CN110093320A - 猪塞内卡病毒gd-sva-2018株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪塞内卡病毒GD‑SVA‑2018株，所述病毒株的全基因序列如SEQ ID NO：2所示。本发明采用PCR方法对广东地区采集的疑似SVA病料进行PCR检测，经PCR证实为猪塞内卡病毒(SVA)，采用仓鼠肾细胞(BHK‑21)细胞分离培养，分离培养出1株BHK‑21传代细胞培养适应毒株，命名为GD‑SVA‑2018株。通过将猪塞内卡病毒GD‑SVA‑2018株灭活病毒液与油乳剂201混合制成灭活疫苗，所述疫苗免疫2月龄母猪28d后，采血测中和抗体效价可达1:256以上，几何平均为1:256～1:512之间，具有良好的免疫原性，具有较大的应用前景。

Description

猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株及其应用

技术领域

本发明涉及兽医生物学技术领域，更具体地，涉及一株猪塞内卡病毒 GD-SVA-2018株及其应用。

背景技术

猪塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)也称为塞尼卡谷病毒(Seneca Valleyvirus， SVV)，是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，是塞内卡病毒属的唯一成 员。猪塞内卡病毒感染具体症状表现为病猪鼻吻部、蹄冠部出现水疱，同时病猪 伴有厌食、跛行、发烧、嗜睡等症状。新生仔猪感染SVA与成年猪不同，某些 仔猪被报道患有腹泻(许多病毒均能引起临床症状)，而不引起鼻和蹄出现病变。 在2002年，美国一家公司的科研人员在胚胎视网膜细胞(PER.c6)培养腺病毒 室发现存在未知病原体污染，经病原分离鉴定得到并命名该病原体为SVV-001。 SVV-001最初被用来研究主要集中于其抗神经内分泌源性肿瘤的作用，研究人员 将其应用于治疗不同类型的肿瘤。直到2007年和2012年加拿大和美国相继发生 的猪原发性水疱病(PIVD)的致病病原都被诊断为SVA。在2014年后，巴西和 美国相继出现几次严重的感染症状，并导致巨大经济损失，该病才逐渐被重视。 2015年，中国首次从广东PIVD猪场爆发的样本中检测出SVA，感染母猪起泡 的临床症状和感染仔猪的急性死亡。近年来，SVA病例爆发性增加，虽然SVA 不像口蹄疫一样属于一类动物疫病，但我们对SVA的研究还不够彻底，SVA对 猪存在潜在的威胁。我们需要对SVA病毒的感染机制和遗传进化分析进行更深 入的研究。同时，有必要制定预防SVA病毒感染的措施。

另一方面，疫苗是预防病毒的最有效措施，其中灭活疫苗在传染病的预防中 发挥着重要作用。但是目前还未见有效的塞内卡病毒疫苗可以使用，也没有其他 有效的治疗手段，因此迫切需要一种可用于防治猪塞内卡病毒病的疫苗。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足和缺陷，提供一种猪塞内卡病毒 GD-SVA-2018株

本发明的另一目的在于提供所述猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株在制备猪塞 内卡病毒灭活疫苗中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株，所述病毒株的全基因序列如SEQ ID NO： 2所示，为7220bp。

本发明采用PCR方法对广东地区采集的疑似SVA病料进行PCR检测，经 PCR证实为猪塞内卡病毒(SVA)，采用仓鼠肾细胞(BHK-21)细胞分离培养， 分离培养出1株BHK-21传代细胞培养适应毒株，命名为GD-SVA-2018株。

本发明通过观察细胞病变、生物学特性研究等途径证实分离的病毒为猪塞内 卡病毒后设计扩增GD-SVA-2018株全部结构基因序列的9对引物，通过重叠PCR 测序得出GD-SVA-2018中间序列，两端序列则通过经过PCR扩增，胶回收，加 polyA，连接T载体，转化，提取质粒等过程，送公司测序，最后通过生物学软 件拼接得到GD-SVA-2018株全部结构基因序列。

本发明还提供所述猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株的繁殖方法，包括如下步 骤：

当BHK-21细胞长至90％左右时，弃去培养液，用PBS清洗3次后，加少 量DMEM，然后按1％的接毒量接种GD-SVA-2018株于BHK-21细胞，轻轻摇 动，使病毒液充分均匀的分布于培养液中，置于5％CO₂、37℃温箱中孵育1h后， 补加培养液，使血清的终浓度为2％，设空白对照组。逐日观察细胞病变情况， 当细胞病变达80％左右时，约在接毒后的24～36h左右，反复冻融三次，收获病 毒，放于-80℃备用。

本发明还请求保护所述猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株在制备猪塞内卡病毒 灭活疫苗中的应用；具体为将猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株灭活病毒液与油乳 剂混合制成灭活疫苗。

优选地，所述油乳剂为白油乳剂201。

将上述灭活疫苗对2月龄左右健康母猪，在免疫后每七天采血，两周后再次 免疫。检测到SVA抗体效价达1:256以上，几何平均为1:512，而对照母猪塞内 卡病毒抗体显示阴性；说明以广东分离株GD-SVA-2018株制备的灭活疫苗接种 母猪后具有良好的免疫原性。

在疫苗制备中，对病原进行有效的灭活，可提供安全的疫苗，主要通过将猪 塞内卡病毒体外培养后灭活，然后与乳化剂混合制成免疫疫苗。

优选地，所述灭活剂为β-丙内酯。

本发明采用1:2000和1:4000的β丙内酯两次灭活猪塞内卡病毒 GD-SVA-2018株，每次灭活4h，两次灭活后，放置37℃恒温箱水解2h。将灭活 的病毒液接种BHK-21细胞经盲传3代无CPE。所以最终确定1:2000和1:4000 的β丙内酯用来灭活猪塞内卡病毒。

一种猪塞内卡病毒灭活疫苗，包含GD-SVA-2018株灭活病毒液与油乳剂。

优选地，所述GD-SVA-2018株灭活病毒液与油乳剂的体积比为1:1。

优选地，所述猪塞内卡病毒灭活疫苗的制备方法为先将油乳剂低速搅拌，过 程中逐渐加入灭活完全的GD-SVA-2018株灭活病毒液，然后高速搅拌混合液进 行乳化，即得猪塞内卡病毒灭活疫苗。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株，所述病毒株的全基因序 列如SEQ ID NO：2所示，为7220bp。通过将猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株灭 活病毒液与油乳剂201混合制成灭活疫苗，所述疫苗免疫2月龄母猪28d后，采 血测中和抗体效价可达1:256以上，几何平均为1:256～1:512之间，具有良好的 免疫原性，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明GD-SVA-2018株Senecavirus A保守区域的扩增电泳图。

图2为本发明GD-SVA-2018株接种于BHK-21单层细胞后的细胞形态。

图3为本发明GD-SVA-2018株9段重叠片段长度扩增产物的琼脂糖凝胶电 泳图。

图4为本发明GD-SVA-2018株9段重叠片段长度扩增产物的琼脂糖凝胶电 泳图。

图5为本发明GD-SVA-2018株VP1基因核苷酸序列与来自Genbank中的75 株VP1基因核苷酸序列的同源性比较结果。

图6为本发明GD-SVA-2018株VP1基因序列与来自Genbank中的75株VP1 基因核苷酸序列生成的SVA VP1基因基因系统进化树。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1猪塞内卡病毒毒株GD-SVA-2018株的分离鉴定和生物学特性的研究

1、材料

(1)病料和细胞

组织病料采集于广东省某猪场病死猪的水疱液、水疱皮。细胞：本研究采用 BHK-21细胞，本实验室冻存，细胞状态良好。

(2)试剂及配方

细胞培养液：DMEM(Gibco)营养液+10％FBS+1％双抗。

细胞维持液：DMEM+2％FBS。

细胞消化液：0.25％胰酶，pH＝8～9。

PBS缓冲液：称取KH₂PO₄ 0.2g，12水合Na₂HPO₄ 2.83g，NaCl 8g和KCl 0.2g， 加ddH₂O定容至1000mL，调PH至7.2，用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤，灭菌 后4℃保存。

Hanks液：NaCl 8g，KCl 0.4g，12水合Na₂HPO₄ 0.06g，葡萄糖1g和酚红 粉0.02g，加ddH₂O定容至1000mL，用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤，灭菌后4℃ 保存。

0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)：8g NaCl，0.2g KC1，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800m1蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水 定容至1L即可。保存于室温或4℃冰箱。

2、引物设计

从NCBI上获取Senecavirus A全基因序列15条，经过MAGA7.0生物信息 学软件分析比对得到全基因序列的保守序列区域。根据引物设计原则利用primer primer 6.0设计Senecavirus A保守区域的特异性引物：

SVVF：5'-CCTCAGAGACACAGAACTC-3'

SVVR：5-'GAAAGGGTGATCGGGAAG-3'

3、病料处理和PCR检测

(1)病料处理

取部分水泡皮用液氮研磨至粉末状，然后用200μL含1％抗生素的DMEM 将其重悬放置-80℃保存，再取200μL的PBS将研磨里的粉末残渣重悬用来提取 基因组。将含有水泡液的棉签剪段放置1.5mL的离心管中，往离心管中加入 500μL含1％抗生素的DMEM，将离心管放置振荡仪剧烈振荡30s。分别将病料 研磨液和水泡稀释液放置-80℃三冻三融。将冻融好的病料研磨液和水泡液稀释 液用4℃离心机12000r/min离心十分钟取上清。把离心取得的上清用0.22μm滤 器过滤并储存在-80℃超低温冰箱。

(2)PCR检测

采用病毒RNA提取试剂盒提取并反转录成cDNA。以反转录所得的cDNA 为模板，以ddH₂O为阴性对照，加入下列组分，配成20μL体系，进行PCR反 应。反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火52℃30s，延伸72℃30s， 30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产 物，使用1X TAE缓冲液配制1.0％琼脂糖悬液，微波炉加热溶解后冷却50℃， 加入6μL GODVIEW混匀，再将其倒入准备好的凝胶板中。待胶凝固后，在加 样孔分别加入PCR产物样品及阴性对照及标准的DNA Marker DL2000样品， 120V电压电泳30min左右后，在紫外检测仪下观察电泳结果并照相。

结果：从疑似SVA感染的组织病料中提取RNA，进行PCR扩增，扩增产物 经1％琼脂糖凝胶电泳检测表明，获得约442bp的特异性条带(图1)，与预期片 段大小相等。序列如SEQID NO：1所示，证实为猪塞内卡病毒(SVA)。

4、病毒的培养

PCR检测阳性的病料，按照维持液量的10％接种于长至约90％的BHK-21 细胞，置37℃，5％CO₂培养箱中培养，细胞病变达约90％，反复冻融三次，收 获病毒。若没有病变，盲传直至出现稳定的细胞病变，此后按培养液的1％接毒， 将该毒株连续传代直至达到稳定的效价，培养出1株BHK-21传代细胞培养适应 毒株，命名为GD-SVA-2018株。

5、细胞病变观察

将形态良好，长至80％～90％的BHK-21单层细胞，弃培养液，将病毒按照 维持液量的1％接种于BHK-21细胞，置37℃，5％CO₂恒温培养箱观察，一般接 毒后4h后细胞出现病变。

结果：将处理后的组织病料接种于长至80％的BHK-21传代细胞，正常 BHK-21细胞紧密的贴壁生长，接毒后的细胞内颗粒物质增多，接着细胞变圆， 皱缩，呈网状，视野中有空洞，很多细胞发生裂解、破碎，部分细胞拉长的碎片 仍贴在细胞瓶壁上(图2)。

6、病毒TCID₅₀的测定

准备好形态良好，长至80％～90％的BHK-21单层细胞的96孔板。用无血 清DMEM培养基将SVA病毒作连续10倍稀释，即从10^-1，I 0^-2，10^-3......10^-8。 将稀释好的病毒液直接加入铺好BHK-21细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释 度作8个重复，每孔接种100μL，设正常细胞对照。混匀后再培养36h左右后， 在显微镜下观察细胞病变(CPE)，判定CPE孔数，根据Reed-Muench法计算 病毒TCID50。

结果：GD-SVA-2018株，经过BHK-21细胞增殖，TCID₅₀稳定在10⁸/mL左 右。

7、耐氯仿实验鉴定

取5支灭菌的离心管，在超净台内加入1mL GD-SVA-2018株细胞培养液。3 管加入终浓度为4.8％的分析纯氯仿，振荡混匀，置4℃，作用10min，随后，4000rpm 离心8min，然后取上清备用。剩下两管做阴性对照。将上清接种于形态良好， 长至80％～90％的BHK-21单层细胞并连续传至三代。病毒可使细胞产生CPE， 并且PCR检测SVA阳性作为判断结果的方式。

实施例2猪塞内卡病毒毒株GD-SVA-2018的全基因组克隆与序列分析

1、材料

猪塞内卡病毒毒株GD-SVA-2018，Genestar2x taq酶，PCR仪，TAE溶液琼 脂糖，EB替代物，T载体，提病毒RNA试剂盒。

2、引物设计

从Gebank下载公布的SVA基因序列，设计9对相互重叠片段的引物(表1)， 用于扩增包括全部编码区在内的全基因序列。引物有上海生工生物工程有限公司 合成。

表1扩增SVA全基因的引物

3、病毒RNA的提取和全基因扩增

用病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。用反转录试剂盒将病毒RNA反转 为cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增。

扩增体系：1μL cDNA，各1μL上下游引物，10μL Genestar2x taq酶，7μL ddH₂O， 共20μL体系。

反应过程：预变性94℃，2min；变性94℃，15s，退火51～59℃(表2)， 30s，延伸72℃，30～60s，30～35个循环；终延伸72℃，5min。PCR产物经1％ 琼脂糖凝胶(含6μL/100mLEB替代物)电泳检测。

若PCR产物为阳性，将CXSVV1F/1R～CXSVV7F/7R扩增的PCR产物进 行胶回收后送至上海生物股份有限公司测序。CXSVV0F/0R与CXSVV8F /8RPCR产物回收纯化后与T载体连接，经转化、提取质粒等过程，将质粒送至 上海生工生物股份有限公司测序。

结果：对猪塞内卡病毒GD-SVA-2018各片段进行扩增，9段重叠片段长度 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳测序结果如图3和图4所示，扩增产物大小与预期大 小一致。

4、SVA全基因组序列的测定与分析

将由上海生工生物有限公司成功测序后的9段序列拼接得到GD-SVA-2018 全基因序列。用DNAstar软件将GD-SVA-2018全基因序列与Genbank上已发表 的SVA序列进行比较和分析。所选用毒株均为Genbank上收录的SVA毒株(表 2)。

表2所用毒株的登录号

结果：用DNAstar软件将9段重叠片段的测序结果进行拼接，得到猪塞内卡 病毒GD-SVA-2018全基因序列。拼接结果表明，该猪塞内卡病毒分离株的全基 因序列为7220bp，序列如SEQ ID NO：2所示。

利用DNAstar序列分析软件对GD-SVA-2018株的VP1基因核苷酸序列分别 与来自Genbank中的75株VP1基因核苷酸序列进行同源性比较，如图5。由图 可知，GD-SVA-2018株的VP1基因序列与其他SVA毒株的VP1基因序列同源 性90.7％～99％之间；GD-SVA-2018-VP1基因序列与中国GD03/2017和 GD01/2017毒株序列同源性最高为99.0％，与SVV-001株的VP1基因序列的同 源性最低。

利用BEAUti/BEAST序列分析软件对GD-SVA-2018株的VP1基因序列及来 自Genbank中的75株VP1基因核苷酸序列进行遗传进化分析，并分别生成SVA VP1基因基因系统进化树(如图6)。由图可知，GD-SVA-2018株由美国SVA USA/GBI26/2015和USA/GBI29/2015演变而来，与SVV-001株的关系最远。

实施例3猪塞内卡病毒灭活疫苗的制备及免疫效力检测

一、材料

BHK-21细胞，保存于华南农业大学微生物实验室；GD-SVA-2018株：通过 实施例1和2获取，并保藏于实验室。

二月龄的猪塞内卡病毒抗体阴性的母猪：广州良种猪场。

灭活剂：β-丙内酯

乳化剂：白油佐剂201。

二、猪塞内卡病毒灭活疫苗制备方法

1、病毒增殖

将病毒液，按照维持液的1％接种于长至90％左右BHK-21细胞，置37℃， 5％CO₂培养箱中培养，细胞病变达约90％(24～36h)收毒，反复冻融三次，-80℃ 保存备用。

2、病毒TCID₅₀C测定

准备好形态良好，长至80％～90％的BHK-21单层细胞的96孔板。用无血 清DMEM培养基将SVA病毒作连续10倍稀释，即从10^-1，10^-2，10^-3......10^-8。 将稀释好的病毒液直接加入铺好BHK-21细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释 度作8个重复，每孔接种100μL，设正常细胞对照。混匀后再培养36h左右后， 在显微镜下观察细胞病变(CPE)，判定CPE孔数，根据Reed-Muench法计算 病毒TCID50。

结果显示，GD-SVA-2018株在BHK-21细胞上稳定增殖在10^8.3TCID₅₀。

3、病毒灭活及灭活检验

(1)灭活时间的确定

病毒液中加入终浓度为1:2000的β-丙内酯，混匀，4℃进行灭活期间，每隔 2小时摇动病毒悬液一次。分别于4h、8h、12h取出病毒液进行水解，然后进行 灭活检验，同时设阳性对照。

病毒灭活效果检验：将不同时间段取出的病毒液分别种BHK-21细胞上，连 续盲传三代，期间观察细胞CPE情况；盲传三代后将细胞反复冻存3次，通过 PCR检测培养液的抗原活性，判断灭活效果。

结果显示，灭活4h、8h、12h灭活的病毒在BHK-21细胞上均没有产生细胞 病变，且细胞生长情况良好。因此选择，4h作为灭活时间。

(2)灭活程序及检验

用1:2000β-丙内酯灭活病毒灭活4h，然后用1:4000β-丙内酯灭活病毒灭活 4h，然后将灭活好的病毒放置37℃恒温箱水解2h，然后在BHK-21细胞上盲传 3代，同时观察细胞病变情况。

将灭活的病毒液接种BHK-21细胞经盲传3代无CPE，所以最终确定1:2000 和1:4000的β丙内酯用来灭活猪塞内卡病毒。

4、乳化：

GD-SVA-2018株灭活疫苗的制备

油相：高压好的佐剂201

水相：首先将灭活好的GD-SVA-2018株病毒液放置37℃水解2h，再将已经 水解完的病毒液进行灭活检测，取20mL灭活完全的病毒液。

乳化(20mL)：水相：油相＝1：1，即10mL高压好的佐剂201，10mL灭 活完全的GD-SVA-2018株病毒液。取佐剂201放置50mL离心管中，在乳化机 低速搅拌的过程中逐渐加入灭活完全的病毒液10mL，然后高速搅拌混合液进行 乳化。高速搅拌5min钟后，进行乳化检验。检验合格后，将制备好的疫苗放置 4℃冰箱保存。

三、疫苗效力检验

1、母猪免疫试验

将11只2月龄母猪分为疫苗注射组、阴性对照组二组，疫苗注射组、阴性 对照组每组5只。注射组每只注射3mL猪塞内卡病毒乳化剂；阴性对照组每只 母猪注射PBS3mL；免疫后每隔一周进行采血分离血清。将分离的血清用来做病 毒中和实验。

结果显示，制备的猪塞内卡病毒灭活疫苗免疫母猪后，观察30d，母猪均健 康生长，无不良反应。

2、抗体水平检测

(1)血液处理：37℃，静置1h，8000rpm，离心10min，取血清分装，-20℃ 保存备用。

(2)固定病毒的稀释：通过观察CPE的方法得出GD-SVA-2018的TCID₅₀， 将准备好已知TCID₅₀的GD-SVA-2018稀释到100TCID₅₀/0.1mL。

3、病毒中和实验

免疫后一周到免疫后四周每七天采取血液并分离过滤得到无菌的血清；然后 将采取的血清用60℃金属水浴锅灭活30min，取200μL不同浓度的稀释血清分 别与200μL标准病毒(100TCID50/0.1mL)混合，置37℃恒温箱作用1h；取混 合液0.1mL分别加到细胞已长成单层的96孔细胞培养板中，每一稀释度接种4 孔细胞。同时设4孔正常细胞对照和设4孔100TCID50/0.1mL作病毒对照；设 病毒滴度对照。将病毒液连续10倍稀释后，加到细胞已长成单层的96孔细胞培 养板中，每个稀释度接种4孔细胞，每孔加0.1mL。结果判定，阴性对照组血清 和阳性病毒对照组细胞均病变。以能中和50％以上的血清稀释效价作为免疫效力评估的数据。

猪塞内卡病毒疫苗中和抗体效价测定结果如表3所示，后备母猪在注射猪塞 内卡病毒灭活疫苗后28d，病毒中和试验方法检测抗体效价结果：试验组(乳化 剂注射组)的抗体效价平均约为1:256～1:512之间。阴性对照组(0mL组)的 猪的猪塞内卡病毒抗体水平呈阴性(<＝1：5)。本发明中的猪免疫实验表明，实 验室制备的猪塞内卡病毒灭活疫苗能够刺激机体产生高水平的抗体。

表3猪塞内卡病毒疫苗中和抗体效价测定结果结果

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株及其应用

<141> 2019-03-27

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 415

<212> DNA

<213> 猪塞内卡病毒(Senecavirus A)

<400> 1

tttcctttcg gtcgactgag caggacagca acgtagggca cgtaagcgtc tgaggcaggc 60

tcgggttcag acacccgccc aaacgccata agagtgggta tacgggccag ttgtaagagg 120

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<210> 2

<211> 7222

<212> DNA

<213> 猪塞内卡病毒(Senecavirus A)

<400> 2

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acttcttaat gaagtgcggg tggcaggtgc aggtccaatg caatttgacg caattccacc 1500

aaggtgctct tcttgttgcc atggtccctg agaccaccct tgatgtcaaa cctgacggca 1560

aggcaaagag cttacaggag ctgaatgaag aacagtgggt agaaatgtct gacgattacc 1620

agaccgggaa aaacatgcct tttcagtctc ttggcacata ctatcggccc cctaactgga 1680

cttggggtcc caattttatc aacccctatc aagtaacagt tttcccacac caaattctga 1740

atgcgagaac ttctacctcg gtagacataa gtgtcccata catcggggag actcctacac 1800

agtcctcaga gacacagaac tcctggaccc tcctcgttat ggtgcttgtc cccttagact 1860

acaaggaggg agccacaact gacccagaaa ttacattctc tgtaaggcct acaagtcctt 1920

acttcaatgg gcttcgtaac cgtttcacga ccgggacgga cgaggaacag gggcccattc 1980

ccacagcacc cagagaaaac tcgcttatgt ttctctcaac catccccgac gacactgtcc 2040

ctgcttacgg gaatgtgcgt acccctcccg tcaattacct ccccggtgaa ataaccgacc 2100

tcttacaact ggcccgtata cccactctta tggcgtttgg gcgggtgtct gaacccgagc 2160

ctgcctcaga cgcttacgtg ccctacgttg ctgttcctgc tcagttcgac gacaagcctc 2220

tcatctcctt cccgatcacc ctttcagatc ctgtctacca gaacaccctg gtaggcgcca 2280

tcagttcgaa cttcgctaac taccgggggt gtatccaaat cactctgaca ttttgtggac 2340

ccatgatggc aagagggaaa ttcctgctct cgtattctcc cccaaatgga gcacaaccac 2400

agaccctttc tgaagctatg cagtgcacat actctatttg ggacataggc ttgaactcta 2460

gttggacctt tgtcatcccc tacatctcgc ccagtgatta ccgtgaaact cgggctatta 2520

ccaactcagt ttattctgct gatggttggt ttagcttaca caagctgacc aaaatcactc 2580

taccacctga ctgcccacag agtccctgta ttctcttttt cgcctctgct ggtgaggatt 2640

acaccctccg tctccctgtt gattgtaatc cttcctacgt gttccactcc accgacaacg 2700

ccgagactgg tgttattgag gcaggcaaca ctgacaccga tttctctggt gaactggcgg 2760

ctcctggctc taaccatact aatgtcaaat ttctttttga tcgatctcga ctactgaatg 2820

taattaaggt actggagaag gacgctgtct tcccccgtcc tttccccaca gcaacaggcg 2880

cacagcagga cgatggttac ttttgtcttc tgacaccccg cccaacggtc gcttcccgac 2940

ccgccacccg tttcggcctg tacgtcaacc cgtctgacag tggcgttctc gctaacactt 3000

cactggattt caatttttac agtttggcct gtttcactta ctttagatca gaccttgaag 3060

tcacggtagt ctcactggag ccagatctgg aattcgccgt ggggtggttc ccctctggca 3120

gtgagtacca ggcttctagc tttgtctacg accaactgca tgtaccctac cactttactg 3180

ggcgcactcc ccgcgctttc accagcaagg gcggaaaggt atctttcgtg ctcccttgga 3240

actctgtctc ttccgtgctt cccgtgcgct gggggggcgc ttccaagctt tcttctgcca 3300

cgcggggtct gccggctcat gctgactggg ggaccattta cgccttcatc ccccgtccta 3360

acgagaagaa aagcaccgct gtaaagcacg tggcggtgta cgttcggtac aagaacgcgc 3420

gtgcttggtg ccccagcatg cttccctttc gcagttacaa gcaaaagatg ctgatgcaat 3480

caggcgacat cgagaccaac cctggccctg cttctgacaa cccaatcttg gagtttcttg 3540

aagcggaaaa cgatctagtc actctggcct ctctctggaa gatggtacac tctgttcaac 3600

agacctggag gaagtatgtg aagaacgata atttttggcc caacttgctc agtgagctag 3660

tgggggaagg ctccatcgct ttggccgcca cgctatctaa ccaagcttca gtgaaagctc 3720

tcttgggcct gcattttctc tctcgagggc tcaattacac agatttttac tctttactga 3780

tagagaaatg ctctagtttc tttactgtag aaccgcctcc tccaccagct gaaaatctga 3840

tgaccaagcc ctccgtgaag tcgaaattcc gaaagctgtt caagatgcaa ggacccatgg 3900

atacagtcaa agactggaac caaatagccg ccggcttgaa gaatttccaa tttgttcgtg 3960

acctagtcaa agaggtggtc gattggctcc aggcctggat caataaagag aaagccagcc 4020

ctgtcctcca gtaccagctg gagatgaaga agctcgggcc cgtggctttg gctcatgatg 4080

ccttcatggc cggttctggg cccccccttg gtgacgacca gattgaatac ctccagaacc 4140

tcaaatctct tgccctgaca ctgggaaaga ctaatttggc ccaaagtctc accactatga 4200

tcaatgccaa gcagagctcc gcccaacgag tcgaacccgt tgtggtggtc ctcagaggca 4260

agccaggatg cggcaaaagc ctggcctcca cgttgattgc ccaggctgtg tctaagcgtc 4320

tctatggctc acaaagtgtg tattctcttc ctccggatcc agacttcttc gacggataca 4380

aaggacagtt tgtaaccttg atggacgacc tgggacaaaa cccggatggg caagatttct 4440

ccaccttttg tcagatggta tcgaccgccc aatttcttcc caacatggcg gaccttgcag 4500

agaaggggcg tcccttcacc tccaatctta tcattgcaac tacaaacctc cctcacttta 4560

gccctgtcac cattgctgat ccttctgcag tctctcggcg tattaactac gacctgactc 4620

tggaagtatc tgaggcctac aagaagcaca cacggctgaa ttttgacctg gctttcagac 4680

gcactgacgc cccccccatt tacccttttg ctgcccatgt gcccttcgtg gacgtggctg 4740

tgcgcttcaa aaatggtcat caaagcttca atctcctaga gttggtcgac tctatttgta 4800

cagacattcg ggccaagcaa caaggtgctc gaaatatgca gactctggtt ctacagagcc 4860

ctaacgagaa cgacgacacc cccgtcgacg aggcgttggg tagagttctc acccccgctg 4920

cggtcgacga agcgcttgct gaccttgctc cagatgccga cccggttggc cgcttggcta 4980

ttctcgccaa gctaggtctt gccctagctg cggtcacccc tggtttgata atcttggcag 5040

tgggactcta caagcacttc tctggctctg atacagacca agaagagaca gaaagtgagg 5100

agcctgctaa agcgcctagg agcgagaatg cttatgacgg tccgaagaaa aactctaagc 5160

cccctggagc gctctctctt atggaaatgc aacagcccaa cgtggacatg ggctttgagg 5220

ctgcggtcgc taagaaagtg gtcgtcccca ttaccttcat ggttcccaac agaccttctg 5280

gacttacaca gtccgctctt cttgtggccg gccggacctt cctaatcaat gagcatacat 5340

ggtccaaccc ctcctggacc agcttcacaa tccgtggtga ggtgcacact cgtgatgagc 5400

ctttccaaac ggttcatttt acccaccatg gtcttcccac agatctgatg atggtacgtc 5460

tcagaccggg caactctttc cctaacaatc tagacaagtt tggacttgac cagatgccgg 5520

cacgtaactc ccgtgtggtt ggcgtttcgg ctagttacgg taacttcttt ttctctggga 5580

acttcctcgg gtttgttgac tccatcacct ctgaccaagg aacctatgcg agacttttca 5640

ggtacagggt gacgacttac aagggatggt gcggttcggc cctggtctgt gaggccggtg 5700

gtgtccggcg catcattggc atgcattctg ctggtgccgc tggtatcggc gccgggactt 5760

acatctcaaa attaggactg atcaaagccc ttaaacacct cggtgagcct ctggctacaa 5820

tgcaaggact aatgactgag ctagagcctg gagtcaccgt acatgtgccc cgaaaatcta 5880

aattgagaaa gacgaccgca cacgcggtgt acaaaccgga gtttgaacct gctgtgttgt 5940

caaaatttga tcccagactg aacaaggatg ttgacctaga tgaggtaatt tggtctaagc 6000

acaccgccaa tgtcccttac caacctcctt tgttctacac atacatgtca gagtacgctc 6060

atcgggtttt ctcctttttg ggaaaagaca atggcattct gaccgtcaaa gaagcaatcc 6120

tgggcatccc tggactagac cctatggatc cccacacagc tccgggtttg ccttacgccg 6180

ttagcggcct tcgacgtact gatctcgtcg attttgcgaa cggcacggta gacccggcac 6240

tggccatgca gatccagaaa ttcttagacg gtgactactc tgatcatgtc ttccaaactt 6300

ttctgaaaga tgaaatcaga ccctcagaga aggtccgggc gggaaaaacc cgcattgttg 6360

acgtgccctc cctggcgcac tgcattgtgg gcagaatgtt gcttgggcgc tttgccgcca 6420

agtttcaatc ccatcctggc tttctccttg gctccgctat cgggtctgac cccgatgtct 6480

tctggaccgt cataggggcc cagctcgagg gaagaaagaa cacgtacgac gtggactaca 6540

gtgcctttga ctcttcacac ggcactggct ccttcgaggc tctcatctct cactttttca 6600

ccgtggacaa tggtttcagc cctgcgctgg gaccgtatct cagatccctg gctgtctcgg 6660

tgcacgctta cggcgagcgt cgcatcaaga ttaccggagg cctcccctct ggttgtgccg 6720

cgaccagcct gctgaacaca gtgctcaaca atgtgatcat caggactgct ctggcattga 6780

cctacaagga atttgaatat gacatggttg atatcatcgc ctacggtgac gatcttctgg 6840

ttggtacgga ttacgatcag gacttcaatg aggtggcgcg gcgcgctgct aaactggggt 6900

ataagatgac tcctgccaac aagggttctg tcttccctcc gacttcctct ctctctggtg 6960

ctgtttttct aaaacgcaaa ttcgtccaaa acaatgatgg cttatataga ccagttatgg 7020

atgtaaagaa tttggaagcc atgctctcct acttcaaacc aggaacacta ctcgagaagc 7080

tgcaatctgt ttctatgttg gctcaacatt ctggaaaaga agaatatgat agattgatgc 7140

accccttcgc tgactacggt gccgtaccga gtcacgagta cctgcaggca agatggaggg 7200

ccttgttcga ctgacctgga aa 7222

Claims (7)

1.猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株，其特征在于，所述病毒株的全基因序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株在制备猪塞内卡病毒灭活疫苗中的应用。

3.一种猪塞内卡病毒灭活疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株灭活病毒液与油乳剂。

4.根据权利要求4所述的灭活疫苗，其特征在于，所述GD-SVA-2018株灭活病毒液与油乳剂的体积比为1:1。

5.根据权利要求3或4所述的灭活疫苗，其特征在于，所述猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株灭活病毒液采用的灭活剂为β-丙内酯。

6.根据权利要求5所述的灭活疫苗，其特征在于，所述猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株灭活病毒液为采用1:2000和1:4000的β丙内酯两次灭活猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株，每次灭活4h，两次灭活后，放置37℃恒温箱水解2h，将灭活的病毒液接种BHK-21细胞经盲传3代无CPE，即得。

7.权利要求3所述猪塞内卡病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，先将油乳剂低速搅拌，过程中逐渐加入灭活完全的GD-SVA-2018株灭活病毒液，然后高速搅拌混合液进行乳化，即得猪塞内卡病毒灭活疫苗。