CN102580079A - 猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗，该疫苗由灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合制成。本发明在乳鼠和猪体上对疫苗进行了安全性评价，结果发现，免疫之后无一只乳鼠死亡，无一头仔猪发生致敏反应，同样也未观察到明显的全身和局部反应，充分证明本发明灭活疫苗是安全、可靠的。本发明猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗组在免疫第4周时CD4⁺/CD8⁺的比值显著高于其他疫苗组，其比值由2.11提高到2.97，说明该疫苗加强了小鼠的细胞免疫状态。本发明猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗能诱导IFN-γ的分泌表达，该疫苗能显著增强Th1型细胞产生免疫应答反应，诱导其分泌IFN-γ，从而增强细胞免疫水平，能产生较强的细胞免疫应答。

Description

猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于猪细小病毒疫苗技术领域，具体涉及一种猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

猪细小病毒病作为一种重要的母猪繁殖障碍疾病，对母猪和种猪的危害都很大，疫苗免疫预防是控制该病的主要手段。现在国内规模化猪场的存栏母猪及种猪场的种猪和后备种猪都需要进行该病的免疫预防接种。灭活疫苗作为预防PPV常用疫苗，具有安全、长效等很多优点，但存在常规白油佐剂疫苗免疫机体后不能产生较好的细胞免疫应答。常规铝佐剂具有注射部位偶有红疹、皮下结节、接触性过敏等症状和增加易感个体的敏感性等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是制备一种新型佐剂，提供一种猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法。

本发明的技术方案是：猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗，该疫苗由灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合制成。

所述的猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下：

（1）将猪细小病毒增值、纯化、灭活；

（2）制备纳米铝佐剂，将氯化铝溶于蒸馏水中，氯化铝与蒸馏水的质量比为1:20-30，制成氯化铝溶液，将质量浓度分数为25-28%的氨水滴入氯化铝溶液中，调节pH为9.0，搅拌10-15分钟，得到白色沉淀物，为氢氧化铝胶，然后采用超速离心法收集氢氧化铝胶沉淀，再用水洗，后转移至锥形瓶中，加入蒸馏水制成悬浮液，蒸馏水的加入量为氯化铝质量的10-15倍，在75-85℃下用磁力搅拌器不断搅拌，用1 mol /L HCl调pH至3.0-4.0，反应持续8-10 h后得到透明的氢氧化铝胶，最后，氢氧化铝胶用双蒸水透析纯化24-28小时，将pH调至6.0，制成纳米铝胶佐剂；

（3）将灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合，振荡均匀，制成猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗。

所述步骤（2）中的氯化铝为六水结晶氯化铝或无水氯化铝。

本发明的有益效果是：本发明在乳鼠和猪体上对疫苗进行了安全性评价，结果发现，免疫之后无一只乳鼠死亡，无一头仔猪发生致敏反应，同样也未观察到明显的全身和局部反应，充分证明本发明灭活疫苗是安全、可靠的。本发明猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗组在免疫第4周时CD4⁺/CD8⁺的比值显著高于其他疫苗组，其比值由2.11提高到2.97，说明该疫苗加强了小鼠的细胞免疫状态。本发明猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗能诱导IFN-γ的分泌表达，该疫苗能显著增强Th1型细胞产生免疫应答反应，诱导其分泌IFN-γ，从而增强细胞免疫水平，能产生较强的细胞免疫应答。

附图说明

图 1为PPV 灭活效果PCR检测结果，M:.DNA marker DL2000；1.灭活16 h；2. 灭活20 h；3. 灭活24 h；4.灭活36 h；5.灭活48h；6.灭活72 h；

图2为血清抗体水平的检测结果；

图3为免疫后小鼠外周血CD3+细胞所占百分比；

图4为免疫后小鼠外周血CD3⁺ CD4⁺细胞所占百分比；

图5为免疫后小鼠外周血CD3⁺CD8⁺细胞所占百分比；

图6为免疫后小鼠外周血CD4+/CD8+的动态变化；

图7为IL-4的标准曲线；

图8为接种疫苗后小鼠血清中IL-4水平；

图9为IFN-γ的标准曲线；

图10为 免疫后小鼠血清中IFN-γ水平；

图11为免疫后血清中HI抗体动态变化（log2）；

图12为免疫后血清中ELISA抗体动态变化；

图13为灭活苗免疫后猪外周血CD3+细胞所占百分比；

图14为灭活苗免疫后猪外周血CD3⁺CD4⁺细胞所占百分比；

图15为灭活苗免疫后猪外周血CD3⁺CD8⁺细胞所占百分比；

图16为纳米铝胶佐剂的XRD表征图。

具体实施方式

猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗，该疫苗由灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合制成。

所述的猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下：

（1）将猪细小病毒增值、纯化、灭活；

（2）制备纳米铝佐剂，将氯化铝溶于蒸馏水中，氯化铝与蒸馏水的质量比为1:20-30，制成氯化铝溶液，将质量浓度分数为25-28%的氨水滴入氯化铝溶液中，调节pH为9.0，搅拌10-15分钟，得到白色沉淀物，为氢氧化铝胶，然后采用超速离心法收集氢氧化铝胶沉淀，再用水洗，后转移至锥形瓶中，加入蒸馏水制成悬浮液，蒸馏水的加入量为氯化铝质量的10-15倍，在75-85℃下用磁力搅拌器不断搅拌，用1 mol /L HCl调pH至3.0-4.0，反应持续8-10 h后得到透明的氢氧化铝胶，最后，氢氧化铝胶用双蒸水透析纯化24小时，将pH调至6.0，制成纳米铝胶佐剂；

（3）将灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合，振荡均匀，制成猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗。

不同佐剂猪细小病毒灭活疫苗的制备

1材料与方法

PK-15细胞购自中国兽药监察所，冻存；猪细小病毒标准株。试验动物：2～4日龄清洁级昆明乳鼠购自郑州大学医学院实验动物中心；35日龄PPV阴性断奶仔猪，由郑州市某养猪场提供。主要仪器：超净工作台，购自苏净集团安泰公司；小型台式离心机，购自德国Sigma公司；MiLLipak40型超纯水制备系统，购自德国MiLLipore公司；AB204-N电子分析天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，购自上海亚荣生化仪器厂；LEICA DMIL倒置显微镜，购自德国莱卡公司；CO₂培养箱，购自美国Thermo Forma公司。主要试剂：胎牛血清购自Hyclone公司；RPMI-1640培养液购自GIBCOBR公司；甲醛溶液（分析纯）购自烟台市双双化工有限公司；胰蛋白酶购自Solarbio公司；MONTANIDE ISA206VG成品白油佐剂为法国赛比克公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PK-15细胞的培养

在无菌条件下，将冻存的PK-15细胞从液氮中取出，1000 rpm离心10 min去除冻存液，再转入细胞培养瓶中，视培养瓶大小补加一定体积含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液，置于5%CO₂，37℃恒温培养箱中培养。待细胞长满单层时，用0.25%的胰蛋白酶液消化3～5 min，经倒置显微镜下观察，待大部分贴壁的扁平细胞变圆并有少许脱落时即停止作用，加入培养液吹打数次至分散成单个细胞时，吸取适量细胞悬液转入另一细胞培养瓶中，继续培养3～5代，待PK-15细胞适应培养环境后即可使用。

1.2.2 病毒的增殖

常规培养PK-15细胞，用RPMI-1640培养液加10%无牛病毒性腹泻病毒抗体的胎牛血清作为PK-15细胞的培养液（pH 7.2～7.4）；在细胞传代时同步接种猪细小病毒猪细小病毒第19代病毒液，按1000 TCID₅₀接毒^[95]，置于5%CO₂，37℃恒温培养箱中培养，培养18～24 h后倒掉细胞培养上清液, 换成不含胎牛血清的 RPMI-1640 培养液，继续培养48～72 h，待贴壁细胞出现80%的CPE时收获病毒，将收获的病毒反复冻融三次，8000 rpm离心30min去除细胞碎片，冻于-80 ℃保存备用。

1.2.3 病毒的纯化

采用差速离心法纯化病毒，将增殖的病毒液于4℃ 8000 rpm离心30 min，取上清液于4℃ 30 000 rpm超速离心3 h，弃上清液，用适量PBS缓冲液悬浮沉淀后，经两次差速离心，用适量PBS液溶解沉淀，将溶解液置于4℃ 8000 rpm离心30 min，取上清，即为纯化的病毒液，分装，-20℃保存备用。

1.2.4 病毒滴度TCID₅₀的测定

将消化吹散的PK-15细胞悬液加入96孔细胞培养板，于5%CO₂，37℃恒温培养箱中培养至贴壁，弃上清，用2%的RPMI-1640培养液将猪细小病毒病毒液作连续倍比稀释10^-1～10^-8，每个稀释度各作8个重复，分别接种96孔细胞培养板，每孔100μL，设一行正常细胞生长对照孔。逐日观察细胞病变并统计结果，按照Reed-Muench法计算TCID₅₀。

1.2.5 病毒血凝效价的测定

在96孔“V”型微量反应板上，每孔加入25 μL PBS液于96孔微量反应板的第1孔到第12孔，在第1孔中加入25 μL 纯化后的病毒液，按1:2、1:4、1:8…等倍比稀释至第11孔，弃去25 μL，第12孔为阴性对照孔。每孔加入0.6%的豚鼠红细胞悬液25 μL，在微量振荡器上混匀，室温静置1～2 h观察结果。

1.2.6 病毒的灭活及其灭活检验

1.2.6.1 灭活时间的确定

取10 μL甲醛溶液加到5 mL病毒液中，使其终浓度为0.2%，混匀，放入37℃温箱中进行灭活，其间每隔2 h摇动病毒悬液一次。分别于16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、72 h取出病毒液进行检测，同时设不加甲醛溶液的病毒液对照组。

1.2.6.2 灭活病毒液的检测

1.2.6.2.1 灭活效果检测

将不同灭活时间段取出的病毒液和不加甲醛的对照组接种到长成单层的PK-15细胞上，连续盲传3代，期间观察细胞病变；盲传3代后反复冻融3次收集病毒液，检测病毒液血凝活性以及通过PCR扩增，设计一对扩增PPV NS1 部分基因的特异性引物，预计扩增片段长度为312bp，采用蛋白酶K法提取病毒DNA。以PPV株DNA为模板，进行PCR扩增反应，通过对PCR扩增条件优化，确定如下扩增方案：Premix Ex Taq DNA聚合酶25 μL，模板DNA 4 μL，上、下游引物各1 μL，补超纯水至50 μL。混匀后于PCR仪上进行扩增，同时设无模板的阴性对照。反应条件为95℃预变性5 min；94℃1 min，55℃50 s，72℃50 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL EB）进行电泳检测PCR结果。来检测灭活效果。

1.2.6.2.2灭活病毒液无菌检验

将灭活病毒液接种于普通肉汤和普通营养琼脂中，37℃培养24～48 h，观察有无细菌生长。

1.2.7 不同佐剂猪细小病毒灭活疫苗的制备

1.2.7.1 猪细小病毒油乳佐剂灭活疫苗的制备：将法国赛比克公司的成品白油佐剂MONTANIDE ISA206VG与经0.2%甲醛灭活20 h的病毒液按1:1的比例，用力震摇使之充分混匀并形成水包油包水的油乳剂型，即为PPV油乳剂疫苗。

1.2.7.2 猪细小病毒铝胶佐剂灭活疫苗的制备

1.2.7.2.1氢氧化铝胶的制备

称取12.5 g无水三氯化铝，用50 mL去离子水配成25%溶液，加热溶化，使用时再稀释成8%，加温至56～60℃；将氢氧化钠配成4%溶液，加温至56～60℃；化学合成时，将三氯化铝维持温度60℃边搅边缓慢加入氢氧化钠溶液，测混合液PH值达到5.6～6.0时，即为终点，继续搅拌10 min，分装，高压灭菌，即为试验用氢氧化铝胶佐剂，透明略带乳光液体。

1.2.7.2.2铝胶佐剂灭活疫苗制备

将灭活病毒液与氢氧化铝胶按4:1的比例配制，充分摇匀、静置沉淀，重复三次，即制成PPV铝胶佐剂疫苗。

1.2.7.3 猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备

    将灭活的病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合，振荡均匀，即制成PPV纳米铝胶佐剂疫苗。

1.2.8猪细小病毒油乳佐剂灭活疫苗的检验

按兽用生物制品质量标准对PPV油乳剂疫苗进行物理性状的检验。

1.2.8.1外观检测：肉眼观察疫苗的外观。

1.2.8.2冷水表面试验：取一清洁吸管，吸取少量疫苗缓慢滴于冷水中，观察油滴是否扩散。

1.2.8.3粘稠度检验:取口径为1.2 mm的l mL吸管于室温下吸满l mL油乳剂苗，以吸管呈垂直状态时自然流出0.4 mL疫苗所需的时间作为判定标准。

1.2.8.4稳定性检验:将油乳剂疫苗加满5 mL小离心管，3000 rpm离心15 min，以不分层为稳定性良好；37℃放置21d，观察是否有破乳、分层现象。

1.2.9不同佐剂猪细小病毒灭活疫苗的无菌检验和安全性检验

1.2.9.1无菌检验

将3种灭活疫苗接种于普通肉汤，普通营养琼脂，血琼脂培养基，37℃培养观察3天，无菌生长为合格。

1.2.9.2安全性检验:

(1)将3种灭活疫苗各皮下接种5只2～4日龄昆明乳鼠，每只0.1 mL，观察7d，看是否出现由疫苗接种引起的任何局部或全身不良反应，同时设不接种对照组。

(2)将3种灭活疫苗各肌肉注射PPV HI阴性健康仔猪2头，每头接种10 mL，观察21d，看是否出现由疫苗接种引起的任何局部或全身不良反应，同时设不接种对照组。

2 结果

2.1病毒滴度TCID₅₀的测定结果

常规培养PK-15细胞，接毒后通过倒置显微镜观察，待细胞出现脱落、拉网等明显的CPE后，统计并按Reed-Muench方法计算毒株的TCID₅₀，结果得出纯化后的猪细小病毒TCID₅₀ 为10^-5.6/0.1 mL。

2.2病毒血凝效价的测定结果

经检测，所纯化的PPV 猪细小病毒血凝效价为2¹⁰。

2.3 病毒灭活效果检验

2.3.1病变观察

用0.2%甲醛灭活病毒，分别将经甲醛灭活16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、72 h的病毒液取出，在PK-15细胞上盲传3代的同时观察细胞病变，均没有细胞病变产生。

2.3.2灭活病毒液的血凝性检验

分别将灭活16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、72 h的病毒液取出，在PK-15细胞上盲传3代后收集病毒液，反复冻融3次，2000 rpm离心10 min，取上清进行血凝效价的测定。灭活16 h病毒液的血凝效价为2⁴，与灭活前比较有所下降，而灭活20 h、24 h、36 h、48 h、72 h的病毒液血凝效价均为2⁰，测定结果见表1。

表1 PPV灭活病毒液血凝性测定结果

灭活时间/h	16	20	24	36	48	72
							HA效价/25μL	24	20	20	20	20	20

2.3.3 灭活病毒液PCR检测

分别将16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、72 h灭活的病毒液取出，盲传3代后收集病毒液，反复冻融3次，提取DNA进行PCR检测（如1）。由图可知，在37℃、0.2%甲醛作用20 h时无特异性电泳条带出现，说明PPV被完全灭活。

2.4灭活病毒液的无菌检测

取灭活后的病毒液分别接种于琼脂平板与营养肉汤中，37℃培养24～28 h后观察无细菌生长，符合生物制品规程要求。

2.5 油乳剂灭活疫苗的鉴定

2.5.1 外观检测  

疫苗下层为淡红色，摇匀后外观呈乳白色均质乳剂，符合质量标准。

2.5.2 冷水表面试验  

制备的疫苗剂型为水包油包水型。将制备的油乳剂灭活苗滴于冷水表面，结果为先不扩散，再缓慢向四周散去。

2.5.3 黏度测定 

用l mL吸管(内径约为1.2 mm)在25℃室温下吸满1 mL油乳剂灭活疫苗，垂直放出0.4 mL需3秒。在2～6秒范围内，说明疫苗黏度合格，适合于注射用。

2.5.4 稳定性测定 

将油乳剂灭活疫苗经3000 rpm离心15 min后无分层和破乳现象，37℃放置21d后也无破乳、分层现象，说明该疫苗具有一定的稳定性。

2.6 不同佐剂灭活疫苗的无菌检验 

3种疫苗接种于普通琼脂、营养肉汤培养基和血琼脂培养基37℃培养24～48 h后，均无细菌生长。

2.7 不同佐剂灭活疫苗的安全性检验  

3种不同佐剂灭活疫苗各接种5只2～4日龄健康乳鼠，每只0.1 mL，观察7d，乳鼠均无任何不良反应，精神状态良好、食欲正常，未观察到明显的全身和局部反应，与阴性对照无显著差异，证明制备的3种灭活疫苗对乳鼠是安全的。

3种不同佐剂的灭活疫苗各免疫2头健康仔猪，逐日观察，均无体温升高现象，未见注射部位有肿块出现，精神状态良好，食欲正常，接种部位无肿胀发热等不良反应。同等条件下的阴性对照组也无不良反应，说明接种后对猪是安全、可靠的。

3 结论与讨论

3.1 猪细小病毒的增殖情况

良好、稳定、特异性高的病毒抗原对试验的后续工作是十分重要的，本试验采用的病毒

抗原是本实验室分离鉴定并保存的猪细小病毒。经过试验证明，该株病毒具有良好的稳定性、特异性和重复性，可应于抗体的检测。而病毒滴度高，细胞培养物的胎牛血清含量低，佐剂与机体相溶性好，是灭活疫苗研究要重点着手解决的问题。本研究在降低细胞培养物中胎牛血清含量方面取得了理想的试验效果，在细胞接毒培养24 h后换维持液，且维持液中不添加胎牛血清，大大降低了病毒培养物中胎牛血清的含量，减少了灭活疫苗的副反应。猪细小病毒病毒滴度和血凝效价在20代时已基本稳定，所以本试验选用第20代病毒液制备疫苗，经测定，纯化后病毒液的TCID₅₀为10^-5.6/0.1mL，血凝效价为2¹⁰，均符合《兽用生物制品质量标准》中对病毒的要求，为猪细小病毒灭活疫苗的制备奠定了基础。

3.2 灭活剂的选择

本试验研究的关键在于降低猪用灭活疫苗的副作用和提高疫苗的安全性。灭活剂中和或水解充分是保证猪用灭活疫苗安全高效的主要前提之一。不同的微生物、活性物质所采用的灭活方法、灭活剂也不尽相同，常用的灭活剂有甲醛、苯酚、β-丙烯内酯、N-乙酰乙烯亚胺（AEI）和二乙烯亚胺（BEI）。

一般化学灭活剂的作用随着灭活剂浓度的增加、灭火温度的升高而增强。所以我们在选用灭活剂时，应在保证生物制品安全和效力的前提下，采用低灭活剂量、低作用温度和短时间处理为最佳。甲醛是最为古老和常用的灭活剂，其灭活的原理是氧化还原作用，该灭活剂虽容易破坏病毒表面的抗原结构，但其副作用较小，只要保证在一定的使用浓度范围内，其对动物机体的影响较小。甲醛与病毒作用后，如果直接进行细胞感染的检测，残留的甲醛会破坏正常的细胞，影响最终的结果判定，所以本试验在进行灭活效果检测时采用非同步解毒的方法以消除甲醛对细胞的毒副作用。本试验病毒液经甲醛灭活后，灭活病毒液接种PK-15细胞培养盲传3代，细胞均未出现CPE，通过灭活效果的检测，最终确定为0.2%的甲醛灭活20 h即能将猪细小病毒完全灭活。

3.3 佐剂的选择

佐剂在增强兽用疫苗的效力方面起着极为重要作用。佐剂选择的好坏与疫苗的副反应和安全性有直接的关系。国内张超范等都进行了PPV灭活苗的佐剂对比试验，结果表明国外进口油佐剂要优于国内矿物质白油佐剂和铝胶佐剂。舒银辉等研究了不同佐剂PPV灭活疫苗的效果比较试验，得出法国佐剂对仔猪副反应小，产生抗体效价高的结论。结合相关文献报道，我们在试验中制备灭活苗时，选用法国ISA206油佐剂，进一步验证了其效果，其纯度高，粘度低，非常适合动物疫苗的免疫吸收。

目前铝佐剂仍是应用最多、最重要的疫苗佐剂，并且可联合其他佐剂以增强免疫应答。韩孝成等研制了猪细小病毒氢氧化铝疫苗，该疫苗具有较好的安全性，其具有免疫原性好、耐热、免疫程序简单、免疫剂量小等特点。本试验采用三氯化铝与氢氧化钠合成法制备的氢氧化铝铝胶，透明无沉淀，注射部位无硬结反应。

如果将铝佐剂纳米化，其比表面积将会大大增加，吸附力增强，在增强佐剂活性的同时还可以提高抗原的靶向投递，大大降低副作用。目前对于纳米铝佐剂已有相关方面的研究，如第三军医大学设计了油相包围水相(W/O)的微乳液体系和原位合成的方法制备纳米铝佐剂，目前已建立稳定的技术平台，制备的佐剂平均粒径稳定在70 nm 左右，疫苗的吸附度约为常规铝佐剂的10倍，能提高疫苗效能，节约成本，并快速激活免疫应答。本试验所用纳米铝胶采用水热法在最优条件下制备，其平均粒径在12.28 nm左右，纯化以后直接用作佐剂。

3.4 疫苗的理化、无菌及安全性检验：

本试验制备的PPV油乳剂灭活苗从自然垂直的l mL吸管中流出0.4 mL时为3秒，表明该疫苗为稀薄乳剂；而且3000 rpm离心15 min不分层，说明制备的疫苗的稳定性较好，对制备的3种疫苗进行无菌检验结果表明，制备的3种疫苗均无菌生长。

理想的灭活疫苗不但能使免疫动物获得较好的免疫保护，更应具备良好的安全性。因此，对疫苗进行安全评价是研制疫苗过程中的必备环节。本研究在乳鼠和猪体上对疫苗进行了安全性评价，结果发现，免疫之后无一只乳鼠死亡，无一头仔猪发生致敏反应，同样也未观察到明显的全身和局部反应，充分证明该3种灭活疫苗是安全、可靠的。

不同佐剂猪细小病毒灭活疫苗小鼠免疫效果研究

1材料与方法

市售猪细小病毒油乳剂灭活疫苗购自中牧实业股份有限公司（批号1009006-2）；市售猪细小病毒蜂胶灭活疫苗购自山东绿都安特动物药业有限公司（批号100803）。试验动物：20g左右清洁级昆明小鼠，60只，购自郑州大学医学院实验动物中心。主要仪器：超净工作台，购自苏净集团安泰公司；小型台式离心机，购自德国Sigma公司；MiLLipak40型超纯水制备系统，购自德国MiLLipore公司；AB204-N电子分析天平，购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Thermo Multiskan MK3型酶标仪，购自上海雷勃分析仪器有限公司。主要试剂：猪细小病毒ELISA诊断试剂盒购自BioXL公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗小鼠IgG抗体购于北京鼎国生物技术发展公司；小鼠细胞因子IL-4 和IFN-γ ELISA检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 动物分组免疫

60只小鼠随机分为6组（见表2），每组10只，雌雄各半。其中Ⅰ为PPV油乳剂疫苗组，每只0.2 mL；Ⅱ为PPV铝胶佐剂疫苗组，每只0.2 mL；Ⅲ为PPV纳米铝胶佐剂疫苗组，每只0.2 mL；Ⅳ为市售油佐剂疫苗组，每只0.2 mL；Ⅴ为市售蜂胶佐剂疫苗组，每只0.2 mL；Ⅵ为生理盐水对照组，每只0.2 mL，免疫途径均采用皮下多点注射免疫，两周后用同样的剂量进行第二次免疫，免疫方案见表3-1：

表 2 试验小鼠分组及免疫情况

组 别	免疫种类	剂量
			Ⅰ	PPV油乳剂疫苗	0.2 mL/只
Ⅱ	PPV铝胶佐剂疫苗	0.2 mL/只
			Ⅲ	PPV纳米铝胶佐剂疫苗	0.2 mL/只
Ⅳ	市售PPV油乳剂疫苗	0.2 mL/只
			Ⅴ	市售PPV蜂胶疫苗	0.2 mL/只
Ⅵ	生理盐水	0.2 mL/只

1.2.2 抗体水平的测定

分别于免疫后0、1、2、3、4、5、6周，每组随机抽取3只小鼠断尾采血，分离血清，56 ℃水浴30 min灭活补体。按照猪细小病毒ELISA诊断试剂盒（BioXL公司）使用说明书进行操作（试剂盒中酶标羊抗猪IgG换为辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG），应用间接ELISA方法检测小鼠血清中抗PPV的抗体，通过测定标记酶的OD₆₃₀值检测抗体水平。

1.2.3细胞免疫水平的测定

1.2.3.1 T淋巴细胞亚群测定

分别于免疫后0、1、2、3、4周，每组随机抽取3只小鼠经眼球采血1mL，柠檬酸钠抗凝，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用PBS溶液将细胞数调至5.0×10⁶/mL，流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群。

1.2.3.2 细胞因子IL-4 和IFN-γ的测定

分别于免疫后0、1、2、3、4周，随机抽取3只小鼠断尾采血，分离血清，按照IL-4和IFN-γ ELISA诊断试剂盒使用说明书进行操作，检测小鼠血清中IL-4和IFN-γ的含量。以测定标准品的OD值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。查出浓度再乘以样品稀释倍数即得出IL-4和IFN-γ的具体含量。

1.2.4 数据处理

用SPSS11.5及Excel统计软件将所得数据进行统计学处理，计算其平均值，数据以Means±SD表示，并用SPSS软件进行Duncan’s多重分析。

2 结果

2.1 小鼠免疫后抗体水平测定

分别对每周收集的血清进行ELISA抗体水平检测，对各组所测数据进行统计分析，结果见表3，得到抗体消长曲线如图2。经统计分析表明，免疫前各组之间抗体水平无显著差异（P＞0.05），免疫后各疫苗组抗体水平都明显升高，首次免疫后第3周，PPV油乳剂疫苗抗体效价达到最高水平，且与生理盐水对照和其他疫苗组差异显著（P<0.05），随后呈下降趋势；二免后第3周，市售油乳剂疫苗抗体效价达到最高水平，且与其他疫苗组差异显著（P<0.05），但仍低于PPV油乳剂疫苗产生抗体的最高水平；说明PPV油乳剂疫苗组抗体效价上升较快，且抗体水平较高。

表3 血清抗体水平的检测结果（Means±SD）

 

注：同一列数据肩标含不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 小鼠免疫后细胞免疫水平的测定

2.2.1 免疫小鼠外周血中T淋巴细胞亚群的动态变化

2.2.1.1 对外周血CD3⁺T淋巴细胞的影响  

各组免疫之后所测得的CD3⁺T淋巴细胞百分比值均呈现了动态的变化（如图3）。从图3可以看出在首次免疫后第1、2、3周，不同疫苗组的CD3⁺细胞在外周血中所占比例均有所升高，但与生理盐水对照组差异不显著（P＞0.05），在免疫后第4周，PPV纳米铝胶佐剂疫苗组CD3⁺细胞百分比值达到峰值，且与生理盐水对照组差异极显著（P<0.05），与PPV油乳剂疫苗组和市售油乳剂疫苗组差异显著（P<0.05），与PPV铝胶佐剂疫苗组和市售蜂胶疫苗组差异不显著（P＞0.05）。

2.2.1.2 对外周血CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞的影响

各组免疫之后所测得的CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞百分比值均呈现了动态的变化（如图4）。从图4中可以看出，首次免疫后第1、2、3周，不同疫苗组的CD3⁺CD4⁺细胞在外周血中所占比例均有所升高，但与生理盐水对照组差异不显著（P＞0.05），在免疫后第4周，PPV纳米铝胶佐剂组CD3⁺CD4⁺细胞百分比值达到峰值，而且与生理盐水对照组差异显著（P<0.05），与其他疫苗组差异不显著（P＞0.05），但有高于其余疫苗组的趋势。 

2.2.1.3 对外周血CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞的影响  

各组免疫之后所测得的CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比值均呈现了动态的变化（如图5），从图5可以看出，首次免疫后第1、2周，不同疫苗组的CD3⁺CD8⁺细胞百分比值升高不显著，二免后第1周，PPV铝胶佐剂疫苗组CD3⁺CD8⁺细胞百分比值达到峰值，且与生理盐水对照组差异显著（P<0.05），与其余疫苗组差异不显著（P＞0.05），但有高于其余疫苗组的趋势。 

2.2.1.4 外周血CD4⁺/CD8⁺的动态变化

将各组小鼠进行免疫后，可以看到 CD4⁺/CD8⁺比值的变化（如图6）。从图6可以看出，在免疫后第3周，PPV纳米铝胶佐剂疫苗组CD4⁺/CD8⁺比值显著高于对照组（P<0.05）；免疫后第4周，PPV纳米铝胶佐剂疫苗组与蜂胶组差异不显著，与其余疫苗组差异显著（P<0.05）。

2.2.2 免疫小鼠血清中细胞因子水平的测定

为检测不同佐剂PPV灭活疫苗的免疫是否影响细胞因子的分泌水平，测量免疫小鼠血清中的IL-4 和 IFN-γ的质量浓度，根据试剂盒说明书，按照特定软件绘制出标准曲线并求得细胞因子的具体含量。

2.2.2.1细胞因子IL-4水平测定

由图7可知，该标准曲线相关系数r值为0.9994，用该曲线计算小鼠血清中IL-4的具体含量并分析不同疫苗组IL-4的水平变化（如图8）。由图8可知，在首次免疫后第2周，各疫苗组IL-4的质量浓度均有所升高，与生理盐水对照组差异显著（P<0.05）；其中以纳米铝胶佐剂疫苗组升高最快，与其余疫苗组差异显著（P<0.05）；免疫后第4周，PPV油乳剂疫苗组IL-4的质量浓度达到峰值，且与其余疫苗组差异显著（P<0.05）。

2.2.2.2 小鼠细胞因子IFN-γ结果

由图9可知，该标准曲线相关系数r值为0.9997，用该曲线计算小鼠IFN-γ的具体含量并分析不同疫苗组IFN-γ的水平变化（如图10）。由图10可知，在首次免疫后第1周，各疫苗组IFN-γ的质量浓度均有所升高，与生理盐水对照组差异显著（P<0.05）；其中以纳米铝胶佐剂组升高最快，并与其余疫苗组差异显著（P<0.05）；二免后第1周，除铝胶佐剂疫苗组和市售蜂胶佐剂疫苗组外，其余疫苗组IFN-γ的质量浓度均达到峰值，其中以纳米铝胶佐剂疫苗组最高，与其余疫苗组差异显著（P<0.05）。

3 结论与讨论

3.1 PPV灭活疫苗免疫小鼠后抗体水平的检测

本试验采用间接ELISA方法，测定了不同佐剂PPV灭活疫苗免疫小鼠后小鼠血清抗体的变化，通过比较不同疫苗组产生抗体水平的差异，结果显示PPV油乳剂疫苗组抗体效价上升较快，随后呈缓慢下降趋势，但抗体水平持续时间较短。

各疫苗组均在二免后第1～2周达到抗体高峰，从抗体效价的高峰值来看，结果为油乳剂组>市售油乳剂组>纳米铝胶佐剂疫苗组>铝胶佐剂疫苗组>市售蜂胶疫苗组。说明PPV油乳剂疫苗组能诱导机体产生很好的体液免疫应答。

3.2 PPV灭活疫苗诱导的细胞免疫应答

T淋巴细胞两个重要的表面标志是CD4⁺和CD8⁺，其中CD4⁺ T淋巴细胞的主要功能是分

泌细胞因子，具有诱导和增强免疫应答的作用，CD8⁺T淋巴细胞主要介导细胞毒杀伤作用。正常机体中两者的互相诱导和制约调节着机体的免疫平衡，CD4⁺和CD8⁺细胞数量以及CD4⁺/ CD8⁺比值反映机体免疫状态的变化。本试验利用流式细胞技术测定小鼠免疫后T淋巴细胞亚群的动态变化，评价各灭活疫苗的细胞免疫水平，从本研究的CD4⁺淋巴细胞百分比变化情况看,在免疫后各疫苗组的CD4⁺淋巴细胞百分比均有一定程度的升高，但除了纳米铝胶佐剂疫苗组与对照组差异显著之外，其余疫苗组与对照组差异均不显著，说明接种纳米铝胶佐剂疫苗后产生的是以CD4⁺T淋巴细胞介导的细胞免疫。从本研究的CD8⁺淋巴细胞数变化情况看，除铝胶佐剂组与对照组差异显著之外，其余疫苗组与对照组差异不显著，说明接种后可能主要是以CD8⁺T淋巴细胞介导的细胞免疫。CD4⁺/CD8⁺的变化,作为预测感染与排斥的重要指标,是评估机体免疫状态的依据。本试验纳米铝胶佐剂疫苗组在免疫第4周时CD4⁺/CD8⁺的比值显著高于其他疫苗组，其比值由2.11提高到2.97，说明纳米铝胶佐剂疫苗加强了小鼠的细胞免疫状态。

IFN-γ和IL-4是重要免疫调节因子，具有多种生物学活性^[102]。IFN-γ是由活化的T细胞和NK细胞产生的一种Thl型细胞因子，主要参与细胞免疫应答及炎症反应，具有抗病毒、抗寄生虫及抑制细胞增殖等多种生物学活性，其中最主要的活性是免疫调节作用，可诱导机体免疫反应向Thl型转化。IL-4是由活化的Th2型细胞产生的一种细胞因子，可增强B细胞和T细胞的相互作用，促进体液免疫应答，特别是IgE分泌，还可诱导单核一巨噬细胞表达MHCII类分子，调节造血细胞的增殖及分化^[104]，诱导CD₄ ^-Th幼稚前体细胞定向分化为Th2型细胞。 

本试验研究证明，制备的3种疫苗均能诱导IL-4的分泌表达，其中以PPV油乳剂疫苗的表达量最大，并与其余疫苗组差异显著，说明该疫苗组能显著诱导Th2型细胞产生免疫应答反应，诱导其分泌IL-4，从而增强B细胞的活性，提高抗体产生的滴度，这与小鼠血清中抗体水平的检测结果相一致，说明PPV油乳剂灭活疫苗能产生较强的体液免疫应答；制备的3种疫苗均能诱导IFN-γ的分泌表达，其中纳米铝胶佐剂疫苗组的表达量最大，说明该组疫苗能显著增强Th1型细胞产生免疫应答反应，诱导其分泌IFN-γ，从而增强细胞免疫水平，说明纳米铝胶佐剂疫苗能产生较强的细胞免疫应答。

不同佐剂猪细小病毒灭活疫苗猪体免疫效果研究

1材料与方法

疫苗：猪细小病毒油乳佐剂灭活疫苗、猪细小病毒铝胶佐剂灭活疫苗、猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗；市售猪细小病毒油乳剂灭活疫苗购自中牧实业股份有限公司(批号1009006-2)；市售猪细小病毒蜂胶灭活疫苗购自山东绿都安特动物药业有限公司（批号100803）。试验动物和地点：35日龄断奶仔猪，30头，经ELISA和HI检验，PPV抗体阴性，由郑州市养猪场提供。主要仪器：超净工作台，购自苏净集团安泰公司；Thermo Multiskan MK3型酶标仪，购自上海雷勃分析仪器有限公司；微量96孔血凝板，购自姜堰市新康医疗器械有限公司。主要试剂：高岭土购自天津市科密欧化学试剂开发中心；猪细小病毒ELISA检测试剂盒购自BioXL公司。

1.2 方法

1.2.1 试验分组及免疫程序

30头35日龄断奶仔猪随机分为6组（见表4），每组5头。其中Ⅰ组为PPV油乳剂灭活疫苗组，每头份2 mL；Ⅱ组为PPV铝胶佐剂灭活疫苗组，每头份2 mL；Ⅲ组为PPV纳米铝胶佐剂灭活疫苗组，每头份2 mL；Ⅳ组为市场上销售油佐剂疫苗组，每头份2 mL；Ⅴ组为市场上销售蜂胶佐剂疫苗组，每头份2 mL；Ⅵ组为生理盐水对照组，每头2 mL；免疫途径均采用颈部肌肉注射免疫，两周后用同样的剂量进行第二次免疫，免疫方案见表1。

表 4 试验分组及免疫方案

组 别	免疫种类	剂量
			Ⅰ	PPV油乳剂疫苗	2 mL/头
Ⅱ	PPV铝胶佐剂疫苗	2 mL/头
			Ⅲ	PPV纳米铝胶佐剂疫苗	2 mL/头
Ⅳ	市售PPV油乳剂疫苗	2 mL/头
			Ⅴ	市售PPV蜂胶疫苗	2 mL/头
Ⅵ	生理盐水	2 mL/头

1.2.2 抗体水平的测定

1.2.2.1血清的制备

分别于免疫后0、1、2、3、4周，随机抽取3头猪，前腔静脉采血，分离血清备用。

1.2.2.2 HI方法测定血清中PPV抗体水平

将分离的血清56℃水浴30min（灭活补体），分别经豚鼠红血球泥和25%酸性高岭土处理作为待检样品，用HI试验检测疫苗免疫后抗体水平，绘制抗体动态规律曲线。具体操作步骤按照蒋玉雯^[105]文献所报道的方法。

1.2.2.3 间接ELISA检测血清中PPV抗体水平

按照猪细小病毒ELISA诊断试剂盒（BioXL公司生产）使用说明书进行操作，应用间接ELISA原理检测猪血清中抗细小病毒的抗体。通过测定标记酶的OD₆₃₀值检测抗体效价，结果大于0.4判定为阳性；0.2～0.4之间判为可疑；小于0.2判为阴性。

1.2.3 T淋巴细胞亚群测定

分别于免疫后0、1、2、3、4周，每组随机抽取2头猪经前腔静脉采血2mL，柠檬酸钠抗凝，分离淋巴细胞，用PBS溶液将细胞数调至5.0×10⁶/mL，用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群。

1.2.4 数据处理

用SPSS11.5及Excel统计软件将所得数据进行统计学处理，计算其平均值。数据以Means±SD表示，并用SPSS软件进行Duncan’s多重分析。

2 结果

2.1 灭活疫苗诱导的体液免疫效果观察

2.1.1免疫猪血清HI检测结果

HI试验结果见表5，得到抗体消长曲线如图11。由图可知，各组疫苗免疫后均能刺激机体产生HI抗体，且抗体水平随着免疫时间的延长逐渐升高，首次免疫后第1周，纳米铝胶组抗体水平显著高于常规铝胶组(P<0.05)；免疫后第3周纳米铝胶组抗体水平达到峰值，较常规铝胶组、油乳剂组分别提前一周和两周。抗体峰值水平油乳剂组最大，达11.67log2，纳米铝胶组为11.33log2，常规铝组为11.00log2。3种疫苗的抗体峰值均高于市场上销售的两种疫苗。比较3种疫苗的抗体水平，发现免疫后第6周纳米组抗体滴度为9.67log2，而油乳剂组为11.33log2，常规铝胶佐剂组为10.00log2，表明纳米组的抗体滴度消降较快，油乳剂组较慢。

表5 免疫后血清中HI抗体动态变化（log2）（Means±SD）

 

注：同一列数据肩标含不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.1.2 ELISA方法检测免疫后猪血清中抗体水平

ELISA法检测免疫后各时间段采集的血清抗体水平，结果见表6，得到抗体消长曲线如图12。由图可知，各组疫苗均能刺激机体产生抗PPV抗体，但抗体水平及峰值出现时间略有不同，首免后第2周，纳米铝胶组抗体水平显著高于常规铝胶组(P<0.05)；免疫后第3周纳米铝胶组抗体水平达到峰值，比油乳剂组提前1周。免疫后第4周，油乳剂组抗体水平达到峰值，且与其他疫苗组差异显著（P<0.05）；抗体峰值水平油乳剂组最大，OD₆₃₀值达0.599，而纳米铝胶组为0.440，常规铝组为0.254。

表6 免疫后血清中ELISA抗体动态变化（Means±SD）

注：同一列数据肩标含不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 外周血中T淋巴细胞亚群的动态变化

免疫后外周血中T淋巴细胞亚群的动态变化如图13、14、15所示，各疫苗组外周血T淋巴细胞亚群数量都明显升高，且与生理盐水对照组差异显著；各个疫苗组之间差异不显著。

3 结论与讨论

3.1 PPV灭活疫苗诱导的体液免疫应答

3.1.1 HI试验检测免疫后猪体内抗体水平结果分析

血凝及血凝抑制试验，在猪细小病毒的检测中有着重要地位,该试验方法具有经济、操作简便等优点。虽然血凝抑制试验方法简单，但是对操作及试剂的配置有较高的要求，试剂的准确度，判定时间的把握，适当的豚鼠红细胞配置的浓度等都是试验成功与否的重要因素。

在试验过程中，参照蒋玉雯（1986）的方法进行，为保证试验的特异性和准确性，对待检血清用酸性高岭土和红血球泥进行处理，去除可能存在的非特异性血凝抑制物和红血球凝集素，研究表明，3种佐剂疫苗组均能产生较高的抗体滴度。其中纳米铝佐剂疫苗抗体水平峰值出现较早，于免疫后第3周达到峰值，比常规铝胶佐剂组提前1周，比油乳剂组疫苗提前2周，且纳米铝佐剂疫苗抗体水平在免疫后第1周显著高于常规铝胶组(P<0.05)，但纳米组的抗体滴度消降较快。3种佐剂疫苗组中油乳剂组的抗体峰值水平最大。

3.1.2间接ELISA检测猪体内抗体水平结果分析

分别对每周收集的血清进行ELISA抗体检测，免疫后各疫苗组均能刺激机体产生抗PPV抗体，首次免疫后第2周，纳米铝胶组抗体水平显著高于常规铝胶组(P<0.05)；免疫后第3周纳米铝胶组抗体水平达到峰值，比油乳剂组提前1周。免疫后第4周，油乳剂组抗体水平达到峰值，且其抗体峰值水平最高，与其他疫苗组差异显著（P<0.05）。

比较两种抗体检测方法可以看出，ELISA 检测抗体消长规律和血凝抑制试验检测抗体消长规律大致相同，经两种方法检测，结果发现，3种佐剂疫苗中纳米佐剂组产生抗体时间和达到峰值的时间均较早，但抗体消降也较快；而油乳剂疫苗组虽然产生抗体时间相对较晚，但持续持续时间较长。

3.2 PPV灭活疫苗诱导的细胞免疫应答

本试验用流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群的动态变化，以研究接种不同佐剂PPV灭活疫苗后机体的细胞免疫应答。研究结果表明，各疫苗组均能刺激机体产生细胞免疫应答，但是各疫苗组之间差异不显著（P＞0.05）。纳米铝胶佐剂疫苗组比常规铝胶佐剂组T淋巴细胞亚群百分比略高，经统计学检验无显著差异。表明制备的3种灭活疫苗对猪的细胞免疫应答起到了一定的增强作用。

本次试验制备的3种猪细小病毒灭活疫苗免疫猪后通过血凝抑制试验和间接 ELISA 检测方法说明了该疫苗具有刺激动物机体产生特异性抗体的能力，利用流式细胞技术测定T淋巴细胞亚群的动态变化，结果表明3种PPV灭活疫苗均能刺激机体产生细胞免疫应答，可以证明该疫苗具备良好的反应原性和免疫原性，为猪细小病毒灭活疫苗的应用奠定基础。

表7  纳米铝胶佐剂的pH值和不同波长的吸光度

本发明中，纳米铝胶佐剂用的XRD表征如图16所示。用EDTA 滴定法测定铝的含量为2.2%，并测定pH值和不同波长的吸光度，如表7所示。

Claims (3)

1.猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗，其特征在于：该疫苗由灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以质量比为1:2的比例混合制成。

2.根据权利要求1所述的猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：

（1）将猪细小病毒增值、纯化、灭活；

（2）制备纳米铝佐剂，将氯化铝溶于蒸馏水中，氯化铝与蒸馏水的质量比为1:20-30，制成氯化铝溶液，将质量浓度分数为25-28%的氨水滴入氯化铝溶液中，调节pH为9.0，搅拌10-15分钟，得到白色沉淀物，为氢氧化铝胶，然后采用超速离心法收集氢氧化铝胶沉淀，再用水洗，加入蒸馏水制成悬浮液，蒸馏水的加入量为氯化铝质量的10-15倍，在75-85℃下用磁力搅拌器不断搅拌，用1 mol /L HCl调pH至3.0-4.0，反应持续8-10 h后得到透明的氢氧化铝胶，最后，氢氧化铝胶用双蒸水透析纯化24-28小时，将pH调至6.0，制成纳米铝胶佐剂；

（3）将灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以质量比为1:2的比例混合，振荡均匀，制成猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗。

3.根据权利要求2所述的猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的氯化铝为六水结晶氯化铝或无水氯化铝。

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