷。数据表明，在提供的方法中使用家兔代替实验猪，两者的疫苗效力检测结果一致，因此，可以用本发明提供的家兔免疫攻毒方法，代替猪免疫攻毒法评价塞内卡病毒病灭活疫苗的免疫效力。另外，本发明提供的方法使用家兔代替实验猪，在灭活疫苗效力检验时，由于感染SVA 发病的家兔鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起，可以避免猪感染SVA后的水泡样症状与口蹄疫等疾病症状的混淆，将猪SVA感染与猪口蹄疫等疾病区别开来。

具体实施方式

本发明旨在建立一种用家兔代替猪的猪塞内卡病毒病灭活疫苗的效力检验方法，为新型塞内卡病毒疫苗的效力检验提供新的载体和替代方法。

通过以下具体实施方式详细说明本发明。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例1、猪塞内卡病毒灭活疫苗的制备

该实施例选择使用SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886(CN110551694A)作为毒株制备塞内卡病毒液，经灭活、乳化后获得以下实施例中的疫苗，具体包括以下步骤：

将塞内卡病毒毒株接种于细胞密度为3.0×10⁶，细胞活率在95％以上的PK15-JY悬浮细胞(猪肾悬浮细胞，金宇保灵生物药品有限公司提供)，置37℃的5％CO₂培养箱中培养3 日后，反复冻融3次收获病毒培养液，加入BEI(二乙烯亚胺，Sigma)使其终浓度为0.003mol/L，于26℃作用48小时灭活，灭活结束后按4％(V/V)的含量加入浓度为50％的硫代硫酸钠溶液阻断灭活作用，获得灭活后抗原。将灭活后抗原与206佐剂(SEPPIC)按质量比为1:1混合，于30℃环境下乳化30分钟，分装后2℃～8℃保存备用。依此方法制备3批疫苗，分别编号为2019003、2019004和2019005，用于下述实施例中评价疫苗的效力。

实施例2、塞内卡病毒液的制备

该实施例选择使用SVV/CH/ZZ/2016 CGMCC No.14886(CN110551694A)作为毒株制备塞内卡病毒液，用于以下实施例中的攻毒用毒，具体包括以下步骤：

将塞内卡病毒毒株接种于长满单层的PK-15细胞(猪肾细胞，金宇保灵生物药品有限公司提供)，置37℃的5％CO₂培养箱中培养5日，反复冻融3次收获病毒培养液，记为F1代，置-20℃保存。取收获的病毒培养液F1代，按照10％(V/V)的含量接种已长满单层的PK-15 细胞，置于37℃的5％CO₂培养箱中培养，每日观察细胞病变(CPE)，接种后48小时收获病毒培养液液，记为F2代。继续按上述方法传代，传至出现典型病变(表现为细胞圆缩、聚合、出现空洞，甚至脱落)为止，该实施例中培养至F3代即出现典型病变。继续传代至F7 代，为病变最典型的最低代次，收获病毒液，测定毒价为10^7.5TCID₅₀/0.1ml(作为病毒原液)。该过程由金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室完成。

实施例3、家兔攻毒剂量的确定

该实施例利用上述实施例2获得的塞内卡病毒液对家兔进行攻毒试验，以确定家兔的攻毒剂量，具体包括以下步骤：

3.1、选取试验动物：选取1.0～2.0kg健康易感家兔20只，检测塞内卡病毒血清中和抗体＜1:2，购自鄂尔多斯市达拉特旗永恒农牧业开发有限公司；

3.2、攻毒用毒制备：以实施例2制备的毒价为10^7.5TCID₅₀/0.1ml的病毒液为病毒原液进行梯度稀释，获得10倍稀释液、10²倍稀释液及10³倍稀释液，用于分别对家兔进行攻毒；

3.3、攻毒：将20只健康易感家兔随机分为5组，每组4只，分别以病毒原液、10倍稀释液、10²倍稀释液及10³倍稀释液，采用2.0ml/只滴鼻途径攻毒，剩余1组作为空白对照，攻毒后连续观察15天；攻毒结果如下表1所示。

表1：攻毒剂量试验结果

由上表1数据可见，使用毒价为10^7.5TCID₅₀/0.1ml的病毒原液攻毒组家兔发病率为100％， 10、10²、及10³倍稀释液攻毒组家兔发病率分别为75％、25％和0，因此，确定用于以下实施例中检验灭活疫苗效力的最小攻毒剂量定为使用病毒原液，即毒价为10^7.5TCID₅₀/0.1ml的塞内卡病毒液，2.0ml/只(或攻毒的毒量为至少2×10^8.5TCID₅₀)，采用滴鼻方式攻毒。

实施例4、用家兔和猪对猪塞内卡病毒病灭活疫苗进行免疫效力检验

4.1、该步骤为对上述实施例1获得的猪塞内卡病毒灭活疫苗(批号2019003、2019004、 2019005)进行效力检验，采用的实验动物为：1.0～2.0kg健康易感家兔20只，检测的塞内卡病毒血清中和抗体＜1:2，购自鄂尔多斯市达拉特旗永恒农牧业开发有限公司；采用的攻毒用毒为上述实施例2获得的塞内卡病毒原液(毒价为10^7.5TCID₅₀/0.1ml)。

具体操作包括以下步骤：

1)分组：将20只健康易感家兔随机分为4组，每组5只，其中3个组为免疫组，1个组留作对照组；

2)免疫：免疫组分别注射批号为2019003、2019004、2019005的猪塞内卡病毒病灭活疫苗注射剂量为1.0ml/只，注射途径采用腿部肌肉注射，对照组以相同方法注射同等剂量的生理盐水，免疫后所有家兔在相同环境下以相同方式进行饲养；

3)攻毒：免疫后第28天，用毒价为10^7.5TCID₅₀/0.1ml的攻毒用毒对已免疫家兔进行攻击，攻毒剂量为2.0ml/只，攻毒方式采用滴鼻途径，攻毒后每天上下午各观察一次，连续观察15天；观察结果如下表2所示。

4)结果判定标准：家兔攻毒后鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起的临床症状，该症状持续2～3天者判为发病(不保护)；无症状者判为保护；对照组至少4/5的家兔发病，免疫组至少4/5的家兔攻毒后未表现上述临床症状，即可判定疫苗效力合格。

表2：兔免疫攻毒试验结果

由上表2数据可见，使用的3批疫苗(批号为2019003、2019004、2019005的猪塞内卡病毒病灭活疫苗)对家兔的保护率均为100％，根据以上结果判定标准，所检测疫苗的效力均合格。

4.2、该步骤利用试验猪对上述4.1的猪塞内卡病毒病灭活疫苗的效力检验结果进行验证，其中使用的试验猪为60日龄以上健康易感猪，检测塞内卡病毒血清中和抗体＜1:2，购自呼和浩特市正大养猪场；采用的攻毒用毒为上述实施例2获得的塞内卡病毒原液(毒价为 10^7.5TCID₅₀/0.1ml)。

具体操作包括以下步骤：

1)分组：将20只健康易感猪随机分为4组，每组5只，其中3个组为免疫组，1个组留作对照组；

2)免疫：免疫组分别注射批号为2019003、2019004、2019005的猪塞内卡病毒病灭活疫苗注射剂量为2.0ml/头，注射途径采用腿部肌肉注射，对照组以相同方法注射同等剂量的生理盐水，免疫后所有猪在相同环境下以相同方式进行饲养；

3)攻毒：免疫后第28天，用毒价为10^7.5TCID₅₀/0.1ml的攻毒用毒对已免疫猪进行攻击，攻毒剂量为5.0ml/只，攻毒方式采用滴鼻途径，攻毒后每天上下午各观察一次，连续观察15 天；观察结果如下表3所示。

4)结果判定标准：猪蹄的蹄掌部、蹄冠部边缘或者蹄附趾部出现水疱、破溃或结痂；吻突部出现水疱、破溃或结痂；四肢腕关节、肘关节、膝关节等部位出现明显破、泡、溃，且取样经PCR鉴定为抗原阳性(即含有猪塞内卡病毒)，其中PCR鉴定使用的PCR引物为：上游引物SVA-F：5’-TATCTCAGATCCCTGGCTGTC-3’(SEQ ID NO:1)；下游引物SVA-R： 5’-CCTGATGATCACATTGTTGAGC-3’(SEQ ID NO:2)。反应体系为：2×One Step RT-PCR BufferⅢ 12.5μl，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μl，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μl，SVA-F (20μM)0.5μl，SVA-R(20μM)0.5μl，RNA模板2.0μl，RNA-free H₂O 5.8μl。PCR 反应条件为：首先42℃反转录15分钟，95℃2分钟预变性；然后94℃变性10秒，59℃退火30秒，45个循环。攻毒猪观察15日内出现上述任意一项症状可判定为发病(不保护)；无上述症状者判为保护。

表3：猪免疫攻毒试验结果

由上表3数据可见，使用的3批疫苗(批号为2019003、2019004、2019005的猪塞内卡病毒病灭活疫苗)免疫猪后，用毒价为10^7.5TCID₅₀/0.1ml的塞内卡病毒攻击，免疫猪未见明显临床症状，判定为保护；而对照组猪全部发病，判定为不保护，试验成立，证明使用的塞内卡病毒灭活疫苗的效力检验合格。

由实施例4结果可知，用家兔进行免疫攻毒试验与用猪进行免疫攻毒试验的结果是一致的，表明可以用家兔代替猪评价塞内卡病毒病灭活疫苗的免疫效力。并且，使用家兔进行猪塞内卡病毒灭活疫苗的效力检验时，由于感染SVA发病的家兔出现的临床症状为鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起，可以避免猪感染SVA后的水泡样症状与口蹄疫等疾病症状的混淆，将猪SVA感染与猪口蹄疫等疾病区别开来。

实施例5、口蹄疫病毒对家兔的致病性

该实施例用A型和O型口蹄疫病毒液(毒价均为10^7.5TCID₅₀/0.1ml，由金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室提供)对家兔进行攻毒试验，研究口蹄疫病毒对家兔的致病性，具体包括以下步骤：

5.1、选取试验动物：选取1.0～2.0kg健康易感家兔12只，检测口蹄疫病毒血清中和抗体＜1:2，购自鄂尔多斯市达拉特旗永恒农牧业开发有限公司；

5.2、攻毒用毒制备：毒价为10^7.5TCID₅₀/0.1ml的A型和O型口蹄疫病毒液，用于对家兔进行攻毒；

5.3、攻毒：将12只健康易感家兔随机分为3组，每组4只，分别以A型和O型口蹄疫病毒液，采用2.0ml/只滴鼻途径攻毒，剩余1组作为空白对照，攻毒后连续观察15天，出现与家兔感染塞内卡病毒相似症状者判为发病；攻毒结果如下表4所示。

表4：攻毒剂量试验结果

由上表4数据可见，使用毒价为10^7.5TCID₅₀/0.1ml的A型和O型口蹄疫病毒液攻击家兔，攻毒后在观察期内，2组家兔均未出现与塞内卡病毒攻击家兔相似的临床症状，即均没有表现出家兔鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起的临床症状，因此可用家兔攻毒方法区分口蹄疫病毒和塞内卡病毒。

用家兔从症状上区分塞内卡病毒与口蹄疫病毒至少包括以下步骤：

a)用病毒液样品接种家兔；病毒液样品可以是猪水泡样病变部位的病毒提取液，用于判断猪水泡样病变是由猪感染SVA引起还是由猪感染口蹄疫病毒引起；病毒液样品也可能是口蹄疫病毒疫苗生产原料，用于在猪口蹄疫病毒疫苗制备过程中筛查原料是否被塞内卡病毒污染。

b)连续观察，发现接种后家兔出现临床症状(家兔鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起)，即判定为含有塞内卡病毒(发病猪至少感染有SVA病毒，或口蹄疫病毒疫苗生产原料被SVA病毒污染)，无临床症状则判定为口蹄疫病毒(发病猪感染了口蹄疫病毒而不是SVA病毒，或口蹄疫病毒疫苗生产原料中不含SVA病毒)。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 金宇保灵生物药品有限公司

<120> 一种用家兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatctcagat ccctggctgt c 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctgatgatc acattgttga gc 22

Claims

1.一种用家兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述健康易感家兔的血清中塞内卡病毒血清中和抗体效价＜1:2。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中对家兔免疫接种的剂量为至少1.0ml，接种途径采用腿部肌肉注射。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中对已免疫家兔进行攻毒的毒量为至少2×10^8.5TCID₅₀。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)使用的塞内卡病毒液的毒价为至少10^7.5TCID₅₀/0.1ml，攻毒剂量为至少2.0ml/只。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中攻毒的方式包括但不限于滴鼻途径。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述临床症状为家兔鼻部、唇部及鼻唇交界部位少毛或无毛处出现粟粒大小白色或红色凸起，且症状持续2～3天。

8.用家兔从症状上区分塞内卡病毒与口蹄疫病毒的方法，其包括以下步骤：

a)用病毒液样品接种家兔；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述病毒液样品包括猪水泡样病变部位的病毒提取液、口蹄疫病毒疫苗生产原料。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述病毒液样品的毒价为至少10^7.5TCID₅₀/0.1ml，接种剂量为至少2.0ml/只。