CN114774372A

CN114774372A - 柯萨奇病毒a10型毒株及其疫苗和应用

Info

Publication number: CN114774372A
Application number: CN202210709091.0A
Authority: CN
Inventors: 肖霞; 张德宝; 顾美荣; 李国顺; 陈磊; 郭林; 简伟; 肖海峰; 徐颖之; 张改梅; 刘建凯
Original assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-06-22
Also published as: WO2023246621A1; CN114774372B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及柯萨奇病毒A10型毒株及其疫苗和应用。本发明的柯萨奇病毒A10型毒株的VP4、VP3、VP2、VP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示。该毒株为采用Vero细胞分离得到，对Vero细胞易感，能够获得较高的滴度，具有免疫原性好、交叉中和能力强、遗传稳定等优势，可用于制备预防或治疗柯萨奇病毒A10型感染或柯萨奇病毒A10型感染引起疾病的疫苗或药物。

Description

柯萨奇病毒A10型毒株及其疫苗和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及柯萨奇病毒A10型毒株及其疫苗和应用。

背景技术

手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）是由多种肠道病毒引起的一种婴幼儿常见传染病，典型表现为手、足、口腔等部位有皮疹、疱疹、溃疡等，可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症会导致残疾或死亡。

手足口病的主要致病血清型包括柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）A组4～7、9、10、16型和B组1～3、5型，埃可病毒（Echovirus）的部分血清型和肠道病毒71型（Enterovirus A71，EV-A71）。目前， CV-A16、EV-A71、CV-A6、CV-A10是引起手足口病的主要病原体之一，而肠道病毒各型之间无交叉免疫力。柯萨奇病毒A10型（CV-A10）感染具有在重症病例中所占比例较高、低月龄婴儿人群更易感等特征（Bracho, Maria Alma, FernandoGonzález-Candelas, Ana Gámez Valero, J Fernandez de Cordoba and AntonioSalazar. “Enterovirus Co-infections and Onychomadesis after Hand, Foot, andMouth Disease, Spain, 2008.” Emerging Infectious Diseases 17 (2011): 2223 -2231.）。目前临床治疗，尚无针对CV-A10的抗病毒药物，因此研制CV-A10 疫苗仍是防治CV-A10感染最有效的方法。Katsumi Mizuta等用CV-A10毒株感染不同细胞系发现其不能在Vero细胞中生长（Mizuta, Katsumi et al. “Longitudinal epidemiology of viralinfectious diseases combining virus isolation, antigenic analysis andphylogenetic analysis as well as seroepidemiology in Yamagata, Japan between1999 and 2018.” Japanese journal of infectious diseases (2019): n. pag.）；卞莲莲等的研究也表明CV-A10的分离率低（卞莲莲,刘思远,姜崴,毛群颖,高帆,杨晓明,梁争论.多价手足口病疫苗：现实与梦想[J].中国生物制品学杂志,2020,33(01):106-112.DOI:10.13200/j.cnki.cjb. 002971）。专利申请CN106661102A公开了CV-A10病毒株M2014，该病毒株仅能感染HEK293细胞，而不能感染其他用于疫苗生产的细胞株（如Vero细胞）。专利申请CN107739731A公开的CV-A10则是由RD细胞（人横纹肌瘤细胞）中分离得到，经过驯化筛选后才可感染用于疫苗生产的细胞株，而按照规定疫苗生产用毒株需采用非肿瘤源细胞。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种柯萨奇病毒A10型毒株。

本发明的第二目的是提供与上述柯萨奇病毒A10型毒株相关的生物材料。

本发明的第三目的是提供含有上述柯萨奇病毒A10型毒株或其相关生物材料的免疫原性组合物以及疫苗、药物等产品。

本发明的第四目的是提供上述毒株、生物材料、免疫组合物的用途。

具体地，本发明提供以下技术方案：

首先，本发明提供一种柯萨奇病毒A10型毒株，所述毒株的VP4、VP3、VP2、VP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示，和/或，所述毒株的2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示。

具体地，以上所述的柯萨奇病毒A10型毒株的P1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示。

本发明提供的柯萨奇病毒A10型毒株的基因组编码氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1、2、3、4所示的VP4、VP3、VP2、VP1蛋白以及氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示的2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D蛋白。

本发明提供氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示的VP4、VP3、VP2、VP1蛋白以及氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示的2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D蛋白组成的融合蛋白及其编码基因。

优选地，所述柯萨奇病毒A10型毒株的P1蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明提供一种柯萨奇病毒A10型毒株，其基因组序列如SEQ ID NO.12所示或如SEQ ID NO.12所示序列的完全互补序列所示。

本发明提供柯萨奇病毒A10型毒株V05790834，该毒株已于2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A10型，保藏编号为CGMCC No.20388。

上述保藏编号为CGMCC No.20388的柯萨奇病毒A10型毒株的基因组编码氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示的VP4、VP3、VP2、VP1蛋白以及氨基酸序列分别如SEQ IDNO.5、6、7、8、9、10和11所示的2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D蛋白。

上述保藏编号为CGMCC No.20388的柯萨奇病毒A10型毒株的基因组序列如SEQ IDNO.12所示。

上述如SEQ ID NO.12所示的基因组序列中包含1个ORF框，编码2193个氨基酸，包括P1（VP4+VP3+VP2+VP1）、P2（2A+2B+2C）、P3（3A+3B+3C+3D）。

上述如SEQ ID NO.12所示的基因组序列中，第1至746位为5'UTR，第747至953位为VP4基因，第954至1718位为VP2基因，第1719至2438位为VP3基因，第2439至3332位为VP1基因，第3333至3782位为2A基因，第3783至4079位为2B基因，第4080至5066位为2C基因，第5067至5324位为3A基因，第5325至5390位为3B基因，第5391至5939位为3C基因，第5940至7328位为3D 基因（含终止密码子），第7329至7406位为3'UTR。

本发明提供的上述柯萨奇病毒A10型毒株是非洲绿猴肾传代细胞（Vero）适应株，具有Vero细胞易感、滴度高、免疫原性好、交叉中和能力强、遗传稳定等优势。

进一步地，本发明提供与所述柯萨奇病毒A10型毒株相关的生物材料，其为以下（1）-（8）中的任意一种：

（1）序列如SEQ ID NO.4所示的VP1蛋白；

（2）序列如SEQ ID NO.13所示的P1蛋白；

（3）序列如SEQ ID NO.14所示的核酸分子；

（4）序列如SEQIDNO.12所示或如SEQIDNO.12所示序列的完全互补序列所示的核酸分子；

（5）含有（3）或（4）中所述核酸分子的表达盒；

（6）含有（3）或（4）中所述核酸分子的重组载体；

（7）表达（1）或（2）中所述蛋白或含有（3）或（4）中所述核酸分子的重组微生物；

（8）表达（1）或（2）中所述蛋白或含有（3）或（4）中所述核酸分子的细胞系。

以上（3）、（4）中所述的核酸分子可为DNA分子或RNA分子。

以上（5）中所述的表达盒为在所述核酸分子的上游和/或下游连接用于转录、翻译的调控元件得到的重组核酸分子。

以上（6）中所述的重组载体为携带所述核酸分子且能够在宿主细胞中复制或整合的质粒载体、病毒载体、噬菌体载体或转座子。

以上（7）中所述的微生物可为细菌或病毒。

以上（8）中所述的细胞系为动物细胞系。所述动物细胞系为不可繁殖为动物个体的动物细胞系，可为用于病毒培养的常用动物细胞系，包括但不限于非洲绿猴肾传代细胞（Vero）、RD细胞等。

本发明提供所述柯萨奇病毒A10型毒株的病毒样颗粒（VLPs），其含有选自VP4、VP3、VP2、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D蛋白中的任意一种或多种；其中，VP4、VP3、VP2、VP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示；2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示。

以上所述的病毒样颗粒可采用昆虫载体系统表达上述蛋白的编码基因。

本发明提供含有以上所述的柯萨奇病毒A10型毒株的免疫原性组合物。

本发明还提供含有以上所述的生物材料的免疫原性组合物。

本发明还提供含有以上所述的病毒样颗粒的免疫原性组合物。

所述免疫原性组合物中除含有所述柯萨奇病毒A10型毒株、生物材料或病毒样颗粒外，还可含有有利于柯萨奇病毒A10型毒株发挥免疫原性的佐剂。所述佐剂包括但不限于铝佐剂。

所述免疫原性组合物中的柯萨奇病毒A10型毒株被灭活。

进一步地，本发明提供所述柯萨奇病毒A10型毒株或所述生物材料或所述病毒样颗粒或所述免疫原性组合物的以下（1）-（9）中任意一种应用：

（1）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的药物中的应用；

（2）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的疫苗中的应用；

（3）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的抗体中的应用；

（4）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的抗血清中的应用；

（5）在制备检测柯萨奇病毒的试剂或试剂盒中的应用；

（6）在非诊断和治疗目的的柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

（7）在非诊断和治疗目的的柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；

（8）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

（9）在预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的药物筛选或药效评价中的应用。

以上（1）-（9）中，所述柯萨奇病毒优选为柯萨奇病毒A10型毒株。

以上（1）-（4）和（9）中，所述柯萨奇病毒感染引起疾病优选为手足口病。

以上（8）中，所述的动物模型优选为鼠模型。

本发明提供一种产品，其含有以下（1）-（5）中的任意一种或多种的组合：

（1）所述柯萨奇病毒A10型毒株；

（2）所述生物材料；

（3）所述病毒样颗粒；

（4）所述免疫原性组合物；

（5）以所述柯萨奇病毒A10型毒株或所述生物材料或所述病毒样颗粒或所述免疫原性组合物为免疫原免疫动物制备得到的抗体或抗血清。

以上所述的产品优选为用于诊断、预防或治疗柯萨奇病毒A10型感染的产品，或者为用于柯萨奇病毒A10型疫苗免疫原性或保护性评价的产品，或者为用于柯萨奇病毒A10型感染动物模型构建的产品。

其中，用于预防或治疗柯萨奇病毒A10型感染的产品可为疫苗或药物。

本发明还提供一种抗体或抗血清的制备方法，其包括：以所述柯萨奇病毒A10型毒株、所述生物材料或所述病毒样颗粒或所述免疫原性组合物为免疫原免疫动物，得到抗柯萨奇病毒A10型的抗体或抗血清。

本发明提供一种疫苗，其含有所述柯萨奇病毒A10型毒株或所述生物材料。

本发明所述的疫苗可为全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、基因工程疫苗（亚单位疫苗、活载体疫苗、基因重组疫苗等）。

优选地，所述疫苗为全病毒灭活疫苗，其中所述柯萨奇病毒A10型毒株被灭活。

所述疫苗还可含有佐剂，所述佐剂包括但不限于铝佐剂。

优选地，以上所述的疫苗中，所述柯萨奇病毒A10型毒株的含量为按蛋白浓度计0.2μg~2.0μg/ml，氢氧化铝的含量为0.3~1.5mg/ml。

用于灭活所述柯萨奇病毒A10型毒株的灭活剂可以为甲醛、β-丙内酯等。

本发明还提供以上所述的疫苗的制备方法，所述方法包括：将所述柯萨奇病毒A10型毒株在Vero细胞上培养，收获病毒液，将收获的病毒液经灭活和纯化后获得疫苗原液，将所述疫苗原液与佐剂混合。

以上所述的纯化包括超滤浓缩和层析柱纯化。

以上所述的佐剂优选为铝佐剂。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗的制备方法包括：将所述柯萨奇病毒A10型毒株在Vero细胞上进行扩大培养，按MOI=0.0001~0.1接种病毒，待细胞病变达 +++~++++时，收获病毒液，经离心、灭活、纯化后，得到疫苗原液，将疫苗原液按蛋白浓度为0.2μg~2.0μg/ml与浓度为0.3~1.5mg/ml氢氧化铝佐剂，得到柯萨奇病毒A10型灭活疫苗。

上述方法中，柯萨奇病毒A10型毒株在Vero细胞上的培养可采用细胞工厂或生物反应器进行。

灭活病毒的方法可采用与病毒液体积比1:（3500~4500）的β-丙内酯于5±3℃灭活1~3天，然后于37℃水解1~4小时；或者采用与病毒液的体积比为1:1000~1:5000的甲醛灭活2~6 天。

本发明提供用于治疗柯萨奇病毒A10型感染的药物，其含有所述柯萨奇病毒A10型毒株的抗体或抗血清。

本发明还提供以上所述的产品、疫苗在预防或治疗柯萨奇病毒A10型感染或柯萨奇病毒A10型感染引起疾病中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一株Vero细胞适应的柯萨奇病毒A10型毒株，该毒株为采用Vero细胞分离得到，对Vero细胞易感，能够获得较高的滴度，具有免疫原性好（可产生较高的血清中和效价和较好的动物保护效果）、交叉中和能力强（与柯萨奇病毒A10型的不同基因型具有较好的交叉中和能力）、遗传稳定等优势，可用于制备预防或治疗柯萨奇病毒A10型感染或柯萨奇病毒A10型感染引起疾病的疫苗或药物。

利用该毒株制备的疫苗可预防柯萨奇病毒A10型感染或柯萨奇病毒A10型感染引起的手足口病，具有较好的免疫效果。利用该毒株制备的免疫血清能够实现较好的被动免疫的效果，可用于柯萨奇病毒A10型感染或柯萨奇病毒A10型感染引起的手足口病的预防和治疗。

附图说明

图1为本发明实施例2中柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的不同代次毒株的动物免疫中和效价。

图2为本发明实施例3中柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的不同代次的滴度结果。

图3为本发明实施例4中柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的免疫血清对各基因型交叉中和效价。

图4为本发明实施例5中柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的免疫血清进行被动保护实验的动物体重监测结果。

图5为本发明实施例5中柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的免疫血清进行被动保护实验的动物临床评分结果。

图6为本发明实施例5中柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的免疫血清进行被动保护实验的动物生存率结果。

具体实施方式

本发明中术语的解释：

MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指病毒感染细胞的比例。选择合适的MOI值，病毒的感染效率以及目的蛋白的表达量越高，相对细胞的毒性越小。

细胞病变效应（cytopathic effect）是指：在体外实验中，通过细胞培养和接种杀细胞性病毒，经过一定时间后，可用显微镜观察到细胞变圆、坏死、从瓶壁脱落等现象，称之细胞病变作用，简写CPE。CPE 程度常用+~++++表示：1+，<25%；2+， 25%-50%；3+， 50%-75%；4+，75%-100%。

本发明中，柯萨奇病毒A10型毒株（CV-A10）的筛选和性能验证过程大致概括如下：临床手足口患者标本经过处理，接种于非洲绿猴肾传代细胞（Vero）上，盲传三代，经鉴定、测序、动物免疫等初步筛选与评价后，经3次蚀斑纯化，得到CV-A10纯化毒株，将CV-A10毒株按固定的MOI进行连续传代，并进行滴度、免疫原性检测及基因序列检测，同时对该毒株的小鼠免疫血清进行交叉中和能力、乳鼠攻毒保护评价，并选用Vero细胞进行CV-A10毒株培养，收获病毒液、灭活、纯化后，得到疫苗原液，制备CV-A10疫苗，进行动物免疫，检测其免疫原性。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 CV-A10病毒株的分离及培养

1、临床样本的处理

将临床样本按照手足口病预防控制指南（2009版）进行处理。

2、病毒分离

将处理好的样品，按一定比例接种至80~90%密度的健康无污染非洲绿猴肾传代细胞（Vero）中，35℃、5%CO₂培养箱中吸附半个小时以上，补液至培养体积，35℃、5%CO₂培养箱中培养，同时设置未加样本的细胞对照。使用倒置显微镜每天观察细胞，如出现肠道病毒致细胞病变效应（CPE）：细胞变圆，折光增强并脱离管壁等，记录其变化，连续观察7天内接种孔和对照孔细胞所发生的变化CPE（1+~4+）。

若CPE出现，观察到75%的细胞发生变化（3+），收获培养液并储藏在-20℃以下冰箱，冻融3次后，2000 rpm 4℃离心10 min，进行下一次传代，连续培养3代后，将第4代病毒液冻存。若7d后没有CPE出现，则继续盲传3代，若仍未出现CPE，则判定为阴性。

经病毒株的分离、培养以及病毒株的分子鉴定、滴度、免疫原性、交叉中和能力、遗传稳定性的检测和筛选，最终筛选得到一株滴度高、免疫原性好、交叉中和能力强、遗传稳定的柯萨奇病毒A10型毒株V05790834。

实施例2 病毒的鉴定及检测

将实施例1收获的柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的第4代病毒液进行分子学鉴定、基因组测序、滴度检测及免疫原性检测。

1、分子学鉴定及基因组测序

采用RT-PCR法鉴定病毒，使用的肠道病毒核酸检测通用引物及VP1特异性引物如表1所示。

表1 肠道病毒核酸检测通用引物及VP1特异性引物

（1）病毒核酸提取

取第4代病毒液，按照说明书添加试剂和病毒样品，然后置于核酸提取仪中，按照预设的程序抽提核酸，将提取好的核酸保存至-70℃冰箱。

（2）HEV- 5UTR通用引物PCR检测

采用HEV-5UTR的两对通用引物59F/588R与153F/541R进行巢式PCR。

第1轮PCR扩增反应体系组成如表2所示。

表2 第1轮PCR扩增反应体系

反应程序如下：55℃，30 min; 94℃，2 min；20个循环：94℃、15 s，55℃、30 s，68℃、40 s；68℃延伸5 min。

以第1轮PCR扩增产物为模板，进行第2轮PCR扩增。第2轮PCR扩增反应体系组成如表3所示。

表3 第2轮PCR扩增反应体系

反应程序如下：94℃，2 min；30个循环：94℃、15 s，55℃、30 s，72℃、40 s；72℃延伸5 min。

（3）CV-A10的VP1特异性序列的扩增

采用CV-A10-VP1特异性引物进行VP1的扩增，反应体系组成如表4所示。

表4 VP1 PCR扩增反应体系

反应程序如下：55℃，30 min; 94℃，2 min；30个循环：94℃、15 s，55℃、30 s，68℃、70 s；68℃延伸5 min。

（4）结果判断

PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，HEV-5UTR通用引物扩增产物目的条带大小约400bp，CV-A10-VP1特异性条带大小约1kb，具体判定标准如表5所示。

表5 PCR扩增产物结果判断标准

上述鉴定结果显示，毒株V05790834为柯萨奇病毒A10型。

（5）取柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的第4代病毒液进行基因组测序，并根据VP1序列分型。该毒株的基因组序列如SEQ ID NO.12所示，基因型为C2型。

2、滴度检测

取柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的第4代病毒液，10倍梯度稀释，从10^-1稀释至10^-10。将稀释好的病毒加入96孔培养板，8孔/稀释度，0.1ml/孔。同时每孔加入100μl RD细胞悬液（1×10⁵个/ml）。再另外取8~16孔加入细胞悬液，0.1ml/孔，补加病毒维持液0.1ml/孔，作为细胞对照。加盖封板，轻轻拍打混匀，置于35℃、5%CO₂培养箱中静置培养，第7天判断结果，每个样品进行3次重复检测。

病毒滴度计算：按Behrens-Karber公式计算LgCCID₅₀。

LgCCID₅₀/0.1ml=L+d(S-0.5)；

式中，L为病毒的最低稀释度的对数值；d为稀释度系数的对数值；S为CPE阳性孔比率总和。

经检测，培养3天，柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的滴度为8.875 LgCCID₅₀/ml。

3、免疫原性检测

按病毒滴度7.0 LgCCID₅₀/ml，免疫10只小鼠（NIH，SPF，雌性，6~8周龄），分别免疫初筛的病毒液及蚀斑纯化后P5，P10，P15的病毒收获液，采用0、14天两针免疫程序，腹腔注射0.5ml/只，第14，28天采血，同时免疫病毒维持液做为对照。

采用微量细胞病变法检测血清中和抗体，具体方法如下：将血清于56℃水浴灭活30min后，从1:8开始稀释，加入96孔板，每个样品2孔，100μl/孔，2倍倍比稀释后，加入32~320CCID₅₀/0.05ml的病毒液，36±1℃，5% CO₂培养箱，中和1~2小时。加入RD细胞悬液（1~2×10⁵个/ml），100μl/孔。置于5% CO₂培养7天，判定结果，中和效价＜8 判为阴性，≥8 为阳性。

结果显示，柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的病毒液一免后14天，100%阳转，二免疫后14天，血清中和效价GMTs达1：1073~1:5931 （图1）。

实施例3 CV-A10 毒株的稳定性检测

1、遗传稳定性

将柯萨奇病毒A10型毒株V05790834进行3次蚀斑纯化后，按相同MOI进行连续传代。具体方法如下：将代次≤147的健康无污染的Vero 细胞，接种于细胞培养瓶中，待生长至90%左右密度，按 MOI=0.0001~0.1接种病毒液，待病变达 +++~++++ 时，收获病毒液，于-60℃及以下保存。每收获一代，代次增加一代。将收获的病毒液采用同样的方法，连续传代至P15，取各代病毒收获液进行P1序列扩增与测序。

P1序列扩增引物如下所示，目的片段大小约3Kb：

CVA10-P1-F1 (5'-3')： TACCATATAGCCTATTGGATTGGCCATCCGG；

CVA10-P1-R (5'-3')： CTCGTGAGCTACTTTCCCATACTAAATTTG。

扩增反应体系如表6所示。

表6 P1的PCR扩增反应体系

反应程序如下：55℃，30 min; 94℃，2 min；30个循环：94℃、15 s，55℃、30 s，68℃、3 min；68℃延伸5 min。

将扩增的目的条带送检测序。测序结果显示柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的第4代病毒液的P1序列与蚀斑纯化后连续传代至P15的各代次P1序列100%一致。该毒株的P1序列如SEQ ID NO.14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

2、滴度稳定性

将毒株V05790834的以上各代毒株进行滴度检测，方法同实施例2的滴度检测，结果如图2所示，P2~P15代的滴度值为7.8~8.7 LgCCID₅₀/ml，滴度稳定。

实施例4 CV-A10 毒株的交叉中和能力检测

将柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的免疫血清，采用微量细胞病变法（方法详见实施例2），分别与14株不同的CV-A10病毒株进行交叉中和检测，其中1株原型株（A型），13株流行基因型（C2）（交叉中和检测委托中国食品药品检定研究院进行，毒株及其对应免疫血清均来自中国食品药品检定研究院并用于测试）。结果显示，毒株V05790834的免疫血清对原型株、流行亚型毒株皆具有较好的中和能力（图3）。

实施例5 CV-A10 毒株的被动保护效果检测

在已建立的CV-A10 1日龄Balb/C乳鼠致死动物模型基础上（CN 113564130 A），采用20倍LD₅₀的CV-A10攻毒毒株对1日龄Balb/C小鼠进行腹腔攻击，1小时后分别腹腔免疫柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的6倍倍比稀释的免疫血清（1:300、1:50、1:8.3、1:1.4、1:0.2，免疫血清的制备参考实施例2的3）、稀释液（MEM溶液pH 7.2~7.4），同时设置阴性对照及空白对照组，连续观察21天，记录乳鼠健康、发病及死亡情况，统计观察期末各组乳鼠的存活率，并采用Reed-Muench法计算毒株的免疫血清平均半数动物保护中和抗体效价（ED₅₀），结果表明柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的免疫血清可有效保护乳鼠，ED₅₀为1:14.5（图4、图5和图6）。

实施例6 CV-A10 毒株三级种子库的建立及检定

按照《中国药典》（2020版）中生物制品生产鉴定用菌毒种管理及质量控制，建立三级种子库，即原始种子、主种子批及工作种子批，并进行相关检定。各检测项目合格后，放行使用。种子库的建立方法如下：将CV-A10毒株按MOI（0.0001~0.1）接种于处于对数生长期的单层Vero细胞，每天观察病变情况，至病变达90%以上收获，建立三级种子库，并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏。

柯萨奇病毒A10型毒株V05790834已于2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A10型，保藏编号为CGMCCNo.20388。

实施例7 CV-A10疫苗的制备

取实施例6建立柯萨奇病毒A10型毒株V05790834的工作种子批，采用细胞工厂或者生物反应器在Vero 细胞上进行扩大培养，按MOI=0.001接种病毒，待病变达 ++++收获病毒液。将收获的病毒液经离心或过滤后，采用与病毒液体积比为1:4000的β-丙内酯于5±3℃灭活2天，然后37℃水解2小时；或者采用病毒液体积比为1:2000的甲醛灭活 4 天。将灭活液进行超滤浓缩、层析柱纯化，纯化液经除菌过滤后获得疫苗原液，采用Lowry法测定其蛋白浓度不低于95%。上述方法中，灭活也可在病毒纯化后进行。

将上述疫苗原液与氢氧化铝佐剂按适宜比例吸附后，得到CV-A10疫苗，疫苗中，蛋白浓度为0.5μg/ml，铝浓度0.5 mg/ml。

实施例8 CV-A10 疫苗的免疫原性

将实施例7中制备的CV-A10 疫苗进行大鼠免疫，大鼠的免疫方法如下：将大鼠随机分成2组，每组小鼠10只按0，14天的免疫程序进行CV-A10疫苗的腹腔免疫，0.5ml/只，于第28天进行采血，同时免疫病毒维持液作为对照组。采集的血清进行中和抗体检测，具体方法见实施例2。

结果显示，二免后14天，试验组血清效价100%阳转，中和抗体水平GTMs可达1:1544，对照组阳转率为0%，GTMs＜1：8，表明使用柯萨奇病毒A10型毒株V05790834制备的CV-A10疫苗具有很好的免疫效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京民海生物科技有限公司

<120> 柯萨奇病毒A10型毒株及其疫苗和应用

<130> KHP221116017.1YS

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Gly

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Thr Arg Gln Asp Phe Thr Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ser Ile Lys Glu Leu

50 55 60

Ser Ala Pro Leu Asn

65

<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Ala Gln Leu

1 5 10 15

Thr Val Gly Asn Ser Ser Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile Val

20 25 30

Leu Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Thr Asp Ala Thr

35 40 45

Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser Val Asn Arg Phe Tyr

50 55 60

Thr Leu Asp Ser Lys Met Trp Gln Glu Asn Ser Thr Gly Trp Tyr Trp

65 70 75 80

Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Lys Thr Gly Val Phe Gly Gln Asn Ala

85 90 95

Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys Leu His Val Gln Cys

100 105 110

Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Val Ile Pro

115 120 125

Glu Phe Val Ile Ala Gly Arg Gly Ser Asn Thr Lys Pro Asn Lys Ala

130 135 140

Pro His Pro Gly Phe Thr Thr Thr Phe Pro Gly Thr Thr Gly Ala Thr

145 150 155 160

Phe Tyr Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ser Gly Val Pro Leu Ser Gln Ala

165 170 175

Leu Ile Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys Ala

180 185 190

Thr Val Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Val Pro Phe Asp Ser Ala Ile

195 200 205

Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ile Val Ile Pro Val Ser Pro Leu Lys

210 215 220

Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ile Pro Ile Thr Ile Thr Ile Ala

225 230 235 240

Pro Leu Asn Ser Glu Phe Gly Gly Leu Arg Gln Ala Val Ser Gln

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<210> 3

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Ile Pro Ala Glu Leu Arg Pro Gly Thr Asn Gln Phe Leu Thr Thr

1 5 10 15

Asp Asp Asp Thr Ala Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe Thr Pro Thr Pro

20 25 30

Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Ser Leu Leu Glu Leu Cys Arg

35 40 45

Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Glu Ala Thr Gly Leu

50 55 60

Thr Arg Leu Leu Ile Pro Val Ser Ser Gln Asn Lys Ala Asp Glu Leu

65 70 75 80

Cys Ala Ala Phe Met Val Asp Pro Gly Arg Ile Gly Pro Trp Gln Ser

85 90 95

Thr Leu Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln Trp Ser Gly Ser

100 105 110

Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met Ala Thr Gly Lys

115 120 125

Met Leu Val Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Ser Ala Gln Pro Ala Asn Arg

130 135 140

Glu Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp Phe Gly Leu Gln

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn Thr His Phe Arg

165 170 175

Thr Ala Lys Thr Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Tyr Thr Ala Gly Val Val

180 185 190

Thr Leu Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Pro Glu Thr Pro Gly

195 200 205

Glu Ala Tyr Ile Ile Ala Met Gly Ala Ala Gln Asp Asn Phe Thr Leu

210 215 220

Lys Ile Cys Lys Asp Thr Asp Glu Val Thr Gln Gln Ala Val Leu Gln

225 230 235 240

<210> 4

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Asp Pro Val Glu Asp Ile Ile His Asp Ala Leu Gly Ser Thr Ala

1 5 10 15

Arg Arg Ala Ile Ser Ser Ala Thr Asn Val Glu Ser Ala Ala Asn Thr

20 25 30

Thr Pro Ser Ser His Arg Leu Glu Thr Gly Arg Val Ser Ala Leu Gln

35 40 45

Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr Asp Glu Asn Met Ile

50 55 60

Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Arg Asn Gly Val Leu Glu Thr Thr Ile

65 70 75 80

Asn His Phe Phe Ser Arg Ser Gly Leu Val Gly Val Val Asn Leu Thr

85 90 95

Asp Gly Gly Thr Asp Thr Thr Gly Tyr Ala Thr Trp Asp Ile Asp Ile

100 105 110

Met Gly Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Met Phe Thr Tyr Met

115 120 125

Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Thr Thr Thr Glu Asn Gly Glu

130 135 140

Ala Arg Pro Tyr Met Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro

145 150 155 160

Lys Pro Thr Gly Arg Asp Ala Phe Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro

165 170 175

Ser Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val Pro

180 185 190

Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro

195 200 205

Thr Phe Gly Gln His Pro Glu Thr Ser Asn Thr Thr Tyr Gly Leu Cys

210 215 220

Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ala Val Arg Ile Val Ser Lys Glu

225 230 235 240

Ala Ser Gln Leu Lys Leu Gln Thr Arg Val Tyr Met Lys Leu Lys His

245 250 255

Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Ile Arg Ser Gln Pro Tyr Leu Leu

260 265 270

Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Ser Lys Ile Ala Asn Ser Ala Arg

275 280 285

Asp Arg Ser Ser Ile Lys Gln Ala Asn Met

290 295

<210> 5

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Lys Phe Gly Gln Gln Ser Gly Ala Ile Tyr Val Gly Asn Tyr Arg

1 5 10 15

Val Val Asn Arg His Leu Ala Thr His Asn Asp Trp Ala Asn Leu Val

20 25 30

Trp Glu Asp Ser Ser Arg Asp Leu Leu Val Ser Ser Thr Thr Ala Gln

35 40 45

Gly Cys Asp Thr Ile Ala Arg Cys Glu Cys Gln Thr Gly Val Tyr Tyr

50 55 60

Cys Asn Ser Arg Arg Lys His Tyr Pro Val Ser Phe Ser Lys Pro Ser

65 70 75 80

Leu Val Phe Ile Glu Ala Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser

85 90 95

His Leu Met Leu Ala Ala Gly His Ser Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly

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Asn Gly Leu Val Gly Phe Ala Asn Val Arg Asp Leu Leu Trp Leu Asp

130 135 140

Glu Glu Ala Met Glu Gln

145 150

<210> 6

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Val Ser Asp Tyr Ile Lys Gly Leu Gly Asp Ala Phe Gly Thr Gly

1 5 10 15

Phe Thr Asp Ala Val Ser Arg Glu Val Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Leu

20 25 30

Ile Gly Ser Glu Gly Ala Val Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Val Lys

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Leu Ile Ser Ala Leu Val Ile Val Ile Arg Ser Asp Tyr Asp Met Val

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Thr Leu Thr Ala Thr Leu Ala Leu Ile Gly Cys His Gly Ser Pro Trp

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Ala Trp Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser Ile Leu Gly Ile Pro Met Ala

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Gln Lys Gln

<210> 7

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Ala Ser Trp Leu Lys Lys Phe Ser Asp Met Ala Asn Ala Ala Lys

1 5 10 15

Gly Leu Glu Trp Ile Ser Asn Lys Ile Ser Lys Phe Ile Asp Trp Leu

20 25 30

Lys Glu Lys Ile Ile Pro Ala Ala Lys Glu Lys Val Glu Phe Leu Asn

35 40 45

Asn Leu Lys Gln Leu Pro Leu Met Glu Asn Gln Ile Ala Asn Leu Glu

50 55 60

Gln Ser Ala Ala Ser Gln Glu Asp Leu Glu Val Met Phe Gly Asn Val

65 70 75 80

Ser Tyr Leu Ala His Phe Cys Arg Lys Phe Gln Pro Leu Tyr Ala Thr

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Glu Ala Lys Arg Val Tyr Ala Leu Glu Lys Arg Met Asn Asn Tyr Met

100 105 110

Gln Phe Lys Ser Lys His Arg Ile Glu Pro Val Cys Leu Ile Ile Arg

115 120 125

Gly Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Ala Thr Gly Ile Ile Ala Arg

130 135 140

Ala Ile Ala Asp Lys Tyr His Ser Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp

145 150 155 160

Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Lys Gln Gln Val Val Thr Val Met Asp

165 170 175

Asp Leu Cys Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Met Ser Leu Phe Cys Gln

180 185 190

Met Val Ser Thr Val Asp Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Glu

195 200 205

Lys Gly Val Ser Phe Thr Ser Lys Phe Val Ile Ala Ser Thr Asn Ala

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Ser Asn Ile Ile Val Pro Thr Val Ser Asp Ser Asp Ala Ile Arg Arg

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Arg Phe Phe Met Asp Cys Asp Ile Glu Val Thr Asp Ser Tyr Lys Thr

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Asp Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly Arg Ala Ala Lys Leu Cys Ser Glu

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Asn Asn Thr Ala Asn Phe Lys Arg Cys Ser Pro Leu Val Cys Gly Lys

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Ala Ile Gln Leu Arg Asp Arg Lys Ser Lys Val Arg Tyr Ser Val Asp

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Gly Asn Thr Ile Glu Ala Leu Phe Gln

325

<210> 8

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Pro Pro Lys Phe Arg Pro Ile Arg Ile Ser Leu Asp Glu Lys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Asp Ala Ile Ser Asp Leu Leu Ala Ser Val Asp Ser Glu Glu

20 25 30

Val Arg Gln Tyr Cys Arg Asp Gln Gly Trp Ile Ile Pro Glu Thr Pro

35 40 45

Thr Asn Val Glu Arg His Leu Asn Arg Ala Val Leu Val Met Gln Ser

50 55 60

Ile Ala Thr Val Val Ala Val Val Ser Leu Val Tyr Val Ile Tyr Lys

65 70 75 80

Leu Phe Ala Gly Phe Gln

85

<210> 9

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Ala Tyr Ser Gly Ala Pro Lys Gln Ala Leu Lys Lys Pro Val Leu

1 5 10 15

Arg Thr Ala Thr Val Gln

20

<210> 10

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Ile Arg

1 5 10 15

Gln Val Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg Asp

20 25 30

Arg Leu Ala Ile Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile Trp

35 40 45

Val Glu His Lys Leu Val Asn Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Lys Phe Arg Asp Val Thr Lys Phe Ile Pro Glu Asn Ile Ser Gly

85 90 95

Ala Ser Asp Ala Thr Leu Val Ile Asn Thr Glu His Met Pro Ser Met

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His Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys Arg

165 170 175

Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gln

180

<210> 11

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Glu Ile Gln Trp Val Lys Pro Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu Asn

1 5 10 15

Ile Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys Leu Glu Pro Ser Val Phe His Asp

20 25 30

Val Phe Glu Gly Asn Lys Glu Pro Ala Val Leu Thr Ser Lys Asp Pro

35 40 45

Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly

50 55 60

Asn Val Leu His Glu Pro Asp Glu Tyr Val Lys Gln Ala Ala Leu His

65 70 75 80

Tyr Ala Asn Gln Leu Lys Gln Leu Asp Ile Asn Thr Asn Lys Met Ser

85 90 95

Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Leu

100 105 110

His Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr Ser Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg

115 120 125

Asp Ile Leu Asp Pro Thr Thr Arg Asp Thr Thr Lys Met Lys Phe Tyr

130 135 140

Met Asp Lys Tyr Gly Leu Asp Leu Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp

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Glu Leu Arg Ser Leu Asp Lys Ile Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile

165 170 175

Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser Val Tyr Leu Arg Met Thr Phe Gly

180 185 190

His Leu Tyr Glu Thr Phe His Ala Asn Pro Gly Thr Val Thr Gly Ser

195 200 205

Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Phe Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu

210 215 220

Leu Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser

225 230 235 240

Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala Leu Glu Met Val Leu Arg Asp Ile

245 250 255

Gly Tyr Ser Glu Glu Ala Val Ser Leu Ile Glu Gly Ile Asn His Thr

260 265 270

His His Val Tyr Arg Asn Lys Thr Tyr Cys Val Leu Gly Gly Met Pro

275 280 285

Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile

290 295 300

Ile Ile Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Phe Lys Gly Ile Asp Leu Asp

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Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly Asp Asp Val Leu Ala Ser Tyr Pro

325 330 335

Phe Pro Ile Asp Cys Phe Glu Leu Ala Lys Thr Gly Lys Glu Tyr Gly

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Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys Ser Pro Cys Phe Asn Glu Val Thr

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Trp Glu Asn Ala Thr Phe Leu Lys Arg Gly Phe Leu Pro Asp His Gln

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Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Ala Cys Asn Thr Gln Asp His Val Arg

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Pro Asn Phe Glu Asn Leu Arg Arg Asn Trp Leu Glu Leu Phe

450 455 460

<210> 12

<211> 7406

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttaaaccagc ctgtgggttg tacccaccca cagggcccac tgggcgctag cactccgatt 60

ctgcggaatc tttgtgcgcc tgttttataa ccctcccccg aaacttgtaa cttagaagtt 120

atgtacgtta ccgatcagca gcaggcgtgg cacaccagcc atgtcttgat caagcacttc 180

tgtacccccg gactgagtat caatagactg ctcacgtggt cgaaggagaa aacgttcgtt 240

atccggctaa ctacttcgag aagcctagta gcgccactga aactgcggag tgtttcgctc 300

agcacttccc ccgtgtagat caggtcgatg agtcactgct caccccacgg gtgaccgtgg 360

cagtggctgc gttggcggcc tgcctatggg gcaacccata ggacgctcta aagtggacat 420

ggtgcgaaga gtctattgag ctagttagta gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatcct 480

aactgcggag cgcatgcccc caaaccagag ggtggtgcgt cgtaacgggt aactctgcag 540

cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt cctttattct tataatggct gcttatggtg 600

acaattgagg aattgttacc atatagctat tggattggcc atccggtgtg caacagagct 660

attatctact tgtttgttgg atacattcca ttaacaccta aatccttcaa tacattacac 720

tatattctaa cgctgaacgc aagaaaatgg gagctcaagt ctcgacgcaa aaatccggca 780

gtcatgagac tggtaacgta gccactggag gatctacaat aaacttcact aacatcaact 840

actataaaga ttcttacgcc gcgtcagcca ctcggcaaga cttcacacaa gatccaaaga 900

agttcacaca accagtgtta gactctatca aagaactatc agctcctttg aattcccctt 960

ctgtggaggc ttgcggctat agtgataggg tcgctcagct taccgttggg aactcctcca 1020

ttactaccca agaggctgct aatattgtat tggcttatgg agagtggcct gaatactgcc 1080

ctgacacaga cgcaactgcc gtggataagc caactcgccc ggacgtgtct gtcaacaggt 1140

tctacacttt ggactctaaa atgtggcaag aaaactcgac tggttggtat tggaagttcc 1200

ctgacgtgct gaacaagacg ggggtgttcg gacaaaatgc ccagtttcat tacttgtacc 1260

ggtcaggttt ctgcttacat gtacagtgca acgctagtaa attccaccag ggggctcttc 1320

ttgtggctgt gataccagaa tttgtgattg ctggcagagg atctaacaca aaaccaaata 1380

aagcacccca cccagggttt actacaactt tccctggtac caccggtgct acattttacg 1440

atccatacgt tctggattcc ggggtaccat tgagtcaagc tctaatatac ccccatcaat 1500

ggatcaatct ccgtaccaac aactgtgcaa ctgttatagt cccatacatc aatgctgttc 1560

cgtttgactc agctatcaat catagcaact ttgggctaat agtgatacca gttagtccgc 1620

tgaagtattc gtccggggca accactgcaa tcccaatcac tatcactata gcccccctga 1680

attcggagtt cggaggacta cgacaagccg ttagccaagg catcccagct gagctcaggc 1740

ccgggactaa tcagttcctg accacagatg acgataccgc agcgcccatc ctcccaggat 1800

tcacccccac acccacaatt catataccag gggaagtaca ctctttgctg gagttgtgta 1860

gggtggagac tattttggaa gtgaacaaca ccacagaagc aacaggatta acaaggctct 1920

taataccagt gtcctcgcaa aacaaagccg atgagttgtg tgctgcgttt atggttgatc 1980

caggccggat tggaccttgg caatctacct tagttggaca gatttgccgt tattacacac 2040

aatggtccgg gtctttgaag gtgaccttta tgttcacagg atcctttatg gcaacaggca 2100

agatgctggt ggcctactcc ccgcccggaa gcgctcaacc agctaacaga gaaaccgcca 2160

tgctgggcac gcacgtcatt tgggactttg gactacaatc atcggtctct ttggtgatac 2220

cgtggatcag taacactcac tttcgcactg ccaagacagg tgggaattac gattactaca 2280

cggcaggtgt agtgaccttg tggtatcaaa ccaattacgt ggtcccgcca gaaacccctg 2340

gagaggcgta tattatagca atgggggcag cacaagacaa cttcactttg aagatttgca 2400

aggatactga tgaagtgacg caacaagctg tgttgcaagg tgaccctgtg gaagatataa 2460

tccatgacgc tctgggaagt acagcgcgca gggctattag cagtgctaca aatgttgaat 2520

ccgcagctaa caccaccccc agttcacacc gactggagac tggacgcgta tcagcgctac 2580

aggctgcaga aacgggtgcc acttctaatg ccacagatga gaacatgatt gagacccgtt 2640

gtgtggttaa cagaaatggg gtgctagaaa ccactattaa tcatttcttc tcccgctctg 2700

gattagtggg agtggttaac ctcacagatg gggggacgga caccactggg tatgctacat 2760

gggatataga cattatgggc tttgtccaac tccgcagaaa gtgcgagatg ttcacataca 2820

tgagattcaa cgcggaattc acgtttgtca caacgactga gaatggagag gctcgcccgt 2880

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tccaatggca aacagcaact aacccatcag tctttgtcaa actcactgac ccccctgcac 3000

aagtctcagt ccctttcatg tcaccagcta gtgcatatca gtggttttat gatggttatc 3060

ccacttttgg ccagcacccg gagacctcaa acacaacgta cgggttgtgc ccaaacaata 3120

tgatgggcac ttttgcggtg agaattgtta gcaaggaggc aagtcaacta aaactacaga 3180

ctagagtgta catgaagctt aagcatgtga gggcttgggt cccaagaccg atcaggtctc 3240

agccatactt gcttaaaaac ttccccaatt acgacagtag caaaattgcc aacagtgcac 3300

gggaccgatc tagtatcaag caagctaata tgggtaaatt tgggcaacaa tctggcgcca 3360

tctacgttgg taactacaga gtggtcaata gacacttggc cacccacaat gactgggcca 3420

acctggtgtg ggaagatagt tctcgagact tgcttgtctc gtctaccact gcccagggtt 3480

gtgatacgat tgcccgttgt gagtgtcaga caggggtgta ctattgtaac tcaaggagga 3540

agcattatcc ggtcagcttc tcaaaaccta gcctcgtctt catagaggcc agtgagtatt 3600

accctgctag atatcaatct cacttaatgc ttgctgcagg ccactctgaa cctggagatt 3660

gcgggggtat cttgaggtgt caacatggtg tagtcggcat agtatctact ggtggcaacg 3720

gtcttgtcgg ttttgcaaac gtgagggacc tcttatggtt ggatgaagaa gccatggaac 3780

agggagtgtc tgactacatt aagggactcg gcgacgcttt tggtactggt ttcactgacg 3840

cagtgtctag ggaagtggag gctttgaaaa attacctgat tggttccgag ggagcggtgg 3900

agaagatcct gaagaatttg gtgaaactca tatcagcttt ggtcatagtt atcagaagcg 3960

actatgacat ggtcaccctt accgcaactc tagctctgat tgggtgtcac gggagcccat 4020

gggcgtggat taaagcaaag acggcatcca tcttaggtat tcctatggca cagaagcaga 4080

gtgcatcttg gcttaagaag ttcagtgata tggcgaatgc cgcaaagggg ttggagtgga 4140

tctctaataa aatcagtaaa tttattgact ggcttaagga aaagatcatt ccagctgcaa 4200

aggaaaaagt tgagtttctt aacaatctca agcaactgcc cttgatggaa aaccaaattg 4260

ctaacttaga acagtctgct gcttcacaag aagacctcga agtcatgttt ggtaatgtgt 4320

catacctagc tcacttttgt cgcaagttcc agccactcta tgcaactgaa gcgaagagag 4380

tgtacgcctt agagaagaga atgaataatt acatgcagtt caagagcaaa caccgtattg 4440

aacctgtatg tttaattatc aggggctcac caggaactgg caagtcactc gccacaggta 4500

taatagcaag agccattgct gacaaatacc actctagtgt gtactccctt ccgccagatc 4560

cagatcactt tgatggatac aagcagcagg tggtgacagt catggatgat ttgtgtcaaa 4620

acccagatgg caaagacatg tcattgtttt gccaaatggt atccactgtc gattttatac 4680

ccccaatggc ttcactggaa gagaaaggcg tatccttcac atctaaattt gttattgctt 4740

caactaacgc tagcaacatc attgtcccca cggtctcaga ctctgacgct attcgaagga 4800

gattcttcat ggattgtgac atcgaagtga ctgactctta caagacagac ttaggccgct 4860

tagatgcggg tagggccgca aagctctgct cagagaataa caccgccaat ttcaagaggt 4920

gcagcccgtt agtgtgcggt aaagccatcc aactgagaga taggaagtcc aaagtcaggt 4980

atagtgtaga cactgtggta tcagagttgg ttagggagta tagtaacagg tctgctatag 5040

gaaatactat agaagcttta ttccaagggc ctcctaaatt taggcctata agaattagcc 5100

ttgatgagaa acccgctcca gatgctatta gcgacctgct tgctagcgtt gacagtgagg 5160

aggtgcggca gtactgcaga gatcaaggat ggataatacc tgaaacgcca accaatgtgg 5220

agcggcatct caatagggca gtgttagtga tgcaatctat cgctactgta gtcgcagttg 5280

tgtcccttgt ttatgttatt tacaagctat ttgctggttt ccaaggcgca tattctggag 5340

cgcccaagca agctctcaag aaacctgtgt tgagaacagc cactgttcaa gggcccagct 5400

tagattttgc cctgtctctc ctgcgacgta acatcaggca ggtgcaaact gaccaagggc 5460

actttaccat gcttggggta cgtgaccgcc ttgctatctt gcctcgtcac tcacaaccag 5520

ggaagactat ctgggttgag cacaagttgg tcaatgtgct tgatgctgtt gagctagtgg 5580

atgaacaagg tgttaatttg gagcttacac tagtaaccct agacaccaat gagaagttta 5640

gagacgtcac caagttcatt ccagagaata tcagtggagc cagtgatgcc acattagtaa 5700

tcaacactga acacatgcca tcaatgtttg tcccggtagg ggatgtcgtt caatacgggt 5760

tcctaaatct tagtggtaag ccaacccaca ggaccatgat gtacaatttc cctacaaagg 5820

ctggacagtg tggaggcgtg gtaacatctg tcggtagaat cattggcatc cacattgggg 5880

gcaatgggcg acaaggcttt tgcgctggcc tgaaaaggag ttatttcgca agtgaacaag 5940

gtgagatcca atgggtgaaa cctaacaagg agaccggcag attaaatatc aatggtccaa 6000

cacgcaccaa gttagagccc agtgtgttcc atgatgtgtt tgagggcaac aaggagccag 6060

cagtcctaac aagcaaggac cctagattag aggttgactt tgagcaagcc ctcttctcca 6120

agtatgtggg taatgtcctc cacgaacctg atgaatatgt gaagcaggca gccctccact 6180

acgcaaatca gctcaagcaa ctggatataa acaccaataa gatgagcatg gaggaagcgt 6240

gctatggcac agagaacctg gaagcaatcg atctccacac tagcgcagga tacccataca 6300

gtgctctggg cataaagaag agggacatac tagatcctac cactagggac acaacaaaaa 6360

tgaagtttta catggataag tatggtttgg acttaccgta ctccacctat gtcaaagatg 6420

aacttaggtc tctggacaag attaagaaag ggaaatcccg cttaatagaa gctagcagcc 6480

tgaatgactc agtgtacctt agaatgactt ttggccatct gtatgaaaca ttccatgcaa 6540

atccagggac tgtgaccgga tcagcggttg ggtgcaatcc ggatgtgttc tggagtaaac 6600

tcccaatcct actcccaggc tcgctatttg cctttgacta ttcaggctac gatgccagtc 6660

ttagccccgt ctggttcagg gctttggaga tggtcttgcg ggacattggt tactcagagg 6720

aagcagtgtc actcatagaa ggaataaatc atacccatca tgtgtaccgg aacaaaacat 6780

attgtgtcct tggcgggatg ccgtcaggat gttctggcac ctccattttc aactcgatga 6840

tcaacaacat catcatcagg acgcttttga ttaaaacatt taaagggata gatttagacg 6900

agttgaatat ggtggcctat ggggatgatg tgctagctag ttatcctttc cccattgatt 6960

gctttgagct agctaaaact ggcaaagaat atgggctgac tatgacacct gcagacaagt 7020

caccttgctt taacgaagtg acgtgggaaa acgccacctt tctgaagaga gggtttctac 7080

cagaccatca attcccattc ttgattcatc ccataatgcc catgaaagag atccacgaat 7140

ccatacgttg gaccaaggat gcgtgcaaca cccaagacca tgtacgctcc ctgtgtttac 7200

tagcttggca taacggtaag gatgaatatg aaaaatttgt gagtacaatt agatcagtcc 7260

cagttgggaa agcattggct attccgaact ttgaaaatct gagaagaaat tggctcgaac 7320

tattttaaat ttacagttgg aagctgaacc ccaccagaaa tctggtcgtg ttaatgactg 7380

gtgggggtaa atttgttata cccaga 7406

<210> 13

<211> 862

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Gly

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Thr Arg Gln Asp Phe Thr Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ser Ile Lys Glu Leu

50 55 60

Ser Ala Pro Leu Asn Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Ser Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Leu Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Ser Lys Met Trp Gln Glu Asn Ser

130 135 140

Thr Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Lys Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Leu His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Ile Pro Glu Phe Val Ile Ala Gly Arg Gly Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Pro Asn Lys Ala Pro His Pro Gly Phe Thr Thr Thr Phe Pro Gly

210 215 220

Thr Thr Gly Ala Thr Phe Tyr Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ser Gly Val

225 230 235 240

Pro Leu Ser Gln Ala Leu Ile Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg

245 250 255

Thr Asn Asn Cys Ala Thr Val Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Val Pro

260 265 270

Phe Asp Ser Ala Ile Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ile Val Ile Pro

275 280 285

Val Ser Pro Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ile Pro Ile

290 295 300

Thr Ile Thr Ile Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Gly Gly Leu Arg Gln

305 310 315 320

Ala Val Ser Gln Gly Ile Pro Ala Glu Leu Arg Pro Gly Thr Asn Gln

325 330 335

Phe Leu Thr Thr Asp Asp Asp Thr Ala Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe

340 345 350

Thr Pro Thr Pro Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Ser Leu Leu

355 360 365

Glu Leu Cys Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Glu

370 375 380

Ala Thr Gly Leu Thr Arg Leu Leu Ile Pro Val Ser Ser Gln Asn Lys

385 390 395 400

Ala Asp Glu Leu Cys Ala Ala Phe Met Val Asp Pro Gly Arg Ile Gly

405 410 415

Pro Trp Gln Ser Thr Leu Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln

420 425 430

Trp Ser Gly Ser Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met

435 440 445

Ala Thr Gly Lys Met Leu Val Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Ser Ala Gln

450 455 460

Pro Ala Asn Arg Glu Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp

465 470 475 480

Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Ser Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn

485 490 495

Thr His Phe Arg Thr Ala Lys Thr Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Tyr Thr

500 505 510

Ala Gly Val Val Thr Leu Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Pro

515 520 525

Glu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ile Ile Ala Met Gly Ala Ala Gln Asp

530 535 540

Asn Phe Thr Leu Lys Ile Cys Lys Asp Thr Asp Glu Val Thr Gln Gln

545 550 555 560

Ala Val Leu Gln Gly Asp Pro Val Glu Asp Ile Ile His Asp Ala Leu

565 570 575

Gly Ser Thr Ala Arg Arg Ala Ile Ser Ser Ala Thr Asn Val Glu Ser

580 585 590

Ala Ala Asn Thr Thr Pro Ser Ser His Arg Leu Glu Thr Gly Arg Val

595 600 605

Ser Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr Asp

610 615 620

Glu Asn Met Ile Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Arg Asn Gly Val Leu

625 630 635 640

Glu Thr Thr Ile Asn His Phe Phe Ser Arg Ser Gly Leu Val Gly Val

645 650 655

Val Asn Leu Thr Asp Gly Gly Thr Asp Thr Thr Gly Tyr Ala Thr Trp

660 665 670

Asp Ile Asp Ile Met Gly Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Met

675 680 685

Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Thr Thr Thr

690 695 700

Glu Asn Gly Glu Ala Arg Pro Tyr Met Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro

705 710 715 720

Pro Gly Ala Pro Lys Pro Thr Gly Arg Asp Ala Phe Gln Trp Gln Thr

725 730 735

Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln

740 745 750

Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr

755 760 765

Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Gln His Pro Glu Thr Ser Asn Thr Thr

770 775 780

Tyr Gly Leu Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ala Val Arg Ile

785 790 795 800

Val Ser Lys Glu Ala Ser Gln Leu Lys Leu Gln Thr Arg Val Tyr Met

805 810 815

Lys Leu Lys His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Ile Arg Ser Gln

820 825 830

Pro Tyr Leu Leu Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Ser Lys Ile Ala

835 840 845

Asn Ser Ala Arg Asp Arg Ser Ser Ile Lys Gln Ala Asn Met

850 855 860

<210> 14

<211> 2586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgggagctc aagtctcgac gcaaaaatcc ggcagtcatg agactggtaa cgtagccact 60

ggaggatcta caataaactt cactaacatc aactactata aagattctta cgccgcgtca 120

gccactcggc aagacttcac acaagatcca aagaagttca cacaaccagt gttagactct 180

atcaaagaac tatcagctcc tttgaattcc ccttctgtgg aggcttgcgg ctatagtgat 240

agggtcgctc agcttaccgt tgggaactcc tccattacta cccaagaggc tgctaatatt 300

gtattggctt atggagagtg gcctgaatac tgccctgaca cagacgcaac tgccgtggat 360

aagccaactc gcccggacgt gtctgtcaac aggttctaca ctttggactc taaaatgtgg 420

caagaaaact cgactggttg gtattggaag ttccctgacg tgctgaacaa gacgggggtg 480

ttcggacaaa atgcccagtt tcattacttg taccggtcag gtttctgctt acatgtacag 540

tgcaacgcta gtaaattcca ccagggggct cttcttgtgg ctgtgatacc agaatttgtg 600

attgctggca gaggatctaa cacaaaacca aataaagcac cccacccagg gtttactaca 660

actttccctg gtaccaccgg tgctacattt tacgatccat acgttctgga ttccggggta 720

ccattgagtc aagctctaat atacccccat caatggatca atctccgtac caacaactgt 780

gcaactgtta tagtcccata catcaatgct gttccgtttg actcagctat caatcatagc 840

aactttgggc taatagtgat accagttagt ccgctgaagt attcgtccgg ggcaaccact 900

gcaatcccaa tcactatcac tatagccccc ctgaattcgg agttcggagg actacgacaa 960

gccgttagcc aaggcatccc agctgagctc aggcccggga ctaatcagtt cctgaccaca 1020

gatgacgata ccgcagcgcc catcctccca ggattcaccc ccacacccac aattcatata 1080

ccaggggaag tacactcttt gctggagttg tgtagggtgg agactatttt ggaagtgaac 1140

aacaccacag aagcaacagg attaacaagg ctcttaatac cagtgtcctc gcaaaacaaa 1200

gccgatgagt tgtgtgctgc gtttatggtt gatccaggcc ggattggacc ttggcaatct 1260

accttagttg gacagatttg ccgttattac acacaatggt ccgggtcttt gaaggtgacc 1320

tttatgttca caggatcctt tatggcaaca ggcaagatgc tggtggccta ctccccgccc 1380

ggaagcgctc aaccagctaa cagagaaacc gccatgctgg gcacgcacgt catttgggac 1440

tttggactac aatcatcggt ctctttggtg ataccgtgga tcagtaacac tcactttcgc 1500

actgccaaga caggtgggaa ttacgattac tacacggcag gtgtagtgac cttgtggtat 1560

caaaccaatt acgtggtccc gccagaaacc cctggagagg cgtatattat agcaatgggg 1620

gcagcacaag acaacttcac tttgaagatt tgcaaggata ctgatgaagt gacgcaacaa 1680

gctgtgttgc aaggtgaccc tgtggaagat ataatccatg acgctctggg aagtacagcg 1740

cgcagggcta ttagcagtgc tacaaatgtt gaatccgcag ctaacaccac ccccagttca 1800

caccgactgg agactggacg cgtatcagcg ctacaggctg cagaaacggg tgccacttct 1860

aatgccacag atgagaacat gattgagacc cgttgtgtgg ttaacagaaa tggggtgcta 1920

gaaaccacta ttaatcattt cttctcccgc tctggattag tgggagtggt taacctcaca 1980

gatgggggga cggacaccac tgggtatgct acatgggata tagacattat gggctttgtc 2040

caactccgca gaaagtgcga gatgttcaca tacatgagat tcaacgcgga attcacgttt 2100

gtcacaacga ctgagaatgg agaggctcgc ccgtacatgc tgcaatacat gtatgtgccc 2160

cctggtgccc ctaaaccgac gggaagggat gccttccaat ggcaaacagc aactaaccca 2220

tcagtctttg tcaaactcac tgacccccct gcacaagtct cagtcccttt catgtcacca 2280

gctagtgcat atcagtggtt ttatgatggt tatcccactt ttggccagca cccggagacc 2340

tcaaacacaa cgtacgggtt gtgcccaaac aatatgatgg gcacttttgc ggtgagaatt 2400

gttagcaagg aggcaagtca actaaaacta cagactagag tgtacatgaa gcttaagcat 2460

gtgagggctt gggtcccaag accgatcagg tctcagccat acttgcttaa aaacttcccc 2520

aattacgaca gtagcaaaat tgccaacagt gcacgggacc gatctagtat caagcaagct 2580

aatatg 2586

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggtatcaaac caattacgtg gtcc 24

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaacaagcag gtctgagaac 20

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cyttgtgcgc ctgtttt 17

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

attgtcacca taagcagcc 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

caagyacttc tgtmwcccc 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cccaaagtag tcggttcc 18

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

taccatatag cctattggat tggccatccg g 31

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctcgtgagct actttcccat actaaatttg 30

Claims

1.柯萨奇病毒A10型毒株，其特征在于，所述毒株的VP4、VP3、VP2、VP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示；

和/或，

所述毒株的2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示。

2.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A10型毒株，其特征在于，所述毒株的基因组序列如SEQ ID NO.12所示或如SEQ ID NO.12所示序列的完全互补序列所示。

3.根据权利要求1或2所述的柯萨奇病毒A10型毒株，其特征在于，所述毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20388。

4.生物材料，其特征在于，其为以下（1）-（8）中的任意一种：

（1）序列如SEQ ID NO.4所示的VP1蛋白；

（2）序列如SEQ ID NO.13所示的P1蛋白；

（3）序列如SEQ ID NO.14所示的核酸分子；

（4）序列如SEQ ID NO.12所示或如SEQ ID NO.12所示序列的完全互补序列所示的核酸分子；

（5）含有（3）或（4）中所述核酸分子的表达盒；

（6）含有（3）或（4）中所述核酸分子的重组载体；

5.一种柯萨奇病毒A10型毒株的病毒样颗粒，其特征在于，其含有选自VP4、VP3、VP2、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D蛋白中的任意一种或多种；

其中，VP4、VP3、VP2、VP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示；

2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示。

6.免疫原性组合物，其特征在于，其含有权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A10型毒株或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的病毒样颗粒。

7.权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A10型毒株或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的病毒样颗粒或权利要求6所述的免疫原性组合物的以下（1）-（9）中任意一种应用：

（5）在制备检测柯萨奇病毒的试剂或试剂盒中的应用；

（8）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

8.一种产品，其特征在于，其含有以下（1）-（5）中的任意一种或多种的组合：

（1）权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A10型毒株；

（2）权利要求4所述的生物材料；

（3）权利要求5所述的病毒样颗粒；

（4）权利要求6所述的免疫原性组合物；

（5）以权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A10型毒株或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的病毒样颗粒或权利要求6所述的免疫原性组合物为免疫原免疫动物制备得到的抗体或抗血清。

9.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A10型毒株或包含权利要求4所述的生物材料。

10.权利要求9所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A10型毒株在Vero细胞上培养，收获病毒液，经灭活和纯化获得疫苗原液，将所述疫苗原液与佐剂混合。