KR20230105300A - 스캐폴드 기반의 다중항원을 포함하는 코로나바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물 - Google Patents

스캐폴드 기반의 다중항원을 포함하는 코로나바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물 Download PDF

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정미숙
백윤희
이혜라
이규도
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고려대학교 세종산학협력단
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Abstract

본 발명은 스캐폴드 기반의 다중항원을 포함하는 코로나바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항원 조성물은 다양한 속 및 아속에 속하는 코로나바이러스의 증식 및 복제를 저해하는 예방 효과가 매우 우수하고, 재조합 단백질을 이용함으로써 재활용성 및 안전성이 인정되는바, 의약 분야, 생명과학 분야 등 다양한 산업 분야에서 널리 활용될 수 있다.

Description

스캐폴드 기반의 다중항원을 포함하는 코로나바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물{Antigen composition comprising scaffold-based multivalent antigens for preventing or treating coronavirus infections}
본 발명은 스캐폴드 기반의 다중항원을 포함하는 코로나바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물에 관한 것이다.
2019년 12월 중국 우한시에서 신종 코로나바이러스 (coronavirus: CoV) 감염이 발생하였고, 2020년 2월 12일 세계보건기구 (WHO)는 감염병을 COVID-19 (코로나19), 원인 바이러스를 SARS-CoV-2로 명명하였다. 1920년대 닭에서 처음 CoV가 발견된 이후, 조류, 개, 돼지 등에서 발견되었고, 1960년대 사람에서도 발견되었으며, CoV로 명명되었다 (Nature, 1968; Adv Vir Res, 1983).
CoV는 positive-sense single-stranded RNA를 갖고 있으며, 게놈 크기는 26~32 kb로 RNA 바이러스 중 매우 큰 크기를 가지며, RNA 바이러스로는 드물게 교정 (proofreading) 기능을 보유하고 있다 (JVI, 2016). SARS-CoV-2는 29.8 kb 크기 게놈으로 13개의 유전자를 가지며, 27개 이상의 단백질을 만드는 것으로 알려졌다 (Microbiol Resour Announc, 2020). CoV는 4개의 속 (genus, α, β, γ and δ)로 나뉘며, SARS-CoV-2는 β-CoV에 속한다 (J Adv Res, 2020). 2003년 홍콩에서 발생하여 세계적으로 확산된 SARS, 2012년 발생한 MERS 및 계절성 human CoV (HCoV)인 HKU1, OC43 등도 β-CoV에 속하며, 2개의 아속 (subgenus)인 Sarbecovirus와 Merbecovirus로 나뉘고 있다 (Nat Microbiol, 2020).
β-CoV인 HKU1, OC43 및 α-CoV인 229E와 NL63 등 4가지 CoV가 계절 감기를 유발하는 human CoV (HCoV)이다. 이들 HCoV 들도 자연적 기원은 박쥐, 설치류를 비롯한 동물 기원이며, 초기에는 낮은 병원성을 갖고 있었지만, 소, 알파카 등 중간 동물을 거쳐 인간으로의 host jump (spillover)를 통해 질병을 야기한 것으로 추정되고 있다 (Nat Rev Microbiol, 2020). 1960년대 이후로 host jump를 이룬 CoV로는 HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2 등이 존재한다.
한편, RNA 바이러스가 갖는 복제 오류에 따라 SARS-CoV-2 변이 바이러스가 출현하였으며, WHO는 2021년 5월 COVID-19 변이 바이러스를 발생 순서에 맞춰 알파 (α), 베타 (β), 감마 (γ), 델타 (δ) 등으로 명명하였다. D614G 변이 발견 이후 다양한 변이 바이러스의 전파능력이 상승된 것으로 확인되었으며, 특히 E484K, L452R 변이 등이 더 높은 전파력, 치명률 및 기존 항체나 치료법 등에 대한 저항력을 증가시킨 것으로 보고되었고 (Nat Rev Immunol 2021), 관심 변이 (variants of interest: VOI) 및 우려 변이(variants of concern: VOC)로 나뉘고 있다. 델타 변이바이러스는 SARS-CoV-2 알파 변이바이러스 보다 1.6배, 기존 코로나19 SARS-CoV-2 보다 2.72배 빠른 전파 속도를 갖고 있어 중증질환 및 사망을 더 많이 유발하고 있다 (NEJM, 2021).
COVID-19 예방을 위해서 RNA 및 DNA 백신, 약독화된 혹은 불활성화 바이러스, 바이러스 유사입자 등 다양한 백신 제조 플랫폼을 활용하여, COVID-19 완화에 기여하는 백신 개발이 이루어지고 있다 (Nature, 2020). 2020년 말에 개발된 RNA 및 DNA 백신은 면역원성 (immunogenicity)을 증강시켜 95%에 달하는 백신 유효율 (vaccine efficacy)을 보였다. 그러나 mRNA 활용의 짧은 역사 때문에 면역 활성 유지 및 안전성에 일부 논란이 있다. 특히 고령층, 임산부, 어린아이를 포함하는 immunocompromised 환자들이나 immunosuppressed 환자에 있어서 안전성은 중요한 문제이며, 이들 백신은 바이러스 표면 에피토프에 특이적이기 때문에, 변이 바이러스 출현에 취약하다는 점에서 3번째 부스터샷의 필요성이 부각되고, 짧은 백신 방어면역 기간 (immunity duration)에 따라 중화항체가가 낮아지는 시점에서 부스터샷을 매번 맞아야 하는 어려움이 있다.
이와 대조적으로 항원 크기 및 밀도를 바이러스처럼 만든 VLP, 나노입자 형태의 단백질 항원은 유전자 백신의 단점을 보강할 안전한 차세대 백신으로서의 가능성을 가지고 있다. 연구를 통해 실제 단점으로 지적되던 낮은 면역활성이 개선되고 있으며, 다양한 바이러스 질병에 대해서 현재 임상 시험 단계에 있는 백신 후보물질이 다수 존재한다 (https://clinicaltrials.gov). 상기와 같은 배경하에서 다양한 변이체에 대해서 광범위한 범용성 백신으로 활용될 수 있는 새로운 백신의 개발이 요구되고 있으며, 특히 안전성이 보장되고, 대량생산이 가능하며 제조가 용이한 바이러스 백신 조성물의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 다양한 속 및 아속에 속하는 코로나바이러스에 대해 광범위하게 활용될 수 있는 범용성 백신을 개발하고자 연구를 수행하였으며, 나노구조의 모자익 다중항원 엔지니어링 플랫폼을 활용하여 스캐폴드에 6가지 재조합 CoV 스파이크 단백질 RBD-SD1이 결합된 모자익 (mosaic) 다중항원을 제조하고, 이의 백신 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 따라 본 발명의 목적은 모자익 다중항원을 이용한 코로나바이러스 감염병에 대한 예방 또는 치료용 항원 조성물 및 코로나바이러스 감염병에 대한 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 스캐폴드 분체에 결합된 하나 이상의 재조합 단백질을 포함하며, 상기 재조합 단백질은 코로나바이러스 유래 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)를 포함하는 것인, 코로나바이러스 감염병에 대한 예방 또는 치료용 항원 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 스캐폴드 분체에 결합된 하나 이상의 재조합 단백질을 포함하며, 상기 재조합 단백질은 코로나바이러스 유래 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)를 포함하는 것인, 코로나바이러스 감염병에 대한 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항원 조성물은 다양한 속 및 아속에 속하는 코로나바이러스의 증식 및 복제를 저해하는 예방 효과가 매우 우수하고, 재조합 단백질을 이용함으로써 재활용성 및 안전성이 인정되는바, 의약 분야, 생명과학 분야 등 다양한 산업 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 다양한 CoV의 계통수 (phylogenetic tree)를 나타낸 것이다. CoV는 4개의 속인 α, β, γ, δ로 나뉘며, SARS-CoV-2는 β-CoV에 속하고 (Shereen et al. J Adv Res (2020)에서 활용), 1960년대 이후 인체로의 host jump를 이룬 HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2를 파란색 원으로 표시하였다.
도 2A는 SARS-CoV-2의 스파이크 구조를 나타낸 것이다 (Spike ectodomain N-, C-terminus, S1/S2 및 S2’site. RBD: receptor binding domain, NTD: N-terminal domain), SD1 및 SD2 subdomains. SARS-CoV-2 야생형 (wild type) 및 변이체 (variant), SARS-CoV, MERS-CoV, human CoV HKU1, human CoV 229E의 RBD-SD1 1차구조를 각각 표시하였으며, diagram 위에 표시된 것이 spike 단백질 아미노산 잔기번호를 나타낸다. 오른쪽에 spike trimer 3차구조 모델을 그렸으며, one protomer의 domain별 color를 1차구조 diagram과 동일한 색으로 나타내었다.
도 2B는 S-PCNA1, M-PCNA2, H-PCNA3 융합단백질의 아미노산 잔기 서열을 표시하였다. RBD-PCNA 링커는 파란색, SARS-CoV-2 변이체 RBD 서열은 빨간색으로 표시하였다.
도 2C는 현재까지 동물에서 인간으로 host jump를 보이거나 추정되는 6가지 CoV 스파이크 RBD 항원 (SARS-CoV-2 wild type 및 variant, SARS-CoV, MERS-CoV, human CoV HKU1, human CoV 229E)의 아미노산 잔기 서열을 표시하였다.
도 3은 6가지 RBD를 PCNA1, PCNA2, PCNA3의 각 N-, C-말단에 결합시킨 융합 단백질 S-PCNA1 (SARS-CoV-2 wild type RBD-PCNA1-SARS1 RBD), M-PCNA2 (MERS RBD-PCNA2-SARS-CoV-2 variant RBD), H-PCNA3 (HCoV 229E RBD-PCNA3-HCoV HKU1 RBD) 구조체 디자인 (위) 및 6RBD-PCNA 헤테로 삼량체(heterotrimer)가 자가조립된 분자모델 (아래)을 나타낸 것이다. 각 융합 단백질 S-PCNA1, M-PCNA2, H-PCNA3의 분자모델도 아울러 표시하였다.
도 4A는 S-PCNA1, M-PCNA2, H-PCNA3 융합단백질을 각각 insect High Five 세포 및 mammalian 293F 세포에서 발현한 후 이들의 단백질 발현량을 SDS-PAGE 상에서 비교한 것이다.
도 4B는 S-PCNA1와 M-PCNA2 융합단백질의 크로마토그래피 정제단계에서 각각 His-tag 친화성 크로마토그래피 (His-tag affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피 (ion exchange chromatography), 크기-배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography, SEC)를 수행한 결과를 나타낸 것이다. 변성 SDS-PAGE 결과에서 정제된 융합단백질의 순도 (purity), 상대분자량 결과 및 SEC 결과 (elution volume 12.1-12.5 ml)를 통해서, 기대되는 분자 크기를 보여주고 있다.
도 4C는 H-PCNA3 융합단백질의 크로마토그래피 정제단계에서 각각 His-tag 친화성 크로마토그래피 (His-tag affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피 (ion exchange chromatography), 크기-배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography, SEC)를 수행한 결과를 나타낸 것이다 (도 4C 왼쪽). 변성 SDS-PAGE 결과에서 정제된 융합단백질의 순도 (purity), 상대분자량 결과 및 SEC 결과 (elution volume 11.7 ml)를 통해서, 기대되는 분자 크기를 보여주고 있다. 또한, 정제된 S-PCNA1, M-PCNA2, H-PCNA3 융합단백질에 대한 SDS-PAGE 결과 및 웨스턴 블랏 결과를 통해서 (anti-Histag 항체, anti-SARS-CoV-2 spike 항체, anti-HCoV HKU1 spike 항체 활용), 각 융합단백질에 결합된 항원의 특성을 검증하였다 (도 4C 오른쪽).
도 5A는 정제된 S-PCNA1, M-PCNA2, H-PCNA3 융합단백질의 최종 분리정제 SEC 크로마토그램 결과 (왼쪽) 및 3가지 융합단백질이 조립된 6RBD-np의 SEC 크로마토그램 결과를 나타낸 것이다 (오른쪽). Elution volume 10.4 ml의 결과를 통해서, 기대되는 분자 크기를 나타내었다.
도 5B는 6가지 종류 RBD가 조립된 6RBD-np 검증의 하나로 SEC-MALS 결과를 나타낸 것이다. 왼쪽부터 S-PCNA1, M-PCNA2, H-PCNA3 및 6RBD-np의 SEC-MALS 결과를 나타내었으며, 각각 예측치와 일치하는 153, 182, 176 및 355 kDa 분자량을 갖는 것을 확인하였다. 특히 각 융합단백질 및 6RBD-np의 높은 단백질 균질성 (homogeneity) 결과를 확인하였다.
도 5C는 조립된 6RBD-np 검증의 하나로 전자현미경 (electron microscopy) (위) 및 AFM (atomic force microscopy) (아래) 관찰 결과를 나타낸 것이다. 6RBD-np는 가운데 홀 구멍이 있고 6개의 RBD 항원이 결합되어 있는 40 nm 크기의 나노입자 형태를 갖고 있는 것을 확인하였다.
도 6은 6RBD-np 모자익 다중항원 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 온도 (-80, 4, 25, 37℃)에 분주해서 저장하고, 시간별 (0, 1, 4, 7, 14, 28일) SDS-PAGE 결과 (위) 및 SEC 크로마토그램 결과 (아래)를 나타낸 것이다.
도 7A는 6RBD-np 모자익 다중항원을 이용한 면역분석을 위한 마우스 동물실험 일자별 계획 (scheme)을 나타낸 것이다. 각 그룹당 10마리 마우스를 사용하였으며 (control naive 그룹은 5마리), 항원 소재를 3주 간격으로 2회 마우스당 5 μg씩 근육 내 투여하였고, 항원 프라이밍 및 부스팅 2주 후 각각 채혈하였으며, 부스팅 후 4주+2일 (26일)에 채혈하였다. 총 실험 기간은 50일이었으며 각 그룹은 아래와 같다. 그룹 1: naive 마우스, PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 2: PCNA1-PCNA2-PCNA3 assembled + 에주번트, 그룹 3: SARS-CoV-2 spike RBD + 에주번트, 그룹 4: 상용 SARS-CoV-2 spike + 에주번트, 그룹 5: S-PCNA1 + 에주번트, 그룹 6: 6RBD-np + 에주번트. 에주번트는 Sigma adjuvant system (S6322, Sigma-Aldrich)을 이용하였다.
도 7B는 마우스로부터 확보한 serum 내 항체 형성 여부를 확인하기 위하여, ELISA 어쎄이를 수행한 결과를 나타낸 것이다. 항원 접종 프라이밍 전 (pre-prime), 프라이밍 후 (post-prime), 부스팅 후 (post-boost) 그룹 간 항체가 결과를 나타내었다. Control 항체로는 상용 SARS-CoV-2 spike polyclonal 항체 (Cat No. 40592-T62, SinoBiological)를 사용하였다. S-PCNA1 및 6RBD-np 면역에 따른 항체 반응이 부스팅 이후 현저히 증가하였다. 데이터는 Mann-Whitney U test (*p < 0.05; **p < 0.01)로, 중앙값을 수평줄로 표시하였다.
도 7C는 마우스로부터 채혈한 혈청을 이용해서 ELISA 실험을 수행하여, SARS-CoV-2 WT, SARS-CoV-2 VAR, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV HKU1 및 HCoV 229E RBD 항원을 각각 기반으로 하여 항체가를 나타낸 것이다. ELISA microplate에 각 항원 200 ng을 4 ℃에서 overnight coating한 후, 1차 항체 결합으로 채혈한 serum을 serially dilution하여 37 ℃에서 1시간 결합하였다. Microplate를 이용한 ELISA assay로 2차항체-양고추냉이과산화효소 반응을 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 8A는 6RBD-np 모자익 다중항원 농도 (dose) 의존성 및 에주번트 (adjuvant) 영향을 확인하기 위한 마우스 동물실험 일자별 계획 (scheme)을 나타낸 것이다. 각 그룹당 8마리 마우스를 사용하였으며 (control naive 그룹은 5마리), 항원 소재를 3주 간격으로 2회 마우스당 5 μg씩 근육 내 투여하였고, 항원 프라이밍 및 부스팅 2주 후 각각 채혈하였으며, 부스팅 후 4주+2일 (26일)에 채혈하였다. 총 실험 기간은 50일이었으며 각 그룹은 아래와 같다. 그룹 1: naive 마우스, PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 2: 5 μg 6RBD-np, 그룹 3: 15 μg 6RBD-np + SAS (adjuvant), 그룹 4: 5 μg 6RBD-np + SAS (adjuvant), 그룹 5: 5 μg 6RBD-np + AddaVax (adjuvant), 그룹 6: 5 μg 6RBD-np + CpG ODN (adjuvant), 그룹 7: 5 μg 6RBD-np (variant CoV RBD 포함) + SAS (adjuvant)
도 8B는 6RBD-np 모자익 다중항원 농도 (dose) 의존성을 확인하기 위한 ELISA assay 항체가를 나타낸 것이다. 항원접종 프라이밍 전, 후, 부스팅 후 농도 의존 (5 μg 및 15 μg) 및 에주번트 종류별에 따른 항체가 결과를 나타내었다.
도 9A는 6RBD-np 모자익 다중항원의 보호 및 면역유도 효과를 확인하기 위한 마우스 동물실험 일자별 계획 (scheme)을 나타낸 것이다. 각 그룹당 10마리 마우스를 사용하였으며 (control naive 그룹은 6마리, 바이러스 challenge control 그룹은 8마리), 항원을 3주 간격으로 2회 마우스당 5 μg씩 근육 내 투여하였고, 항원 프라이밍 및 부스팅 2주 후 각각 채혈하였으며, 바이러스 감염 (challenge) 5일 후 채혈하였다. 총 실험 기간은 56 일이었으며 각 그룹은 아래와 같다. 그룹 1: naive 마우스, PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 2: 바이러스 challenge 그룹, 그룹 3: SARS-CoV-2 spike RBD + 에주번트, 그룹 4: 상용 SARS-CoV-2 S-2P + 에주번트, 그룹 5: S-PCNA1 + 에주번트, 그룹 6: 6RBD-np + 에주번트. 에주번트는 AddaVax (vac-adx-10, InvivoGen)을 이용하였다.
도 9B는 6RBD-np 모자익 다중항원의 면역효능을 확인하기 위한 SARS-CoV-2 wild type (위) 및 Delta 변이 (아래) 바이러스 challenge 마우스 동물실험 결과로, 바이러스에 감염된 마우스의 일자별 체중변화 및 생존율을 나타낸 것이다. 마우스 체중 20%이상 감소를 생존율 종료로 결정하였다.
도 9C는 마우스로부터 채혈한 혈청을 이용해서 ELISA 실험을 수행하여, SARS-CoV-2 WT, SARS-CoV-2 VAR, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV HKU1 및 HCoV 229E RBD 항원을 각각 기반으로 하여 항체가를 나타낸 것이다.
도 9D는 SARS-CoV-2 wild type 및 Delta 변이 바이러스 challenge 마우스의 비장세포 (splenocyte)를 이용해서 IFN-γ ELISpot 반응 실험을 수행한 결과를 나타낸 도이다. Averaged ELISpot spot forming units (SFUs) 당 2´105 splenocytes (왼쪽) 및 각 바이러스 challenge 별 IFN-γ-producing T-cell (오른쪽) 측정은 0.2 mg PepMixTM SARS-CoV-2 WT peptide (RBD) 기반 활성화를 통해서 수행하였다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 스캐폴드 분체에 결합된 하나 이상의 재조합 단백질을 포함하며, 상기 재조합 단백질은 코로나바이러스 유래 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)를 포함하는 것인, 코로나바이러스 감염병에 대한 예방 또는 치료용 항원 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, '예방' 또는 '치료'는 질환 증상의 경감 또는 개선, 질환 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서, '조성물'은 특정 성분을 포함하는 산물 외에, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명에 있어서, 항원이란 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 성분으로, 바람직하게는 바이러스가 발현하는 단백질을 의미한다.
본 발명에 따른 항원 조성물은 척추동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에 투여되는 의약 조성물의 형태이거나 식품 조성물, 통상의 예방 및 치료용 항바이러스제 등 통상적으로 알려진 모든 형태로의 적용이 가능하다.
본 발명에 따른 항원 조성물은 스캐폴드 분체가 자가 조립되어 고리형 스캐폴드를 형성하고, 상기 고리형 스캐폴드를 중심으로 외측에 상기 코로나바이러스 유래 스파이크 단백질의 RBD가 노출되는 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 다수개의 스캐폴드 분체의 양 말단에 코로나바이러스 유래 스파이크 단백질의 RBD가 결합된 형태로서, 고리형 스캐폴드를 중심으로 외측에 목적하는 수의 항원 단백질을 노출시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스캐폴드 분체는 Saccharolobus solfataricus 유래의 PCNA (proliferating cell nuclear antigen)일 수 있으며, 이의 서브유닛인 PCNA1, PCNA2, PCNA3 인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 PCNA는 N- 또는 C-말단에 단백질을 결합시킬 수 있는 것을 특징으로 하며, 최대 6가지 다른 항원을 결합시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스는 코로나비리대 (coronaviridae)에 속하는 코로나바이러스를 모두 포함하며, 예를 들어, SARS 코로나 바이러스 (SARS-CoV), SARS-CoV-2, 메르스 코로나바이러스 (MERS-CoV) 및 인간 코로나바이러스 (HCoV)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질은 면역 활성을 높이기 위하여 코로나바이러스 유래 스파이크 단백질의 RBD 외에 SD1 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 한다. RBD 구조는 두 가지 구조, 즉 Up down conformation을 이루고 있는 것으로 알려져 있으며, RBD 구조가 down conformation일 경우 교차 반응을 일으킬 수 있는 항체가 잘 유도된다는 보고가 있기 때문에, SD1 도메인을 추가적으로 포함시켰다.
따라서 본 발명에 따른 재조합 단백질은 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나로 표시되는 RBD-SD1일 수 있으며, 보다 구체적으로는 SARS-CoV-2 야생형, SARS-CoV-2 변이체, SARS-CoV, 메르스 코로나바이러스 또는 인간 코로나바이러스 유래일 수 있고, 보다 더 구체적으로는 상기 SARS-CoV-2 변이체는 델타 변이체일 수 있으며, 인간 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 229E 또는 인간 코로나바이러스 HKU1 유래일 수 있다.
본 발명에 따른 항원 조성물은 바람직하게는 3개의 스캐폴드 분체가 자가조립된 헤테로 삼량체를 포함하며, 이는 서열번호 7로 표시되는 제1 스캐폴드 분체 및 상기 제1 스캐폴드 분체에 각각 결합하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 RBD-SD1; 서열번호 8로 표시되는 제2 스캐폴드 분체 및 상기 제2 스캐폴드 분체에 각각 결합하는 서열번호 3 및 서열번호 4의 RBD-SD1; 서열번호 9로 표시되는 제3 스캐폴드 분체 및 상기 제3 스캐폴드 분체에 각각 결합하는 서열번호 5 및 서열번호 6의 RBD-SD1;을 포함하는 형태일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 재조합 SARS-CoV-2 야생형 (wild type) RBD-SD1 (서열번호 1)과 SARS1 RBD-SD1 (서열번호 2)을 PCNA1 (서열번호 7)에 결합시킨 융합 단백질을 S-PCNA1 (서열번호 10)로 명명하였으며, 재조합 MERS RBD-SD1 (서열번호 3)과 SARS-CoV-2 델타 변이체의 RBD-SD1 (서열번호 4)을 PCNA2 (서열번호 8)에 결합시킨 융합 단백질을 M-PCNA2 (서열번호 11)로 명명하고, 재조합 HCoV 229E RBD-SD1 (서열번호 5)과 HCoV HKU1 RBD-SD1 (서열번호 6)을 PCNA3 (서열번호 9)에 결합시킨 융합 단백질을 H-PCNA3 (서열번호 12)으로 명명하였다. 또한, 상기 S-PCNA1, M-PCNA2, H-PCNA3를 자가조립 시켜 제조된 모자익 다중항원을 6RBD-np라 명명하였다.
본 발명의 조성물은 제형, 사용 방법 및 사용 목적에 따라 당 분야에 사용되는 통상의 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함할 수 있을 뿐만 아니라, 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
상기 조성물은 통상의 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 예컨대 경구 투여시에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 제형으로 제공될 수 있다. 조류를 포함하는 동물, 바람직하게는 인간, 조류를 포함하는 동물에 투여되는 의약 조성물의 형태 등 통상적으로 알려진 모든 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 식품 조성물의 형태로 투여될 수 있으며, 본 발명의 식품 조성물은 인체를 비롯한 동물 신체에 투여하기에 적합한 임의의 생약 형태, 경구 투여에 통상적인 임의의 형태, 예를 들어, 첨가제, 보조제, 정제, 환제, 과립, 캡슐 및 발포 배합물과 같은 고체 형태, 또는 용액, 현탁액, 유화액 등과 같은 액체 형태일 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 재조합 단백질을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
바람직한 투여량은 투여대상 및/또는 질환의 치료 또는 예방에 적합한 함량이 될 수 있으며, 이는 투여대상의 연령, 성별, 일반 건강 상태 및 체중, 질병의 종류 및 중증도, 제형의 종류, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 조성물의 분비율, 투여경로 및 기간 등을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절 및 적절하게 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 스캐폴드 분체에 결합된 하나 이상의 재조합 단백질을 포함하며, 상기 재조합 단백질은 코로나바이러스 유래 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)를 포함하는 것인, 코로나바이러스 감염병에 대한 예방용 백신 조성물을 제공한다.
상기 백신은 바람직하게는 범용성 백신이며, 이는 코로나바이러스의 속, 아속 및 신규한 변이체를 포함하는 다양한 코로나바이러스를 한번에 중화시킬 수 있는 광범위한 적용 범위를 가진 백신을 의미한다.
상기 코로나바이러스 감염병은 COVID-19, SARS, MERS 및 계절 독감으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 코로나바이러스에 의한 질병이면 모두 포함할 수 있고 이에 제한되지 않는다.
상기 백신 조성물은 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수를 사용할 수 있으며, 상기 면역증강제로는 프로인트(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 및 식물성 및 광물성 오일 등을 사용할 수 있고, 상기 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사 액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.
또한, 백신 제조에 사용되는 공지의 물질을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 코로나바이러스 감염병에 대한 예방 또는 치료용 약학 및/또는 수의학 조성물을 제공한다.
상기 바이러스 감염병은 2차 감염 문제가 아니라면 항생제는 효과가 없다. 따라서 본 발명에 따른 항원 조성물을 이용함으로써 감염을 효과적으로 방지할 수 있다.
본 발명에 따른 항원 조성물은 바이러스 재조합 표면 스파이크 단백질의 RBD가 스캐폴드 분자에 결합된 형태의 모자익 다중항원 (MOSAIC SCAFFOLD-BASED MULTIVALENT ANTIGENS) 조성물로서, 보다 상세하게는 코로나바이러스 표면단백질인 스파이크 단백질의 안정한 재조합 RBD를 스캐폴드 분자인 PCNA에 결합시켜 만든 복합체인 모자익 다중항원을 유효성분으로 포함함으로써, 다양한 코로나바이러스 변이주가 야기하는 질병에 대한 예방 또는 치료 효과가 있는 범용성 또는 유니버설 항원 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항원 조성물은 다음과 같은 기술에 근거하고 있다. 먼저, 나노입자 사이즈 및 항원 밀도를 높여 단백질 백신의 단점인 낮은 면역효능의 증강을 유도하는 점이다. 본 발명에 따른 6RBD-np는 약 40 nm 크기의 나노입자 형태를 가지며, 동물실험에서 면역반응의 개선 효과를 나타낸다. 특히 VLP (virus-like particle) 혹은 나노입자 플랫폼에 적용한 바이러스 단백질 항원으로서 스파이크 단백질은 1,273개의 아미노산을 갖는 거대한 크기이기 때문에, 단백질 안정성 및 폴딩에 어려움이 있지만, 재조합 RBD 항원은 스캐폴드에 융합할 때 응집 문제가 없고, 조립되었을 때 안정성, 수용성 등 특성이 개선된다. 또한, 안정한 모자익 다중항원 제조에는 시간과 노력이 필요하지만, 안정성이 이루어지면 결과적으로 보존성이 높은 부위 (highly conserved region)의 항원결정기 노출이 더욱 쉽기 때문에 범용성 항원으로 가치가 높아지게 된다. 다음으로, 지금까지 개발되고 있는 자가조립형 나노입자 항원 플랫폼 기술은 2개 이상의 항원을 정확히 융합시킬 수 없는 단점을 갖고 있다. 즉, 몰비로 혼합하는 방법 이외에는 한 나노입자에 다중항원을 융합할 수 있는 기술이 부재하지만, 본 발명은 PCNA 스캐폴드를 이용함으로써 헤테로 삼량체를 제조할 수 있고, 이에 따 라 총 6개의 항원을 융합시킬 수 있다는 점에서 기술의 혁신성이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1: 코로나바이러스 유래 스파이크 RBD 단백질과 PCNA가 융합된 6RBD-np 모자익 다중항원의 제조
1-1: 구조기반 RBD 단백질의 제조
1-1-1: CoV RBD의 의의
CoV는 막융합 기작을 통해서 숙주 세포에 침입하는데, 이때 중요한 역할이 스파이크 단백질의 호스트 리셉터인 ACE2 결합이다. ACE2 리셉터에 결합하는 부위가 스파이크 단백질의 RBD이며, 특히 인체에서 항원에 의하여 유도되는 많은 항체가 스파이크 RBD를 주요 에피토프로 결합한다. 한편, CoP (Correlate of protection)는 중화항체 또는 회복기 혈장 (convalescent plasma)과 같이 면역 방어와 인과관계가 있는 기전적 (mechanistic) 상관관계로 주로 나타내며, 편리하고 간단한 중화항체가 혈청방어율 (seroprotection)이 주로 이용되고 있다. SARS-CoV-2에 있어서 중화항체 분석이 아직 표준화되어 있지 않은 문제점이 있지만, 현재까지 개발된 다양한 백신의 임상 1, 2, 3상 자료에 따르면, 회복기 환자의 회복기 혈장의 평균 중화항체가의 20% 수준이 감염 (infection)에 대해 50% 보호를 보이는 백신 중화항체가를 SARS-CoV-2 CoP라고 보고된 바 있다 (Nat Med, 2021a). 이는 일반적인 symptomatic infection에 대한 CoP로서 실제 severe infection에 있어서는 회복기 혈장의 평균 중화항체가의 3% 수준에 불과하다. 또한 DNA 백신 임상 결과를 기반으로 anti-spike 혹은 anti-RBD 항체가 264 binding antibody unit (BAU)/ml 이면 80% 백신 효능을 갖는 것이 보고되었다 (Nat Med, 2021b).
1-1-2: 구조기반 CoV RBD 디자인
1960년대 이후 host jump를 이룬 zoonotic origin CoV인 HCoV-229E, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-HKU1, SARS-CoV-2 (WT 및 variant) 등 α 및 β-CoV에 속하는 스파이크 단백질 RBD를 선택하였다. 이들의 아미노산 잔기 서열 분석, 서열 정렬 (alignment), 바이러스 계통 분석, 3차 구조 분석을 통해서 구조체 디자인을 수행하였다 (도 1 내지 도 2 참고).
1-2: PCNA 기반 6RBD-np 제조 및 특성
Archaea인 Sulfolobus solfataricus (Sso) PCNA 단백질은 DNA clamp 기능을 하며, 3개의 서브유닛인 PCNA1, PCNA2, PCNA3이 안정한 헤테로 삼량체 (heterotrimer)로서 자가조립 (self-assembly) 된다. 본 발명에서는 상기 PCNA 및 6가지 CoV spike RBD 항원 (SARS-CoV-2 wild type 및 variant, human CoV HKU1, MERS, SARS-CoV, human CoV 229E)을 이용하여 다중 항원을 제조하였다. 특히, 영국, 남아프리카 공화국, 브라질 및 인도 변이바이러스 α, β, γ, δ (각각 B.1.1.7, P.1, B.1.351, B.1.617.2)에 대한 우려를 반영하고자, SARS-CoV-2 변이체의 RBD는 델타 (δ) 변이를 따라 제작하였으며, 인간으로 host jump를 이룬 코로나바이러스를 이용함으로써, 면역 반응을 유도함과 동시에 교차 반응에 따른 효과를 유도하고자 하였다.
보다 구체적으로는 재조합 SARS-CoV-2 야생형 (wild type) RBD-SD1 (서열번호 1)과 SARS1 RBD-SD1 (서열번호 2)을 PCNA1 (서열번호 7)에 결합시켜 S-PCNA1를 제조하고, 재조합 MERS RBD-SD1 (서열번호 3)과 SARS-CoV-2 델타 변이체의 RBD-SD1 (서열번호 4)을 PCNA2 (서열번호 8)에 결합시켜 M-PCNA2를 제조하였으며, 재조합 HCoV 229E RBD-SD1 (서열번호 5)과 HCoV HKU1 RBD-SD1 (서열번호 6)을 PCNA3 (서열번호 9)에 결합시켜 H-PCNA3을 제조하였다. 이를 포유동물 세포에 적용되는 재조합 단백질 벡터 구조체로 각각 제조하였으며. 6RBD-np 모델을 도 3에 나타내었다.
보다 더 구체적으로는 각 RBD-SD1을 PCNA 서브유닛의 N-, C-말단에 결합시키고, 각각의 S-PCNA1, M-PCNA2, H-PCNA3를 IgK signal peptide, Myc epitope signal 및 His tag을 포함하는 pSecTag2 A 벡터 구조체를 제작하였다. Escherichia coli DH5α에서 이들 벡터 구조체를 증폭한 다음, HEK 293F 포유동물 세포 (1x106 cells/ml)에 transfection하여 발현을 진행하였다. 이때 pSecTag2 A vector의 pCMV 프로모터를 활용하여, 37℃, 8% CO2, humidified 조건에서 HEK 293F 세포의 현탁 배양을 통해 발현시켰다. 125 ml Erlenmeyer flasks를 135 rpm 조건에서 세포 1x106 cells/ml일 때, transfection:freestyle MAX reagent (Invitrogen):1 μl reagent + 1 μg DNA를 이용해서 transfection하였으며, 발현된 상등액을 농축하였다.
한편, 곤충세포의 경우, cellfectin reagent와 recombinant bacmid DNA를 이용하여 벡터 구조체를 Sf9 세포에 transfection 시키고, 27℃에서 72시간동안 배양하였다. P1 baculoviral stock을 분주하여 감염시켜 27℃에서 48시간동안 배양한 후, P2 baculoviral stock을 이용해 P3 baculoviral stock을 제작하였다. 이후 바이러스를 곤충세포에 MOI 2 수준으로 감염시켜 3일동안 배양한 후 발현된 단백질 상등액을 모았다. 각각의 S-PCNA1, M-PCNA1, H-PCNA1 융합단백질의 발현을 2-6일간 분석하기 위해서, 세포 배양액을 새로운 튜브에 옮기고 TBS 용액에 재현탁한 뒤, 각각 10 μl씩 SDS-PAGE 샘플 완충액에 가한 후, 변성시키고 SDS-PAGE로 전기영동을 수행하였다.
도 4A에 나타낸 바와 같이, HEK 293F 포유동물 세포에서 곤충 세포보다 높은 단백질 발현을 확인하였으며, 각 융합단백질 마다 차이는 있지만 2-5 mg/liter 발현양을 보였다. 특히, 번역 후 변형, 글리코실화 반응을 고려하여 이후 실험에서는 HEK 293F 세포에서의 발현을 선택하였다.
다음으로, 재조합 S-PCNA1, M-PCNA1, H-PCNA1 융합단백질을 각각 AKTA BASIC 크로마토그래피 시스템으로 정제하였다. Ni-NTA affinity, Mono Q 이온 교환 및 superdex 200HR 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 90% 이상의 순도로 정제하였다 (도 4B, 4C의 왼쪽). 웨스턴 블랏을 위하여 각각의 융합단백질을 정제한 후, 10 μl를 SDS-PAGE 샘플 완충액에 가한 후, 변성시키고 SDS-PAGE로 전기영동을 수행하였으며, 이를 PVDF 멤브레인에 옮긴 후, 6% skim milk가 포함된 TBS-T 완충액으로 블락킹하였다. 이후 rabbit anti-Avitag 항체 (GenScript, A00674)를 TBS-T에 1:2000으로 희석하여 1시간 동안 결합시켰다. HRP conjugated anti-rabbit 2차 항체를 1:5000으로 결합시키고, substrate를 반응시켜 Avi-tagged 단백질을 확인하였다 (도 4C의 오른쪽).
S-PCNA1, M-PCNA1, H-PCNA1 융합단백질은 His tag을 갖고 있기 때문에, anti-His tag, anti-PCNA polyclonal serum, SARS-CoV-2 anti-spike polyclonal 항체에 대한 항체-항원 반응 결과를 이용하여 다중항원의 자가조립 특성을 검증하였다. 구체적으로, S-PCNA1와 M-PCNA1 융합단백질을 먼저 배양한 다음, H-PCNA1 융합단백질을 배양하여 자가조립 (assembly)을 유도함으로써 모자익 다중항원인 6RBD-np를 제조하였다. 이를 SEC을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 5A에 나타내었다. 최종적으로 제조된 6RBD-np는 높은 순도 (90% 이상)를 가지고 있으며, 균질하게 정제되었음을 확인하였다.
실시예 2: 모자익 다중항원 6RBD-np의 특성 분석
2-1: 6RBD-np 모자익 다중항원의 특성
실시예 1을 통해 제조된 6RBD-np를 크기배제 크로마토그래피-다각도광산란 (size-exclusion chromatography-multiangle light scattering: SEC-MALS), EM (electron microscopy) 및 AFM (atomic force microscopy)을 통해서 검증하였다 (도 5B, 5C).
도 5B에 나타낸 바와 같이, SEC-MALS 측정 결과, S-PCNA1, M-PCNA1, H-PCNA1 및 6RBD-np의 항원 분자량은 각각 153, 182, 176 및 355 kDa 이었다. 뿐만 아니라, 도 5C에 나타낸 바와 같이, 투과전자현미경 (transmission electron microscope)을 이용한 음성 염색 방법을 이용하여 조립이 이루어진 6RBD-np를 관찰한 결과, 6RBD-np의 크기가 평균 30-40 nm이며, AFM을 통해 접시모양의 40 nm 입자 형태인 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여 안정성이 높은 6개의 RBD-SD1이 PCNA 헤테로 삼량체에 융합된 것을 확인하였다.
2-2: 6RBD-np 모자익 다중항원의 안정성
실시예 1을 통해 제조된 6RBD-np의 안정성을 확인하기 위하여, 이를 다양한 온도 (-80, 4, 25℃)에서 분주해서 저장한 후, 0, 1, 4, 7, 14, 28일에 각각 SDS-PAGE를 수행하였다. 이때 12% PAGE gel을 사용하였고, 각 레인 당 샘플의 양은 20 μl를 주입하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 6RBD-np는 30일 이후 온도에 따른 SEC 결과를 통해 안정성을 관찰하였으며, 4℃에서 1개월 이상 안정적으로 유지됨을 확인하였다.
실시예 3: 모자익 다중항원 6RBD-np를 이용한 동물실험
3-1: 면역 분석
마우스 동물실험 계획 (scheme)에 따라, 5주령 BALB/c 마우스에 5 μg 근육주사 (intramuscular injection)를 통해 prime-boost mode (3주간 interval)로 각 항원을 접종하였다. 그룹 1: naive 마우스 + 에주번트, 그룹 2: PCNA1-3 control + 에주번트, 그룹 3: SARS-CoV-2 S RBD + 에주번트, 그룹 4: 상용 SARS-CoV-2 S-2P trimer + 에주번트, 그룹 5: S-PCNA1 + 에주번트, 그룹 6: 6RBD-np + 에주번트로 각 그룹을 구성하여, 실험 기간 동안 체중 변화 및 혈청 분석을 수행함으로써 백신 효능을 평가하였다. 마우스 혈청은 프라이밍, 부스팅 2주 후 분리하였으며, 부스터 접종 26일 후 그룹당 마우스 3마리를 희생시켜 혈청 및 비장을 적출하였다. 구체적인 동물실험 계획을 도 7A에 나타내었다.
한편, 모든 그룹 마우스의 체중 변화는 마우스 주령 증가에 따른 10% 내외의 증가 외에는 변화가 없었다. 또한, 자가조립 PCNA 독성실험은 동물실험을 통해서 검증하였으며, archaea S, solfataricus 유래 PCNA 단백질의 in vivo 독성을 동물실험을 통해서 확인한 결과, 0-200 μg range에서 독성이 없었다.
3-2: 마우스 혈청 항체가 분석
마이크로플레이트 내에 SARS-CoV-2 RBD 항원을 부동화 (immobilization) 시킨 다음, 혈청 항체-항원 상호작용을 유도하였다. 1차 항원-항체반응에 각 그룹 혈청을 활용하였고, 양고추냉이과산화효소 (horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 사용하였다. 보다 구체적으로는 ELISA 마이크로플레이트에 항원 200 ng을 4℃에서 밤새 코팅한 후, 1차 항체 결합을 위해서 채혈한 마우스 혈청을 순차적으로 희석하여 37℃에서 1시간 결합하였다. 항원-항체 반응은 TMB (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 100 μl씩을 넣고 상온에서 10분 발색시켜, 마이크로플레이트 리더기 (Molecular Devices, SpectraMax 190, Sunnyvale, CA)를 통해 450 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 확인하였다. 그 결과를 도 7B에 나타내었다.
도 7B에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 6RBD-np 다중항원 그룹과 S-PCNA1 그룹에서 가장 높은 항체 반응이 나타났으며, 특히 프라이밍 이후 부스터 효과가 우수함을 확인하였다.
상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 6RBD-np 다중항원이 동물실험을 통해서 항체 반응 개선에 대해 유의미한 결과를 나타냄을 확인하였다. 특히 S-PCNA1과 6RBD-np 그룹이 유사한 면역반응을 보였지만, 마우스당 5 μg 항원을 접종한 조건이기 때문에 실제 SARS-CoV-2 RBD에 대한 ELISA 반응은 상대적인 SARS-CoV-2 RBD 함량이 1/6에 불과한바, 6RBD-np 그룹에 의한 항체반응이 더 좋은 결과라고 판단하였다.
3-3: 항원특이적 항체가 분석
마이크로플레이트 내에 SARS-CoV-2 WT 혹은 VAR RBD, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV HKU1 혹은 HCoV 229E RBD 항원을 각각 부동화 (immobilization) 시킨 다음, 혈청 항체-항원 상호작용을 유도하였다. 1차 항원-항체반응에 각 그룹 혈청을 활용하였고, 양고추냉이과산화효소 (horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 사용하였다. 보다 구체적으로는 ELISA 마이크로플레이트에 각 항원 200 ng을 4℃에서 밤새 코팅한 후, 1차 항체 결합을 위해서 채혈한 마우스 혈청을 순차적으로 희석하여 37℃에서 1시간 결합하였다. 항원-항체 반응은 TMB (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 100 μl씩을 넣고 상온에서 10분 발색시켜, 마이크로플레이트 리더기 (Molecular Devices, SpectraMax 190, Sunnyvale, CA)를 통해 450 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 확인하였다. 그 결과를 도 7C에 나타내었다.
도 7C에 나타낸 바와 같이, 6RBD-np 다중항원 그룹과 S-PCNA1 그룹은 SARS-CoV-2 WT 혹은 VAR RBD, SARS-CoV RBD 항원에 대해 특이성을 보여주었으며, 더 나아가 6RBD-np 다중항원은 MERS-CoV, HCoV HKU1 및 HCoV 229E RBD 항원에 대해서도 높은 항체 반응을 보여주었다.
상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 6RBD-np는 SARS-CoV-2, SARS1 RBD 및 HCoV HKU1 RBD 항원에 대해서 모두 항체반응을 나타냄을 확인하였다.
실시예 4: 농도 의존성 및 에주번트 영향을 확인하기 위한 동물실험
4-1: 동물실험 디자인
6RBD-np 농도 (dose) 의존성 및 에주번트 (adjuvant) 영향을 확인하기 위하여, 동물실험을 디자인하였다. 각 그룹당 5주령 BALB/c 마우스 8마리를 사용하였으며 (control naive 그룹은 5마리), 5 μg 근육주사 (intramuscular injection)를 통해 prime-boost mode (3주간 interval)로 각 항원을 접종하였다. 총 실험 기간은 50일이었으며 각 그룹은 다음과 같다. 그룹 1: naive 마우스, PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 2: 5 μg 6RBD-np, 그룹 3: 15 μg 6RBD-np + SAS (adjuvant), 그룹 4: 5 μg 6RBD-np + SAS (adjuvant), 그룹 5: 5 μg 6RBD-np + AddaVax (adjuvant), 그룹 6: 5 μg 6RBD-np + CpG ODN (adjuvant), 그룹 7: 5 μg 6RBD-np (delta variant RBD 포함) + SAS (adjuvant). 마우스 혈청은 프라이밍, 부스팅 2주 후 분리하였으며, 부스터 접종 26일 후 그룹당 마우스 3마리를 희생시켜 혈청 및 비장을 적출하였다. 구체적인 동물실험 계획을 도 8A에 나타내었다.
한편, 모든 그룹 마우스의 체중 변화는 마우스 주령 증가에 따른 10% 내외의 증가 외에는 변화가 없었다.
4-2: 마우스 혈청 항체가 기반 농도 의존성 및 에주번트 분석
마이크로플레이트 내에 SARS-CoV-2 RBD 항원을 부동화 (immobilization) 시킨 다음, 혈청 항체-항원 상호작용을 유도하였다. 1차 항원-항체반응에 각 그룹 혈청을 활용하였고, 양고추냉이과산화효소 (horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 사용하였다. 보다 구체적으로는 ELISA 마이크로플레이트에 각 항원 200 ng을 4℃에서 밤새 코팅한 후, 1차 항체 결합을 위해서 채혈한 마우스 혈청을 순차적으로 희석하여 37℃에서 1시간 결합하였다. 항원-항체 반응은 TMB (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 100 μl씩을 넣고 상온에서 10분 발색시켜, 마이크로플레이트 리더기 (Molecular Devices, SpectraMax 190, Sunnyvale, CA)를 통해 450 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 확인하였다. 그 결과를 도 8B에 나타내었다.
항원에 따라 약간 차이는 있지만, S-PCNA1 및 6RBD-np 면역에 따른 항체 반응이 증가하였으며, HCoV 및 MERS-CoV RBD에 대해서 역시 6RBD-np 항체반응이 증가하였다.
도 8B에 나타낸 바와 같이, 6RBD-np 모자익 다중항원은 5 μg 접종에 대해서 에주번트를 병행하였을 때가 하지 않았을 때 보다 훨씬 높은 항체가를 나타내었으며, 5 μg 접종에 비해서 15 μg 접종이 훨씬 높은 항체가를 보여줌을 확인하였다. 또한 SAS, AddaVax 및 CpG ODN 에주번트의 종류에 따른 차이는 없었다.
특히 SARS-CoV-2 RBD의 함량이 1/6에 불과함을 고려할 때 S-PCNA1 항원 그룹에 적용된 항원양 5 μg 접종에 비해서 15 μg 6RBD-np 항원 그룹에서 월등하게 높은 항체가가 나타난 것을 통해 본 발명의 우수성을 확인할 수 있다.
실시예 5: 다중항원 6RBD-np 항원을 이용한 동물실험: 바이러스 challenge
5-1: 동물실험 디자인
6RBD-np 항원 효능을 확인하기 위하여, 다음과 같이 동물실험을 디자인하였다. 그룹당 6주령의 B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J 마우스 (SARS-CoV-2 receptor인 angiotensin converting enzyme 2: hACE2-K/I 마우스)를 10마리씩 사용하였으며 (control naive 그룹은 6마리, 바이러스 challenge control 그룹은 8마리), 5 μg 근육주사 (intramuscular injection)를 통해 prime-boost mode (3주간 interval)로 각 항원을 접종하였다. 항원 프라이밍 및 부스팅 2주 후 각각 채혈하였으며, 바이러스 감염 (challenge) 5일 후 채혈하였다. 총 실험 기간은 56일이었으며 각 그룹은 다음과 같다. 그룹 1: naive 마우스, PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 2: 바이러스 challenge 그룹, 그룹 3: SARS-CoV-2 spike RBD + 에주번트, 그룹 4: 상용 SARS-CoV-2 S-2P + 에주번트, 그룹 5: S-PCNA1 + 에주번트, 그룹 6: 6RBD-np + 에주번트. 에주번트는 AddaVax (vac-adx-10, InvivoGen)을 이용하였다. 마우스 혈청은 프라이밍, 부스팅 2주 후 분리하였으며, 바이러스 감염 5일 후 그룹당 마우스 3마리를 희생시켜 혈청 및 비장을 적출하였다. 구체적인 동물실험 계획을 도 9A에 나타내었다.
5-2: 체중변화 및 생존율 분석
실험 기간 동안 바이러스에 감염된 마우스의 일자별 체중변화 및 생존율을 도 9B에 나타내었다. 도 9B에 나타낸 바와 같이, SARS-CoV-2 야생형 (wild type: WT) 바이러스 및 Delta 변이 바이러스 감염에도 6RBD-np 그룹은 바이러스 challenge에 상관없이 100%의 생존율을 보임을 확인하였다. 한편, S-PCNA1 및 S-2P 그룹은 SARS-CoV-2 야생형 바이러스 challenge 실험에서 높은 생존율을 보였으나, Delta 변이 바이러스 감염에서는 각각 60% 및 80%의 생존율을 보였다. 이와는 대조적으로 RBD-SD1 그룹은 야생형 바이러스 challenge 실험에서 60% 생존율을 보였으나, Delta 변이 바이러스 감염에서는 높은 생존율을 보였다. 상기 결과를 통하여, 6RBD-np 다중항원 그룹이 다른 그룹에 비해 야생형 및 변이형 모두에서 일관되게 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다.
5-3: 혈청 항체가 ELISA 분석
실험 종료 후 마우스로부터 분리한 혈청을 이용한 ELISA 실험 결과를 도 9C에 나타내었다. 도 9C에 나타낸 바와 같이, SARS-CoV-2 WT, SARS-CoV-2 VAR, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV HKU1 및 HCoV 229E RBD 항원을 사용하였을 때, 6RBD-np 면역에 따른 항체 반응이 골고루 증가하였으며, 특히, HCoV에 대해서도 6RBD-np에 의한 항체 반응이 증가함을 확인하여, 6RBD-np의 우수성을 확인하였다.
다음으로, 마우스 비장세포를 이용하여 IFN-γ ELISpot 반응 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 9D에 나타내었다. 도 9D에 나타낸 바와 같이, IFN-γ-producing T-cell 반응에서도 6RBD-np 다중항원이 가장 높은 유도값을 보여주었다.
이상의 실험을 통하여, 본 발명에서 제조한 6RBD-np 모자익 다중항원은 바이러스 감소 및 혈청내 유도된 항체가를 통해 현저하게 우수한 면역 유도 활성을 가짐을 확인하였는바, 본 발명의 항원 조성물은 코로나바이러스 감염에 유용하게 적용 가능할 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Sejong Campus Industry & Academy Collaboration <120> Antigen composition comprising scaffold-based multivalent antigens for preventing or treating coronavirus infections <130> 1-23 <150> KR 10-2022-0000412 <151> 2022-01-03 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD-SD1 of SARS-CoV-2 wild type <400> 1 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val Arg Ser 20 25 30 Leu Val Pro Ser Ser Asp Pro Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val 35 40 45 Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn 50 55 60 Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser 65 70 75 80 Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser 85 90 95 Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys 100 105 110 Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val 115 120 125 Arg Gln Ile Ala Pro Gly 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Ser Asp Gly Phe Lys Ser Ala Ile Ser 130 135 140 Glu Val Ser Thr Val Thr Asp Asn Val Val Val Glu Gly His Glu Asp 145 150 155 160 Arg Ile Leu Ile Lys Ala Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Val Glu Phe 165 170 175 Ser Lys Asp Thr Gly Gly Leu Gln Asp Leu Glu Phe Ser Lys Glu Ser 180 185 190 Lys Asn Ser Tyr Ser Ala Glu Tyr Leu Asp Asp Val Leu Ser Leu Thr 195 200 205 Lys Leu Ser Asp Tyr Val Lys Ile Ser Phe Gly Asn Gln Lys Pro Leu 210 215 220 Gln Leu Phe Phe Asn Met Glu Gly Gly Gly Lys Val Thr Tyr Leu Leu 225 230 235 240 Ala Pro Lys Gly <210> 10 <211> 869 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S-PCNA1 <400> 10 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val Arg Ser 20 25 30 Leu Val Pro Ser Ser Asp Pro Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val 35 40 45 Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn 50 55 60 Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser 65 70 75 80 Asn Cys Val Ala Asp 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Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu 290 295 300 Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Ser Gly Gly Met Phe Lys Ile 305 310 315 320 Val Tyr Pro Asn Ala Lys Asp Phe Phe Ser Phe Ile Asn Ser Ile Thr 325 330 335 Asn Val Thr Asp Ser Ile Ile Leu Asn Phe Thr Glu Asp Gly Ile Phe 340 345 350 Ser Arg His Leu Thr Glu Asp Lys Val Leu Met Ala Ile Met Arg Ile 355 360 365 Pro Lys Asp Val Leu Ser Glu Tyr Ser Ile Asp Ser Pro Thr Ser Val 370 375 380 Lys Leu Asp Val Ser Ser Val Lys Lys Ile Leu Ser Lys Ala Ser Ser 385 390 395 400 Lys Lys Ala Thr Ile Glu Leu Thr Glu Thr Asp Ser Gly Leu Lys Ile 405 410 415 Ile Ile Arg Asp Glu Lys Ser Gly Ala Lys Ser Thr Ile Tyr Ile Lys 420 425 430 Ala Glu Lys Gly Gln Val Glu Gln Leu Thr Glu Pro Lys Val Asn Leu 435 440 445 Ala Val Asn Phe Thr Thr Asp Glu Ser Val Leu Asn Val Ile Ala Ala 450 455 460 Asp Val Thr Leu Val Gly Glu Glu Met Arg Ile Ser Thr Glu Glu Asp 465 470 475 480 Lys Ile Lys Ile Glu Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Tyr Val Ala Phe 485 490 495 Leu Met Lys Asp Lys Pro Leu Lys Glu Leu Ser Ile Asp Thr Ser Ala 500 505 510 Ser Ser Ser Tyr Ser Ala Glu Met Phe Lys Asp Ala Val Lys Gly Leu 515 520 525 Arg Gly Phe Ser Ala Pro Thr Met Val Ser Phe Gly Glu Asn Leu Pro 530 535 540 Met Lys Ile Asp Val Glu Ala Val Ser Gly Gly His Met Ile Phe Trp 545 550 555 560 Ile Ala Pro Arg Gly Ser Gly Gly Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val 565 570 575 Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe 580 585 590 Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile 595 600 605 Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe 610 615 620 Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu 625 630 635 640 Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp 645 650 655 Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn 660 665 670 Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr 675 680 685 Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg 690 695 700 Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg 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Pro Ser Ser Asp Pro Glu Ala Lys Pro Ser Gly Ser Val Val 35 40 45 Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp Phe Ser Pro Leu Leu Ser Gly 50 55 60 Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys Arg Leu Val Phe Thr Asn Cys 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser Leu Phe Ser Val Asn Asp Phe 85 90 95 Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala Ile Ala Ser Asn Cys Tyr Ser 100 105 110 Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Ser Met Lys Ser Asp 115 120 125 Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile Ser Gln Phe Asn Tyr Lys Gln 130 135 140 Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile Leu Ala Thr Val Pro His Asn 145 150 155 160 Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Cys 165 170 175 Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr Glu Val Pro Gln Leu Val Asn 180 185 190 Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser Thr Val Pro Ser Thr Val Trp 195 200 205 Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly 210 215 220 Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr Val Ala Met Thr Glu Gln Leu 225 230 235 240 Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln Tyr Gly Thr Asp Thr Asn Ser 245 250 255 Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn Asp Thr Lys Ile Ala Ser Gln 260 265 270 Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr Ser Leu Tyr Gly Val Ser Gly Arg Gly 275 280 285 Val Phe Gln Asn Cys Thr Ala Val Gly Val Arg Gln Gln Arg Phe Val 290 295 300 Tyr Asp Ala Tyr Gln Asn Leu Val Gly Tyr Tyr Ser Asp Asp Gly Asn 305 310 315 320 Tyr Tyr Cys Leu Arg Ala Cys Val Ser Val Ser Gly Gly Met Lys Ala 325 330 335 Lys Val Ile Asp Ala Val Ser Phe Ser Tyr Ile Leu Arg Thr Val Gly 340 345 350 Asp Phe Leu Ser Glu Ala Asn Phe Ile Val Thr Lys Glu Gly Ile Arg 355 360 365 Val Ser Gly Ile Asp Pro Ser Arg Val Val Phe Leu Asp Ile Phe Leu 370 375 380 Pro Ser Ser Tyr Phe Glu Gly Phe Glu Val Ser Gln Glu Lys Glu Ile 385 390 395 400 Ile Gly Phe Lys Leu Glu Asp Val Asn Asp Ile Leu Lys Arg Val Leu 405 410 415 Lys Asp Asp Thr Leu Ile Leu Ser Ser Asn Glu Ser Lys Leu Thr Leu 420 425 430 Thr Phe Asp Gly Glu Phe Thr Arg Ser Phe Glu Leu Pro Leu Ile Gln 435 440 445 Val Glu Ser Thr Gln Pro Pro Ser Val Asn Leu Glu Phe Pro Phe Lys 450 455 460 Ala Gln Leu Leu Thr Ile Thr Phe Ala Asp Ile Ile Asp Glu Leu Ser 465 470 475 480 Asp Leu Gly Glu Val Leu Asn Ile His Ser Lys Glu Asn Lys Leu Tyr 485 490 495 Phe Glu Val Ile Gly Asp Leu Ser Thr Ala Lys Val Glu Leu Ser Thr 500 505 510 Asp Asn Gly Thr Leu Leu Glu Ala Ser Gly Ala Asp Val Ser Ser Ser 515 520 525 Tyr Gly Met Glu Tyr Val Ala Asn Thr Thr Lys Met Arg Arg Ala Ser 530 535 540 Asp Ser Met Glu Leu Tyr Phe Gly Ser Gln Ile Pro Leu Lys Leu Arg 545 550 555 560 Phe Lys Leu Pro Gln Glu Gly Tyr Gly Asp Phe Tyr Ile Ala Pro Arg 565 570 575 Ala Asp Ser Gly Gly Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe 580 585 590 Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr 595 600 605 Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys 610 615 620 Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe 625 630 635 640 Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr 645 650 655 Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln 660 665 670 Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu 675 680 685 Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu 690 695 700 Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg 705 710 715 720 Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr 725 730 735 Gln Ala Gly Ser Lys Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr 740 745 750 Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr 755 760 765 Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro 770 775 780 Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys 785 790 795 800 Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr 805 810 815 Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile 820 825 830 Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu 835 840 845 Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln 850 855 860 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His 865 870 875 880 His His His <210> 12 <211> 897 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-PCNA3 <400> 12 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val Arg Ser 20 25 30 Leu Val Pro Ser Ser Asp Pro Val Glu Leu Pro Val Ser Ile Val Ser 35 40 45 Leu Pro Val Tyr His Lys His Thr Phe Ile Val Leu Tyr Val Asp Phe 50 55 60 Lys Pro Gln Ser Gly Gly Gly Lys Cys Phe Asn Cys Tyr Pro Ala Gly 65 70 75 80 Val Asn Ile Thr Leu Ala Asn Phe Asn Glu Thr Lys Gly Pro Leu Cys 85 90 95 Val Asp Thr Ser His Phe Thr Thr Lys Tyr Val Ala Val Tyr Ala Asn 100 105 110 Val Gly Arg Trp Ser Ala Ser Ile Asn Thr Gly Asn Cys Pro Phe Ser 115 120 125 Phe Gly Lys Val Asn Asn Phe Val Lys Phe Gly Ser Val Cys Phe Ser 130 135 140 Leu Lys Asp Ile Pro Gly Gly Cys Ala Met Pro Ile Val Ala Asn Trp 145 150 155 160 Ala Tyr Ser Lys Tyr Tyr Thr Ile Gly Ser Leu Tyr Val Ser Trp Ser 165 170 175 Asp Gly Asp Gly Ile Thr Gly Val Pro Gln Pro Val Glu Gly Val Ser 180 185 190 Ser Phe Met Asn Val Thr Leu Asp Lys Cys Thr Lys Tyr Asn Ile Tyr 195 200 205 Asp Val Ser Gly Val Gly Val Ile Arg Val Ser Asn Asp Thr Phe Leu 210 215 220 Asn Gly Ile Thr Tyr Thr Ser Thr Ser Gly Asn Leu Leu Gly Phe Lys 225 230 235 240 Asp Val Thr Lys Gly Thr Ile Tyr Ser Ile Thr Pro Cys Asn Pro Ser 245 250 255 Gly Gly Met Lys Val Val Tyr Asp Asp Val Arg Val Leu Lys Asp Ile 260 265 270 Ile Gln Ala Leu Ala Arg Leu Val Asp Glu Ala Val Leu Lys Phe Lys 275 280 285 Gln Asp Ser Val Glu Leu Val Ala Leu Asp Arg Ala His Ile Ser Leu 290 295 300 Ile Ser Val Asn Leu Pro Arg Glu Met Phe Lys Glu Tyr Asp Val Asn 305 310 315 320 Asp Glu Phe Lys Phe Gly Phe Asn Thr Gln Tyr Leu Met Lys Ile Leu 325 330 335 Lys Val Ala Lys Arg Lys Glu Ala Ile Glu Ile Ala Ser Glu Ser Pro 340 345 350 Asp Ser Val Ile Ile Asn Ile Ile Gly Ser Thr Asn Arg Glu Phe Asn 355 360 365 Val Arg Asn Leu Glu Val Ser Glu Gln Glu Ile Pro Glu Ile Asn Leu 370 375 380 Gln Phe Asp Ile Ser Ala Thr Ile Ser Ser Asp Gly Phe Lys Ser Ala 385 390 395 400 Ile Ser Glu Val Ser Thr Val Thr Asp Asn Val Val Val Glu Gly His 405 410 415 Glu Asp Arg Ile Leu Ile Lys Ala Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Val 420 425 430 Glu Phe Ser Lys Asp Thr Gly Gly Leu Gln Asp Leu Glu Phe Ser Lys 435 440 445 Glu Ser Lys Asn Ser Tyr Ser Ala Glu Tyr Leu Asp Asp Val Leu Ser 450 455 460 Leu Thr Lys Leu Ser Asp Tyr Val Lys Ile Ser Phe Gly Asn Gln Lys 465 470 475 480 Pro Leu Gln Leu Phe Phe Asn Met Glu Gly Gly Gly Lys Val Thr Tyr 485 490 495 Leu Leu Ala Pro Lys Gly Ser Gly Gly Pro Val Ala Thr Val His Arg 500 505 510 Arg Ile Pro Asp Leu Pro Asp Cys Asp Ile Asp Lys Trp Leu Asn Asn 515 520 525 Phe Asn Val Pro Ser Pro Leu Asn Trp Glu Arg Lys Ile Phe Ser Asn 530 535 540 Cys Asn Phe Asn Leu Ser Thr Leu Leu Arg Leu Val His Thr Asp Ser 545 550 555 560 Phe Ser Cys Asn Asn Phe Asp Glu Ser Lys Ile Tyr Gly Ser Cys Phe 565 570 575 Lys Ser Ile Val Leu Asp Lys Phe Ala Ile Pro Asn Ser Arg Arg Ser 580 585 590 Asp Leu Gln Leu Gly Ser Ser 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Glu Val Phe Thr Asp Val Cys Val Asp 805 810 815 Tyr Asp Leu Tyr Gly Ile Thr Gly Gln Gly Ile Phe Lys Glu Val Ser 820 825 830 Ala Val Tyr Tyr Asn Ser Trp Gln Asn Leu Leu Tyr Asp Ser Asn Gly 835 840 845 Asn Ile Ile Gly Phe Lys Asp Phe Val Thr Asn Lys Thr Tyr Asn Ile 850 855 860 Phe Pro Cys Tyr Ala Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu 865 870 875 880 Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His 885 890 895 His

Claims (7)

  1. 스캐폴드 분체에 결합된 하나 이상의 재조합 단백질을 포함하며, 상기 재조합 단백질은 코로나바이러스 유래 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)를 포함하는 것인, 코로나바이러스 감염병에 대한 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항원 조성물은 스캐폴드 분체가 자가 조립되어 고리형 스캐폴드를 형성하고,
    상기 고리형 스캐폴드를 중심으로 외측에 상기 코로나바이러스 유래 스파이크 단백질의 RBD가 노출되는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 감염병에 대한 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 코로나바이러스는 SARS 코로나 바이러스 (SARS-CoV), SARS-CoV-2, 메르스 코로나바이러스 (MERS-CoV) 및 인간 코로나바이러스 (HCoV)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염병에 대한 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항원 조성물은 서열번호 7로 표시되는 제1 스캐폴드 분체 및 상기 제1 스캐폴드 분체에 각각 결합된 서열번호 1 및 서열번호 2의 RBD-SD1을 포함하고; 서열번호 8로 표시되는 제2 스캐폴드 분체 및 상기 제2 스캐폴드 분체에 각각 결합된 서열번호 3 및 서열번호 4의 RBD-SD1을 포함하고; 서열번호 9로 표시되는 제3 스캐폴드 분체 및 상기 제3 스캐폴드 분체에 각각 결합된 서열번호 5 및 서열번호 6의 RBD-SD1을 포함하는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염병에 대한 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  5. 스캐폴드 분체에 결합된 하나 이상의 재조합 단백질을 포함하며, 상기 재조합 단백질은 코로나바이러스 유래 스파이크 단백질의 RBD (receptor binding domain)를 포함하는 것인, 코로나바이러스 감염병에 대한 예방용 백신 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 백신은 범용성 백신인 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염병에 대한 예방용 백신 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 코로나바이러스 감염병은 COVID-19, SARS, MERS 및 계절 독감으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염병에 대한 예방용 백신 조성물.
KR1020220064235A 2022-01-03 2022-05-25 스캐폴드 기반의 다중항원을 포함하는 코로나바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물 KR20230105300A (ko)

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