CN114214289A - 一株马冠状病毒ECoV464693及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株马冠状病毒ECoV464693及其应用，属于马冠状病毒疫苗试剂领域。针对国内外尚无安全有效马冠状病毒疫苗的问题，本发明提供了一种免疫原性强的ECoV464693株；马冠状病毒ECoV464693株对马属动物有较强的致病性，同时具有良好的免疫原性，应用其制备的灭活油乳剂疫苗安全可靠，免疫后能够产生较强免疫力，接种马属动物群体发病率和死亡率明显减少，能够有效的预防马冠状病毒的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

Description

一株马冠状病毒ECoV464693及其应用
技术领域
本发明涉及一株马冠状病毒ECoV464693及其应用，属于马冠状病毒疫苗试剂领域。
背景技术
冠状病毒在系统分类上属套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）。冠状病毒属的病毒是具囊膜（envelope）、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有poly(A)尾，基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，如人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类。 冠状病毒最先是1937年从鸡身上分离出来，病毒颗粒的直径60～200nm，平均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。在冠状病毒感染细胞内有时可以见到管状的包涵体。
动物冠状病毒包括哺乳动物冠状病毒和禽冠状病毒。哺乳动物冠状病毒主要为α、β属冠状病毒，可感染蝙蝠、猪、犬、猫、鼠、牛、马等多种动物。禽冠状病毒主要来源于γ、δ属冠状病毒，可感染如鸡、麻雀、鸭、鹅、鸽子等多种禽鸟类。马冠状病毒引发马属动物幼驹和成年动物以发烧和腹泻为主要症状的疾病，严重时可导致幼驹死亡，死亡率高达60%；国内外尚无安全有效马冠状病毒疫苗。
发明内容
针对国内外尚无安全有效马冠状病毒疫苗的问题，本发明提供了一种免疫原性强的ECoV464693株；还提供了所述ECoV464693株的应用。
本发明的技术方案如下：
一种马冠状病毒ECoV464693株，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述马冠状病毒ECoV464693株在制备灭活疫苗和弱毒疫苗中的应用。
优选地，所述的灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
（1）取病毒株接种于Vero细胞，扩繁病毒，收集病毒液，经甲醛灭活后，得灭活病毒液；灭活疫苗中病毒含量≥106 TCID50/mL；
（2）将步骤（1）灭活病毒液与氢氧化铝佐剂混合配置成灭活铝胶疫苗；或者，以灭活病毒液为水相，以206佐剂为油相，制备成油乳剂灭活疫苗；灭活疫苗中病毒含量≥106TCID50/mL。
优选地，所述的弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤为：取病毒株接种于Vero细胞，培养，从20代起进行蚀斑纯化，蚀斑纯化连续进行3次；以克隆毒22代为弱毒病毒液，将弱毒病毒液与冻干保护剂混合后，即为马冠状病毒弱毒活疫苗；弱毒疫苗中病毒含量≥105 TCID50/mL。
本发明的有益效果
马冠状病毒ECoV464693株对马属动物有较强的致病性，同时具有良好的免疫原性，应用其制备的灭活油乳剂疫苗安全可靠，免疫后能够产生较强免疫力，接种马属动物群体发病率和死亡率明显减少，能够有效的预防马冠状病毒的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1得到的病毒的电镜图。
具体实施方式
实施例1马冠状病毒ECoV464693株的制备
细胞培养用培养基，即，10%胎牛血清的RPMI 1640；其配制：取500ml液体RPMI1640培养基，按照10%的体积加入胎牛血清，充分混匀后备用。
病毒培养用培养基，即，含有0.25ug/ml TPCK胰酶的无血清RPMI 1640；其配制：取500ml液体RPMI 1640培养基，按照0.25ug/ml终浓度的加入TPCK胰酶，充分混匀后备用。
1.1 ECoV的分离纯化及传代方法
从山东省聊城地区某马场送检的病料中，收集ECoV检测结果为阳性马肠道组织及内容物，剪刀剪碎后，12000r/min，离心2min，取上清，0.22μm滤膜过滤。将过滤后病料上清按照0.5 ml/10cm2的比例接种HCT-8细胞，感作1.5h后，加入10ml病毒培养用培养基，置于37℃，5%（体积百分数，下同）CO2的培养箱中约72-120h，待细胞出现显著病变后，将含病毒的细胞培养物及上清反复冻融两次，分装后于-80℃保存。
将已培养的病毒按照1ml/75cm2的比例接种HCT-8细胞，感作1.5h后，加入15ml病毒培养用培养基，置于37℃，5%CO2的培养箱中约72-120h，待细胞出现显著病变后收取病毒，即为本发明的马冠状病毒ECoV464693株。
1.2 ECoV464693株序列测定
1.2.1引物设计：根据ECoV毒株（NC99）的序列，将该病毒基因组分为21个片段进行扩增，引物序列如下：
引物名称 序列
ECoV-1F GGACCGTGTTATTCAAGATGC，如SEQ ID NO.2所示；
ECoV-1R CACATCGCTGCCTCCAAAG，如SEQ ID NO.3所示；
ECoV-2F CATTTACTGTTTGTTCAGATGGCTT，如SEQ ID NO.4所示；
ECoV-2R TGAGATGTCGCTTGCCATTC，如SEQ ID NO.5所示；
ECoV-3F TGTACCTAAAGCAACGCGCA，如SEQ ID NO.6所示；
ECoV-3R ACGGCACATATCGAGTGGT，如SEQ ID NO.7所示；
ECoV-4F CCTGCAGATTGGCGCATAGT，如SEQ ID NO.8所示；
ECoV-4R GCGCTGCAGGATTCAACTTC，如SEQ ID NO.9所示；
ECoV-5F TGTTAGGAGGTATGAAAGAGGGT，如SEQ ID NO.10所示；
ECoV-5R CTGTAGGCTGAATAGGCCGT，如SEQ ID NO.11所示；
ECoV-6F GTAGTACGATCGTCGGTGGC，如SEQ ID NO.12所示；
ECoV-6R CGTTCTGCATAAGCCCCTCT，如SEQ ID NO.13所示；
ECoV-7F TGCTGATGGAGTGCAGTGTTA，如SEQ ID NO.14所示；
ECoV-7R CCAACAGATCCACAAGATCCG，如SEQ ID NO.15所示；
ECoV-8F GCCTTTCATGTGACTATGCGT，如SEQ ID NO.16所示；
ECoV-8R TGCGTAATCGTCGCAAACTT，如SEQ ID NO.17所示；
ECoV-9F GTTGTGGCAGTATTGTAGCACT，如SEQ ID NO.18所示；
ECoV-9R CGAGACGGGCATCTACACTC，如SEQ ID NO.19所示；
ECoV-10F GTGCAAATTACGCGGCAAGT，如SEQ ID NO.20所示；
ECoV-10R TGCCGGTATACACCCACCAT，如SEQ ID NO.21所示；
ECoV-11F CCATGGTGGACATTAAGCAGTT，如SEQ ID NO.22所示；
ECoV-11R ATCCTGGTGCGTTACACACAT，如SEQ ID NO.23所示；
ECoV-12F GAGTGTTGGAGCTTGCGTTG，如SEQ ID NO.24所示；
ECoV-12R GCGCTGAATCTACGGTTTGG，如SEQ ID NO.25所示；
ECoV-13F GGCGTTACAACACATGAGAGTT，如SEQ ID NO.26所示；
ECoV-13R GGCTGCCCTAGAAAAGGGATT，如SEQ ID NO.27所示；
ECoV-14F GGTTTGTGTATGTTTTGGAACTGC，如SEQ ID NO.28所示；
ECoV-14R GCAAAGTAACTGGCTTCCCG，如SEQ ID NO.29所示；
ECoV-15F TCAGTTCATGCTTTGGTGTAACG，如SEQ ID NO.30所示；
ECoV-15R GCTTGCTCCATGCATCATCATC，如SEQ ID NO.31所示；
ECoV-16F GGTGCTGAAAAGGTTGATGGT，如SEQ ID NO.32所示；
ECoV-16R ACAGCAAAAGCGGTAGGTAGA，如SEQ ID NO.33所示；
ECoV-17F GTGTATGACCCCTTACCCATT，如SEQ ID NO.34所示；
ECoV-17R TACCTACACAGGTTGCACCA，如SEQ ID NO.35所示；
ECoV-18F CTGGAACAGGCGGTATGGTT，如SEQ ID NO.36所示；
ECoV-18R GCAGATGTTGCAGCCAAAGT，如SEQ ID NO.37所示；
ECoV-19F AGTAAGGTTGTCTGATGTTGGCT，如SEQ ID NO.38所示；
ECoV-19R TCCTCTCAGGTCTCCAGATGT，如SEQ ID NO.39所示；
ECoV-20F TAAGACCTGCCTTTGTGGGTT，如SEQ ID NO.40所示；
ECoV-20R CTGGTCGGCCCATTTAAGGA，如SEQ ID NO.41所示；
ECoV-21F GGCGATAATAGTGGCTTTGCTG，如SEQ ID NO.42所示；
ECoV-21R TCCCTTATGGCACTTGTCGG，如SEQ ID NO.43所示。
1.2.2 病毒RNA的提取及一步法RT-PCR扩增
a)取1.1的病毒培养液0.2 ml，加入0.5 ml裂解液，涡旋震荡10 sec，12000r/min离心2 min；
b)加入0.6 ml洗液，12000r/min 离心1 min，弃滤液；
c)重复1次步骤b；
d)12000r/min空离2 min；
e)加入适量洗脱液，室温静置1min，12000r/min离心1 min；
f)使用引物列表中的引物，按照一步法RT-PCR试剂盒说明书进行扩增；扩增产物序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2马冠状病毒ECoV464693株在制备的马冠状病毒灭活疫苗中的应用
取马冠状病毒ECoV464693株，接种于Vero细胞扩繁病毒，收集病毒液，经甲醛灭活后，与氢氧化铝佐剂混合配置成灭活铝胶疫苗。操作步骤如下：
2.1毒种选择
制苗毒种为ECoV464693株，对马有较强的致病性，0.1mL病毒液（104TCID50）经口腔攻毒幼驹即可导致能够80%的幼驹发病。ECoV464693株的免疫原性良好，最低免疫剂量应≥2.0×106TCID50。
2.2生产用毒种的制备
2.2.1一级生产种子繁殖
取ECoV464693株，按照0.5mL/75cm2的比例接种Vero胞，病毒感作1.5h后更换病毒培养用培养基并置于37℃ 5%（体积百分数）CO2的环境中培养，待80%细胞出现明显病变后，收取培养液，并将培养液中病毒含量调整至106 TCID50/mL。经纯粹检验合格后，作为一级生产种子。
2.2.2 二级生产种子的繁殖
取一级生产种子按照5%的接种量接种于Vero细胞，于37℃ 5%CO2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液。经纯粹检验合格后，作为二级种子。
2.3 制苗病毒液的制备
将二级种子按照5%的接种量接种于Vero细胞，于37℃ 5%CO2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液并进行纯粹检验和病毒滴度测定。纯粹检验和病毒滴度测定均按照《中华人民共和国兽药典》附录进行。每批制苗用病毒液均纯粹，无其他病毒生长，且调整毒价至2×106 TCID50/mL。
2.4 病毒液的灭活
用不同浓度的甲醛对病毒液进行灭活：向病毒液中加入甲醛溶液分别至终浓度（v/v）为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，将其置于37℃灭活，期间每隔4 h～6h振摇一次。灭活6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h和48 h时取样检测，观察是否灭活完全。三组平行试验结果均显示0.3%和0.4%甲醛溶液灭活病毒液24 h时均未检出活病毒，如表1所示。因此，病毒液的灭活方法选用终浓度为0.3%甲醛溶液37℃灭活24 h，期间每隔4 h～6 h振摇一次。灭活病毒液经检验无菌生长为合格，以该灭活病毒液作为制苗用抗原。
表1不同浓度甲醛灭活ECoV464693株时病毒活性的检测
Figure 951672DEST_PATH_IMAGE002
注：“＋”存在活病毒；“－”无活病毒。
2.5 免疫佐剂的筛选
2.5.1油苗的制备
取病毒液96份（所述份为重量份，下同）加入4份吐温混匀作为水相，取ISA206混合，121℃灭菌30 min后作为油相。按水相与油相1:1（体积比）进行乳化制备油乳剂灭活疫苗。成品疫苗中含病毒量106 TCID50/mL。将疫苗取样进行无菌检验，按现行《中华人民共和国兽药典》方法进行，无细菌、霉菌生长。
2.5.2 铝胶疫苗的制备
取20 g铝胶加入100 mL灭菌蒸馏水中，搅拌至完全溶解，121℃高压灭菌1 h配制成20%的铝胶，按体积比1:2加入灭活病毒液中，混匀后，2～8℃静置2天～3天，抽弃上清约浓缩成全量的三分之二，分装保存。成品疫苗中含病毒量106 TCID50/mL。将疫苗取样进行无菌检验，按现行《中华人民共和国兽药典》方法进行，无细菌、霉菌生长。
2.5.3安全检验
分别对5匹怀孕母马于产前5周、产前2周注射油苗、铝胶疫苗和PBS 5mL。注射后连续观察2周，结果免疫后绝大部分马的精神、体温、食欲均正常，但油苗组注射部位到试验结束仍稍有肿胀，疫苗吸收不良，铝胶苗组无肿胀和坏死，无其他不良反应。
2.5.4 效力检验
待母马生产后，取5日龄的幼驹5匹，分别按照104.0 TCID50的剂量进行攻毒，连续观察1周，记录体温变化和临床表现，剖检后观察病理变化。
油苗组：1匹幼驹攻毒后厌食，精神沉郁，体温升高（＞40.5℃），于攻毒后第2天出现腹泻症状，剖解后发现小肠变薄，另外4匹体温变化不大，食欲正常，剖检后无典型变化。该组疫苗的保护率为80%。
铝胶苗组：5匹幼驹体温、食欲均无异常，剖检后各器官均无异常变化。该组疫苗的保护率为100%。
对照组：5匹幼驹体温均升高（＞40.5℃），食欲明显减退，精神沉郁，被毛粗乱，伴有腹泻症状。3匹于试验过程中死亡，剖检后发现小肠壁变薄，呈半透明状。
综上所述，油苗和铝胶苗均能为幼驹提供保护，但铝胶苗的保护效果要强于油苗。
实施例3 ECoV464693株在制备马冠状病毒弱毒疫苗的应用
取ECoV464693株，在Vero细胞系传代培养，从20代（总代次48代）起进行蚀斑纯化，蚀斑纯化连续进行3次。以克隆毒22代（总代次70代）制备马冠状病毒弱毒疫苗。
2.1毒种选择
制苗毒种为ECoV464693株，经Vero细胞传代后，ECoV464693毒株 F70代对幼驹致病力丧失，但保留良好的免疫原性。最低免疫剂量应≥2.0×105 TCID50。
2.2生产用毒种的制备
2.2.1一级生产种子繁殖
取ECoV464693株，将其F68代病毒按照0.5mL/ 75cm2的比例接种Vero细胞，病毒感作1.5h更换病毒培养用培养基并置于37℃ 5%（体积百分数）CO2的环境中培养，待80%细胞出现明显病变后，收取培养液，并将培养液中病毒含量调整至106 TCID50/mL。经纯粹检验合格后，作为一级生产种子。
2.2.2 二级生产种子的繁殖
取一级生产种子按照5%的接种量接种于Vero细胞，于37℃ 5%CO2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液。经纯粹检验合格后，作为二级种子。
2.3 制苗病毒液的制备
将二级种子按照5%的接种量接种于Vero细胞，于37℃ 5%CO2（体积百分数）的环境中培养，待80%的细胞出现明显病变后（约48h）收取培养液并进行纯粹检验和病毒滴度测定。纯粹检验和病毒滴度测定均按照《中华人民共和国兽药典》附录进行。每批制苗用弱毒病毒液均纯粹，无杂病毒生长；将弱毒病毒液与与冻干保护剂混合后，且调整毒价至105TCID50/mL，分装、冻干，保存于-15~-20℃，即为马冠状病毒弱毒活疫苗。
2.5 ECoV弱毒疫苗安全、效力的检验
2.5.1安全检验
分别对5匹怀孕母马于产前5周、产前2周肌肉注射弱毒疫苗和PBS 5mL。注射 后连续观察2周，结果免疫后绝大部分马的精神、体温、食欲均正常，且疫苗注射部位无其他不良反应。取5日龄的ECoV抗原抗体双阴性的健康幼驹，经口服和肌肉注射ECoV弱毒疫苗5mL。免疫后连续观察2周，幼驹在精神、体温、食欲等方面均正常，无任何腹泻症状。
2.5.2 效力检验
待母马生产后，取5日龄的幼驹5匹，分别按照104 TCID50的剂量进行攻毒，连续观察1周，记录体温变化和临床表现，剖检后观察病理变化。
弱毒疫苗免疫组：5匹幼驹体温、食欲均无异常，剖检后各器官均无异常变化。该组疫苗的保护率为100%。
对照组：5匹幼驹体温均升高（＞40.5℃），食欲明显减退，精神沉郁，被毛粗乱，出现腹泻症状，3头于试验过程中死亡，剖检后发现小肠壁变薄，呈半透明状。
综上所述，弱毒疫苗免疫母马后产生的抗体可以经过乳汁传递给幼驹，使幼驹被动获得抵抗ECoV感染的能力。
序列表
<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一株马冠状病毒ECoV464693及其应用
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30953
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
aattgcgtcc gtgcatcccg cttcaccgat ctcttgttag atctctttta atctaaactt 60
tataaaaaca cccactccct gtaatctatg cttgcgagct tagacttttc atagtggtgt 120
ttgtattaat ttctattgtt aacaactctc agccagggac gtgttgtatc ctagtcagtg 180
gccctcccat aggtcacaat ggcgaagatc aacaaatacg gtctcgacct gcaatgggct 240
ccagaatttc cgtggatgtt tgaggacaca gaggagaagt tggataaccc tagtgggtca 300
gaggtgggta taatttgccc caccactgcg caagagttgg gaacaggtag aattgctttt 360
gagaatcatg tgatggttga ttgtcgccgc ctcattcagg agggttgtgt gcagtccaac 420
ctaatacgtg aaataaagat gaatacacgt cctgatgata tggaccgtgt tattcaagat 480
gccttactgt cccgtgaggc tgtgttgatt ccacccccgc ggcgtttgtc tattgagaca 540
tgctataagt ggggttgttg tccacaaggt tgggctatgg gactgtttag acgttgtagc 600
acctgttatg gtggttgcga cgtgaatagt catgtggcct accaattgtt tttaatagac 660
ccacaaggtt gctgcctagg tgctggcaac tttgtagggt gggtggtgcc tctagctaag 720
ttatcaaaag aggcacaagt taaaactgtg ccctggacca tgtggttgcg taaacgtgga 780
gaaaagggtg cttataataa ataccacaag cttgattttg atgatgaagt ttgtgatgtg 840
ctgttggaaa gagcctatga tagtgttctt gatgacccta aaggtaaatt ttctgcaaaa 900
gcatttgctc ttttaagaag ttatcgtggt gttaagccac tactttatgt agaccagtat 960
ggctgtgatt atactggtag tcttgcagtt ggtttagagg cttatgctga caagacactg 1020
caggaaatga agagtttatt tggtgcttgg agtcaggaac ttccttatga ggtagttgtg 1080
gcatggcatg ttgtgcgtga tacacgctac actatgaaat tacagagtgc tgctactata 1140
cgtagtatca catatgttgc caatcctact gaagatttgt gtgatggttc tgttgttata 1200
caagagccag tacatattta tgctgctgat tctattatcc ttcggctacc taagttagtt 1260
gacattatgg atcattttta tatggaagaa gatagggctc ttgacgctat ttatggtgtc 1320
aatttggaag aatgtggtct tgttatgcaa tttggttata ttgattgcaa gcaagattct 1380
tgcgatttta gaggttggct tcctggcaat atgatagatg gttttgtgtg cacaacttgt 1440
ggtcatgttt atgaaacagg tgaattatta gctcaatctt caggtgtttt accatcaaat 1500
cctgttttgc gcactaatag tgcagcaggt tatgctggtt ttggttgtaa agattctttt 1560
actttatttg accagactgt agtgtgtttt ggtggttgtg tttattggaa cccagtgcct 1620
aagatatgga ttccaatatt aaagtcatct gttaaggctt ttgatggttt ggtttataca 1680
ggatctgtag gaatcaagtc tgttgtaaaa gagactgctc ttatttgtaa ggccttgtat 1740
cttgattatg ttcaacataa gtgtggcaac ttggatcagc gtgagttgtt agggttgtca 1800
gatgtgtggc ataagcaatt gttattaaat agaggtgttt acaaaccttt gttagatcat 1860
attgattatt ttaatatgcg tcgtgctaaa tttagtttag aaacatttac tgtttgttca 1920
gatggcttta tgcctttttt agtagatgat ttaatacctc gttcatatta tttgattaaa 1980
agtggccagg ccttttttga aaggtttgat cagtttgttt ccaagagtaa agaattaatt 2040
gaagtgtctc ttgactcttt ggaggcagcg atgtgttatt taaattttaa aattgcagat 2100
ttggcacaac attttagtgc attaggcgca gtttttgtgt caaaaattat acattatttt 2160
aaaactttta ctactaatac tgctcgtgca tttgcatggg ttttatttca tgtgttgcat 2220
gggttttaca tggtagttga gagtagtata tattttgtta ggagcgttcc catttatgcc 2280
cgttctgtag tacaggcatt tcaggacgtt gttagagttg tattggaatc tttaagagtt 2340
acttttatta aaggcctttc tgtttttaag ataggacgta aaagaatttg tttttcaggt 2400
agcaatgtct atgaacttga gcgtggtttg ttagattcat cacacttacc atcgagtgtt 2460
tatgatttga ccatgcctag taaaattcag aaagccaacc agaagcctat ttatttaaaa 2520
ggcgtgggct ttgatttttc attaagtgat gatgtggttg aagttgttac agcttcaatt 2580
ataccatgtg gctattctaa accacctaaa atagtagaaa aaatctgtgt tgtggataat 2640
gtttatatgg ctaaggctgg tgataaatat tatcctgtag tggtagataa acaggctgga 2700
cttttggatc aggcatggag gattccttgt gcaggtaggc atgtttcttt taaagaggaa 2760
tctgcagtta aagaaatttc tacttcaaaa ttaattaagg tttgttatga acttgatgta 2820
gattttaatt ttatattaaa taccgcttgt ggcgtgtttg aggtagatac cactgtagat 2880
atggaggaat tttctgctgt tgttgctgat gcaatagagg ataaacttac tctatgtaag 2940
gagattgatg gtgtaggcgc taaagttagt gcctttttgc agaagttgga agataatgct 3000
cttcacttct ttgatgatgc tggtgattgc gtcctagctt ctaaattgta ttgcacattt 3060
tcagctcctg ttgatgaaga ttttggagag ccagaatttg aagaagatga tgttgatgtt 3120
gatgaaactg attttattgt tactagtgcc tcggatgagg tttgtgccaa tgaacaggag 3180
gaggcattag aagttttagt tcaggctgaa gagtctatgg aagaacttca cgtcaacata 3240
caagcatatg atgaagcaga tgttgtatct gcggattttg attatgtctt tgtgcatgat 3300
cacatagatg ttgttgatta tgataccttc tattgtgaca gtgtctttga gttctatgct 3360
acacagcagg aacctgcttt tgttaaggtt ctaggtgtgt atgtacctaa agcaacgcgc 3420
aataattgtt ggttgcggtc tgttttgaca gtttttcaga aactgccatg tgtttttaag 3480
gataaaaatt tgcagagttt gtggttgtcc tataaacaac attttgatca gttgtttata 3540
gacactatta tgcagaagat acctgcaaat atagttgtac cacagggtgg ttatgtggct 3600
gattttgctt attggttgtt tactttgtgt gaatggcaag cgacatctca ttggaggtgt 3660
cttaaatgtg atatggcact aaaccttcaa ggtttggatg ctatgttctt ttatggagac 3720
atagtgtctc atgtttgtaa ttgtggagaa cctatggttc ttcttaaagt taatgtgcca 3780
tttactgcgc attttgctat gaaagacaag cagttttgtg cttttacgac tcaacgtcgt 3840
atttttaagg ctgcttgtgt tattgataca aatgaccgtc attcaatggc tgtcattgat 3900
ggtaaacaag ttgatgacaa gcttgttact gatcttaaca gtgataagtt tgattttatt 3960
attgggcatg agatgacatt taatatgtcg tcatttgaaa ttgcccaatt gtatggtagc 4020
tgtataacat ctaatgtttg ttttgttaag ggtgatgtga taagaattgc tcagcttgta 4080
tatgctgatg ttgttgtaaa tccagccaac ggtcatatgg ctcatggtgg tggtgttgca 4140
aaagctatag ctaatgcagc tggtcaaagt tttgttaagg agactgccaa tatggttaaa 4200
tctaaaggag tttgcgctat tggtgattgt tatgtttcat caggtggcaa attatgtaaa 4260
acagtgctta atgttgtagg cccagatgct agatctcagg gtaagcaaag ttatgcattg 4320
ttggaaaaga catataagca ccttaacaag tacgattgta gtcttactac actcatttca 4380
gctggcatat ttagtgtgcc ttctgatgtg tctttgacat acttacttgg tgttgtagaa 4440
aaacaagtta ttcttgttag caataacaaa gaagattttg atataatttc taagtgtcag 4500
ataacggctg tagagggcac tagaaaattt gcagagcgcc tttctattaa tgtagggcgc 4560
catgttaaat atgaaacaga tgctaataaa ttgcttctta gcagtgacgt agtatttgtt 4620
tctactttta atgtgttgca ggatgttaca tcactgcggc acgatattag acttgatgat 4680
gattcgcgtg tttttgtgca gtcaaatatg gagaatttgc ctgcagattg gcgcatagtt 4740
aataaatttg atcagattaa tggtgttaga accattaagt attttgaatg tcctggtggt 4800
atagatgttt gcagccaggg taaagagttt ggttatgtac agcaaggttc tttttataag 4860
gccactgtta gccaaattaa ggctttgttt gttgataaaa tagatgtttt gcttactgtt 4920
gatggtgtta atttcaccac tcgatatgtg ccgtgtggtg aagtttttgg caaaacatta 4980
ggtaatgtat tttgtgatgc tattaatgtt actaaatgca aagccgaaca gaaatataaa 5040
ggaaaggtgt tctttcagtt tgacaacctg tctaatgcag atttgaaagc tgttaagagt 5100
tcttttaatt ttgaccagaa agaattgttg gcttattaca atgtccttgt gaattgtgat 5160
aagtggcaaa ttgttgttaa tggtaaatat tttactttta agcaggcaaa taataattgc 5220
tttgttaatg ttgcatgtct tatgcttcag aatgttaatc tgaagtttgt aagcgtgcaa 5280
tggcaggagg catggctcga atttagagct ggtaaaccct ttcggtttgt agcacttgtc 5340
tatgctaaag gtgcctttaa atttggagag cctgctgatt ccagagattt tattcgtgtg 5400
gttcttagcc aaactgattt ggctgatgcc gcatgtgatt atgagattgt ttgtaaatgt 5460
ggtgttaagc aggagcagcg taaaggtatt gacgctgtta tgcattttgg aacattgagt 5520
cgtgaagatc ttgaaaatgg ctacacaatt gagtgcagtt gtggtgataa gctaattcat 5580
tgtacgcgaa ttaaggttcc atttttaatt tgcagcaaca caccaaaaga caatgttttg 5640
cctaagggtg tgatatgtgc aaatgtcttt actggtgata atgtgggtca ttatactcat 5700
ttgagatgtg attcaagtta tcaacttttt gatgcttcta aggttaaaaa gattactaca 5760
gtcagtggta aaatcactga ctgtttgtat cttaaagatt tgaagcaaac atttaagtct 5820
gttttgacga cctattattt ggatgatgtt atgaaggttg agtataagcc tgatcttaca 5880
cagtattact gtgaaggagg caagtattac actcagagaa ttataaaggc tcagtttaga 5940
acttttgaga aagttgatgg tgcctatatc aattttaaat tggtaggaca caccatctgt 6000
gatagtctca atgctaaatt gggttttgat agctctaagg attttgttga atataacgtg 6060
actgagtggc caacagctac aggtgatgtg gtgttggcta atgacgattt gtatgttagg 6120
aggtatgaaa gagggtgtat tacttttggt aagcctgtta tttggtataa tcatgagcaa 6180
gcatccctta attctcttac atattttaat cgacctagtt tggttgatgt taataagttt 6240
gatgttttga aatttgatga tgctgttgca gaagttgaat cctgcagcgc taatttgagc 6300
caagggagta catgtattgg tgcgagtaca gacaattctt acctgagcct acaaggtagt 6360
cagggtaatg tcgaagcttg tgctgctgct ttaactccag gcaaccaaga gagttatgca 6420
gctaatggtt tagccattag caataatatt gttaaattaa atggtgttaa aaagcctttt 6480
aaggttgaaa atagtattgt tattaatgac aatactagcg ataccaaatt tgttaagagt 6540
ttgtctattg tggatgttta tgatatgtgg ctgactggtt gtcggtatgt tgttaaggct 6600
gctaatgctt taagcgttgc ggttaacgta ccaacaatta agaggtttat aaaatttggt 6660
atgactgttg ttagtatacc aatagatttg ttaaatttaa gagatattaa gcccgttgat 6720
gtagttaaag tggtgcgtaa aacttttgcc tgctttaatt ttattagatg gctttttgtc 6780
ttattattcg gctggattaa aatatctgct gataataaag taatatacat cacagaaatt 6840
gcatcaaagc ttacttataa gcttgttgct ttagctttta aaaatgcatt tttgacattt 6900
aagtggagtg tggttgctag aggtgcttgc attatagcga ctatattttt actgtggttt 6960
aattttatat atgccaatgt aatttttagt gatttttatt tgcctaatat tggtttcttg 7020
ccgacttttg ttggtaagat cgcacagtgg attaagaaca cttttagtct tgtaactatt 7080
tgtgatctat attccattca ggatgtgggc tttaagaatc agtattgtaa tggaagtatc 7140
gtatgtcagt tctgcttggc aggatttgat atgttagata attataaagc cattgatgta 7200
gtacagtatg aagctgatag gagagcattt gttgattata caggtgtgtt aaagcttgtc 7260
attgaattga tagttagtta cgccctgtat acggcatggt tttatccatt gtttgctctt 7320
atcagtattc agatcttgac aacttggctg cctgagcttt ttatgcttag tacgttacat 7380
tggagtttta ggttgctggt gtctttagct aatatgttac cagcacatgt gtttatgagg 7440
ttttatatta ttattgcctc ttttattaag ctgtttagct tgtttaggca tgttgcctac 7500
ggttgtagta aatctggttg tttgttttgt tacaagagga atcgtagtct acgtgttaaa 7560
tgtagtacga tcgtcggtgg catgatacgc tattacgatg ttatggctaa tggtggcact 7620
ggcttttgtt caaaacatca atggaattgc atagattgtg attcttataa accaggtaat 7680
acttttatta ctgttgaggc cgctcttgat ctatctaagg aattgaaacg gcctattcag 7740
cctacagacg ttgcttatca tactgtgacg gatgttaagc aagttggttg ttttatgcga 7800
ctgttctatg accgtgatgg acagcgcatg tatgatgatg ttaatgctag tttgtttgtg 7860
gattatagta atttgctaca ttctaaggtt aagagtgtgc cgaatatgca cgtagttgtg 7920
gttgaaaatg aagctgataa agctaatttt ttgaatgctg ctgtgtttta tgcacagtct 7980
ttgtttagac ctattttaat ggtagataaa aatttgataa ctactgctac tactggtacg 8040
tctgttacag aaactatgtt tgatgtttat gtggatacat ttttgtctat gtttgatgtg 8100
gacaaaaaga gtcttaatgc tttaatagca actgcgcatt cttctataaa acagggtacg 8160
cagatttgta aagttttgga taccttttta agctgtgctc gtaaaagttg ttctattgat 8220
tcagatgttg atactaagtg tttagctgat tctgtcatgt ctgctgtatc ggcaggcctt 8280
gaattgacgg atgaaagttg caataacttg gtgccaacat atttgaaggg tgataacatt 8340
gtggcagctg atttaggtgt tctgattcaa aattctgcta agcatgtgca gggtaatgtt 8400
gctaaaatag ccggtgtttc ctgtatatgg tctgtggatg cttttaatca gcttagttct 8460
gatttccagc ataaattgaa gaaagcatgt tgtaaaactg gtttgaaact gaagcttact 8520
tataataagc agatggctaa tgtctctgtt ttaactacac cctttagtct taaagggggt 8580
gcagttttta gttattttgt ttatgtatgt tttgtgttga gtttggtttg ttttattgga 8640
ttgtggtgct taatgcccac ttacacagta cacaaatcag attttcagct tcccgtttat 8700
gccagttata aagttttaga taatggtgtt attagagatg ttagtgttga agatgtttgt 8760
ttcgctaaca aatttgaaca atttgatcaa tggtatgagt ctacattcgg tctaagttat 8820
tatagtaaca gtatggcttg tcccattgtt gttgctgtag tagaccagga ttttggctct 8880
actgtgttta atgtccctac caaagtgtta cgatatggtt accatgtgtt gcactttatt 8940
acacatgcac tttctgctga tggagtgcag tgttatacgc cacatagtca aatatcgtat 9000
tctaattttt atgctagtgg ctgtgtgctt tcctctgctt gtactatgtt tgcaatggct 9060
gatggtagtc cacaacctta ttgttataca gaggggctta tgcagaacgc ttctctgtat 9120
agttcattgg tacctcatgt gcggtataat cttgctaatg ctaaaggttt tatccgtttt 9180
ccagaagtgc tgcaagaagg acttgtgcgt attgttcgta cgcgttctat gtcgtattgc 9240
agagttggtt tatgtgagga agccgatgag ggtatatgtt ttaattttaa tggttcttgg 9300
gttcttaata atgaatatta tagatcattg ccagggacat tttgtggtag agatgttttt 9360
gatttaatgt accagctttt taagggttta gcacagcctg tagactttct ggcattgact 9420
gttagttcta ttgctggtgc tatacttgct gtaattgttg tgttggtgtt ttattactta 9480
ataaagctta aacgtgcttt tggtgattac accagtattg tttttgttaa tgtgattgtg 9540
tggtgtgtaa attttatgat gcttttcgtg tttcaagttt atcctacact ttcttgtgta 9600
tatgcgattt gttattttta tgccacgctt tatttccctt cggagataag tgtgataatg 9660
catttacaat ggctagttat gtatggcact attatgcctt tatggttttg tttgctatat 9720
atatctgttg ttgtttcaaa tcatgctttc tgggtatttt cttactgcag acggattggt 9780
acttctgttc gtagtgatgg tacatttgaa gaaatggctc ttactacttt tatgattaca 9840
aaagattctt attgtaagct taagaattct ttgtctgatg ttgcttttaa tagatatttg 9900
agtttgtata ataaatatag gtattacagc ggtaaaatgg atactgctgc atatagggag 9960
gctgcttgtt ctcagttggc taaagcaatg gatacattta ccaataataa tggtagtgat 10020
gtgctttacc aaccacctac tgcttccctt tcaacttcat tcttgcaatc tggtattgtg 10080
aaaatggtta atcctacttc taaggtagaa ccatgtattg tcagtgttac ctatggtaat 10140
atgacattga atggtttatg gttggatgat aaggtctact gtcccagaca tgtgatatgt 10200
tctgcttcag atatgactaa tccagattat acaaatttgt tgtgtagagt aacatcaagt 10260
gattttactg tattgtttga tcgtttgagc cttacagtga tgtcttatca aatgcagggt 10320
tgtatgcttg ttcttacagt gaccctgcaa aattctcgta cgccaaaata tacatttggt 10380
gtggttaaac ctggtgagac ttttactgtt ttagctgctt ataacggcaa accacaagga 10440
gcctttcatg tgactatgcg tagtagttat accattaagg gttccttttt atgcggatct 10500
tgtggatctg ttggttatgt gctaatgggt gattgtgtta aatttgtgta tatgcatcaa 10560
ttggagctta gtactggttg tcatactggt actgatttca atggggattt ttatggtcct 10620
tataaggatg ctcaggttgt ccaattgccc gttcaggatt atatacaatc tgttaatttt 10680
gtagcatggc tttatgctgc tatacttaat aattgtaatt ggtttgtaca aagtgataag 10740
tgttctgttg aagattttaa tgtgtgggct ttgtctaatg ggtttagcca agttaagtct 10800
gatcttgtta tagatgcttt agcttctatg actggtgtgt ctttggaaac actattggct 10860
gctattaagc gtctcaagaa tggttttcaa ggacgtcaga ttatgggtag ttgctccttt 10920
gaggatgaat tgacacctag cgatgtttat caacaactcg ctggtatcaa gttacaatca 10980
aagcgtatta gattggttaa aggcattgtt tgttggatta tggcttctac atttttgttt 11040
agttgtataa ttacagcatt tgtgaaatgg actatgttta tgtatgtaac tactaatatg 11100
cttagtatta ctttttgtgc actttgtgtt ataagtttgg ctatgttgtt ggttaaacat 11160
aagcatcttt atttgactat gtatataatt cctgtgcttt ttacactgct gtataacaac 11220
tatttggttg tgtacaagca gacatttaga ggctatgttt atgcatggct atcatattat 11280
gttccatcag ttgagtatac ttatactgat gaagttattt atggcgtgtt attgcttata 11340
ggaatggttt ttgttacatt acgtagcatt aaccatgatt tgttttcttt tataatgttt 11400
ggtggtcgtg tgatttctgt tgtttctttg tggtacatgg gttctaactt agaggaagaa 11460
attcttctta tgttggcttc tctttttggt acttatacat ggacaacagc tttatctatg 11520
gctgcagcaa aggttattgc taagtgggtt gctgtgaatg ttttgtattt cacagacata 11580
cctcaaatta agatagtgct tatatgctat ttgtttatag gttatattat tagctgttat 11640
tggggtttgt tttccttgat gaacagtttg tttagaatgc ctttgggtgt ttataattat 11700
aaaatttcag tacaggagtt aagatatatg aatgctaatg gattgcgccc tcctaagaat 11760
agttttgaag cccttatgct taattttaag cttttgggta ttggaggtgt gccaattatt 11820
gaagtatctc aatttcaatc aaaattgact gatgttaaat gtgctaatgt tgtcttgctt 11880
aattgcttgc aacatttgca tgttgcttct aattctaagt tgtggcagta ttgtagcact 11940
ttgcacaatg aaatactagc cacttctgat ctgggtgttg cttttgaaaa gcttgctcag 12000
ttgttaattg ttttgtttgc taatccagct gctgtggata gcaagtgcct gattagtatt 12060
gaagaagttt gcgacgatta cgcaaaggac aatactgttt tgcaggcttt acagagtgaa 12120
tttgttaata tggctagctt cgttgaatat gaagttgcta agaaaaatct tgatgaggcg 12180
cgttctagtg gttctgctaa tcaacagcag ttaaaacagc tagagaaagc ctgtaatatt 12240
gctaaatctg cttatgaacg cgaccgtgct gtagcaagaa agttggagcg tatggcagat 12300
ttggctctca ctaatatgta taaagaagct agaattaatg ataagaagag taaggttgtt 12360
tctgccttgc aaactatgct ttttagtatg gtgcgtaagt tagataatca agctctgaat 12420
tcaatattag ataatgctgt gaagggttgt gtaccattga acgcaatccc ttcattggct 12480
gcaaatactc tgactataat tgtaccagat aaaagtgttt acgatcaggt agttgacaat 12540
gtctatgtta cctatgcggg taatgtatgg cagattcaaa ctatccaaga ttcagatggt 12600
acaaataagc agttgaatga gatatctgat gattgtaact ggccactagt tattattgca 12660
aatcggcata atgaggtatc tgctaccgtt ttgcaaaata atgaattaat gcctgctaag 12720
ttgaaaactc aggttgttaa tagtggtcca gatcagattt gtaatacacc tactcaatgt 12780
tactataaca atagtaacaa tgggaagatt gtttatgcta tacttagtga tgttgatggt 12840
cttaagtata caaaaattct tagagatgat ggcaattttg ttgttttgga gttagaccct 12900
ccttgtaaat ttactgttca agatgttaaa ggtcttaaaa ttaagtacct ttattttgta 12960
aaaggttgta acacactagc aagaggctgg gttgttggta caatttcttc tacagttaga 13020
ttgcaagctg gaactgctac tgagtatgct tccaactcat ctatattatc tttatgtgcg 13080
ttttctgtag atcctaagaa aacgtattta gattttatac agcagggagg aacacctatt 13140
gccaattgtg ttaaaatgtt gtgtgaccat gctggtaccg gtatggccat tactgttaaa 13200
cccgatgcta ccactaatca ggattcatat ggtggtgcgt ctgtttgtat atattgccgc 13260
gcacgagttg aacacccaga tgttgatggg ttgtgcaaat tacgcggcaa gtttgtacaa 13320
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ggatgtttac tggtagtggt tattactacc ctgaacctat aactgaaaat aatgttgttg 27360
ttatgagtac ctgtgctgtt aattatacta aagcaccgga tgtaatgttg aacatttcta 27420
tacccaacct tcctgatttt aaggaagagt tggaccaatg gtttaaaaat caaacttcag 27480
tggcaccaga tttgtcactc gattatataa atgttacatt cttgaaccta caagatgaaa 27540
tgaataggtt acaggagtca ataaaagttt taaatcagag ctacatcaat ctcaaggaca 27600
ttggtacata tgaatattac gtaaagtggc cttggtatgt atggctttta attggccttg 27660
ttggtgtagc tatgcttgtt ttactatttt ttatttgttg ttgtacagga tgtgggacta 27720
gctgttttaa gaaatgtggt ggttgttgtg atgattatac tggacatcaa gagctagtta 27780
ttaaaacttc acatgacgat taatttcgtc atttaataaa ttattttata agacctgcct 27840
ttgtgggtta aatttgctac aaccatttat ggttgtacta agattagtac agctttacaa 27900
tggcttatat gcatttttat atggtttgac accaccacca tcgggttaaa ccggtttatg 27960
gtgctagtgc caaattatat tttgttatac tctataactt taagcatttg ctaaagttct 28020
taaagccaac ccttattaat ggacatctgg agacctgaga ggaaatttct tcgttttact 28080
aacggattta aagtcccaga attagaagat gtctgtttta aatttaatta ccaatttcct 28140
aaagtaggat attgtagagt tcctaattat gcttggtgtc gtaatcaagg tagcttttgt 28200
gctacattta ccctttacgg caaatccaaa cattattata aatattttag aataataact 28260
ggtttcacag cgttcgccaa tactatagag gaggctgtta ataaactggt tttagaggct 28320
gttgatttta ttatctggcg tagccagaat ttaaatgctt atggctgatt tttatcttgc 28380
agacactgtg tggtatgtgg ggcaaatgat ttttatagtt gccatttgtt tactggttat 28440
aatagttgta gtggcatttt tggcaacttt taaattgtgt attcaacttt gcggtatgtg 28500
taatacctta gtactgtccc cttctattta tgtgtttaat agaggtaggc agttttatga 28560
gttatacaat caagtaaaac caccagtcct taatgtggat gacgtttagt taatccaaac 28620
attatgagta gtacacttac accagcacca ggttacacct ggactgctga tgaagctatt 28680
aaattcctaa aggaatggaa tttttctttg ggcattatac tactttttat tacagtcata 28740
ttgcaatttg gttatacaag tcgcagtatg tttgtttatg ttgttaagat gattattttg 28800
tggcttatgt ggccccttac tatcatctta actattttca actgcgtata cgcgttgaat 28860
aacatctacc ttggcttttc tatagttttc actatagtgg ccattattat gtggattttg 28920
tattttgtga atagtatcag gttatttatt agaactggta gttggtggag tttcaaccca 28980
gaaacaaaca acctgatgtg tgtagatatg aagggtaaga tgtatgttag gcctataatt 29040
gaggaccacc atactcttac cgccacaata atacgtggcc acctgtattt tcaaggtgta 29100
aaattaggaa tcggctattc tttgtcagat ttgccagttt atgttactgt agctaaggtg 29160
tcacaccttt gcacatataa gcgtggtttt cttgacaaga taggcgataa tagtggcttt 29220
gctgtttatg ttaagtccaa agtcggtaat tatcgactgc cttcaactca aaaaggttca 29280
ggcatggaca ccgcattgtt gaaaaatcaa atctaaactt taaggatgtc tttcactcct 29340
ggcaagcagt ccagtagtag agcatcctct ggaaatcgtg ctggtaatgg aatccttaaa 29400
tgggccgacc agtccgacca gtctacaaat tttcaaacca gaggtagaag agctcaaccc 29460
aagcaaactg ctacttctca accagcagga gggaatgttg ttccctacta ctcttggttc 29520
tctggaatta ctcagtttca aaagggaaag gagtttcaat ttgccgacgg acaaggtgtg 29580
cctattgcac caggaatccc agctactgaa gctaaggggt attggtatag acacaaccga 29640
cgttctttta aaacagccga tggcaatcaa cgccaattgt tgccacgctg gtatttttac 29700
tacttgggaa caggcccgca tgctaaagcc cagtatggca ccgacattga tggagtcttc 29760
tgggtcgcta acaagcaggc tgatgttaat acctcagctg acattgtcga tcgggaccca 29820
agcagtgatg aggctattcc gactaggttt ccgcctggta cggtactccc tcaaggttac 29880
tatattgaag gctcgggaag gtctctttct aattccagat ctacttcccg cgcatccagt 29940
agagcctcta gtgcaggatc aagaagtaga gccaattccg gcactagaac acctacctct 30000
ggtgtgacac ctgatatggc tgatcagatt gctagtcttg tgctggctaa gcttggtaag 30060
gatgccacaa agccgcagca agttactaag cagactgcca aagaagtcag gcagaaaatt 30120
ttgaataagc ctcgccaaaa gaggagccca aacaaacaat gcactgttca gcagtgtttt 30180
ggaaaaaggg gtcctaatca aaattttggc ggagcagaaa tgttaaaact tggaactagt 30240
gatccacagt tccccattct tgcagagctt gcacctacag caggtgcatt tttctttgga 30300
tcaagactag agttggccaa agtacagaat ttgtctggga gttttgatga gccccagaag 30360
gatgtttatg aattgcgcta taatggcgcg attagatttg acagcacact tccaggtttt 30420
gaaactataa tgaaggtgct gaacgagaat ttgaatgcct atcaacaaca ggatgatggg 30480
acgaatatga gcccaaaacc acagcgacag cgtggtcaaa agaagggtgg agataatgaa 30540
gatgtaagcg ttgcagcgcc taagagtcgc gtgcagcaaa ataagagtag agagttgact 30600
gcagaggata tcagccttct taagaagatg gatgagccct ccacagagga taactctgaa 30660
atgtaagaga atgaacctta tgtcggcacc tggtggtaac ccctcgcagg aaagtcggga 30720
taaggcactc tctatcagaa tggatgtctt gctgttataa tagatagaga aggttatagc 30780
agactataga ttaattagtt gaaagttttg tgtggtaatg tatagtgttg gagaatgtga 30840
aagacttgcg gaagtaattg ccgacaagtg ccataaggga agagccagca tgttaagtta 30900
ccatgcagta attagtaaat gaatgaagtt aatcatggcc aattggaaga atc 30953
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
ggaccgtgtt attcaagatg c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
cacatcgctg cctccaaag 19
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
catttactgt ttgttcagat ggctt 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
tgagatgtcg cttgccattc 20
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 6
tgtacctaaa gcaacgcgca 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 7
acggcacata tcgagtggt 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 8
cctgcagatt ggcgcatagt 20
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 9
gcgctgcagg attcaacttc 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 10
tgttaggagg tatgaaagag ggt 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 11
ctgtaggctg aataggccgt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 12
gtagtacgat cgtcggtggc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 13
cgttctgcat aagcccctct 20
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 14
tgctgatgga gtgcagtgtt a 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 15
ccaacagatc cacaagatcc g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 16
gcctttcatg tgactatgcg t 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 17
tgcgtaatcg tcgcaaactt 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 18
gttgtggcag tattgtagca ct 22
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 19
cgagacgggc atctacactc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 20
gtgcaaatta cgcggcaagt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 21
tgccggtata cacccaccat 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 22
ccatggtgga cattaagcag tt 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 23
atcctggtgc gttacacaca t 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 24
gagtgttgga gcttgcgttg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 25
gcgctgaatc tacggtttgg 20
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 26
ggcgttacaa cacatgagag tt 22
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 27
ggctgcccta gaaaagggat t 21
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 28
ggtttgtgta tgttttggaa ctgc 24
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 29
gcaaagtaac tggcttcccg 20
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 30
tcagttcatg ctttggtgta acg 23
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 31
gcttgctcca tgcatcatca tc 22
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 32
ggtgctgaaa aggttgatgg t 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 33
acagcaaaag cggtaggtag a 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 34
gtgtatgacc ccttacccat t 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 35
tacctacaca ggttgcacca 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 36
ctggaacagg cggtatggtt 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 37
gcagatgttg cagccaaagt 20
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 38
agtaaggttg tctgatgttg gct 23
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 39
tcctctcagg tctccagatg t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 40
taagacctgc ctttgtgggt t 21
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 41
ctggtcggcc catttaagga 20
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 42
ggcgataata gtggctttgc tg 22
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 43
tcccttatgg cacttgtcgg 20

Claims (4)

1. 一种马冠状病毒ECoV464693株，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的马冠状病毒ECoV464693株在制备灭活疫苗和弱毒疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
（1）取病毒株接种于Vero细胞，扩繁病毒，收集病毒液，经甲醛灭活后，得灭活病毒液；灭活疫苗中病毒含量≥106 TCID50/mL；
（2）将步骤（1）灭活病毒液与氢氧化铝佐剂混合配置成灭活铝胶疫苗；或者，以灭活病毒液为水相，以206佐剂为油相，制备成油乳剂灭活疫苗；灭活疫苗中病毒含量≥106TCID50/mL。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤为：取病毒株接种于Vero细胞，培养，从20代起进行蚀斑纯化，蚀斑纯化连续进行3次；以克隆毒22代为弱毒病毒液，将弱毒病毒液与冻干保护剂混合后，即为马冠状病毒弱毒活疫苗；弱毒疫苗中病毒含量≥105 TCID50/mL。
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