CN108624601B

CN108624601B - 酵母表达的柯萨奇病毒a10病毒样颗粒及其应用

Info

Publication number: CN108624601B
Application number: CN201710161591.4A
Authority: CN
Inventors: 黄忠; 周瑜; 刘庆伟
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Immunology and Infection, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2037-03-17
Also published as: CN108624601A

Abstract

本发明提供了一种酵母表达的柯萨奇病毒A10病毒样颗粒及其应用。具体的，本发明将柯萨奇病毒A10型P1蛋白和3CD蛋白的基因序列转化入酵母细胞中进行表达，获得了柯萨奇病毒A10型的新型病毒样颗粒，且该病毒样颗粒的表达量高、免疫原性强、并显示了良好的特异性。

Description

酵母表达的柯萨奇病毒A10病毒样颗粒及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及酵母表达的柯萨奇病毒A10病毒样颗粒及其应用。

背景技术

手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是由肠道病毒引起的一种传染性疾病，主要感染5岁以下的儿童。HFMD主要引起一些温和的症状，表现为发热及手、足、口部位出现疱疹或者溃疡，通常能够自愈；但是HFMD也能引起一些严重的并发症，比如无菌性脑膜炎、肺水肿等，如不及时救治，甚至会导致死亡。

传统上，引起HFMD的病原主要是EV71和CA16，近年来，CA6和CA10引起的病例逐渐增加。2008年，CA6和CA10共流行在芬兰引起了HFMD的爆发，同年，新加坡HFMD疫情的主要致病原之一被证实是CA6和CA10。一个法国的HFMD监测系统显示，在2010年，当地CA6和CA10引起的HFMD病例分别达到28％和39.9％。在中国深圳、石家庄、武汉等地，CA10与CA6、EV71、CA16一起成为HFMD的主要致病原。虽然CA10引起的HFMD正在逐渐增加，但是当前大部分研究仍然针对EV71和CA16，其中EV71灭活疫苗已经上市，CA16也有多种候选疫苗可用，对CA10的研究仍然很少，尚无疫苗可用。因此，本领域技术人员致力于开发能够特异性针对CA10的疫苗用于手足口病的预防。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柯萨奇病毒A10型的新型病毒样颗粒、其制备方法及应用。

本发明的第一方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A10型(Coxsackievirus A10,CA10)P1蛋白的多核苷酸序列，和/或编码柯萨奇病毒A10型3CD蛋白的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述柯萨奇病毒A10型P1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在另一优选例中，所述柯萨奇病毒A10型3CD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在另一优选例中，所述编码柯萨奇病毒A10型P1蛋白的多核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在另一优选例中，所述编码柯萨奇病毒A10型3CD蛋白的多核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在另一优选例中，所述多核苷酸为适合酵母(优选为毕赤酵母)表达的基因序列。

本发明的第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第一方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述表达载体为以pPink-HC载体为骨架。

本发明的第三方面，提供了一种基因工程细胞，所述的基因工程细胞含有本发明第二方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第一方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述基因工程细胞为真核细胞，并且所述细胞的基因组中整合有柯萨奇病毒A10型外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有柯萨奇病毒A10型外壳蛋白的表达盒；

所述基因工程细胞在胞内表达所述柯萨奇病毒A10型外壳蛋白，且所述外壳蛋白自组装形成病毒样颗粒(VLP)。

在另一优选例中，所述细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞。

在另一优选例中，所述的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、所述外壳蛋白的ORF序列和终止密码子。

本发明的第四方面，提供了一种柯萨奇病毒A10型病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由本发明第三方面所述的基因工程细胞表达。

本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本发明第一方面所述的多核苷酸、本发明第二方面所述的表达载体、本发明第三方面所述的基因工程细胞、或本发明第四方面所述的病毒样颗粒(VLP)，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quil A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。

本发明的第六方面，提供了一种制备柯萨奇病毒A10型病毒样颗粒(VLP)的方法，所述方法包括步骤：

(1)培养本发明第三方面所述的基因工程细胞，从而在所述基因工程细胞内表达柯萨奇病毒A10型前体衣壳蛋白P1蛋白和3CD蛋白，并自组装形成具有免疫原性的病毒样颗粒(VLP)；

(2)分离所述的具有免疫原性的病毒样颗粒(VLP)。

在另一优选例中，步骤(1)包括步骤：

(1)将编码3CD蛋白的多核苷酸序列和编码P1蛋白的多核苷酸序列插入pPink-HC载体，构建成表达质粒，随后用所述表达质粒转化毕赤酵母感受态细胞，从而获得所述基因工程细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.毕赤酵母共表达CA10的P1和3CD蛋白(A)质粒YCA10-003示意图。TRP2-L与TRP2-R，TRP的上游和下游区域；PAOX1，AOX1启动子；CYC1TT，CYC1转录终止区；ADE2，编码氨基咪唑核苷酸羧化酶，作为筛选标记。(B)高表达株筛选。抗-CA10/S0148b多抗作为检测抗体。空载体转化的酵母菌体裂解液作为阴性对照(ctr)。(C)Western blotting分析酵母克隆表达状态。泳道M：Marker，泳道C：空载体转化的酵母菌体裂解液，泳道1、2：质粒YCA10-003转化菌株7、15裂解液。

图2.CA10-VLP的组装。质粒YCA10-003转化的酵母菌体裂解液过10％-50％，从上往下依次取12层。(A)Elisa。一抗：抗-CA10/S0148b抗体(B)Western blotting，一抗：抗-CA10VP0抗体。(C)Western blotting，一抗：抗-CA10VP1抗体。(D)Westernblotting，一抗：抗-CA10VP3抗体。(E)电镜图。Bar＝100nm。

图3.小鼠免疫及抗体反应。(A)SDS-PAGE分析CA10-VLP与对照抗原。(B)CA10-VLP包板作ELISA检测。三免两周血清1：1000稀释。(C)CA10特异性抗体滴度检测。(D)抗血清中和能力检测。每个点代表一只老鼠，横线代表几何平均值。

图4.抗-VLP血清赋予小鼠完全保护。6日龄ICR小鼠腹腔注射75μl抗-VLP血清或对照血清。24小时后，小鼠腹腔注射(A、B)CA10/Kowalik或(C、D)CA10/S0148b。连续15天观察记录小鼠的(A、C)存活率和(B、D)临床症状。临床症状评分等级如下：0，健康；1，行动迟缓；2，共济失调；3，瘫痪；4，死亡。

图5.母源免疫被动保护实验。免疫母鼠所生的7日龄小鼠腹腔注射(A、B)CA10/Kowalik或(C、D)CA10/S0148b。连续15天观察记录小鼠的(A、C)存活率和(B、D)临床症状。临床症状评分等级如下：0，健康；1，行动迟缓；2，共济失调；3，瘫痪；4，死亡。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外地获得了可以在酵母中高效表达且能够组装成VLP颗粒的多核苷酸序列，基于此开发了一种VLP形式的CA10疫苗，实验结果显示该疫苗具有良好的抗原性和免疫原性，并且能够保护小鼠抵抗致死剂量的CA10病毒感染。在此基础上，完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

柯萨奇病毒A10型及其病毒样颗粒

手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种常见的儿童传染性疾病。柯萨奇病毒A10型(Coxsackievirus A10,CA10)是HFMD的主要病原之一。柯萨奇病毒A10型的衣壳蛋白包括VP0蛋白、VP1蛋白、VP3蛋白，所述VP0蛋白、VP1蛋白和及VP3蛋白在细胞内部形成病毒样颗粒(VLP)。

本发明开发了一种基于病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)的CA10疫苗。在毕赤酵母中共表达CA10的P1和3CD蛋白，产生自组装的CA10-VLP,用该VLP免疫小鼠后，可在小鼠体内诱发CA10特异性的血清抗体。在小鼠攻毒试验中，注射CA10-VLP免疫血清可以保护小鼠在遭受致死剂量的CA10病毒攻击后存活下来；类似地，CA10-VLP免疫母鼠所生的幼鼠也得到了完全的保护。这些结果表明，CA10-VLP是一种有效的针对CA10的疫苗。

在本发明的一个优选地实施方式中，CA10的P1蛋白的氨基酸序列如下：

MGAQVSTQKSGSHETGNVATGGSTINFTNINYYKDSYAASATRQDFTQDPKKFTQPVLDSIKELSAPLNSPSVEACGYSDRVAQLTVGNSSITTQEAANIVLAYGEWPEYCPDTDATAVDKPTRPDVSVNRFYTLDSKMWQENSTGWYWKFPDVLNKTGVFGQNAQFHYLYRSGFCLHVQCNASKFHQGALLVAVIPEFVIAGRGSNTKPNEAPHPGFTTTFPGTTGATFHDPYVLDSGVPLSQALIYPHQWINLRTNNCATVIVPYINAVPFDSAINHSNFGLIVIPVSPLKYSSGATTAIPITITIAPLNSEFGGLRQAVSQGIPAELRPGTNQFLTTDDDTAAPILPGFTPTPTIHIPGEVHSLLELCRVETILEVNNTTEATGLTRLLIPVSSQNKADELCAAFMVDPGRIGPWQSTLVGQVCRYYTQWSGSLKVTFMFTGSFMATGKMLVAYSPPGSAQPANRETAMLGTHVIWDFGLQSSVSLVIPWISNTHFRTAKTGGNYDYYTAGVVTLWYQTNYVVPPETPGEAYIIAMGAAQDNFTLKICKDTDEVTQQAVLQGDPVEDIIHDALGNTARRAISSATNVESAANTTPSSHRLETGRVPALQAAETGATSNATDENMIETRCVVNRNGVLETTINHFFSRSGLVGVVNLTDGGTDTTGYATWDIDIMGFVQLRRKCEMFTYMRFNAEFTFVTTTDNGEARPYMLQYMYVPPGAPKPTGRDAFQWQTATNPSVFVKLTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGQHPETSNTTYGLCPNNMMGTFAVRVVSRKASQIKLQTRVYMKLKHVRAWVPRPIRSQPYLLKNFPNYDSSKIANSARDRSSIKQANM

(SEQ ID NO.1)；

优选地，其编码多核苷酸序列如下：

ATGGGAGCACAGGTTTCAACACAAAAGAGCGGTTCGCACGAGACAGGCAACGTCGCAACTGGCGGTTCCACAATCAACTTCACCAACATCAACTACTACAAGGACTCTTACGCTGCCTCAGCTACTCGCCAGGATTTCACACAAGACCCTAAGAAATTCACTCAGCCCGTGCTGGACTCTATCAAGGAGTTGTCAGCCCCACTGAACTCCCCGAGCGTCGAAGCATGCGGATACTCTGATCGTGTCGCGCAGCTGACCGTTGGTAACTCCAGCATCACCACTCAAGAGGCAGCGAACATTGTGCTCGCTTACGGAGAGTGGCCTGAATACTGTCCCGATACGGACGCAACCGCAGTCGACAAGCCTACCAGACCAGATGTCTCAGTTAACCGTTTCTACACTCTGGACTCTAAAATGTGGCAGGAAAACTCAACAGGCTGGTACTGGAAGTTCCCCGATGTCCTCAACAAAACCGGAGTTTTCGGTCAGAACGCTCAATTCCACTACCTCTACCGCTCTGGATTCTGCTTGCACGTGCAGTGTAACGCCTCAAAGTTCCATCAAGGTGCTCTGCTCGTGGCCGTCATCCCAGAGTTCGTCATTGCAGGTCGTGGCAGCAACACTAAACCTAACGAAGCGCCTCACCCCGGCTTCACAACGACCTTCCCCGGCACTACAGGAGCTACCTTCCATGACCCTTACGTGTTGGATAGTGGTGTGCCTCTGTCCCAGGCTTTGATCTACCCACACCAATGGATTAACCTGCGCACGAACAACTGCGCCACCGTTATCGTGCCATACATTAACGCAGTGCCGTTCGACTCCGCGATCAACCATAGCAACTTCGGTCTCATCGTTATTCCAGTGTCTCCGTTGAAGTACTCTTCAGGCGCAACGACCGCGATCCCAATTACCATCACTATTGCCCCGCTGAACTCCGAGTTCGGTGGTCTGCGCCAGGCTGTGTCCCAAGGCATCCCTGCGGAACTGCGTCCCGGAACAAACCAGTTCCTCACTACAGACGATGACACGGCTGCCCCTATCCTGCCCGGCTTCACACCAACGCCGACCATCCACATTCCTGGAGAGGTCCATTCCTTGCTGGAATTGTGTAGGGTGGAGACCATCCTGGAAGTCAACAACACGACCGAGGCTACTGGTCTCACAAGACTCTTGATTCCCGTTAGTTCGCAGAACAAGGCCGACGAATTGTGCGCAGCGTTCATGGTGGACCCTGGTAGGATCGGCCCGTGGCAGTCTACTTTGGTCGGTCAAGTTTGTAGATACTACACACAATGGTCTGGCTCACTGAAGGTTACGTTCATGTTCACCGGTTCATTCATGGCTACTGGCAAAATGCTCGTCGCCTACAGTCCTCCCGGATCGGCTCAGCCAGCCAACAGGGAGACTGCTATGTTGGGTACACACGTGATCTGGGACTTCGGCCTGCAATCCAGCGTGAGTCTCGTCATCCCTTGGATTTCGAACACCCATTTCAGAACGGCTAAGACCGGTGGTAACTACGATTACTACACGGCCGGCGTGGTCACCTTGTGGTATCAGACTAACTACGTTGTGCCACCGGAGACCCCAGGAGAAGCATACATCATTGCGATGGGTGCTGCCCAGGACAACTTCACTCTCAAGATTTGCAAAGATACTGACGAGGTTACACAGCAAGCTGTGCTGCAAGGCGATCCTGTGGAAGACATCATTCACGATGCACTCGGAAACACAGCACGCCGTGCGATCTCTTCAGCGACGAACGTGGAGAGTGCAGCGAACACTACACCTAGTTCGCATCGCTTGGAGACCGGACGTGTCCCCGCACTGCAGGCTGCAGAAACTGGTGCTACAAGCAACGCCACAGACGAGAACATGATCGAAACGCGTTGCGTCGTTAACAGAAACGGTGTCCTGGAAACGACCATTAACCACTTCTTCAGTAGGTCGGGATTGGTTGGTGTGGTCAACCTGACGGACGGCGGAACCGATACTACAGGTTACGCTACCTGGGATATCGACATTATGGGCTTCGTGCAGCTGAGGAGAAAGTGTGAGATGTTCACCTACATGCGCTTCAACGCTGAGTTCACTTTCGTGACGACCACTGACAACGGCGAGGCCCGTCCCTACATGCTGCA ATACATGTACGTCCCTCCCGGAGCTCCTAAGCCCACTGGTCGTGACGCTTTCCAGTGGCAAACTGCCACAAACCCAAGTGTCTTCGTTAAACTGACAGATCCACCGGCCCAGGTGTCGGTCCCATTCATGTCCCCGGCTAGCGCCTACCAGTGGTTCTACGACGGCTACCCTACCTTCGGACAACACCCCGAAACTTCCAACACAACGTACGGCCTGTGCCCTAACAACATGATGGGAACATTCGCTGTGAGGGTTGTGTCCAGAAAGGCCAGCCAGATCAAACTCCAAACCAGGGTCTACATGAAGTTGAAACACGTTAGAGCATGGGTGCCAAGACCAATCCGTAGCCAACCCTACCTGCTCAAGAACTTCCCAAACTACGACAGCAGCAAAATCGCCAACTCAGCAAGAGATAGGTCATCAATCAAACAAGCCAACATG

(SEQ ID NO.2)。

在本发明的一个优选地实施方式中，CA10的3CD蛋白的氨基酸序列如下：

MGPSLDFALSLLRRNIRQAQTDQGHFTMLGIRDRLAILPRHSQPGKTIWIEHKLVNVLDAVELVDEQGVNLELTLVTLDTNEKFRDITKFIPETIAGASDATLVINTEHMPSMFVPIGDVVQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQCGGVVTSVGKIIGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQGEIQWMKPNKETGRLNINGPTRTKLEPSVFHNVFEGNKEPAVLTSKDPRLEVDFEQALFSKYVGNTLHEPDEYVTQAALHYANQLKQLDINTSKMSMEEACYGTENLEAIDLHTSAGYPYSALGIKKRDILDPVTRDTSKMKLYMDKYGLDLPYSTYVKDELRSLDKIKKGKSRLIEASSLNDSVYLRMTFGHLYEVFHANPGTITGSAVGCNPDVFWSKLPILLPGSLFAFDYSSYDASLSPVWFRALELVLREIGYSEEAVSLIEGINHTHHVYRNKTYCVLGGMPSGCSGTSIFNSMINNIIIRTLLIKTFKGIDLDELNMVAYGDDVLASYPFPIDCLELARTGKEYGLTMTPADKSPCFNEVTWENATFLKRGFLPDHQFPFLIHPTMPMREIHESIRWTKDARNTQDHVRSLCLLAWHNGKEEYEKFVSTIRSVPIGKALAIPNFENLRRNWLELF(SEQ ID NO.3)；

优选地，其编码多核苷酸序列如下：

atgggacctagcttggacttcgctttgtctcttctgaggcgcaacatcagacaagcgcagaccgaccagggacacttcaccatgctaggcatacgggaccgtctagccatcttgccacgccactcacaaccagggaagaccatctggatagagcacaaattggtcaacgtactagatgcagttgagttggtggatgagcaaggtgttaatttggaactcacgctggtgaccttggacactaatgagaagtttagggacattaccaagttcatcccagagacaatagctggtgctagtgatgcaactctagttatcaacactgagcatatgccctcgatgtttgtgccaataggtgacgttgtgcagtatgggtttttgaatctcagtggcaaacccacacacagaactatgatgtacaatttccccacgaaagcaggacagtgtgggggggtagtcacttcagttggcaagatcattggaatccacattggcgggaatggacgccagggcttctgcgctggtttaaagaggagctactttgccagcgagcaaggagagatccagtggatgaagcccaacaaagagactgggaggctgaacatcaatggtccaacccgaaccaaactggaacctagcgtgttccacaatgtgttcgagggtaataaagagc cagcagttctgaccagtaaagaccccaggcttgaggttgattttgaacaagccttgttctccaaatatgtgggcaacactctgcatgagcctgatgagtatgtgacacaagctgcccttcattacgcaaatcaattaaaacaactagacataaacaccagcaagatgagcatggaggaggcgtgctatggtacagaaaatttagaagctatagacctacacaccagtgctggatatccttatagtgccttgggtattaaaaagagggatattcttgatccggtcaccagggacacctccaagatgaaactatacatggacaagtatggactagatttaccctattcaacctatgtgaaggatgagcttaggtctctagataaaatcaagaaggggaaatctcgcttaattgaggccagcagcttgaatgattctgtctaccttagaatgacttttggtcatctttatgaggtgtttcacgccaacccgggaactataaccgggtctgcagtggggtgtaatcctgatgtgttctggagcaagttgccaattctactaccgggttcgctctttgcgtttgactactcaagctatgatgcaagtcttagtcctgtatggttcagagctttagaattggttttacgagagattggttactcagaggaggctgtgtcactcatagaggggattaaccacactcaccatgtgtatcggaataagacatactgtgtccttggtgggatgccttcaggttgctctggcacttccattttcaattccatgattaacaacataatcattagaactctcttgatcaagacgttcaaagggatagacttggatgaactaaacatggtggcctacggagatgatgtactggctagctacccatttcccatcgactgtttggagttggcgagaactggcaaagagtatggactgactatgactcccgccgataagtcaccctgttttaatgaagtcacctgggagaacgcaacctttttgaagaggggtttcctaccagaccatcagttcccttttctaatccaccctaccatgcccatgagggaaatccacgagtccattcgttggaccaaggatgcacgtaacactcaagaccacgtgcgttccctttgcttgttggcgtggcacaatggaaaggaggaatatgaaaaatttgtgagcacaatcagatcagttcctattggaaaagccttggcgataccaaattttgagaacttgaggagaaattggctcgaattgttttaa(SEQ ID NO.4)。

基因工程细胞

本发明提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞表达根据本发明的柯萨奇病毒A10型病毒样颗粒。

本发明中，术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的重组病毒样颗粒(VLP)或本发明的可编码重组病毒样颗粒的多核苷酸，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是单价的(仅含有一种重组病毒样颗粒或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多种重组病毒样颗粒或多核苷酸)。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(1)药物组合物

本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明重组病毒样颗粒或多核苷酸。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的重组病毒样颗粒。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的重组病毒样颗粒)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组病毒样颗粒)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。

(iii)给药途径和剂量

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予重组病毒样颗粒疫苗，即重组病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。

代表性的疾病包括(但并不限于)：柯萨奇病毒A10型感染等。

在各疫苗剂份中所选用的重组病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予。

本发明的主要优点在于：

(1)首次实现了在基因工程细胞内部表达形成柯萨奇病毒A10型病毒样颗粒(VLP)；

(2)本发明的重组柯萨奇病毒A10型病毒样颗粒能够在宿主细胞内相对高表达，从而降低制备成本。

(3)本发明的重组柯萨奇病毒A10型病毒样颗粒能够特异性地与抗柯萨奇病毒A10型抗体结合，可以用于柯萨奇病毒A10型抗体的检测。

(4)本发明的重组柯萨奇病毒A10型病毒样颗粒能够诱发动物体产生抗柯萨奇病毒A10型的免疫反应。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料与方法

1菌株和抗体

本实验中用到三株CA10病毒，CA10/Kowalik(GenBank ID:AY421764.1)购自美国菌种保藏中心(ATCC#VR-168)，临床株C A10/S0148b(GenBankID:KX094564.1)和CA10/S0273b(GenBank ID:KX094565.1)分离自临床样本。在大肠杆菌中表达CA10的VP0蛋白，用该蛋白免疫兔子后得到抗-CA10VP0多抗，用同样的方法表达产生CA10的VP1和VP3蛋白，分别免疫小鼠后得到抗-CA10VP1和抗-CA10VP3多抗。抗-CA10/S0148b多抗为本实验室制备。(相关制备参考Shen C et al.Inactivated coxsackievirus A10 experimentalvaccines protect mice against lethal viral challenge.Vaccine.2016 Sep 22；34(41):5005-12.)

2载体构建

通过逆转录得到CA10/Kowalik的cDNA基因。然后，以cDNA为模板扩增得到3CD片段并将其克隆pPink-HC(Invitrogen)产生质粒YCA10-001。在金斯瑞公司(上海，中国)优化合成临床株S0273b(GenBank ID:KX094565.1)的P1基因，克隆到载体pPink-HC(Invitrogen),产生质粒YCA10-002。通过同源重组的方法在BglII位点将3CD表达盒插入到质粒YCA10-002中，产生质粒YCA10-003。

3酵母转化与筛选

单酶切EcoNI位点将质粒YCA10-003线性化，电转化进入PichiaPink^TMStrain 1(Invitrogen)。酵母转化及随后的转化株筛选都是根据产品说明书操作。转化的酵母克隆先进行小规模培养和甲醇诱导。诱导结束后，离心菌液，裂解菌体。收集裂解液上清用于ELISA和Western blotting分析。

4酶联免疫吸附实验和免疫印迹实验

取上述得到的裂解液上清进行酶联免疫吸附实验。每孔含有5μl裂解液上清和45μl PBS溶液包被96孔Elisa板，4℃过夜，然后用含5％脱脂牛奶的PBST溶液37℃孵育1h，再用抗-CA10/S0148b多克隆抗体作为一抗37℃孵育2h，相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗进行孵育1h，最后用TMB显色终止后读取吸光值OD450。

免疫印迹实验如前所述，通过特异性的多克隆抗体(抗-CA10VP0，抗-CA10VP1和抗-CA10VP3)及其对应的HRP标记二抗进行检测分析。

5VLP的表达与纯化

CA10-VLP的表达和纯化如前所述。空载体pPink-HC转化酵母菌作为对照组，纯化的蛋白作为对照抗原。最终得到的CA10-VLP通过Bradford法确定浓度。

6电镜检测电子显微镜观察采用本领域常规方法进行。

7小鼠免疫与抗体检测

纯化后的CA10-VLP用0.15M PBS稀释，然后将6μg CA10VLP或对照抗原(300μl)与等体积的铝佐剂Alhydrogel(3mg)(Invivogen,USA)等体积1:1充分混合。选用两组(6只/组)6周龄ICR雌鼠分别腹腔注射对照抗原或CA10VLP，1μg/只。在第0，2，4周免疫，共免疫三次。在第6，7，8周采血，分离血清用于抗体检测和体内被动保护实验。

通过ELISA实验确定血清中CA10特异性的IgG抗体，方法如前所述(31)。简而言之，用CA10-VLP包被96孔板(10ng/孔)，4℃过夜，用含5％脱脂牛奶的PBST溶液37℃封闭1h，然后分别用抗-pPink HC和抗-CA10VLP的血清作为一抗37℃孵育2h，相应HRP标记的二抗孵育1h后读取吸光值OD450。

8中和实验

中和实验方法如前所述。简而言之，在96孔板中用含2％FBS的DMEM二倍稀释血清样品，从16倍开始稀释到2048倍。50μl稀释血清与50μl的CA10/Kowalik或CA10/S0148b病毒稀释液(含100TCID50的病毒)在37℃、5％CO2培养箱孵育1小时。然后每孔加入1.5×10⁴个(100μl)RD细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中继续孵育72小时后，在显微镜下观察细胞病变。使细胞不病变的血清最高稀释度定义为该血清样品的中和滴度。

9血清被动保护实验

挑选四组ICR小鼠，6日龄时腹腔注射75μl抗-VLP血清或对照组血清，24h后，腹腔注射4.65×105TCID50的CA10/Kowalik病毒或8.9×105TCID50的CA10/S0148b病毒。随后，连续15天观察记录小鼠的临床状况和存活率。临床打分标准如下：0，健康；1，行动缓慢；2，共济失调；3，瘫痪；4，死亡。

10母源被动保护实验

从疫苗组和对照组小鼠中分别挑选2只雌鼠与ICR雄鼠交配产仔。所生的新生鼠于7日龄时腹腔注射4.65×10⁵TCID₅₀的CA10/Kowalik病毒或8.9×10⁵TCID₅₀的CA10/S0148b病毒。随后，连续15天观察记录小鼠的临床状况和存活率。临床打分标准如下：0，健康；1，行动缓慢；2，共济失调；3，瘫痪；4，死亡。

11数据统计

统计学差异分析使用GraphPad Prism version 5软件完成双尾t-检测。

实施例1VLP的表达和纯化

为了表达CA10-VLP，将3CD和P1基因一同插入pPink-HC载体上，构建成质粒YCA10-003(图1A)，随后用该质粒转化毕赤酵母感受态，小量表达获得菌体裂解液离心上清用于ELISA和Western blotting分析。转化空载体pPink-HC的酵母克隆平行操作作为阴性对照。与对照组相比，质粒YCA10-003转化的酵母菌裂解液上清表现出了明显的抗原抗体反应(图1B)。从酵母克隆里挑出反应最强的两个转化株进行Western blotting分析，实验结果如图所示(图1C)，分别用抗-CA10VP0、抗-CA10VP3、抗-CA10VP1作为检测抗体，三个酵母裂解液样品都出现了对应的条带，大小分别为39kDa、29kDa、37kDa，对照组并未出现对应的条带。以上结果表明质粒YCA10-003转化的酵母株能够表达P1蛋白，并且3CD能够将P1切割成VP0、VP1、VP3。

YCA10-003转化的酵母菌体裂解液随后用于蔗糖密度梯度离心。取梯度样品进行Elisa分析，可以看见#7，#8和#9层OD值比较高(图2A)；取梯度样品进行Western blotting分析，分别用抗-CA10VP0、抗-CA10VP1、抗-CA10VP3作为检测抗体，在#7，#8和#9层能看到大小分别为39kDa、37kDa、29kDa的三个条带(图2B-D)。VP0、VP1、VP3在#7，#8和#9层的共迁移现象提示它们共组装成VLP结构。随后将#7，#8和#9层样品混合后在电镜下观察，可以看到直径约为30nm的球形颗粒结构(图2E)。以上结果显示毕赤酵母能够表达CA10-VLP。

本实施例中对编码P1蛋白的基因进行了优化，因此在本发明中，提供了优化的、特别适合在毕赤酵母细胞中表达的编码P1蛋白和编码3CD蛋白的核酸编码序列。经过筛选，获得了能够在酵母中高效表达的P1蛋白基因序列，而原始的3CD蛋白基因序列即可较好的在酵母细胞中表达。

本发明人在不改变氨基酸序列的前提下对P1蛋白的DNA序列进行了优化。然而，本发明人发现，仅依据密码子频率获得的优化序列并不完全适合在毕赤酵母中表达。因此本发明人进行了二次优化，其中包括消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变基因中A+T组成、改变G+C含量等。本发明针对目的基因P1的优化，与未优化的核酸序列相比较，密码适应指数(Codon Apatation Index)从0.74升高为0.86，核苷酸同源性为75.5％，P1基因原核苷酸GC含量48.99％，优化后的P1基因GC含量为53.75％，针对序列的GC含量进行了调整和优化，消除了原始序列中GC含量较高的区域；针对原始序列中的重复序列和顺式作用因子等复杂结构(GGAGGA、GGGGGG、CCCGGG、GGGCTAATA、AGGGGA、CCCGGA、AATAAA)进行优化；根据偏好性针对原核苷酸中存在的稀有密码子(CGA、CGG、GGG)进行了优化。

将初步优化的一系列基因序列转化到毕赤酵母中进行表达验证，一部分基因序列表达量较低甚至无法表达，一部分基因序列表达产物无法组装成VLP。经过大量测试和筛选，本发明人在众多优化序列中获得了一个特别优化的P1蛋白编码序列，其序列如SEQ IDNO.2所示，这条基因序列不仅表达量高，而且表达后能够自组装形成VLP。使用本发明的方法进行VLP制备，目标蛋白纯化后产量达到1.2mg/L,与已发表的文献相比较(文献Shen C,Liu Q,Zhou Y,Ku Z,Wang L,Lan K,Ye X*,Huang Z*.(2016)Inactivatedcoxsackievirus A10experimental vaccines protect mice against lethal viralchallenge.Vaccine 34:5005-5012.中采用Vero细胞生产CA10灭活疫苗产量为0.68mg/L)，产量达到了野生型的两倍。

实施例2.CA10-VLP在小鼠体内的免疫原性

免疫小鼠前，制备CA10-VLP和对照抗原并且定量(图3A)，随后分别添加铝佐剂。取两组(6只/组)ICR小鼠在第0，2，4周时分别腹腔注射CA10-VLP疫苗和对照抗原，在第6周时采血用于ELISA分析和中和实验。用CA10-VLP包板的ELISA结果显示，疫苗组小鼠都出现了明显的抗原抗体反应(图3B)，并且几何平均滴度达到了45254.8(图3C)；而对照组无明显反应。在病毒微中和实验中，对照组小鼠血清即使在最低稀释度(1：16)时也未能表现出中和能力；而疫苗组小鼠血清对同源毒株CA10/S0273b及异源毒株CA10/kowalik和CA10/S0148b都表现出了较强的中和能力，几何平均滴度分别为287.4、101.6、181(图3D)。以上结果不仅证明了CA10-VLP具有很高的免疫原性，而且显示CA10-VLP所诱导的血清抗体具有交叉中和性。

实施例3.CA10-VLP疫苗抗血清具有体内保护效果

首先通过病毒攻击试验去评价抗-VLP抗体的体内保护效果。6日龄新生小鼠腹腔注射75μl的抗-VLP血清或对照组血清，并在24小时后腹腔注射致死剂量的CA10/Kowalik或CA10/S0148b病毒，随后观察病毒攻击小鼠的临床症状及死亡情况。结果显示，注射对照血清的小鼠在CA10/Kowalik病毒攻击后逐渐出现严重的临床症状，包括行动迟缓，共济失调和瘫痪，并且在攻毒后9天内全部死亡；与之相反，注射抗-VLP血清的小鼠，在15天的观察期内并未出现明显的临床症状(图4A-B)。类似地，CA10/S0148b病毒攻击后，对照组小鼠在7天内全部死亡，注射抗-VLP血清的小鼠全部存活并且未出现明显的临床症状(图4C-D)。以上实验结果表明CA10-VLP所诱导的血清抗体能够完全保护小鼠。

随后我们采用了免疫母鼠-病毒攻击幼鼠的方法进一步评价疫苗的抗病毒保护效果。免疫母鼠所生的新生小鼠在7日龄时腹腔注射致死剂量的CA10/Kowalik或CA10/S0148b病毒，随后15天观察其临床症状及死亡情况。在注射CA10/Kowalik后，对照组小鼠逐渐出现严重的临床症状并在10天内全部死亡，而疫苗组小鼠在整个观察期内并未出现明显的临床症状(图5A-B)。类似地，在CA10/S0148b病毒攻击后，对照组小鼠在6天内即全部死亡，而疫苗组小鼠全部成活(图5C-D)。该结果表明CA10-VLP疫苗能够诱导保护性的免疫反应。

4讨论

随着EV71疫苗的上市，群体会逐渐获得针对EV71的抵抗力。以CA16、CA6、CA10为代表的柯萨奇病毒家族将更多的威胁婴幼儿健康。同时，CA16与CA6已有多种候选疫苗可用，因此，研发针对CA10的疫苗已经十分迫切。

本发明成功地在毕赤酵母中表达了CA10-VLP，该VLP能在小鼠体内诱导产生较高滴度的中和抗体。更重要的是，在血清被动保护和母源被动保护实验中，CA10-VLP疫苗组小鼠都得到了完全的保护。这些结果说明CA10-VLP是优秀的CA10疫苗候选者，值得进一步开发。

EV71、CA16、CA6、CA10是当前HFMD的主要致病原。基于VLP的EV71、CA16、CA6重组已分别完成了概念性验证，因此CA10-VLP疫苗可以与之组合成四联苗。这种四联苗将具有更广谱的保护效果，对于全面有效地防控HFMD将产生重要作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海巴斯德研究所

<120> 酵母表达的柯萨奇病毒A10 病毒样颗粒及其应用

<130> P2017-0012

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 柯萨奇病毒A10 型

<400> 1

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Gly

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Thr Arg Gln Asp Phe Thr Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ser Ile Lys Glu Leu

50 55 60

Ser Ala Pro Leu Asn Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Ser Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Leu Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Ser Lys Met Trp Gln Glu Asn Ser

130 135 140

Thr Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Lys Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Leu His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Ile Pro Glu Phe Val Ile Ala Gly Arg Gly Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Pro Asn Glu Ala Pro His Pro Gly Phe Thr Thr Thr Phe Pro Gly

210 215 220

Thr Thr Gly Ala Thr Phe His Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ser Gly Val

225 230 235 240

Pro Leu Ser Gln Ala Leu Ile Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg

245 250 255

Thr Asn Asn Cys Ala Thr Val Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Val Pro

260 265 270

Phe Asp Ser Ala Ile Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ile Val Ile Pro

275 280 285

Val Ser Pro Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ile Pro Ile

290 295 300

Thr Ile Thr Ile Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Gly Gly Leu Arg Gln

305 310 315 320

Ala Val Ser Gln Gly Ile Pro Ala Glu Leu Arg Pro Gly Thr Asn Gln

325 330 335

Phe Leu Thr Thr Asp Asp Asp Thr Ala Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe

340 345 350

Thr Pro Thr Pro Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Ser Leu Leu

355 360 365

Glu Leu Cys Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Glu

370 375 380

Ala Thr Gly Leu Thr Arg Leu Leu Ile Pro Val Ser Ser Gln Asn Lys

385 390 395 400

Ala Asp Glu Leu Cys Ala Ala Phe Met Val Asp Pro Gly Arg Ile Gly

405 410 415

Pro Trp Gln Ser Thr Leu Val Gly Gln Val Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln

420 425 430

Trp Ser Gly Ser Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met

435 440 445

Ala Thr Gly Lys Met Leu Val Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Ser Ala Gln

450 455 460

Pro Ala Asn Arg Glu Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp

465 470 475 480

Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Ser Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn

485 490 495

Thr His Phe Arg Thr Ala Lys Thr Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Tyr Thr

500 505 510

Ala Gly Val Val Thr Leu Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Pro

515 520 525

Glu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ile Ile Ala Met Gly Ala Ala Gln Asp

530 535 540

Asn Phe Thr Leu Lys Ile Cys Lys Asp Thr Asp Glu Val Thr Gln Gln

545 550 555 560

Ala Val Leu Gln Gly Asp Pro Val Glu Asp Ile Ile His Asp Ala Leu

565 570 575

Gly Asn Thr Ala Arg Arg Ala Ile Ser Ser Ala Thr Asn Val Glu Ser

580 585 590

Ala Ala Asn Thr Thr Pro Ser Ser His Arg Leu Glu Thr Gly Arg Val

595 600 605

Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr Asp

610 615 620

Glu Asn Met Ile Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Arg Asn Gly Val Leu

625 630 635 640

Glu Thr Thr Ile Asn His Phe Phe Ser Arg Ser Gly Leu Val Gly Val

645 650 655

Val Asn Leu Thr Asp Gly Gly Thr Asp Thr Thr Gly Tyr Ala Thr Trp

660 665 670

Asp Ile Asp Ile Met Gly Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Met

675 680 685

Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Thr Thr Thr

690 695 700

Asp Asn Gly Glu Ala Arg Pro Tyr Met Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro

705 710 715 720

Pro Gly Ala Pro Lys Pro Thr Gly Arg Asp Ala Phe Gln Trp Gln Thr

725 730 735

Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln

740 745 750

Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr

755 760 765

Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Gln His Pro Glu Thr Ser Asn Thr Thr

770 775 780

Tyr Gly Leu Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ala Val Arg Val

785 790 795 800

Val Ser Arg Lys Ala Ser Gln Ile Lys Leu Gln Thr Arg Val Tyr Met

805 810 815

Lys Leu Lys His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Ile Arg Ser Gln

820 825 830

Pro Tyr Leu Leu Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Ser Lys Ile Ala

835 840 845

Asn Ser Ala Arg Asp Arg Ser Ser Ile Lys Gln Ala Asn Met

850 855 860

<210> 2

<211> 2586

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggagcac aggtttcaac acaaaagagc ggttcgcacg agacaggcaa cgtcgcaact 60

ggcggttcca caatcaactt caccaacatc aactactaca aggactctta cgctgcctca 120

gctactcgcc aggatttcac acaagaccct aagaaattca ctcagcccgt gctggactct 180

atcaaggagt tgtcagcccc actgaactcc ccgagcgtcg aagcatgcgg atactctgat 240

cgtgtcgcgc agctgaccgt tggtaactcc agcatcacca ctcaagaggc agcgaacatt 300

gtgctcgctt acggagagtg gcctgaatac tgtcccgata cggacgcaac cgcagtcgac 360

aagcctacca gaccagatgt ctcagttaac cgtttctaca ctctggactc taaaatgtgg 420

caggaaaact caacaggctg gtactggaag ttccccgatg tcctcaacaa aaccggagtt 480

ttcggtcaga acgctcaatt ccactacctc taccgctctg gattctgctt gcacgtgcag 540

tgtaacgcct caaagttcca tcaaggtgct ctgctcgtgg ccgtcatccc agagttcgtc 600

attgcaggtc gtggcagcaa cactaaacct aacgaagcgc ctcaccccgg cttcacaacg 660

accttccccg gcactacagg agctaccttc catgaccctt acgtgttgga tagtggtgtg 720

cctctgtccc aggctttgat ctacccacac caatggatta acctgcgcac gaacaactgc 780

gccaccgtta tcgtgccata cattaacgca gtgccgttcg actccgcgat caaccatagc 840

aacttcggtc tcatcgttat tccagtgtct ccgttgaagt actcttcagg cgcaacgacc 900

gcgatcccaa ttaccatcac tattgccccg ctgaactccg agttcggtgg tctgcgccag 960

gctgtgtccc aaggcatccc tgcggaactg cgtcccggaa caaaccagtt cctcactaca 1020

gacgatgaca cggctgcccc tatcctgccc ggcttcacac caacgccgac catccacatt 1080

cctggagagg tccattcctt gctggaattg tgtagggtgg agaccatcct ggaagtcaac 1140

aacacgaccg aggctactgg tctcacaaga ctcttgattc ccgttagttc gcagaacaag 1200

gccgacgaat tgtgcgcagc gttcatggtg gaccctggta ggatcggccc gtggcagtct 1260

actttggtcg gtcaagtttg tagatactac acacaatggt ctggctcact gaaggttacg 1320

ttcatgttca ccggttcatt catggctact ggcaaaatgc tcgtcgccta cagtcctccc 1380

ggatcggctc agccagccaa cagggagact gctatgttgg gtacacacgt gatctgggac 1440

ttcggcctgc aatccagcgt gagtctcgtc atcccttgga tttcgaacac ccatttcaga 1500

acggctaaga ccggtggtaa ctacgattac tacacggccg gcgtggtcac cttgtggtat 1560

cagactaact acgttgtgcc accggagacc ccaggagaag catacatcat tgcgatgggt 1620

gctgcccagg acaacttcac tctcaagatt tgcaaagata ctgacgaggt tacacagcaa 1680

gctgtgctgc aaggcgatcc tgtggaagac atcattcacg atgcactcgg aaacacagca 1740

cgccgtgcga tctcttcagc gacgaacgtg gagagtgcag cgaacactac acctagttcg 1800

catcgcttgg agaccggacg tgtccccgca ctgcaggctg cagaaactgg tgctacaagc 1860

aacgccacag acgagaacat gatcgaaacg cgttgcgtcg ttaacagaaa cggtgtcctg 1920

gaaacgacca ttaaccactt cttcagtagg tcgggattgg ttggtgtggt caacctgacg 1980

gacggcggaa ccgatactac aggttacgct acctgggata tcgacattat gggcttcgtg 2040

cagctgagga gaaagtgtga gatgttcacc tacatgcgct tcaacgctga gttcactttc 2100

gtgacgacca ctgacaacgg cgaggcccgt ccctacatgc tgcaatacat gtacgtccct 2160

cccggagctc ctaagcccac tggtcgtgac gctttccagt ggcaaactgc cacaaaccca 2220

agtgtcttcg ttaaactgac agatccaccg gcccaggtgt cggtcccatt catgtccccg 2280

gctagcgcct accagtggtt ctacgacggc taccctacct tcggacaaca ccccgaaact 2340

tccaacacaa cgtacggcct gtgccctaac aacatgatgg gaacattcgc tgtgagggtt 2400

gtgtccagaa aggccagcca gatcaaactc caaaccaggg tctacatgaa gttgaaacac 2460

gttagagcat gggtgccaag accaatccgt agccaaccct acctgctcaa gaacttccca 2520

aactacgaca gcagcaaaat cgccaactca gcaagagata ggtcatcaat caaacaagcc 2580

aacatg 2586

<210> 3

<211> 646

<212> PRT

<213> 柯萨奇病毒A10 型

<400> 3

Met Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Ile

1 5 10 15

Arg Gln Ala Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Ile Arg

20 25 30

Asp Arg Leu Ala Ile Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile

35 40 45

Trp Ile Glu His Lys Leu Val Asn Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val

50 55 60

Asp Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Val Thr Leu Asp Thr

65 70 75 80

Asn Glu Lys Phe Arg Asp Ile Thr Lys Phe Ile Pro Glu Thr Ile Ala

85 90 95

Gly Ala Ser Asp Ala Thr Leu Val Ile Asn Thr Glu His Met Pro Ser

100 105 110

Met Phe Val Pro Ile Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly Phe Leu Asn Leu

115 120 125

Ser Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys

130 135 140

Ala Gly Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Ile Ile Gly

145 150 155 160

Ile His Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys

165 170 175

Arg Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gln Gly Glu Ile Gln Trp Met Lys Pro

180 185 190

Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu Asn Ile Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys

195 200 205

Leu Glu Pro Ser Val Phe His Asn Val Phe Glu Gly Asn Lys Glu Pro

210 215 220

Ala Val Leu Thr Ser Lys Asp Pro Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln

225 230 235 240

Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly Asn Thr Leu His Glu Pro Asp Glu

245 250 255

Tyr Val Thr Gln Ala Ala Leu His Tyr Ala Asn Gln Leu Lys Gln Leu

260 265 270

Asp Ile Asn Thr Ser Lys Met Ser Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr

275 280 285

Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Leu His Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr

290 295 300

Ser Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg Asp Ile Leu Asp Pro Val Thr Arg

305 310 315 320

Asp Thr Ser Lys Met Lys Leu Tyr Met Asp Lys Tyr Gly Leu Asp Leu

325 330 335

Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp Glu Leu Arg Ser Leu Asp Lys Ile

340 345 350

Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser

355 360 365

Val Tyr Leu Arg Met Thr Phe Gly His Leu Tyr Glu Val Phe His Ala

370 375 380

Asn Pro Gly Thr Ile Thr Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val

385 390 395 400

Phe Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu Leu Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe

405 410 415

Asp Tyr Ser Ser Tyr Asp Ala Ser Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala

420 425 430

Leu Glu Leu Val Leu Arg Glu Ile Gly Tyr Ser Glu Glu Ala Val Ser

435 440 445

Leu Ile Glu Gly Ile Asn His Thr His His Val Tyr Arg Asn Lys Thr

450 455 460

Tyr Cys Val Leu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile

465 470 475 480

Phe Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile Ile Ile Arg Thr Leu Leu Ile Lys

485 490 495

Thr Phe Lys Gly Ile Asp Leu Asp Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly

500 505 510

Asp Asp Val Leu Ala Ser Tyr Pro Phe Pro Ile Asp Cys Leu Glu Leu

515 520 525

Ala Arg Thr Gly Lys Glu Tyr Gly Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys

530 535 540

Ser Pro Cys Phe Asn Glu Val Thr Trp Glu Asn Ala Thr Phe Leu Lys

545 550 555 560

Arg Gly Phe Leu Pro Asp His Gln Phe Pro Phe Leu Ile His Pro Thr

565 570 575

Met Pro Met Arg Glu Ile His Glu Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Ala

580 585 590

Arg Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His

595 600 605

Asn Gly Lys Glu Glu Tyr Glu Lys Phe Val Ser Thr Ile Arg Ser Val

610 615 620

Pro Ile Gly Lys Ala Leu Ala Ile Pro Asn Phe Glu Asn Leu Arg Arg

625 630 635 640

Asn Trp Leu Glu Leu Phe

645

<210> 4

<211> 1941

<212> DNA

<213> 柯萨奇病毒A10 型

<400> 4

atgggaccta gcttggactt cgctttgtct cttctgaggc gcaacatcag acaagcgcag 60

accgaccagg gacacttcac catgctaggc atacgggacc gtctagccat cttgccacgc 120

cactcacaac cagggaagac catctggata gagcacaaat tggtcaacgt actagatgca 180

gttgagttgg tggatgagca aggtgttaat ttggaactca cgctggtgac cttggacact 240

aatgagaagt ttagggacat taccaagttc atcccagaga caatagctgg tgctagtgat 300

gcaactctag ttatcaacac tgagcatatg ccctcgatgt ttgtgccaat aggtgacgtt 360

gtgcagtatg ggtttttgaa tctcagtggc aaacccacac acagaactat gatgtacaat 420

ttccccacga aagcaggaca gtgtgggggg gtagtcactt cagttggcaa gatcattgga 480

atccacattg gcgggaatgg acgccagggc ttctgcgctg gtttaaagag gagctacttt 540

gccagcgagc aaggagagat ccagtggatg aagcccaaca aagagactgg gaggctgaac 600

atcaatggtc caacccgaac caaactggaa cctagcgtgt tccacaatgt gttcgagggt 660

aataaagagc cagcagttct gaccagtaaa gaccccaggc ttgaggttga ttttgaacaa 720

gccttgttct ccaaatatgt gggcaacact ctgcatgagc ctgatgagta tgtgacacaa 780

gctgcccttc attacgcaaa tcaattaaaa caactagaca taaacaccag caagatgagc 840

atggaggagg cgtgctatgg tacagaaaat ttagaagcta tagacctaca caccagtgct 900

ggatatcctt atagtgcctt gggtattaaa aagagggata ttcttgatcc ggtcaccagg 960

gacacctcca agatgaaact atacatggac aagtatggac tagatttacc ctattcaacc 1020

tatgtgaagg atgagcttag gtctctagat aaaatcaaga aggggaaatc tcgcttaatt 1080

gaggccagca gcttgaatga ttctgtctac cttagaatga cttttggtca tctttatgag 1140

gtgtttcacg ccaacccggg aactataacc gggtctgcag tggggtgtaa tcctgatgtg 1200

ttctggagca agttgccaat tctactaccg ggttcgctct ttgcgtttga ctactcaagc 1260

tatgatgcaa gtcttagtcc tgtatggttc agagctttag aattggtttt acgagagatt 1320

ggttactcag aggaggctgt gtcactcata gaggggatta accacactca ccatgtgtat 1380

cggaataaga catactgtgt ccttggtggg atgccttcag gttgctctgg cacttccatt 1440

ttcaattcca tgattaacaa cataatcatt agaactctct tgatcaagac gttcaaaggg 1500

atagacttgg atgaactaaa catggtggcc tacggagatg atgtactggc tagctaccca 1560

tttcccatcg actgtttgga gttggcgaga actggcaaag agtatggact gactatgact 1620

cccgccgata agtcaccctg ttttaatgaa gtcacctggg agaacgcaac ctttttgaag 1680

aggggtttcc taccagacca tcagttccct tttctaatcc accctaccat gcccatgagg 1740

gaaatccacg agtccattcg ttggaccaag gatgcacgta acactcaaga ccacgtgcgt 1800

tccctttgct tgttggcgtg gcacaatgga aaggaggaat atgaaaaatt tgtgagcaca 1860

atcagatcag ttcctattgg aaaagccttg gcgataccaa attttgagaa cttgaggaga 1920

aattggctcg aattgtttta a 1941

Claims

1.一种用于共表达柯萨奇病毒A10型P1蛋白和3CD蛋白的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A10 型（Coxsackievirus A10, CA10）P1蛋白的多核苷酸序列和编码柯萨奇病毒A10 型3CD蛋白的多核苷酸序列，其中所述编码柯萨奇病毒A10型P1蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，并且所述柯萨奇病毒A10型3CD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2. 如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码柯萨奇病毒A10 型3CD蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为适合酵母表达的基因序列。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为以pPink-HC载体为骨架。

7.一种基因工程细胞，其特征在于，所述的基因工程细胞含有权利要求5所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求1所述的多核苷酸，并且所述基因工程细胞不是动物和植物品种。

8.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述基因工程细胞为真核细胞，并且所述细胞的基因组中整合有柯萨奇病毒A10型外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有柯萨奇病毒A10型外壳蛋白的表达盒；

9.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞为酵母细胞。

10.如权利要求9所述的细胞，其特征在于，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞。

11.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、所述外壳蛋白的ORF序列和终止密码子。

12.一种柯萨奇病毒A10型病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由权利要求7所述的基因工程细胞表达。

13.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的多核苷酸、权利要求5所述的表达载体、权利要求7所述的基因工程细胞、或权利要求12所述的病毒样颗粒(VLP)，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括疫苗组合物。

15. 一种制备柯萨奇病毒A10 型病毒样颗粒(VLP)的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)培养权利要求7所述的基因工程细胞，从而在所述基因工程细胞内表达柯萨奇病毒A10 型前体衣壳蛋白P1蛋白和3CD蛋白，并自组装形成具有免疫原性的病毒样颗粒(VLP)；

(2)分离所述的具有免疫原性的病毒样颗粒(VLP)。