CN105462936A - 一种流猪行性腹泻病毒my01株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种流猪行性腹泻病毒MY01株及其应用，属于猪流行性腹泻病毒疫苗试剂领域。本发明的猪流行性腹泻病毒MY01株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为：CGMCC？No.11495。本发明的猪流行性腹泻病毒MY01株对猪有较强的致病性，且具有良好的免疫原性，应用其制备的灭活油乳剂疫苗安全可靠，不仅能提供同源攻毒保护，还可为PEDV流行毒株提供保护力，免疫后能够产生较强免疫力，接种猪群发病率和死亡率明显减少，其免疫效果优于市场上现有的商品化疫苗，具备了与国美外同类产品竞争的优势，能够有效的预防猪流行性腹泻病毒的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

Description

一种流猪行性腹泻病毒MY01株及其应用
技术领域
本发明涉及一种流猪行性腹泻病毒MY01株及其应用，属于猪流行性腹泻病毒疫苗试剂领域。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，各种年龄的猪均易感。猪流行性腹泻病毒(PEDV)为冠状病毒科冠状病毒属的成员。病毒形态略呈球形，有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突，呈皇冠状。PEDV核酸为线性单股正链RNA，长为27000～33000个核苷酸(nt)。该病毒不能凝集人、兔、猪、鼠、犬、马、羊、牛的红细胞。对外界抵抗力弱，对乙醚、氯仿敏感，一般消毒药物都可将其杀灭。病毒在60℃30min，可失去感染力，但在50℃条件下相对稳定。病毒在4℃，pH5.0～9.0或在37℃，pH6.5～7.5时稳定。
我国于1995年开始使用疫苗进行PEDV的防控，但是从2006年开始，PEDV疫苗的免疫效果越来越差，免疫过的猪群仍然会爆发PED，2010年以来，全国大部分地区的猪场开始大规模爆发PED，这次爆发中初生仔猪死亡率达90%，全国仔猪死亡估计有上千万头。给我国养猪业造成巨大的经济损失们，已经引起政府和社会的高度关注。
对于本病目前尚无特效药物和疗法，主要是通过隔离、消毒、加强饲养管理，较少人员流动等生物安全防控措施进行预防和控制。疫苗是防控病毒性疫病的常规防控手段。CV777毒株是当前使用最为广泛的疫苗毒株，但是由于长期广泛的使用造成猪场PEDV流行毒株在免疫选择压下发生变异，当前流行毒株与疫苗毒株同源性小于97%，其主要保护抗原纤突蛋白同源性小于94%。大量的临床数据表明PEDV疫苗免疫保护性下降十分严重，免疫后不能提供足够的保护力，仍然会发生PEDV疫情。因此发掘更多的保护性好且免疫原性强的PEDV毒株并利用其研制高效的猪流行性腹泻疫苗是该病防控的迫切需要。
发明内容
为了解决以上现有猪流性腹泻病毒疫苗免疫原性差，免疫保护力低的问题，本发明提供了一种免疫原性强的猪流行性腹泻病毒MY01株。
本发明还提供了所述猪流行性腹泻MY01株的应用。
技术方案：
一种猪流行性腹泻病毒MY01株，其保藏编号为：CGMCCNo.11495。
上述猪流行性腹泻病毒MY01株在制备灭活疫苗和弱毒疫苗中的应用。
上述应用，取病毒株接种于PIEC细胞扩繁病毒，收集病毒液，经甲醛灭活后，得灭活病毒液；将灭活病毒液与氢氧化铝佐剂混合配置成灭活铝胶疫苗；或者，以灭活病毒液为水相，以白油、司本、硬脂酸铝为油相，制备成油乳剂灭活疫苗。
取病毒株，在PIEC细胞系传代28代后，转向猴源VERO细胞培养；然后，从20代起进行蚀斑纯化，蚀斑纯化连续进行3次；之后，以克隆毒22代为弱毒病毒液，将弱毒病毒液与与冻干保护剂混合后，即为猪流行性腹泻病毒弱毒活疫苗。
一种以保藏编号为CGMCCNo.11495的病毒株为抗原制备的猪流行性腹泻灭活疫苗或弱毒疫苗。上述猪流行性腹泻灭活疫苗或弱毒疫苗，优选的，为油乳剂疫苗或铝胶疫苗；更优选的为铝胶疫苗。上述猪流行性腹泻灭活疫苗或弱毒疫苗，优选的，灭活疫苗中病毒含量≥106TCID50/mL；弱毒疫苗中病毒含量≥105TCID50/mL。
本发明的有益效果：猪流行性腹泻病毒MY01株对猪有较强的致病性，且具有良好的免疫原性，应用其制备的灭活油乳剂疫苗安全可靠，不仅能提供同源攻毒保护，还可为PEDV流行毒株提供保护力，免疫后能够产生较强免疫力，接种猪群发病率和死亡率明显减少，其免疫效果优于市场上现有的商品化疫苗，具备了与国美外同类产品竞争的优势，能够有效的预防猪流行性腹泻病毒的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。
保藏信息
保藏时间：2015年11月11日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCCNo.11495，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，
分类命名：猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus）。
附图说明
图1为攻毒实验中PEDV感染后自主体温变化情况；其中，圆形为PBS免疫对照组，方形为油苗免疫组，三角形为铝胶疫苗免疫组。
具体实施方式
实施例1
细胞培养用培养基，即，10%新生牛血清的DMEM；其配制：取500ml液体DMEM培养基，按照10%的体积加入新生牛血清，充分混匀后备用。
病毒培养用培养基，即，2%新生牛血清的DMEM；其配制：取500ml液体DMEM培养基，按照2%的体积加入新生牛血清，充分混匀后备用。
1.1PEDV的分离纯化及传代方法
从山东省临沂地区某大型猪场送检的病料中，收集PEDV检测结果为阳性、TGEV等病毒为阴性的猪肠道内容物，12000r/min，离心10min，取上清，0.22μm滤膜过滤。将过滤后病料上清按照1ml/25cm2的比例接种猪肠道上皮细胞，感作2h后，加入10ml病毒培养用培养基，置于37℃，5%（体积百分数，下同）CO2的培养箱中约48-72h，待细胞出现显著病变后，将含病毒的培养基冻融两次，分装后于-80℃保存。
将已培养的病毒按照1ml/25cm2的比例接种猪肠道上皮细胞，感作2h后，加入10ml病毒培养用培养基，置于37℃，5%CO2的培养箱中约48-72h，待细胞出现显著病变后收取病毒，即为本发明的猪流行性腹泻病毒（PEDV）MY01株。
1.2MY01株序列测定
1.2.1引物设计：根据PEDV流行毒株（AH2012）的序列，将该病毒基因组分为37个片段进行扩增，引物序列如下：
引物名称序列
PEDV-1FTAGTTAGCTCTTTTTCTAGACTCTTG，如SEQIDNO.2所示；
PEDV-1RACAACAGAACCAGGCGTAG，如SEQIDNO.3所示；
PEDV-2FGTGTTCCTCCACGCTTTTGTT，如SEQIDNO.4所示；
PEDV-2RGGCACTTCGGCGATAAACTC，如SEQIDNO.5所示；
PEDV-3FATGAGGTCGTGCTCTTTGGC，如SEQIDNO.6所示；
PEDV-3RAAAAGACCGCCAGATGCTACC，如SEQIDNO.7所示；
PEDV-4FGATGAGGTCGTGCTCTTTGGC，如SEQIDNO.8所示；
PEDV-4RAAAAGACCGCCAGATGCTACC，如SEQIDNO.9所示；
PEDV-5FCCACTTGTTGCACGATGTCAGG，如SEQIDNO.10所示；
PEDV-5RCCATCATCCTCAGGCTCAGAGTTAG，如SEQIDNO.11所示；
PEDV-6FAAGGTTACAGGTGGTTGGGACG，如SEQIDNO.12所示；
PEDV-6RCCATAACCATCAATAGCCATAGCAG，如SEQIDNO.13所示；
PEDV-7FAAGGTTACAGGTGGTTGGGACG，如SEQIDNO.14所示；
PEDV-7RAAATAGCATCTACCAAGCCATCCA，如SEQIDNO.15所示；
PEDV-8FGTCTCACGGTGGCGGCATAG，如SEQIDNO.16所示；
PEDV-8RGGATACGAAACCTACCACGCTGAG，如SEQIDNO.17所示；
PEDV-9FGCCGTCGTCAAGGTATCTAAGC，如SEQIDNO.18所示；
PEDV-9RTTACGAAAGGCCCTAAAACAGAG，如SEQIDNO.19所示；
PEDV-10FCCCTGTGAAGAAAGTAGAGTTAGACGC，如SEQIDNO.20所示；
PEDV-10RAAAAGTGCAGCCTGGACCATAAG，如SEQIDNO.21所示；
PEDV-11FTAGTATGGCAACACCTTAGAGACCC，如SEQIDNO.22所示；
PEDV-11RTCTTGGCACCTACACGCATACA，如SEQIDNO.23所示；
PEDV-12FTTGCTGAGGCTCATCGTTACG，如SEQIDNO.24所示；
PEDV-12RAAGCACCGACAGTGAAAACGC，如SEQIDNO.25所示；
PEDV-13FAATTATCTCACGCGGCTTTGG，如SEQIDNO.26所示；
PEDV-13RAGCCTCTGAAGCACTGCCTGA，如SEQIDNO.27所示；
PEDV-14FTTTTGAGGGTGACAAGTTCGTAG，如SEQIDNO.28所示；
PEDV-14RAATCCTAGAAGAACTAAGCCACC，如SEQIDNO.29所示；
PEDV-15FCACCTATCGCACAGTTAGACCG，如SEQIDNO.30所示；
PEDV-15RCGCTCACCACCAATACCAATC，如SEQIDNO.31所示；
PEDV-16FGTTTAAGTATATGGTTGCTAACGGCC，如SEQIDNO.32所示；
PEDV-16RTCCCTCACGCTGGATACGATTA，如SEQIDNO.33所示；
PEDV-17FGCGAATTTGACCGTGAGGCTT，如SEQIDNO.34所示；
PEDV-17RGGACGCACCACCGTATGAATC，如SEQIDNO.35所示；
PEDV-18FGTAGGGGTGCTGTTCTCGGC，如SEQIDNO.36所示；
PEDV-18RCAAAACACTCACTAGCAAGGCAAT，如SEQIDNO.37所示；
PEDV-19FTTAGGTACCATTGTTTCACGTGCT，如SEQIDNO.38所示；
PEDV-19RCAACCGAAGCGCCCCTAG，如SEQIDNO.39所示；
PEDV-20FTCGCGTCGTGTATCAAATAGTGC，如SEQIDNO.40所示；
PEDV-20RTTGAAGGATCAGGGTAAGGAAGG，如SEQIDNO.41所示；
PEDV-21FATGATGATTCTTTCTGATGATGGCG，如SEQIDNO.42所示；
PEDV-21RAATTTCTATTAAGGGGTGGTTTGGG，如SEQIDNO.43所示；
PEDV-22FGCTCACCCGATGTTGAAGACTTTAA，如SEQIDNO.44所示；
PEDV-22RCACAGTACGCACTATCTCAGCAGGAC，如SEQIDNO.45所示；
PEDV-23FAATCAGCGCATCAGCTATAGGC，如SEQIDNO.46所示；
PEDV-23RATGGGACATTTGTACCGACGTTA，如SEQIDNO.47所示；
PEDV-24FTTAAAGACTGTAGCAGAGGTGATGATC，如SEQIDNO.48所示；
PEDV-24RGCATCCGTTACGGCACATCTA，如SEQIDNO.49所示；
PEDV-25FCAGCAGTGGGGATACAAGGGA，如SEQIDNO.50所示；
PEDV-25RCGTTCGGCTTCATAGTCCCAA，如SEQIDNO.51所示；
PEDV-26FCTCACCCCACCCATTACGATC，如SEQIDNO.52所示；
PEDV-26RACCCTTGTCGGAGCCAGC，如SEQIDNO.53所示；
PEDV-27FTGTATGGGTGTGCTCAAAATAGACG，如SEQIDNO.54所示；
PEDV-27RTCACCAATAGGTAGATAACCGCCC，如SEQIDNO.55所示；
PEDV-28FATGACGCCATTTGTGGTTTTTCTA，如SEQIDNO.56所示；
PEDV-28RGAGCCTTCAGCAAGAATGACAGAG，如SEQIDNO.57所示；
PEDV-29FAATGATTGGTCCCGTGTTGC，如SEQIDNO.58所示；
PEDV-29RCGCTGAATGGCAGTTCCTTG，如SEQIDNO.59所示；
PEDV-30F1AAGGAACTGCCATTCAGCGTAT，如SEQIDNO.60所示；
PEDV-30R1CAGCCTGCTCTGAAAAAGAACAT，如SEQIDNO.61所示；
PEDV-31FGTGAGTTGATTACTGGCACGCCTA，如SEQIDNO.62所示；
PEDV-31RCCATACCACCGATGAGAGACGC，如SEQIDNO.63所示；
PEDV-32FGCTGGGTGTTTCTGTGTATGATCC，如SEQIDNO.64所示；
PEDV-32RGAGACTCTGAACGCTGCTCTAAATT，如SEQIDNO.65所示；
PEDV-33FGGCTTAGTCTTGTTTACGCATGAA，如SEQIDNO.66所示；
PEDV-33RCAGACTAAACAAAGCCTGCCAAT，如SEQIDNO.67所示；
PEDV-34FGACAAGCTTCAAATGTGACGGGTT，如SEQIDNO.68所示；
PEDV-34RACCACCAAGAATGTGTCCTGCG，如SEQIDNO.69所示；
PEDV-35FTGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGG，如SEQIDNO.70所示；
PEDV-35RCGGCGTGAGGTCCTGTTCC，如SEQIDNO.71所示；
PEDV-36FGGTCCAAACACGGCGACTACT，如SEQIDNO.72所示；
PEDV-36RTCTCCTCCACTCTGGGATGTCTT，如SEQIDNO.73所示；
PEDV-37FCCTTAAATCTTTGGGTATTGGCG，如SEQIDNO.74所示；
PEDV-37RCAACACCGTCAGGTCTTCAGTTAC，如SEQIDNO.75所示。
1.2.2病毒RNA的提取及RT-PCR扩增
a)取冻融后的病毒培养液0.25ml，加入0.75mlTrizol，剧烈震荡5min，12000r/min瞬离；
b)加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，充分剧烈震荡15sec后静置3min；
c)于4℃离心15min，小心吸取上清，转移入新的离心管中；
d)向新的离心管加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于室温静置10min后，4℃离心15min，弃上清；得RNA样品；
e)将RNA样品干燥后，加入适量DEPC水溶解；
f)使用引物列表中的引物，按照常规RT-PCR方法进行扩增；扩增产物序列如如SEQIDNO.1所示。
实施例2
猪流行性腹泻病毒MY01株在制备的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗中的应用：取毒种保藏编号为CGMCCNo.11495的猪流行性腹泻病毒MY01株，接种于PIEC细胞扩繁病毒，收集病病毒液，经甲醛灭活后，与氢氧化铝佐剂混合配置成灭活铝胶疫苗。操作步骤如下：
2.1毒种选择
制苗毒种为PEDVMY01株，其藏编号为CGMCCNo.11495，对猪有较强的致病性，0.1mL病毒液（104.0TCID50）经口腔攻毒仔猪即可导致能够90%的仔猪发病。PEDVMY01株的免疫原性良好，最低免疫剂量应≥2.0×106TCID50。
2.2生产用毒种的制备
2.2.1一级生产种子繁殖
取毒种保藏编号为CGMCCNo.11495的PEDVMY01株，按照0.1mL/25cm2的比例接种PIEC细胞，病毒感作1h后补加病毒培养用培养基并置于37℃5%（体积百分数）CO2的环境中培养，待80%细胞出现明显病变后，收取培养液，并将培养液中病毒含量调整至106TCID50/mL。经纯粹检验合格后，作为一级生产种子。
2.2.2二级生产种子的繁殖
取一级生产种子按照5%的接种量接种于PIEC细胞，于37℃5%CO2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液。经纯粹检验合格后，作为二级种子。
2.3制苗病毒液的制备
将二级种子按照5%的接种量接种于PIEC细胞，于37℃5%CO2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液并进行纯粹检验和病毒滴度测定。纯粹检验和病毒滴度测定均按照《中华人民共和国兽药典》附录进行。每批制苗用病毒液均纯粹，无杂病毒生长，且调整毒价至2×106TCID50/mL。
2.4病毒液的灭活
用不同浓度的甲醛对病毒液进行灭活：向病毒液中加入甲醛溶液分别至终浓度（v/v）为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，将其置于37℃灭活，期间每隔4h～6h振摇一次。灭活6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h和48h时取样检测，观察是否灭活完全。三组平行试验的结果均显示0.3%和0.4%甲醛溶液灭活病毒液24h时均未检出活病毒，如表1所示。因此，病毒液的灭活方法选用终浓度为0.3%甲醛溶液37℃灭活24h，期间每隔4h～6h振摇一次。灭活病毒液经检验无菌生长为合格，以该灭活病毒液作为制苗用抗原。
表1不同浓度甲醛灭活PEDVMY01株时病毒活性的检测
注：“＋”存在活病毒；“－”无活病毒。
2.5免疫佐剂的筛选
2.5.1油苗的制备
取病毒液96份（所述份为重量份，下同）加入4份吐温混匀作为水相，取白油93份加入6份司本-80、硬脂酸铝1份混合，121℃灭菌30min后作为油相。按水相与油相1:2的（体积）比例进行乳化制备油乳剂灭活疫苗。成品疫苗中含病毒量106TCID50/mL。将疫苗取样进行无菌检验，按现行《中华人民共和国兽药典》方法进行，无细菌、霉菌生长。
2.5.2铝胶疫苗的制备
取20g铝胶加入100mL水中，搅拌至完全溶解，121℃高压灭菌1h配制成20%的铝胶，按体积比1:2加入灭活病毒液中，混匀后，2～8℃静置2天～3天，抽弃上清约浓缩成全量的三分之二，分装保存。成品疫苗中含病毒量106TCID50/mL。将疫苗取样进行无菌检验，按现行《中华人民共和国兽药典》方法进行，无细菌、霉菌生长。
2.5.3安全检验
分别对3头怀孕母猪于产前5周、产前2周注射油苗、铝胶疫苗和PBS2mL。注射后连续观察2周，结果免疫后绝大部分猪的精神、体温、食欲均正常，但油苗组注射部位到试验结束仍稍有肿胀，疫苗吸收不良，铝胶苗组无肿胀和坏死，无其他不良反应。
2.5.4效力检验
待母猪生产后，取5日龄的仔猪5头，分别按照104.0TCID50的剂量进行攻毒，连续观察1周，记录体温变化和临床表现，剖检后观察病理变化。
油苗组：1头仔猪攻毒后厌食，精神沉郁，体温升高（＞40.5℃），于攻毒后第2天出现腹泻症状，剖解后发现小肠变薄，另外3头体温变化不大，食欲正常，剖检后无典型变化。该组疫苗的保护率为80%。
铝胶苗组：5头仔猪体温、食欲均无异常，剖检后各器官均无异常变化。该组疫苗的保护率为100%。
对照组：5头仔猪体温均升高（＞40.5℃），出现腹泻症状，3头于试验过程中死亡，剖检后发现小肠壁变薄，呈半透明状。4头仔猪食欲明显减退，精神沉郁，被毛粗乱，后肢肌肉萎缩。
综上所述，油苗和铝胶苗均能为仔猪提供保护，但铝胶苗的保护效果要强于油苗。
实施例3
猪流行性腹泻病毒MY01株在制备的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗中的应用：取毒种保藏编号为CGMCCNo.11495的猪流行性腹泻病毒MY01株，在PIEC细胞系传代28代后，转向猴源VERO细胞培养。从20代（总代次48代）起进行蚀斑纯化，蚀斑纯化连续进行3次。以克隆毒22代（总代次70代）制备猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗。
2.1毒种选择
制苗毒种为PEDVMY01株，经PIEC细胞核Vero细胞传代后，MY01毒株F70代对仔猪致病力丧失，但保留良好的免疫原性。最低免疫剂量应≥2.0×105TCID50。
2.2生产用毒种的制备
2.2.1一级生产种子繁殖
取毒种保藏编号为CGMCCNo.11495的PEDVMY01株，将其F68代病毒按照0.1mL/25cm2的比例接种Vero细胞，病毒感作1h后补加病毒培养用培养基并置于37℃5%（体积百分数）CO2的环境中培养，待80%细胞出现明显病变后，收取培养液，并将培养液中病毒含量调整至106TCID50/mL。经纯粹检验合格后，作为一级生产种子。
2.2.2二级生产种子的繁殖
取一级生产种子按照5%的接种量接种于Vero细胞，于37℃5%CO2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液。经纯粹检验合格后，作为二级种子。
2.3制苗病毒液的制备
将二级种子按照5%的接种量接种于Vero细胞，于37℃5%CO2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液并进行纯粹检验和病毒滴度测定。纯粹检验和病毒滴度测定均按照《中华人民共和国兽药典》附录进行。每批制苗用弱毒病毒液均纯粹，无杂病毒生长；将弱毒病毒液与与冻干保护剂混合后，且调整毒价至105TCID50/mL，分装、冻干，保存于-15~-20℃，即为猪流行性腹泻病毒弱毒活疫苗。
2.5PEDV弱毒疫苗安全、效力的检验
2.5.1安全检验
分别对3头怀孕母猪于产前5周、产前2周经后海穴注射弱毒疫苗和PBS2mL。注射后连续观察2周，结果免疫后绝大部分猪的精神、体温、食欲均正常，且疫苗注射部位无其他不良反应。取5日龄的PEDV抗原抗体双阴性的健康仔猪，经口服和后海穴注射PEDV弱毒疫苗2mL。免疫后连续观察2周，仔猪在精神、体温、食欲等方面均正常，无任何呕吐腹泻症状。
2.5.2效力检验
待母猪生产后，取5日龄的仔猪5头，分别按照104.0TCID50的剂量进行攻毒，连续观察1周，记录体温变化和临床表现，剖检后观察病理变化。
弱毒疫苗免疫组：5头仔猪体温、食欲均无异常，剖检后各器官均无异常变化。该组疫苗的保护率为100%。
对照组：5头仔猪体温均升高（＞40.5℃），出现腹泻症状，3头于试验过程中死亡，剖检后发现小肠壁变薄，呈半透明状。4头仔猪食欲明显减退，精神沉郁，被毛粗乱，后肢肌肉萎缩。
综上所述，弱毒疫苗免疫母猪后产生的抗体可以经过乳汁传递给仔猪，使仔猪被动获得抵抗PEDV流行性毒株的能力。
<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>一种流猪行性腹泻病毒MY01株及其应用
<160>75
<210>1
<211>28045
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
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Claims (8)

1.一种猪流行性腹泻病毒MY01株，其保藏编号为：CGMCCNo.11495。
2.一种权利要求1所述猪流行性腹泻病毒MY01株在制备灭活疫苗和弱毒疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，取病毒株接种于PIEC细胞扩繁病毒，收集病毒液，经甲醛灭活后，得灭活病毒液；
将灭活病毒液与氢氧化铝佐剂混合配置成灭活吕胶疫苗；
或者，以灭活病毒液为水相，以白油、司本、硬脂酸铝为油相，制备成油乳剂灭活疫苗。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，取病毒株，在PIEC细胞系传代28代后，转向猴源VERO细胞培养；然后，从20代起进行蚀斑纯化，蚀斑纯化连续进行3次；之后，以克隆毒22代为弱毒病毒液；
将弱毒病毒液与氢氧化铝佐剂混合配置成弱毒吕胶疫苗；
或者，以弱毒病毒液为水相，以白油、司本、硬脂酸铝为油相，制备成油乳剂弱毒疫苗。
5.一种以权利要求1所述的病毒株为抗原制备的猪流行性腹泻灭活疫苗或弱毒疫苗。
6.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻灭活疫苗或弱毒疫苗，其特征在于，为油乳剂疫苗或吕胶疫。
7.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻灭活疫苗或弱毒疫苗，其特征在于，为吕胶疫苗。
8.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻灭活疫苗或弱毒疫苗，其特征在于，灭活疫苗中病毒含量≥106TCID50/mL；弱毒疫苗中病毒含量≥105TCID50/mL。
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