CN106591244B

CN106591244B - 一种猪流行性腹泻病毒、灭活疫苗及其制备方法

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Publication number: CN106591244B
Application number: CN201611248419.4A
Authority: CN
Inventors: 陈瑾; 郑其升; 于晓明; 侯立婷; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2019-09-03
Anticipated expiration: 2036-12-29
Also published as: CN106591244A

Abstract

本发明提供一种猪流行性腹泻病毒、灭活疫苗及其制备方法，属于生物工程领域。猪流行性腹泻病毒NJ株，其保藏登记号为：CGMCC NO.13283。本发明提供该毒株在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用、制备该毒株病毒液的方法及获得的病毒液、灭活疫苗。上述灭活疫苗的制备方法，包括取灭活后的病毒液与吐温‑80按照体积比为96:4混合均匀，得到水相；将注射用白油和司本‑80按照体积比96:4混合均匀，得到油相；将水相和油相按照体积比1:2~3混合，乳化。本发明NJ株是新近流行毒，免疫原性好且适应细胞培养，可以进行大规模发酵培养，采用该毒株灭活疫苗免疫怀孕母猪，能够在新近流行毒攻毒中有效保护新生哺乳仔猪。

Description

一种猪流行性腹泻病毒、灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒、灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由PED病毒(PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。自2000年以来，该病在全国范围内流行，特别是从2010年起，该病在免疫猪群再度流行，以哺乳仔猪高发病为特征，给我国的养猪业带来极大的危害。猪流行性腹泻在仔猪初生至两周龄时均为高死亡率。目前，疫苗免疫是该病的主要防治手段，但是现有的商品化疫苗只能用于免疫断奶仔猪(30日龄左右)，并不能够对新生哺乳仔猪(初生至两周龄仔猪)提供保护；另外现有疫苗株与国内新近流行毒株在基因序列方面有一定的差异性，对新近流行毒攻毒的保护效果不理想；猪流行性腹泻病毒细胞适应难度大，繁殖条件复杂，病毒在细胞中培养繁殖滴度低，因此严重阻碍了PED疾病的防制。

发明内容

本发明的目的在于提供猪流行性腹泻病毒NJ株，该毒株是新近流行毒，免疫原性好且适应细胞培养，可以进行大规模发酵培养，采用该毒株灭活疫苗免疫怀孕母猪，能够在新近流行毒攻毒中有效保护新生哺乳仔猪。

本发明的另一个目的是提供所述的猪流行性腹泻病毒NJ株在制备猪流行性腹泻病毒灭活疫苗中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种猪流行性腹泻的灭活疫苗，采用该疫苗免疫的母猪，其血清、初乳中中和抗体水平较高，初乳中IgA水平也较高，仔猪通过初乳获得抗体，对新近流行毒株攻毒的保护率达到100％。

本发明的第四个目的是提供所述猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备方法，该方法简单，成本低，且安全有效，可以免疫怀孕母猪。

本发明提供猪流行性腹泻病毒NJ株，其保藏登记号为：CGMCC NO.13283。

本发明提供猪流行性腹泻病毒NJ株在制备猪流行性腹泻病毒疫苗中的应用。

本发明提供一种制备猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液的方法，将猪流行性腹泻病毒NJ株接种Vero细胞，培养后获得病毒液。

本发明提供上述方法制备的猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液。

本发明提供一种猪流行性腹泻灭活疫苗，含有灭活的所述病毒液。

本发明还提供所述猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：将猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液进行灭活；取灭活后的病毒液与吐温-80按照体积比为96:4混合均匀，得到水相溶液；将注射用白油和司本-80按照体积比96:4混合均匀，得到油相溶液；将水相和油相按照体积比1:2～3混合，乳化，得到所述疫苗。

在本发明中，所述猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液的病毒含量不低于10^8.0TCID₅₀/mL。

本发明还提供猪流行性腹泻病毒NJ株在制备预防和治疗猪流行性腹泻药物中的应用。

有益效果：

(1)猪流行性腹泻病毒NJ株，是新近流行毒株，免疫原性好，攻毒保护效果好，且适应细胞规模化培养；采用该毒株灭活疫苗免疫怀孕母猪，能够在新近流行毒攻毒中有效保护新生哺乳仔猪。

(2)猪流行性腹泻病毒NJ株灭活疫苗免疫母猪后，抗体效价高：母猪产前免疫两次后，初乳中中和抗体可达1:512以上，初乳中的IgA水平(韩国安捷试剂盒检测)可达OD值2～3，达到“魔力乳”水平，通过比较发现血清、初乳中中和抗体水平、初乳中IgA水平显著高于现有商品化灭活疫苗。采用本发明流行性腹泻病毒NJ株灭活疫苗免疫后的母猪，由于初乳中含有高水平的中和抗体和IgA，新生哺乳仔猪通过初乳获得被动保护，对新近流行毒株攻毒的保护率达到100％，较现有商品苗明显提高仔猪存活率和日增重。仔猪经新近流行毒株攻毒，保护力较目前市场上的商品苗提高60～80％，同时安全性高，效力稳定，母猪免疫安全，无副作用。

(3)本发明制备猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的方法，成本低，安全，简单，效力好。

附图说明

图1：病料的PCR鉴定电泳图，1：PRRSV鉴定引物扩增的产物；2：PRV鉴定引物的扩增产物；3：PPV鉴定引物扩增的产物；4：PCV2鉴定引物扩增的产物；5：CSFV鉴定引物扩增的产物；6:TGEV鉴定引物扩增的产物；7：PEDV鉴定引物扩增的产物。

图2：接种病毒液的细胞病变图,(A)是盲传6代后的细胞病变，(B)是细胞对照。

图3：不同代次盲传病毒的M基因RT-PCR鉴定图，1：F3代病毒；2：F6代病毒；3：F12代病毒；M；DL2000。

图4：是不同代次盲传病毒的S基因全长扩增产物电泳图，1：F3代病毒；2：F6代病毒；3：F12代病毒；M；DL10000。

图5是显微镜下长满微载体的Vero细胞。

图6是显微镜下收毒时微载体和Vero细胞的。

图7显示了各组母猪生产后血清中平均中和抗体水平。

图8显示了各组母猪生产后初乳中平均中和抗体水平。

图9显示了各组母猪生产后初乳中平均IgA水平。

具体实施方式

实例1猪流行性腹泻病毒NJ株的分离与鉴定

1.NJ株的分离

(1)病料

病料为无菌采集的疑似猪流行性腹泻病死亡小猪的小肠及其内容物。用RT-PCR扩增M基因，得到长度为476bp的扩增产物,与设计片段大小完全相符，测序如SEQ ID NO:1所示。同时采用PCR检测方法检测该病料是否感染了其他猪常见病毒，结果如图1，并未检测到其他外源病毒。

(2)病料处理

将上述病料在无菌容器中剪碎，研磨，用含青链霉素的灭菌PBS缓冲液做1:5稀释，反复冻融三次，3000rpm/min离心20min，取上清采用0.22μm滤膜过滤，得到了病料提取液，保存于-20℃备用。

(3)病毒分离、细胞驯化及鉴定

将长满单层的Vero细胞，提前用pH 7.4的PBS缓冲液清洗细胞表面，按照5％的比例接种步骤(2)中获得的病料提取液，37℃吸附1小时，换含有5ug/mL胰酶的维持液(含有2％血清的DMEM培养液)，在37℃培养箱中继续培养，设细胞对照(操作相同，仅不加入病毒液)。如此盲传，观察是否有细胞病变产生。

盲传至第3代，有少量细胞在接毒48h后出现圆缩、聚堆现象，随着培养时间延长，开始出现聚集变大。盲传至第6代，细胞在接毒后60h开始有明显的聚堆或细胞脱落(图2)。盲传至12代，基本出现稳定的、明显的细胞病变。在连续盲传过程中，病料提取液接种细胞培养96h后收获的病毒液，标记为F1代，继续传1代，收获细胞毒抗原液，标记为F2代，以此类推，取F3、F6、F12代病毒进行基因序列测定，3代次病毒M基因的RT-PCR扩增结果表明：扩增产物长度均为476bp，具体序列见SEQ ID NO:1，与设计片段大小完全相符(见图3)。对M基因进行同源性分析，发现本发明分离到的病毒与CH/HNZZ47/2016株的同源性达到99％，符合猪流行性腹泻病毒新近流行毒株特点，与猪流行性腹泻病毒CV777株存在一定的差异。上述结果表明，分离到的病毒为猪流行性腹泻病毒，且在盲传中稳定存在。

另外，分别扩增F3、F6、F12代病毒液的S基因全长，扩增片段的电泳图如图4；扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，与国内2012年后分离到的猪流行性腹泻病毒毒株(CH-SDWF-2012株等)的S基因同源性均99％左右，再次证明本发明分离病毒为猪流行性腹泻病毒新近流行毒株。

(4)、细胞毒纯化

将Vero细胞铺至96孔板中，将F12代病毒10倍倍比稀释至稀释度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，将各稀释度病毒接96孔细胞板，每孔接0.2ml，接毒后置37℃培养5天，每天观察细胞病变情况。待细胞孔出现单个蚀斑时，把此孔细胞毒单独回收，反复冻融3次，-20℃保存备用。选择稀释度最高的蚀斑毒按此方法重复克隆两次。测定第三次挑选的蚀斑毒病毒含量，共挑选蚀斑毒三株，其中第一株病毒含量为10^5.0TCID₅₀/mL，高于另外两株10^4.6TCID₅₀/mL、10^4.8TCID₅₀/mL。选择病毒含量最高的蚀斑毒采用Vero细胞连续传代，从第1代传至第50代，观察病毒的毒价曲线，发现第50代及其后病毒毒价基本稳定，将第50代病毒液命名为猪流行性腹泻病毒PEDV-NJ株，送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏。

保藏的具体信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

分类命名：猪流行性腹泻病毒。

参椐的生物材料(株)：PEDV-NJ

保藏号：CGMCC NO.13283。

保藏日期：2016年11月18日。

为了方便描述，将猪流行性腹泻病毒PEDV-NJ株缩写为猪流行性腹泻病毒NJ株。

(5)无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，将猪流行性腹泻病毒NJ株接种后检测，发现各代次病毒无细菌生长，无霉菌、支原体感染，且无外源病毒污染。

(6)病毒含量测定

将猪流行性腹泻病毒NJ株采用Vero细胞培养至细胞病变达到60-80％时，反复冻融，离心取上清液作为F1代病毒液。F1代病毒液10倍系列稀释后，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7四个稀释度，分别接种Vero细胞，置37℃孵育5天，逐孔观察细胞病变，以接种细胞出现明显的细胞聚集和突起，判为感染，按Reed-Muench方法计算病毒含量。结果表明：F1代病毒液的病毒含量为10^6.4TCID₅₀/mL。

(7)特异性试验

将本实施例标题(6)中F1代病毒液用灭菌PBS缓冲液按照体积比为1∶100稀释，取100uL稀释后的病毒液与100uL猪流行性腹泻高免血清混合，置37℃中和60分钟后，接种Vero细胞，0.2mL/孔，同时设病毒对照组和阴性对照组各5孔，分别接种1∶100稀释的病毒液及灭菌PBS缓冲液，接种后置37℃培养5天，每天观察细胞病变情况。结果：中和组、阴性对照组细胞均无病变，阳性对照组出现典型病变，再次证明本发明分离到的是猪流行性腹泻病毒。

实施例2猪流行性腹泻病毒NJ株的毒力试验

购买5、25、45日龄仔猪各7头，同日龄仔猪随机选择5头作为试验组，另外两头作为对照组。各日龄仔猪人工饲喂牛奶，攻毒前8小时，每头口服100IU青链霉素。攻毒方法：试验组仔猪每头口服0.25mL猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液(毒价10⁵TCID₅₀/mL)进行攻毒，攻毒后隔离饲养，观察攻毒后10天内临症床状，将腹泻致死的仔猪剖检，观察病变，收集小肠病料研磨后采用RT-PCR扩增M基因，以检测是否感染猪流行性腹泻病毒NJ株。

结果：攻毒后仔猪观察期内全部发病，发病仔猪排黄色稀粪；攻毒观察期内全部死亡，剖检发现肠道水肿，常闭变薄或充血，场内充满气体，胃内充满乳凝块，胃底粘膜有充血；小肠病料均检测到猪流行性腹泻病毒NJ株。因此，适应细胞的猪流行性腹泻病毒NJ株，具有良好的毒力，对不同日龄仔猪采用0.25mL病毒液(毒价10⁵TCID₅₀/mL)攻毒均可致死。

实施例3制备猪流行性腹泻病毒NJ株灭活疫苗

制备猪流行性腹泻病毒NJ株灭活疫苗(缩写为NJ株灭活疫苗)，具体方法如下：

(1)制备猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液

用猪流行性腹泻病毒NJ株接种Vero细胞发酵罐，收获细胞毒抗原液，取病毒含量为10^8.0TCID₅₀/mL以上的猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液制备NJ株灭活疫苗。猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液的制备方法具体如下：

细胞复苏：配制细胞生长液：在100mLDMEM培养基中添加7mL的小牛血清，另外还添加青霉素和链霉素；每毫升细胞生长液含100单位的青霉素和100单位的链霉素。将Vero细胞从液氮中取出，置37℃水浴中迅速化开后，1000rpm离心5分钟去除DMSO，将Vero细胞用1mL细胞生长液重悬后加到细胞瓶中，在细胞瓶中补加9mL细胞生长液。

细胞传代：待细胞长成致密单层后，用3-5mLpH7.2的PBS缓冲液洗涤细胞表面，再用0.1％胰酶溶液消化细胞，细胞分散成单个细胞后，加入细胞生长液，按1:3的比例分瓶。分瓶后把细胞置37℃、CO₂培养箱中培养。按照相同条件放大培养至滚瓶，最后放大至发酵罐培养。

发酵罐培养：微载体CytodexI(购于GE healthcare)提前进行灭菌处理。在发酵罐中加入细胞生长液，然后加入终浓度为2-5g/L的微载体CytodexI，调节体系pH为7.2，按照2*10⁵-5*10⁵个细胞/mL的接种量接种Vero细胞，在搅拌速度50rpm、溶氧50％、37℃条件下培养48-72小时，当细胞密度达到0.8*10⁶-1.6*10⁶个细胞/mL时(见图5)，按照MOI为0.02～0.1接种猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液，在病毒增殖期间维持条件：pH6.8、微载体搅拌速度50rpm、溶氧50％、温度37℃，病毒培养液为含1％小牛血清的DMEM培养液，接毒56-72h小时后收获细胞培养物(见图6)。将细胞培养物反复冻融3次，5000rpm离心10分钟，取上清液，即得猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液。

采用上述条件制备的猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液，毒价至少可达10^8.0TCID₅₀/mL(见表1)。取毒价达到10^8.0TCID₅₀/mL以上的病毒液制备灭活疫苗。在本发明中取5批次病毒液制备灭活疫苗，各批次病毒液的毒价及制备得到的灭活疫苗编号如表1。

表1各批次病毒液的毒价及相应疫苗的编号

病毒液批次	毒价	灭活疫苗
			第一批次	10<sup>8.1</sup>TCID<sub>50</sub>/mL	NJ株灭活疫苗1
第二批次	10<sup>8.3</sup>TCID<sub>50</sub>/mL	NJ株灭活疫苗2
			第三批次	10<sup>8.5</sup>TCID<sub>50</sub>/mL	NJ株灭活疫苗3
第四批次	10<sup>8.2</sup>TCID<sub>50</sub>/mL	NJ株灭活疫苗4
			第五批次	10<sup>8.3</sup>TCID<sub>50</sub>/mL	NJ株灭活疫苗5

(2)灭活猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液

灭活五批次猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液。方法如下：在猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液中加入终浓度(质量百分浓度)为0.1％的甲醛，置37℃下灭活36小时，得到灭活的猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液。

对灭活的猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液进行灭活检验，合格后再进行下一步。

(3)乳化

油相溶液制备：将注射用白油和司本-80按照体积比为96：4混合均匀，作为油相溶液备用。

水相溶液制备：将灭活的猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液和吐温-80按照体积比为96：4混合均匀，作为水相溶液备用。

乳化：将油相溶液和水相溶液按照体积比为2：1混和，乳化后得到NJ株灭活疫苗。具体方法如下：将2份油相溶液放入乳化罐内，启动乳化罐搅拌机搅拌，同时徐徐加入水相溶液1份，加完后继续搅拌10～15min，打开均质机进出口开关，启动均质机，使乳化液经均质机进入另一罐，如此反复乳化数次(一般6～8次)。乳化后取10mL疫苗，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层现象。

注：疫苗的配制过程需无菌操作。五批次病毒液制备得到灭活疫苗编号见表1。

猪流行性腹泻病毒NJ株灭活疫苗(缩写为NJ株灭活疫苗)的接种动物：怀孕后期母猪，用途：通过免疫母猪，使仔猪通过被动免疫获得猪流行性腹泻抗体，抵抗猪流行性腹泻病毒的感染，从而起到对仔猪流行性腹泻病的预防和治疗；接种方法：母猪产前2月、产前1月各接种一次，接种方式为后海穴注射，每次接种剂量：4mL/头。

实施例4猪流行性腹泻病毒NJ株灭活疫苗的安全性

对实施例3制备的NJ株灭活疫苗进行安全性试验。

试验设计：产前2个月、产前1个月的怀孕母猪各5头，免疫前检测血清中的PEDV抗体及抗原，均为阴性。对各怀孕母猪进行双倍剂量(8mL/头)接种，接种方式为后海穴注射。观察疫苗接种后14天内是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应，对疫苗的安全性进行研究。具体来说，观察母猪注射部位吸收情况、体温、采食饮水及是否有流产症状。

结果：注射疫苗后的母猪没有观察到任何临床异常，采食饮水、体温正常，健康状况良好。疫苗刚刚接种后，后海穴有轻微肿大，半天后基本消失，未发现任何局部反应和全身反应，没有流产症状。因此，猪流行性腹泻病毒NJ株灭活疫苗双倍剂量对怀孕母猪是安全的。

实施例5猪流行性腹泻病毒NJ株的免疫原性测定

取实施例3中制备的五批次NJ株灭活疫苗进行下面的试验。

(1)分组及免疫

将35头怀孕母猪分成7组，其中5组分别接种实施例3中五批次NJ株灭活疫苗；剩下的两组，其中一组接种商品化灭活疫苗(洛阳普莱柯生物工程有限公司生产猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联灭活疫苗，抗原为猪流行性腹泻病毒CV777株)，另一组不接种作为对照。接种方法：怀孕母猪产前2月、产前1月各接种一次，接种方式为后海穴注射，每次接种剂量：4mL/头。分组的具体情况见表2。

表2疫苗免疫试验分组及母猪耳号

分组	免疫疫苗	怀孕母猪耳号
			第一组	NJ株灭活疫苗1	1311,1312,1313,1314,1315
第二组	NJ株灭活疫苗2	1316,1317,1318,1319,1320
			第三组	NJ株灭活疫苗3	1321,1322,1323,1324,1325
第四组	NJ株灭活疫苗4	1326,1327,1328,1329,1330
			第五组	NJ株灭活疫苗5	1331,1332,1333,1334,1335
第六组	商品化灭活疫苗	1336,1337,1338,1339,1340
			第七组	不接种	1341,1342,1343,1344,1345

(2)样品采集

各母猪分娩后24小时内采血、采奶，检测血清及初乳中的中和抗体水平和初乳中的IgA水平。

血清和初乳中的中和抗体检测方法见中华人民共和国兽药典，2010年版，三部，附录49，固定病毒稀释血清法。计算每组母猪血清或初乳中和抗体滴度的平均值。

采用韩国安捷Anigen(Bionote)猪流行性腹泻病毒IgA检测试剂盒检测初乳中的IgA水平，结果以OD值表示。计算每组母猪初乳中IgA水平的平均值。

结果如图7-9。从图7中可见免疫，免疫了本发明NJ株灭活疫苗的第一、二、三、四和五组母猪血清中平均中和抗体水平分别达到1:133.2、1:156.8、1:166.6、1:149.4和1:156.6，免疫商品化灭活疫苗的母猪血清中平均中和抗体水平为1:65，可见NJ株灭活疫苗免疫后母猪血清中的平均中和抗体水平是商品化疫苗免疫后母猪的两倍以上。从图8可见，免疫了NJ株灭活疫苗的第一、二、三、四和五组母猪初乳中平均中和抗体水平分别达到1:620、1:635.6、1:678.8、1:677和1:640.2；免疫商品化灭活疫苗的母猪，血清中平均中和抗体水平为1:220，可见NJ株灭活疫苗免疫后母猪初乳中平均中和抗体水平是商品化疫苗免疫后母猪的近三倍以上。从图9可见，免疫了NJ株灭活疫苗的第一、二、三、四和五组母猪，初乳中平均IgA水平分别达到2.4814、2.6134、3.1708、2.7336和2.4966；免疫商品化灭活疫苗的母猪，初乳中平均IgA水平为仅有0.7592，可见NJ株灭活疫苗免疫后母猪初乳中平均IgA水平是商品化疫苗免疫后母猪的3倍以上。由上可见，各批次NJ株灭活疫苗免疫后母猪的血清中和抗体，初乳中和抗体和IgA水平均远远高于商品化灭活疫苗免疫母猪。

(3)仔猪攻毒保护试验

①、试验分组与攻毒

从本实施例标题1中免疫NJ株灭活苗、商品化灭活疫苗及未免疫的母猪中各选2头，以该6头母猪所产5日龄仔猪为研究对象，进行攻毒保护实验，选取的母猪耳号、免疫背景、攻毒方式见表3。攻毒前每头仔猪口服100IU青链霉素。攻毒方法：每头仔猪口服0.25mLPEDV TX株组织毒(于晓明等，猪流行性腹泻病毒TX株的分离鉴定及毒力研究，华北农学报，2015,30(增刊)：342-347.)。攻毒后仔猪采用人工牛乳饲养。

表3仔猪背景及攻毒分组情况

母猪耳号	免疫背景	攻毒毒株	攻毒剂量
				1335	NJ株灭活疫苗	猪流行性腹泻病毒NJ株	0.25mL细胞毒
1338	商品化灭活疫苗	猪流行性腹泻病毒NJ株	0.25mL细胞毒
				1341	未免疫	猪流行性腹泻病毒NJ株	0.25mL细胞毒
1321	NJ株灭活疫苗	PEDVTX株	0.25mL组织毒
				1336	商品化灭活疫苗	PEDVTX株	0.25mL组织毒
1342	未免疫	PEDVTX株	0.25mL组织毒

②攻毒结果

攻毒后每日定时观察，记录试验动物发病情况，收集腹泻猪粪便样品。病死猪及时剖检，收集小肠病料研磨后-20℃存放备用，统计每组PEDV阳性猪个数。

表4仔猪采用同源毒株(猪流行性腹泻病毒NJ株)攻毒发病统计表

表5、仔猪采用异源毒株(PEDV TX株)攻毒发病统计表

从表4中可以看到，同源毒株攻毒全部实验仔猪均发病，可能是由于同居造成仔猪的同居感染，但免疫NJ株灭活疫苗母猪所产仔猪攻毒后没有死亡，免疫商品化灭活苗后母猪所产仔猪有4/5死亡，未免疫母猪所产仔猪全部死亡。另外，免疫NJ株灭活疫苗母猪所产仔猪攻毒后，有轻微腹泻，采食量下降，发病较轻，且经过3-5日即可自行恢复，至攻毒后10天仔猪全部康复，日增重良好；免疫商品化灭活苗后母猪所产仔猪攻毒后24小时开始发病，48-72小时出现水样腹泻较重，仔猪倒地不起，随后开始死亡，死亡4头，至攻毒结束康复一头，但仍较瘦弱，日增重尚未恢复。商品化灭活苗对猪流行性腹泻病毒NJ株保护效率为20％，NJ株灭活疫苗的保护效率100％。

从表5中可以看到，异源毒株攻毒，实验仔猪均有腹泻发生，但是免疫NJ株灭活疫苗母猪所产仔猪攻毒后没有死亡，且在攻毒后恢复采食，免疫商品化灭活苗后母猪所产仔猪有5/5死亡，未免疫母猪所产仔猪全部死亡。由此可见免疫NJ株灭活苗的母猪，可以保护仔猪在出生后抵抗各类猪流行性腹泻病毒的感染，对新近的流行毒株具有较好的保护效果。

肛门拭子RT-PCR检测结果：攻毒后24h采集攻毒仔猪肛门拭子进行RT-PCR检测，结果所有免疫仔猪粪便均呈PEDV阳性。

剖检结果：发病死亡猪剖检呈典型流行性腹泻症状，发病猪胃内有大量乳凝块，肠道鼓气、肠壁变薄，肠内有大量黄绿色水样液体。

④、免疫效力评价

猪流行性腹泻病毒NJ株具有较好的细胞适应能力，发酵罐发酵后病毒滴度达到10^8.0TCID50/mL以上，从而为高效的灭活疫苗制备提供了有利的条件。

猪流行性腹泻病毒NJ株灭活苗与现有商品化疫苗进行免疫效力比较：NJ株灭活疫苗可以显著提高母猪血清、初乳中中和抗体水平和初乳中IgA水平，从而给新生仔猪提供更好的免疫保护，提高仔猪的存活率和降低养殖损失。比现有商品苗使用的疫苗毒CV777更适合在目前的猪流行性腹泻病中进行预防和免疫作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种猪流行性腹泻病毒、灭活疫苗及其制备方法

<130> 20161229

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 476

<212> DNA

<213> 猪流行性腹泻病毒 PEDV-NJ株

<400> 1

gatttatgtc taacggttct attcccgttg atgaggtgat tcaacacctt aggaactgga 60

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tgttagcact gtcacttttt gatgcatggg ctagctttca ggtcaattgg gtcttttttg 240

ctttcagcat ccttatggct tgcatcactc ttatgctgtg gataatgtac tttgtcaata 300

gcattcggtt gtggcgcagg acacattctt ggtggtcttt caatcctgaa acagacgcgc 360

ttctcactac ttctgtgatg ggccgacagg tctgcattcc agtgcttgga gcaccaactg 420

gtgtaacgct aacactcctt agtggtacat tgcttgtaga gggctataag gaatct 476

<210> 2

<211> 4160

<212> DNA

<213> 猪流行性腹泻病毒 PEDV-NJ株

<400> 2

atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60

caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120

gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 180

gtcaattcaa cttggtactg tgctggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggaatc 240

tttgttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300

gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 360

gcgcgactgc gcatttgcca gtttcctagc attaaaacat tgggccccac tgctaataat 420

gatgttacaa caggtcgtaa ttgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480

catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540

tattattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600

ggttgtgcta tgcaatatgt tacgaaccca cctattacat gcttaatgtt actagtgctg 660

gtgaggatgg tatttcttat caaccctgta cagctaattg cattggttat gctgccaatg 720

tatttgctac tgagcccaat ggccacatac cagaaggttt tagttttaat aattggtttc 780

ttttgtccaa tgattccact ttggtgcatg gtaaggtggt ttccaaccaa ccattgttgg 840

tcaattgtct tttggccatt cctaagattt atggactagg ccaatttttc tcctttaatc 900

aaacgatcga tggtgtttgt aatggagctg ctgtgcagcg tgcaccagag gctctgaggt 960

ttaatattaa tgacacctct gtcattcttg ctgaaggctc aattgtactt catactgctt 1020

taggaacaaa tttttctttt gtttgcagta attcctcaga tcctcactta gccaccttcg 1080

ccatacctct gggtgctatc caagtaccct attattgttt tcttaaagtg gatacttaca 1140

actccactgt ttataaattc ttggctgttt tacctcctac cgtcagggaa attgtcatca 1200

ccaagtatgg tgatgtttat gtcaatgggt ttggctactt gcatctcggt ttgttggatg 1260

ctgtcacaat taatttcact ggtcatggca ctgacgatga cgtttctggt ttttggacca 1320

tagcatcgac taattttgtt gatgcactta tcgaagttca aggaactgcc attcagcgta 1380

ttctttattg tgatgatcct gttagccaac tcaagtgttc tcaggtttct tttgaccttg 1440

acgatggttt ttaccctatt tcctctacaa accttctgag tcatgaacag ccaacttctt 1500

ttgttacttt gccagcattt aatgatcatt cttttgttaa tattactgtc tctgctgttt 1560

ttggtggtca tagtggtgcc aaccttattg catctgacac tactatcaat gggtttagtt 1620

ctttctgtgt tgacactaga caatttacca tttcactgtt ttataatgtt acaaacagtt 1680

atggttatgt gtctaactca caggacagta attgcccttt caccttgcaa tctgttaatg 1740

attacctgtc ttttagcaaa ttttgtgttt ctaccagcct tttggctagt gcctgtacca 1800

tagatctttt tggttaccct gagtttggta gtggtgttaa gtttacgtcc ctttactttc 1860

aattcacaaa gggtgagttg attactggca cgcctaaacc acttgaaggt gtcacggacg 1920

tttcttttat gactctggat gtgtgtacca agtatactat ctatggcttt aaaggtgagg 1980

gtatcattac ccttacaaat tctagctttt tggcaggtgt ttattacaca tctgattctg 2040

gacagttgtt agcctttaag aatgtcacta gtggtgctgt ttattctgtt acgccatgtt 2100

ctttttcaga gcaggctgca tatgttgatg atgatatagt gggtgttatt tctagtttgt 2160

ctagctccac ttttaacagt actagggagt tgcctggttt cttctaccat tctaatgatg 2220

gctctaattg tacagagcct gtgttggtgt atagtaacat aggtgtttgt aaatctggca 2280

gtattggcta cgtcccatct cagtctggcc aagtcaagat tgcacccacg gttactggga 2340

atattagtat tcccaccaac tttagtatga gtattaggac agaatattta cagctttaca 2400

acacgcctgt tagtgttgat tgtgccacat atgtttgtaa tggtaactct cgttgtaaac 2460

aattactcac ccagtacact gcagcatgta agaccataga gtcagcatta caactcagcg 2520

ctaggcttga gtctgctgaa gttaactcta tgcttactat ttctgaagag gctctacagt 2580

tagctaccat cagttcgttt aatggtgatg gatataattt tactaatgtg ctgggtgttt 2640

ctgtgtatga tcctgcaagt ggcagggtgg tacaaaaaag gtcttttatt gaagacctgc 2700

tttttaataa agtggttact aatggccttg gtactgttga tgaagactat aagcgctgtt 2760

ctaatggtcg ctctgtggca gatctagtct gtgcacagta ttactctggt gtcatggtac 2820

tacctggtgt tgttgacgct gagaagcttc acatgtatag tgcgtctctc atcggtggta 2880

tggtgctagg aggttttact tctgcagcgg cattgccttt tagctatgct gttcaagcta 2940

gactcaatta tcttgctcta cagacggatg ttctacagcg gaaccagcaa ttgcttgctg 3000

agtcttttaa ctctgctatt ggtaatataa cttcagcctt tgagagtgtt aaagaggcta 3060

ttagtcaaac ttccaagggt ttgaacactg tggctcatgc gcttactaag gttcaagagg 3120

ttgttaactc gcagggtgca gctttgactc aacttaccgt acagctggaa cacaacttcc 3180

aaaccatttc tagttctatt gatgacattt actctcgact ggacattctt tcagccgatg 3240

ttcaggttga ccgtctcatc accggcagat tatcagcact taatgctttt gttgctcaaa 3300

ccctcactaa gtatactgag gttcaggcta gcaggaagct agcacagcaa aaggttaatg 3360

agtgcgttaa atcgcaatct cagcgttatg gtttttgtgg tggtgatggc gagcacattt 3420

tctctctggt acaggcagca cctcagggcc tgctgttttt acatacagta cttgtaccgg 3480

gtgactttgt agatgttatt gccatcgctg gcttatgcgt taacgatgaa attgccttga 3540

ctctacgtga gcctggctta gtcttgttta cgcatgaact tcaaaatcat actgcgacgg 3600

aatattttgt ttcatcgcga cgtatgtttg aacctagaaa acctaccgtt agtgattttg 3660

ttcaaattga gagttgtgtg gtcacctatg tcaatttgac tagagaccaa ctaccagatg 3720

taatcccaga ttacatcgat gttaacaaaa cacttgatga gattttagct tctctgccca 3780

atagaactgg tccaagtctt cctttagatg tttttaatgc cacttatctt aatctcactg 3840

gtgaaattgc agatttagag cagcgttcag agtctctccg taatactaca gaggagctcc 3900

aaagtcttat atataatatc aacaacacac tagttgacct tgagtggctc aaccgagttg 3960

agacatatat caagtggccg tggtgggttt ggttgattat tttcattgtt ctcatctttg 4020

ttgtgtcatt actagtgttc tgctgcattt ccactggttg ttgtggatgc tgcggctgct 4080

gctgtgcttg tttttcaggt tgttgtaggg gtcctagact tcaaccttac gaagtttttg 4140

aaaaggtcca cgtgcagtga 4160

Claims

1.猪流行性腹泻病毒NJ株，其保藏登记号为：CGMCC NO.13283。

2.权利要求1所述猪流行性腹泻病毒NJ株在制备猪流行性腹泻病毒疫苗中的应用。

3.一种制备猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液的方法，其特征在于：在发酵罐中，将权利要求1所述猪流行性腹泻病毒NJ株接种Vero细胞，培养后获得病毒液。

4.权利要求3所述方法制备的猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液。

5.一种猪流行性腹泻灭活疫苗，其特征在于含有灭活的权利要求4所述病毒液。

6.权利要求5所述猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液进行灭活；取灭活后的病毒液与吐温-80按照体积比为96:4混合均匀，得到水相溶液；将注射用白油和司本-80按照体积比96:4混合均匀，得到油相溶液；将水相和油相按照体积比1:2~3混合，乳化，得到所述疫苗。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于所述猪流行性腹泻病毒NJ株病毒液的病毒含量不低于10^8.0TCID₅₀/mL。

8.猪流行性腹泻病毒NJ株在制备预防和治疗猪流行性腹泻药物中的应用。