CN113564132A

CN113564132A - 柯萨奇病毒a16型毒株及其应用

Info

Publication number: CN113564132A
Application number: CN202111109653.XA
Authority: CN
Inventors: 张改梅; 刘建凯; 梁祁; 潘红星; 张黎; 赵丽丽; 谢学超; 陈磊; 马廷涛; 顾美荣
Original assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: CN113564132B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了柯萨奇病毒A16型毒株及其应用。本发明的柯萨奇病毒A16型毒株，其P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该毒株型内和型间交叉性良好、遗传稳定，可作为柯萨奇病毒A16型血清中和抗体效价检测用毒株，为柯萨奇病毒A16型相关单/多价疫苗研发提供支持。该毒株免疫原性好、滴度高、毒力强，为建立稳定的感染动物模型提供攻击毒株，对于构建CV‑A16小鼠模型至关重要。

Description

柯萨奇病毒A16型毒株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及柯萨奇病毒A16型毒株及其应用。

背景技术

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是由肠道病毒引起的传染病，肠道病毒包括20多种类型，其中柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus type A16，CA16）和肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）是引起世界各地手足口病的两种常见重要病原体，两者交替流行或同时在一个地区流行传播。而已上市的EV-A71疫苗对CV-A16无交叉保护作用。中和抗体检测是开展CV-A16流行病学调查和疫苗免疫原性评价的关键指标之一。中和抗体效价检测的准确性与使用的检测毒株密切相关。建立符合疾病流行特征的基因型标准检测毒株，固定检测用毒株代次，提高疫苗中和抗体检测的准确性、重复性，可保障疫苗临床前和临床试验的免疫原性评价具有重要意义。目前，国内外尚未有柯萨奇病毒A16型标准检测毒株。亟需企业自行筛选并建立标准检测毒株。

另外，任庆杰等（任庆杰, 李敏, 杨晓岚, 等. Cox A16 型手足口病乳鼠动物模型的建立及免疫、病理特征[J].中国兽医学报, 2013, 33( 11) : 1685-1690．）通过1日龄C57BL/6J乳母鼠驯化得到稳定的致死11日龄小鼠适应株CA16-TS，CA16-TS株可致小鼠后肢麻痹和严重的肌肉坏死，随后体质量逐渐降低至死亡，CA16-TS没有表现出强的神经嗜性，而是表现出更强的肌肉侵入性和毒性。MAO 等（Mao Q, Wang Y, Gao R, Shao J, Yao X,Lang S, Wang C, Mao P, Liang Z, Wang J. A neonatal mouse model ofcoxsackievirus A16 for vaccine evaluation. J Virol. 2012 Nov;86(22):11967-76.doi: 10.1128/JVI.00902-12. Epub 2012 Sep 5. PMID: 22951825; PMCID:PMC3486452.）将CV-A16临床分离株BJCA08 /CA16通过脑内注射方式感染1日龄ICR乳鼠制备手足口病模型，被感染鼠出现身体消瘦，下肢瘫痪，甚至全身肌肉麻痹、死亡，经病理学及免疫组化检查后发现，该临床株对肌肉组织有较强的趋向性，极易导致骨骼肌和心肌严重坏死。CoxA16所致的小鼠手足口病模型，动物行为上均表现出明显的共济失调、肢体瘫痪、精神萎靡等症状，这与目前的小鼠适应株一致。李景良（李景良.重组柯萨奇 A16 病毒致病机理及候选疫苗对动物模型致死性保护机制[D].长春:吉林大学, 2014．）将CA16 CC024病毒通过颅腔注射的方式对1日龄的小鼠进行感染，结果攻毒的乳鼠在第3天出现4级临床症状，4级乳鼠的临床症状为肢体麻痹，被感染乳鼠后肢肌肉、脊柱肌肉纤维断裂，肺组织损伤和充血。免疫组织化学分析结果表明在肌肉组织和肺部有大量的病毒抗原，对肺部组织有明显的特异趋向性。李雅静（李雅静.一种柯萨奇病毒A16型鼠适应株及其应用:中国,201310471154.4 [P].2015-05-13.）用4~6日龄BalB/c乳鼠制备CV-A16鼠适应株，获得成功。

但目前国内外尚未有柯萨奇病毒A16型相关检测标准毒株和用于疫苗保护性评价用攻击毒株。

发明内容

本发明的目的是提供一株交叉中和能力好、遗传稳定、毒力强的柯萨奇病毒A16型毒株及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

首先，本发明提供一种柯萨奇病毒A16型毒株，其P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

在所述柯萨奇病毒A16型毒株基因组中，以上所述的P1结构蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

具体地，本发明提供的柯萨奇病毒A16型毒株含有P1结构蛋白以及非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D；其中，所述非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-10所示。

本发明提供的柯萨奇病毒A16型毒株的基因组编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白以及序列如SEQ ID NO.4-10所示的非结构蛋白。

优选地，所述柯萨奇病毒A16型毒株的基因组中，P1结构蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的编码基因序列分别如SEQ IDNO.11-17所示。

以上所述的结构蛋白和非结构蛋白的编码基因在所述柯萨奇病毒A16型毒株的基因组上的排列顺序为VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。VP1、VP2、VP3和VP4组成结构蛋白P1。

本发明提供由如SEQ ID NO.2所示的基因以及如SEQ ID NO.11-17所示的基因顺次连接组成的重组核酸分子。

进一步优选地，所述柯萨奇病毒A16型毒株的基因组序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.3所示序列的互补序列所示。所述SEQ ID NO.3中的1-717bp为5’UTR的核酸序列，718-924bp为VP4的核酸序列，925-1686bp为VP2的核酸序列，1687-2412bp为VP3的核酸序列，2413-3303bp为VP1的核酸序列，3304-3753bp为2A的核酸序列，3754-4050bp为2B的核酸序列，4051-5037bp为2C的核酸序列，5038-5295bp为3A的核酸序列，5296-5361bp为3B的核酸序列，5362-5910bp为3C的核酸序列，5911-7296bp为3D的核酸序列，7297-7299bp为终止密码子，7300-7381bp为3’UTR的核酸序列。

具体地，本发明提供柯萨奇病毒A16型毒株R00880662，该毒株已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A16型，保藏编号为CGMCC No.19534。

柯萨奇病毒A16型毒株R00880662的基因组编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白以及序列如SEQ ID NO.4-10所示的非结构蛋白，其基因组序列如SEQ ID NO.3所示，亚型为B1型。

本发明提供的上述柯萨奇病毒A16型毒株具有较强的毒力，在基因型内和基因型间具有较好的交叉中和能力，免疫原性好，能够以RD等细胞作为基质细胞进行快速繁殖。

进一步地，本发明提供与所述柯萨奇病毒A16型相关的生物材料，其为以下（1）-（8）中的任意一种：

（1）序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白；

（2）编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白的核酸分子；

（3）序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.3所示序列的互补序列所示的核酸分子；

（4）含有（2）或（3）中所述核酸分子的表达盒；

（5）含有（2）或（3）中所述核酸分子的重组载体；

（6）含有（2）或（3）中所述核酸分子的重组微生物；

（7）含有（2）或（3）中所述核酸分子的细胞系；

（8）检测（2）或（3）中所述核酸分子的引物或探针。

以上（2）或（3）中所述的核酸分子可为DNA分子或RNA分子。

以上（4）中所述的表达盒为在（2）或（3）中所述的核酸分子的上游、下游连接用于转录、翻译的调控元件得到的重组核酸分子。

以上（5）中所述的重组载体为携带（2）或（3）中所述的核酸分子且能够在宿主细胞中复制或整合的质粒载体、病毒载体、噬菌体载体或转座子。

以上（6）中所述的重组微生物可为细菌或病毒。

以上（7）中所述的细胞系为动物细胞系，所述动物细胞系为不可繁殖为动物个体的动物细胞系，可为用于病毒培养的常用动物细胞系，包括但不限于RD、Vero、MRC-5等其他细胞。

以上（8）中所述的引物、探针为能够与（2）或（3）中所述核酸分子结合并进行PCR扩增的寡核苷酸。

本发明还提供所述柯萨奇病毒A16型毒株的病毒样颗粒，其含有P1结构蛋白以及选自非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D中的任意一种或多种；所述P1结构蛋白具有如SEQID NO.1所示的序列，所述非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D分别具有如SEQ ID NO.4-10所示的序列。

以上所述的病毒样颗粒可采用昆虫载体系统表达上述结构蛋白、非结构蛋白的编码基因。

本发明还提供含有以上所述的柯萨奇病毒A16型毒株、生物材料或病毒样颗粒的免疫原性组合物。

所述免疫原性组合物中除含有所述柯萨奇病毒A16型毒株、生物材料或病毒样颗粒外，还可含有有利于柯萨奇病毒A16型毒株发挥免疫原性的佐剂。所述佐剂包括但不限于铝佐剂。

进一步地，本发明提供柯萨奇病毒A16型毒株或所述的生物材料或所述病毒样颗粒的如下任意一种应用：

（1）在柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

（2）在柯萨奇病毒的免疫血清中和抗体含量检测中的应用；

（3）在柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；

（4）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

（5）在预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的药物的筛选或药效评价中的应用；

（6）在制备诊断柯萨奇病毒感染的试剂或试剂盒中的应用；

（7）在柯萨奇病毒的流行病学调查中的应用；

（8）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的疫苗中的应用；

（9）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的药物中的应用；

（10）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗体中的应用；

（11）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗血清中的应用。

以上（1）中，所述应用具体为作为疫苗免疫原性评价的标准检测毒株。

以上（3）中，所述应用具体为作为用于疫苗保护性评价的攻击毒株。

以上（4）中，所述动物模型优选为鼠模型。

以上（1）-（11）中，所述柯萨奇病毒优选为柯萨奇病毒A16型毒株。

以上（5）和（8）-（11）中，所述柯萨奇病毒引起疾病优选为手足口病。

本发明提供一种抗体或抗血清，其为以所述柯萨奇病毒A16型毒株或所述生物材料或所述病毒样颗粒为免疫原制备得到。

本发明还提供一种抗体或抗血清的制备方法，该方法包括：以所述柯萨奇病毒A16型毒株、所述生物材料或所述病毒样颗粒为免疫原免疫动物，经分离获得抗柯萨奇病毒A16型的抗体或抗血清。

本发明提供一种产品，其含有以下（1）-（4）中的任意一种或多种的组合：

（1）上述柯萨奇病毒A16型毒株；

（2）上述生物材料；

（3）上述病毒样颗粒；

（4）上述柯萨奇病毒A16型毒株的抗体或抗血清。

以上所述的产品优选为用于柯萨奇病毒A16型疫苗免疫原性或保护性评价的产品，或者为用于柯萨奇病毒A16型感染动物模型构建的产品，或者为用于诊断、预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染的产品。

所述产品可为试剂、试剂盒、疫苗或药物。

作为本发明的一种实施方式，所述产品为用于柯萨奇病毒A16型疫苗免疫原性或保护性评价的试剂，其含有所述柯萨奇病毒A16型毒株。

作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于柯萨奇病毒A16型感染动物模型构建的试剂，其含有所述柯萨奇病毒A16型毒株。

作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于预防柯萨奇病毒A16型感染的疫苗，其含有所述柯萨奇病毒A16型毒株。

本发明所述的疫苗可为全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、基因工程疫苗（亚单位疫苗、活载体疫苗、基因重组疫苗等）。

优选地，所述疫苗为全病毒灭活疫苗，其中所述柯萨奇病毒A16型毒株被灭活。所述疫苗还可含有佐剂，所述佐剂包括但不限于铝佐剂。

本发明还提供以上所述的疫苗的制备方法，所述方法包括：将所述柯萨奇病毒A16型毒株在细胞上培养，收获病毒液，将收获的病毒液经灭活、纯化后获得疫苗原液，将所述疫苗原液与佐剂混合。

作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于治疗柯萨奇病毒A16型感染的药物，其含有所述柯萨奇病毒A16型毒株的抗体或抗血清。

本发明还提供以上所述的产品在柯萨奇病毒A16型疫苗的免疫原性评价或保护性评价、制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用。

本发明还提供以上所述的产品在诊断、预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染中的应用。

本发明的有益效果至少在于：

本发明筛选到一株基因型内和型间交叉性良好、遗传稳定的毒株，可作为柯萨奇病毒A16型血清中和抗体效价检测用毒株，为柯萨奇病毒A16型相关单/多价疫苗研发提供支持。该毒株免疫原性好、滴度高，腹腔注射10²CCID₅₀病毒液可使1日龄乳鼠7天内100%死亡。表明该毒株是一株强毒力的毒株，该对小鼠具有高致病和致死能力的强毒株为建立稳定的感染动物模型提供攻击毒株，对于构建CV-A16小鼠模型至关重要。

附图说明

图1为本发明实施例1中毒株的型内交叉中和研究结果。

图2为本发明实施例5中攻击毒株筛选-存活曲线。

图3为本发明实施例5中LD₅₀确定-存活曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

本发明的基本研究方法为：

（1）对已经过荧光定量PCR检测为柯萨奇病毒A16型阳性的咽肛试子样本，在RD细胞上进行分离，并经过3次传代适应性培养，对收获的病毒液进行初步的鉴定，主要包括病毒滴定、分子生物学鉴定（病毒确定，核酸序列测定分析亚型）、免疫原性试验、及交叉中和能力的研究、基因组测序等，初步获得合适的中和抗体检测毒株和攻击毒株（初筛毒株）。

（2）初筛毒株分别进行3次蚀斑纯化，在RD细胞上进行3次传代适应性培养（P4代），对收获的病毒液进行检定，病毒液检定主要包括病毒滴定。根据病毒检定结果结合病毒病变进程、病变融合度，建立原始种子，并进行相关评价研究和传代稳定性研究。原始种子的评价研究主要包括病毒滴定、免疫原性研究、致病性研究及交叉中和能力的研究等。传代稳定性研究主要是将原始种子病毒液按一定比例在RD细胞上进行连续传代培养至第15代，对传代过程中每代毒株进行病毒滴定，对传代过程中的第5、10、15代病毒液进行病毒滴定、基因测序检测（基因组测序分析）。根据以上研究结果选择交叉保护范围广、免疫原性好、遗传稳定性好的毒株一株作为中和抗体检测毒株；遗传稳定性好、致病性强的毒株一株作为疫苗保护性评价的攻击毒株。

（3）中和抗体检测候选毒株确立后，对其进行病毒滴定。然后对其进行滴度标定及专属性评价。确定该检测毒株的标示滴度，从而确定中和试验时检测滴度株的稀释倍数。专属性评价旨在验证该检测毒株只对CV-A16型免疫血清有特异性中和能力，而对其他肠道病毒如EV-A71、CV-A6及CV-A10免疫血清无交叉反应。从而证明该毒株适用于柯萨奇病毒A16型免疫血清的中和抗体效价的检测。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 柯萨奇病毒A16型毒株的初步筛选

临床样本的处理：

在生物安全柜中将每一份样品（已经过荧光定量PCR检测为柯萨奇病毒A16型阳性的咽肛试子样本）取0.25 ml加入离心管中。加入2.5μl青链霉素溶液，混匀，4 ℃放置过夜。2000 rpm 离心20 min，上清存于2~8℃以备接种。

病毒分离培养：

取准备好的，长至80-90%密度的健康无污染的RD细胞，弃去细胞培养液。将处理好的样品0.2ml/孔接种于6孔板内，每一份样品接种1孔，同时加入0.2 ml/孔病毒培养液，置35℃ 5% CO₂培养箱中吸附1h。之后每孔补加3.5ml病毒培养液，置35℃ 5% CO₂培养箱中静置培养。设置2孔生长状态良好且未接种标本的细胞作为细胞对照。

病毒收获及适应性传代培养：

每天观察并记录接种后细胞特征性肠道病毒致细胞病变效应（CPE）情况。如果出现CPE且CPE程度达+++以上时，冻融一次，收获细胞培养物，用0.2μm针头滤器过滤，0.2ml/支分装病毒液，于-60℃冰箱保存，取病毒液继续传代三次，每代冻融一次，2000 rpm 4℃离心10 min，上清分装，于-60℃冰箱保存，做好标记和记录。如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取阳性分离物传三代，继续观察。

病毒鉴定：

对获得的病毒分离阳性株的第3代病毒液进行病毒鉴定试验，主要包括病毒滴定、分子生物学鉴定（病毒鉴定及病毒基因型分型）及免疫原性试验、交叉中和能力的研究、基因组测序等。

病毒滴定：

（1）检测方法：将经三次传代的病毒液用无血清的培养液在离心管中10倍梯度稀释，从10^-1~10^-8。将稀释好的病毒加入96孔培养板，8孔/稀释度，0.1ml/孔。同时每孔加入100μl RD细胞悬液（1.5×10⁵个/ml）。再另外取8~16孔加入细胞悬液，0.1ml/孔，补加稀释液0.1ml/孔，作为细胞对照。加盖封板，轻轻拍打混匀，置于35℃，5% CO₂培养箱中静置培养，第7天判断结果。每个样品进行3次重复。

（2）病毒滴度计算：按Behrens-Karber公式计算LgCCID₅₀：

LgCCID₅₀ = L-d (S-0.5)，其中：

L = 实验中使用的病毒的最低稀释度的对数值；

d = 稀释梯度的对数值；

S = 终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。具体参见中华人民共和国卫生部．手足口病预防控制指南(2009版)．[EB/OL]．(2009-06-04) http://www.gov.cn/gzdt/2009-06/04/content_1332078.htm。

分子生物学鉴定：

采用RT-PCR法鉴定CV-A16病毒，将CV-A16阳性的病毒株进行VP1核酸序列测定，并根据VP1核苷酸序列进行CV-A16基因型分型。

RT-PCR法鉴定CV-A16病毒：

提取病毒核酸，应用EV组肠道病毒核酸检测通用引物及CV-A16核酸检测引物进行CV-A16病毒鉴定。

（1）扩增引物设计如下：

A、人肠道病毒核酸检测通用引物序列（产物长度400-500bp）

59F: 5’-CYTTGTGCGCCTGTTTT-3’（SEQ ID NO.18）；

588R: 5’-ATTGTCACCATAAGCAGCC-3’（SEQ ID NO.19）；

153F: 5’-CAAGYACTTCTGTMWCCCC-3’（SEQ ID NO.20）；

541R: 5’-CCCAAAGTAGTCGGTTCC-3’（SEQ ID NO.21）。

以上引物中，Y代表C/T，M代表A/C，W代表A/T。

B、CV-A16 核酸检测引物序列（产物长度 1kb）

CA16-VP1- WHF: 5’- ATTGGTGCTCCCACTACAGC -3’（SEQ ID NO.22）；

CA16-VP1- WHR: 5’- GAGCTGTCCTCCCACACAAG -3’（SEQ ID NO.23）。

（2）病毒核酸提取：

按照说明书中顺序和用量向96孔板添加试剂和病毒样品，然后置于核酸提取仪中，按照预设的程序抽提核酸；将提取好的核酸分装至EP管中，标记样品信息和日期，保存至-60℃冰箱。

（3）PCR扩增：

1）HEV- 5’UTR通用引物PCR扩增

a. 第一轮PCR扩增：

配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表1），然后加入0.4μl供试品病毒基因组并混匀，放入PCR仪运行程序（见表2）。

表1 HEV-5’UTR通用引物第一轮PCR扩增反应体系

表2 HEV-5’UTR通用引物第一轮PCR扩增程序

b. 第二轮PCR扩增：

配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表3），然后加入0.4μl第一轮PCR扩增产物为模板，放入PCR仪运行程序（见表4）。

表3 HEV-5’UTR通用引物第二轮PCR扩增反应体系

表4 HEV-5’UTR通用引物第二轮PCR扩增程序

2）CV-A16 VP1特异性引物PCR扩增

配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表5），然后加入0.4μl供试品病毒基因组并混匀，放入PCR仪运行程序（见表6）。

表5 VP1特异性引物PCR扩增反应体系

表6 VP1特异性引物PCR扩增程序

3）用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

4）结果判断

HEV-5’UTR通用引物扩增阳性样本应能观察到大小为400bp的目的条带，VP1特异性引物扩增阳性样本应能观察到大小为1kb的目的条带。标本的实验室诊断结果根据表7进行判断。其中，HEV（－）代表HEV- 5’UTR通用引物未扩增出目的条带，HEV（＋）代表HEV- 5’UTR通用引物扩增出目的条带；CV-A16（－）代表CV-A16 VP1特异性引物未扩增出目的条带，CV-A16（＋）代表CV-A16 VP1特异性引物扩增出目的条带。

表7

CV-A16基因型分型：

将鉴定为CV-A16阳性的病毒株，根据VP1核酸序列进行CV-A16基因型分型。结果显示均为B1型。

免疫原性研究：

挑选滴度高的毒株，应用NIH小鼠进行免疫原性分析。

将17株第三代病毒液制备成相同病毒滴度（6.0 LgCCID₅₀/ml），免疫NIH小鼠（SPF级，18-22g，雌性），各毒株组10只，分别编号。按照0、14天两针免疫程序，分别腹腔注射灭活病毒500 μl/只，同时设置培养基对照组，分别于一免、二免后14天采血，分离血清。采用微量细胞病变法测定血清抗特异性中和抗体效价，分析阳转率及中和抗体水平。

中和抗体效价测定步骤：将待测血清按1:8稀释，经56 ℃灭活30 min，加至96孔板中，0.05ml/孔，作2倍系列稀释后，分别与100CCID₅₀的CV-A16病毒悬液于37℃中和1~3h；加入1.5×10⁵个/ml的RD细胞悬液，0.1ml/孔，置35±0.5℃，5% CO₂培养箱中培养7d。将能抑制50%细胞病变的最高稀释度定为CV-A16抗体的中和效价，并以稀释倍数的倒数表示。每次试验均设病毒回滴试验，回滴结果在32~320 CCID₅₀/孔时试验判为成立。以中和效价≥8判为CV-A16中和抗体阳性，阴性样品的几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）均按4计算。

试验结果显示，一免阳转率可达到70%以上，二免阳转率达到100%，一免中和抗体效价在1:8~1:127之间，二免中和抗体效价在1:100~1:1042之间，其中，R088中和抗体效价可达1:1042，表明为优势毒株。

交叉中和能力研究：

将毒株与毒株免疫血清进行交叉中和能力研究，以毒株对全部待测血清的中和抗体效价倍数差反映交叉中和能力。倍数差低代表该毒株具有较均一的交叉中和检测能力，筛选中和抗体GMT高且倍数差较低的毒株，作为检测候选毒株。

a. 型内交叉中和研究：

挑选免疫原性好的6株初筛毒株（R054、R008、R088、R068、R081、R080）进行型内交叉中和研究（以6株毒株和对应的6份免疫血清进行交叉中和反应），免疫血清为2次免疫小鼠14天后采集的血清（具体步骤参见上述血清抗特异性中和抗体效价的测定）。以毒株对全部血清的中和抗体效价GMT和倍数差（MAX/MIN）反映交叉中和能力。结果见图1，编号为R088的初筛毒株检测各免疫血清的中和抗体效价GMT为1:435，且倍数差为8。

b. 型间交叉中和研究：

以包括3株A基因型、8株B基因型和1株C基因型毒株在内的12个CV-A16毒株（毒株信息见表8）进行型间交叉中和研究（委托中国食品药品检定研究院进行，毒株及其对应的免疫血清均来自中国食品药品检定研究院），免疫血清为经过2次免疫14天后采集的小鼠血清。将12份血清分别与12株CV-A16病毒株进行交叉中和检测。以毒株对全部血清的中和抗体效价和倍数差反映交叉中和检测能力。

表8 毒株信息

注：毒株V01~V07均为从中国大陆自行分离获得。

结果表明：全部待检毒株检测不同毒株免疫血清中和效价GMT在36～875，R088毒株检测不同毒株免疫血清中和效价GMT为829；全部待检毒株检测不同毒株免疫血清中和效价GMT倍数差在11～171，而R088毒株倍数差为11，表明该毒株对现有的柯萨奇病毒A、B、C基因型具有较好的交叉中和检测能力。

实施例2 蚀斑纯化

将初筛毒株的病毒稀释液接种于6孔细胞培养板中进行纯化。

（1）细胞准备：取已长成单层的RD细胞经洗涤、消化后接种于6孔细胞培养板中，7×10⁵个细胞/孔，补加RD细胞细胞培养液，置5% CO₂培养箱中37±1℃静置培养至长成致密单层。弃去原培养液，清洗细胞表面，洗去残留的牛血清与死细胞。

（2）病毒准备：将病毒液进行适当倍数的稀释。

（3）病毒吸附：将稀释好的病毒液进行接种，0.4ml/孔，同时设置病毒液对照和细胞对照，置5% CO₂培养箱中35℃吸附1~2小时，期间每隔15~20min轻轻晃动细胞板数次，使其接触整个细胞表面。

（4）覆盖与培养：吸附完毕后，弃去病毒液，病毒对照和细胞对照孔，加入病毒维持液3ml/孔。其余各孔沿壁缓慢加入琼脂糖和病毒维持液混合物，每孔3ml，室温放置30min以上使其冷却凝固成覆盖层，把加入琼脂糖的培养板倒置于5% CO₂培养箱内37±1℃培养，每天观察并记录，蚀斑情况（形态、大小及数量）及病毒对照病变情况。

（5）蚀斑培养：将单个蚀斑，用200μl带滤芯的枪头挑取至含有100μl病毒维持液的1.5 ml EP管中，反复吹打混匀，接种至细胞已长至单层的6孔细胞培养板中，置5% CO₂培养箱中37±1℃培养，每天观察CPE。待细胞出现CPE达75%时，收集上清液，于-60℃冰箱中保存。此时病毒代次为P2代。

（6）鉴定及分析：将P2代病毒进行病毒滴度检测。

（7）选择滴度较高的毒株进行第二次和第三次蚀斑纯化，操作同上。

实施例3 检测候选毒株的确定

将经三次蚀斑纯化的毒株扩增至第5代建立原始种子，并对其进行相关检定研究以及传代稳定性研究，根据传代稳定性研究结果选择交叉保护范围广、遗传稳定性好、滴度高的毒株作为检测候选毒株。如未特殊说明，具体的研究方法操作步骤参见实施例1。

原始种子毒株的检定研究主要包括免疫原性、病毒滴定、基因组测序分析、交叉中和能力研究。

传代稳定性研究主要是将原始种子病毒液按一定比例在RD细胞上进行连续传代培养至第15代，对传代过程中每代毒株进行病毒滴定、基因组序列分析。

毒株检定研究结果显示编号为R00880662的毒株的免疫原性良好（一免后血清阳转率即可达到80%以上，二免后血清阳转率为100%，二免后中和抗体效价GMT值为1:512），滴度为8.95LgCCID₅₀/ml，基因组序列与初筛毒株R088一致。

型内交叉中和研究结果显示该毒株检测免疫血清中和抗体的GMT值为1:488，倍数差为4。实验结果详见下表9。其中，毒株R00540613、R00080265、R00681123、R00800833、R00810253为将实施例1中的初筛毒株R054、R008、R068、R080、R081进行多次蚀斑纯化获得的原始种子。

表9 型内交叉中和实验结果

进一步进行R00880662毒株的型间交叉中和研究，以包括3株A基因型、8株B基因型和1株C基因型毒株在内的12个CV-A16毒株（毒株信息参见上述表8）进行型间交叉中和研究，免疫血清为经过2次免疫14天后采集的小鼠血清。将12份血清分别与12株CV-A16病毒株进行交叉中和检测。以毒株对全部血清的中和抗体效价和倍数差反映交叉中和检测能力。

结果表明：全部待检毒株检测不同毒株免疫血清中和效价GMT在14～598，R00880662毒株检测不同毒株免疫血清中和效价GMT为598；全部待检毒株检测不同毒株免疫血清中和效价GMT倍数差在4～171，而R00880662毒株倍数差为16，表明该毒株对现有的柯萨奇病毒A、B、C基因型具有较好的交叉中和检测能力。

传代稳定性研究表明编号为R00880662的毒株连续传15代，5~15代滴度趋势稳定（8.21~9.17LgCCID₅₀/ml之间），5代、10代及15代的基因组序列一致。

上述编号为R00880662的毒株已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A16型，保藏编号为CGMCC No.19534。

R00880662毒株的基因组序列如SEQ ID NO.3所示，P1蛋白的编码基因序列如SEQID NO.2所示，P1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-10所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的编码基因序列分别如SEQ ID NO.11-17所示。

实施例4 检测毒株滴度标定和专属性评价

由3名实验员，分别独立进行9次滴度测定，结果表明滴度均值为7.444LgCCID₅₀/ml（95%CI：7.361~7.528），符合正态分布。专属性研究表明与同为肠道病毒的柯萨奇病毒A10血清（毒株保藏编号为CGMCC No.19533，该毒株名称为R06030451，该毒株已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A10型）、肠道病毒71型血清和柯萨奇病毒A6血清（毒株保藏编号为CGMCC No.19532，该毒株名称为R01170631，该毒株已于2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A6型）均无交叉中和现象，研究方法参见实施例1中的型内交叉中和研究方法。

实施例5 致病性研究

根据实施例1中的免疫原性结果，选择最优的3个毒株进行致病性初步研究，根据结果挑选致病性最强的毒株进行LD₅₀研究。

初步研究将取冻存的3个毒株迅速融化，用含2%FBS的病毒维持液稀释至10⁵CCID₅₀/0.05ml，分别腹腔接种1日龄Balb/C乳鼠，每只50μl，每个毒株1窝（5-10只），另设含2%FBS的病毒维持液为对照组。记录实际小鼠数量。连续观察21天，记录小鼠发病和死亡情况。结果显示同样的攻毒剂量，编号R00880662的毒株攻毒后第3天使乳鼠100%死亡，其余两个毒株（R00681123、R00540613）分别于攻毒后第6天和第9天使乳鼠100%死亡，见图2。表明编号R00880662的毒株具有更强的毒力。因此选择该毒株作为攻击毒株，进行LD₅₀研究。

取冻存的R00880662毒株迅速融化，用含2%FBS的病毒维持液做10倍系列稀释，依次稀释至10³、10²、10¹、10⁰、10^-1CCID₅₀/0.05ml五个浓度。

将每个稀释度病毒液分别腹腔接种1日龄Balb/C乳鼠，每只50μl，每个稀释度1窝（5-10只），另设含2%FBS的病毒维持液为对照组。记录实际小鼠数量。连续观察21天，记录小鼠发病和死亡情况，按照Reed-Muench法计算每株病毒的累计死亡率和LD₅₀值。

对照组21天存活率100%，试验成立。结果显示10² CCID₅₀/只攻毒组的乳鼠7天全部死亡，而10 CCID₅₀/只攻毒组的死亡率为33.3%，而1 CCID₅₀/只、0.1 CCID₅₀/只攻毒组和对照组未出现临床症状，死亡率为0%。按Reed-muench法计算，以稀释度为标准，LD₅₀为5×10^-5；以滴度为标准，LD₅₀为112.94CCID₅₀/ml，存活曲线见图3。表明该毒株为致病力强的毒株，可以用于柯萨奇病毒A16相关疫苗保护性评价。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京民海生物科技有限公司

<120> 柯萨奇病毒A16型毒株及其应用

<130> KHP211120537.2YS

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

1 5 10 15

Asn Ser Ala Ser Glu Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ala Tyr Ala Ala Ser Ala Gly Arg Gln Asp Met Ser Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Asp Pro Val Met Asp Val Ile His Glu Met

50 55 60

Ala Pro Pro Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Ile Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Phe Thr Leu Asp Thr Lys Ser Trp Ala Lys Asp Ser

130 135 140

Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Val Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Val His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Leu Pro Glu Tyr Val Leu Gly Thr Ile Ala Gly Gly Thr

195 200 205

Gly Asn Glu Asn Ser His Pro Pro Tyr Ala Thr Thr Gln Pro Gly Gln

210 215 220

Val Gly Ala Val Leu Met His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro

225 230 235 240

Leu Ser Gln Leu Thr Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr

245 250 255

Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Val Pro Tyr Met Asn Thr Val Pro Phe

260 265 270

Asp Ser Ala Leu Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Val Pro Val

275 280 285

Val Pro Leu Asp Phe Asn Thr Gly Ala Thr Ser Glu Ile Pro Ile Thr

290 295 300

Val Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala

305 310 315 320

Val Lys Gln Gly Ile Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe

325 330 335

Leu Thr Thr Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe His

340 345 350

Pro Thr Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Asn Leu Leu Glu

355 360 365

Ile Cys Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Leu Lys Thr Asn

370 375 380

Glu Thr Thr Pro Met Gln Arg Leu Cys Phe Pro Val Ser Val Gln Ser

385 390 395 400

Lys Thr Gly Glu Leu Cys Ala Ala Phe Arg Ala Asp Pro Gly Arg Asp

405 410 415

Gly Pro Trp Gln Ser Thr Ile Leu Gly Gln Leu Cys Arg Tyr Tyr Thr

420 425 430

Gln Trp Ser Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Ala Gly Ser Phe

435 440 445

Met Ala Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Asn

450 455 460

Val Pro Ala Asp Arg Ile Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp

465 470 475 480

Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Val Pro Trp Ile Ser

485 490 495

Asn Thr His Tyr Arg Ala His Ala Arg Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Tyr

500 505 510

Thr Thr Gly Ile Ile Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro

515 520 525

Ile Gly Ala Pro Thr Thr Ala Tyr Ile Val Ala Leu Ala Ala Ala Gln

530 535 540

Asp Asn Phe Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Thr Glu Asp Ile Glu Gln

545 550 555 560

Thr Ala Asn Ile Gln Gly Asp Pro Ile Ala Asp Met Ile Asp Gln Thr

565 570 575

Val Asn Asn Gln Val Asn Arg Ser Leu Thr Ala Leu Gln Val Leu Pro

580 585 590

Thr Ala Ala Asn Thr Glu Ala Ser Ser His Arg Leu Gly Thr Gly Val

595 600 605

Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser

610 615 620

Asp Lys Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn His His Ser Thr

625 630 635 640

Gln Glu Thr Ala Ile Gly Asn Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Ser

645 650 655

Ile Ile Thr Met Pro Thr Thr Gly Thr Gln Asp Thr Asp Gly Tyr Val

660 665 670

Asn Trp Asp Ile Asp Leu Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Cys

675 680 685

Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Val

690 695 700

Ala Lys Pro Asn Gly Gly Leu Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Tyr

705 710 715 720

Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys Ser Arg Asp Ser Phe Ala Trp

725 730 735

Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Met Thr Asp Pro Pro

740 745 750

Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp

755 760 765

Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Leu Gln Ala Asn Asp

770 775 780

Leu Asp Tyr Gly Gln Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Ile

785 790 795 800

Arg Thr Val Gly Thr Glu Lys Ser Pro His Ser Ile Ala Leu Arg Ile

805 810 815

Tyr Met Arg Ile Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Leu Arg

820 825 830

Asn Gln Pro Tyr Leu Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp

835 840 845

Ile Lys Cys Thr Ser Thr Ser Arg Asp Lys Ile Thr Thr Leu

850 855 860

<210> 2

<211> 2586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggggtcac aagtctctac tcagcggtcc gggtcgcatg agaactcaaa ctccgcatcg 60

gaaggctcaa ccataaatta tacaactata aactactata aggatgcata tgctgcgagt 120

gcggggcgcc aggatatgtc tcaagacccg aagaaattta ccgaccctgt tatggatgtt 180

atacatgaga tggccccacc gctcaagtct ccgagcgctg aggcgtgtgg ttatagtgat 240

cgtgtggccc agcttaccat tgggaattct accattacta cgcaagaagc agctaacata 300

gttatagcct atggggagtg gcctgaatat tgcccagaca cggatgcgac ggcagtcgac 360

aagcccacac gacctgacgt gtcagtgaat agatttttca cactagatac taaatcttgg 420

gcaaaggatt caaagggatg gtattggaaa ttccccgatg ttttgacaga ggtaggcgtg 480

tttggtcaaa atgctcaatt tcactacctg tatcgatctg gattttgcgt gcacgtccag 540

tgtaatgcaa gtaaattcca ccagggtgct ttactggtgg ccgtgctacc tgagtatgtg 600

ctcggcacta tcgcaggggg gactgggaac gagaattctc atcctcccta cgctactaca 660

cagcctggtc aggttggtgc agtcctgatg cacccatatg tactagatgc agggatacct 720

ttgagccaat taaccgtgtg tcctcaccag tggatcaact tgagaaccaa caattgtgca 780

actattatag tcccatacat gaacacggtt ccatttgatt cagctcttaa tcactgcaat 840

tttgggttgc tggtcgtccc ggtggtgcca ttggacttta atacaggtgc cacgtctgaa 900

attcctatta cagtcaccat agctcccatg tgtgcagagt ttgcgggtct gcgccaggca 960

gtgaagcaag gcataccaac agagctcaag cctggtacca atcagtttct cactaccgat 1020

gatggtgtct ctgcaccaat tttaccaggc ttccacccaa ccccccctat acatatacca 1080

ggagaagtgc ataacttatt ggagatatgt agagtggaga ccattttaga agttaacaac 1140

ctgaagacca atgagaccac ccccatgcag cgcttgtgct ttccagtgtc agttcagagc 1200

aaaacaggtg agttgtgtgc tgcctttaga gcagaccctg gaagagatgg tccgtggcag 1260

tccacaatac tgggtcaact ctgcaggtac tacacccagt ggtcgggttc attggaggtg 1320

acatttatgt ttgcgggctc attcatggcc acaggcaaga tgctcatcgc ctacacccca 1380

cctgggggaa atgtgcctgc ggacagaatc acagcaatgt taggaacgca tgtgatctgg 1440

gactttggat tgcaatcctc tgtgacattg gttgtgccat ggattagcaa tacgcattac 1500

agggcgcacg cccgtgctgg gtactttgac tattacacta ccggcattat aactatatgg 1560

tatcaaacca actatgtggt acctattggc gctcccacta cagcatacat cgtagctctg 1620

gcagcagccc aagacaactt taccatgaaa ttatgcaagg atacagagga cattgagcaa 1680

acagctaata tacaagggga tcccattgct gacatgatcg accaaactgt gaataaccaa 1740

gtgaaccgct ccttaaccgc attacaagta ctacctacag ctgccaatac tgaagcaagt 1800

agccacagat taggcactgg tgttgtgcca gcactgcaag ctgcggagac gggggcgtca 1860

tcaaatgcca gtgacaagaa tctcattgag acgagatgtg tgttgaacca tcattccaca 1920

caggagacag ccatcgggaa tttctttagc cgtgctggtt tggttagyat catcacaatg 1980

cccaccacgg gtacacagga cacagacggt tacgtcaact gggacattga cttgatggga 2040

tatgctcaac tacggcgcaa gtgcgagttg ttcacgtata tgcgctttga tgctgaattc 2100

acatttgtcg tagctaaacc caatggcgga ctggtccccc agttactgca gtacatgtat 2160

gtcccaccag gagccccgaa acccaaatct agagattcat ttgcttggca aactgctacc 2220

aacccgtctg tatttgtgaa aatgacagac ccaccagctc aagtgtcagt cccctttatg 2280

tcaccagcca gtgcatacca atggttttac gatggttatc ccactttcgg ggagcatctc 2340

caagcaaatg atctagatta tggccagtgc ccgaacaata tgatgggcac ctttagtatt 2400

agaacagtag ggactgagaa gtcaccacac tccattgctc tgaggatata tatgaggatt 2460

aaacacgtta gagcgtggat tccaaggcct ctgagaaatc aaccctattt gtttaagacc 2520

aacccaaatt ataaagggaa tgacattaag tgtactagta ctagtagaga caagataaca 2580

acatta 2586

<210> 3

<211> 7381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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ccaccatgaa cgttgcagag tgtttcgctc agcacatccc cagtgtagat caggtcgatg 300

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gcaacccata ggacgctcta ataccgacat ggtgcgaaga gcctattgag ctagttggta 420

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ccttttattc ttatattggc tgcttatggt gacaattgaa gaattgttac catatagcta 600

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catgagatgg ccccaccgct caagtctccg agcgctgagg cgtgtggtta tagtgatcgt 960

gtggcccagc ttaccattgg gaattctacc attactacgc aagaagcagc taacatagtt 1020

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cccacacgac ctgacgtgtc agtgaataga tttttcacac tagatactaa atcttgggca 1140

aaggattcaa agggatggta ttggaaattc cccgatgttt tgacagaggt aggcgtgttt 1200

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aatgcaagta aattccacca gggtgcttta ctggtggccg tgctacctga gtatgtgctc 1320

ggcactatcg caggggggac tgggaacgag aattctcatc ctccctacgc tactacacag 1380

cctggtcagg ttggtgcagt cctgatgcac ccatatgtac tagatgcagg gatacctttg 1440

agccaattaa ccgtgtgtcc tcaccagtgg atcaacttga gaaccaacaa ttgtgcaact 1500

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acaatactgg gtcaactctg caggtactac acccagtggt cgggttcatt ggaggtgaca 2040

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ctgttagttt cttccaccac tgcccagggg tgcgatacca tcgctagatg cgattgtcaa 3480

gccggagtat attattgcaa ctccaagaga aaacactacc cggttagttt caccaagccc 3540

agcctggtat ttgtggaggc tagtgagtat tacccagcta gataccaatc ccaccttatg 3600

cttgctgtag gccattcaga acctggcgac tgtggtggca tcctcagatg ccaacacggt 3660

gtgataggaa ttgtctccac tggtggcaat ggtcttgtgg ggtttgctga catcagagat 3720

ctcctgtggc tggatgaaga agcgatggag caaggagtgt ctgattatat caaaggcctc 3780

ggtgatgctt ttggcatggg cttcactgat gcagtgtcca gggaagtgga ggcattgaag 3840

aaccacttaa tcggttcaga aggggctgtt gaaaaaattc tgaagaattt ggtgaagcta 3900

atttcagcat tagtcatagt cgttaggagt gactatgaca tggtcaccct cacagccacg 3960

cttgccttga ttgggtgcca tggaagccct tgggcatgga taaaagcgaa gacagcctct 4020

attcttggca ttcccatagt gcaaaagcag agcgcttcat ggctaaagaa gtttaatgac 4080

atggctaatg ctgctaaggg acttgagtgg atttctagta aaatcagtaa gtttattgat 4140

tggcttaagg aaaagattat cccagccgct aaagagaagg ttgaattctt gaacaacttg 4200

aagcagcttc ccttactgga gaaccaaatt tcgaatctcg aacagtctgc tgcctcgcag 4260

gaggatctag aagctatgtt tggtaacgtg tcatatttgg cccacttttg ccgcaagttt 4320

cagccactct acgcaaccga agctaaacga gtctatgcgc tggagaaaag gatgaacaac 4380

tacatgcagt tcaagagcaa acaccgtatt gaacccgtat gtttgatcat cagaggctcc 4440

ccaggaacag gcaagtcgct tgccacgggc atcatagcta gagccattgc cgataaatac 4500

cattctagtg tttactcact tcctccagac ccagaccatt tcgatgggta caagcaacag 4560

gtagtcactg ttatggatga tctttgtcaa aacccagatg gaaaggacat gtcactattt 4620

tgccagatgg tttctacagt ggatttcata ccacccatgg catccctgga agagaaggga 4680

gtgtctttca cctctaagtt tgtcattgca tcgaccaatg ctagcaacat agtagttccc 4740

acagtttcag actcagatgc gattcgcaga cggttctaca tggactgtga tatagaggtg 4800

acagattcct acaagacaga ccttggccga cttgatgcag gtagagccgc caagctttgc 4860

acggaaaata ataccgccaa ctttaagaga tgcagcccac tagtgtgtgg caaagctatt 4920

caactaagag ataggaaatc caaagtgaga tacagcattg atactgtagt atcggagcta 4980

atcagagagt acaacaatag atccgccatc ggtaatacta tagaagctct cttccaagga 5040

ccccttaagt tcaagcctat aaggattagc cttgaagaga agccagctcc ggatgccatc 5100

agtgacctac tagctagtgt ggatagcgaa gaggttcggc aatactgcag ggaacagggg 5160

tggataattc cagaaacacc ggccaatgtg gaacgtcacc tcaacagagc agtgctagtg 5220

atgcagtcta tcgccaccgt ggttgcagtt gtgtctcttg tctatgttat ttacaaattg 5280

ttcgctgggt ttcagggtgc ttattctggt gcgcccaaac aagctcttaa gaagcccgtg 5340

ctaagaacag ccacggttca aggaccgagt ttagactttg ccttatccct tttaaggcgt 5400

aacattagac aggtgcaaac tgatcaaggg cacttcacca tgttaggggt acgggaccgc 5460

ctggctgttc tgccacgcca ctcgcaacca ggaaaaacta tttgggtgga acacaaattg 5520

attaatgtgc tagacgctgt tgagttagta gatgaacaag gtgtgaattt ggaacttaca 5580

ctagtaactt tagacaccaa cgaaaagttt agggacatca ccaagtttat tccagagaca 5640

atcactggag caagtgacgc aaccttgatc atcaacactg agcatatgcc ctcaatgttc 5700

gtcccagtgg gtgatgttgt acaatatgga ttcttgaatc ttagcggtaa gcccacacac 5760

cggaccatga tgtataactt ccccacaaag gcaggacagt gtggaggagt agtcacctca 5820

gttggtaaga tcattggagt ccacattggt gggaacggcc gtcaaggttt ctgtgctggg 5880

ttgaagagga gctactttgc cagtgaacag ggagaaatcc agtggatgaa gcccaataag 5940

gagactggga gattgaatgt taatggcccg acccgtacca aattagagcc tagtgtattc 6000

catgatgtgt ttgagggcag caaagaacca gcagtcttaa ccagtaagga ccccagactc 6060

gaggttgatt ttgagcaagc tttgttttcc aagtatgtgg gaaacacctt gcatgagcct 6120

gatgagtatg tgacgcaggc tgctctccac tatgctaacc agttaaaaca attagacatc 6180

aatactaata agatgagcat ggaagaagca tgttatggca ctgaatatct ggaggccata 6240

gaccttcata ccagtgctgg gtatccctat agtgccttgg gcattaagaa aagggacata 6300

ctcgacccgg tcactagaga caccactaaa atgaaattct acatggacaa atatgggtta 6360

gacatgccct attccactta tgtgaaagat gagctcaggt ccttagataa gattaagaag 6420

gggaaatccc gtttgattga agccagcagc ttgaatgatt cagtctatct taggatgacc 6480

tttgggcatc tctatgagac ttttcatgcc aacccgggga ctgtgaccgg atctgcagta 6540

gggtgcaatc ctgatgtgtt ctggagtaaa ttaccgatcc tgttaccggg gtcgctcttt 6600

gcatttgatt attcagggta tgatgcaagc ctcagcccag tgtggttcag agctttagag 6660

gtggtcctcc gtgagattgg ttactcagag gaggctgtgt cactaataga agggatcaac 6720

cacacccatc atgtgtatcg gaacaagaca tattgtgtcc ttggtggaat gccctcaggt 6780

tgttccggca cttccatctt caactctatg atcaataata taataatcag aactcttctg 6840

atcaaaacct ttaaggggat cgatttagat gagttgaaca tggtagctta tggagatgat 6900

gtgctggcta gctatccatt ccctattgac tgttcggagt tggccaagac tggcaaagag 6960

tatggattaa caatgacacc tgctgacaaa tcaccctgct ttaacgaagt cacttgggag 7020

aatgctacat tcttaaagag aggcttcttg ccagatcacc agtttccatt ccttatccac 7080

cccaccatgc ctatgagaga gatccatgag tccattcgtt ggactaagga tgcacgcaac 7140

actcaggacc acgtgcgttc cttgtgccta ttagcatggc ataatgggaa ggaggagtat 7200

gaaaaatttg tgagcacaat tagatcggtt cctattggga aagccttggc tataccaaat 7260

tttgaaaacc tgagaagaaa ttggctcgaa ttattttgat atacagctca aagctgaacc 7320

ccaccagaaa tctggtcatg ttaatgactg gtgggggtaa atttgttata accaagaaat 7380

a 7381

<210> 4

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Arg Phe Gly Gln Gln Ser Gly Ala Ile Tyr Val Gly Asn Tyr Arg

1 5 10 15

Val Val Asn Arg His Leu Ala Thr His Asn Asp Trp Ala Asn Leu Val

20 25 30

Trp Glu Asp Ser Ser Arg Asp Leu Leu Val Ser Ser Thr Thr Ala Gln

35 40 45

Gly Cys Asp Thr Ile Ala Arg Cys Asp Cys Gln Ala Gly Val Tyr Tyr

50 55 60

Cys Asn Ser Lys Arg Lys His Tyr Pro Val Ser Phe Thr Lys Pro Ser

65 70 75 80

Leu Val Phe Val Glu Ala Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser

85 90 95

His Leu Met Leu Ala Val Gly His Ser Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly

100 105 110

Ile Leu Arg Cys Gln His Gly Val Ile Gly Ile Val Ser Thr Gly Gly

115 120 125

Asn Gly Leu Val Gly Phe Ala Asp Ile Arg Asp Leu Leu Trp Leu Asp

130 135 140

Glu Glu Ala Met Glu Gln

145 150

<210> 5

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Val Ser Asp Tyr Ile Lys Gly Leu Gly Asp Ala Phe Gly Met Gly

1 5 10 15

Phe Thr Asp Ala Val Ser Arg Glu Val Glu Ala Leu Lys Asn His Leu

20 25 30

Ile Gly Ser Glu Gly Ala Val Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Val Lys

35 40 45

Leu Ile Ser Ala Leu Val Ile Val Val Arg Ser Asp Tyr Asp Met Val

50 55 60

Thr Leu Thr Ala Thr Leu Ala Leu Ile Gly Cys His Gly Ser Pro Trp

65 70 75 80

Ala Trp Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser Ile Leu Gly Ile Pro Ile Val

85 90 95

Gln Lys Gln

<210> 6

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Ala Ser Trp Leu Lys Lys Phe Asn Asp Met Ala Asn Ala Ala Lys

1 5 10 15

Gly Leu Glu Trp Ile Ser Ser Lys Ile Ser Lys Phe Ile Asp Trp Leu

20 25 30

Lys Glu Lys Ile Ile Pro Ala Ala Lys Glu Lys Val Glu Phe Leu Asn

35 40 45

Asn Leu Lys Gln Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Ser Asn Leu Glu

50 55 60

Gln Ser Ala Ala Ser Gln Glu Asp Leu Glu Ala Met Phe Gly Asn Val

65 70 75 80

Ser Tyr Leu Ala His Phe Cys Arg Lys Phe Gln Pro Leu Tyr Ala Thr

85 90 95

Glu Ala Lys Arg Val Tyr Ala Leu Glu Lys Arg Met Asn Asn Tyr Met

100 105 110

Gln Phe Lys Ser Lys His Arg Ile Glu Pro Val Cys Leu Ile Ile Arg

115 120 125

Gly Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Ala Thr Gly Ile Ile Ala Arg

130 135 140

Ala Ile Ala Asp Lys Tyr His Ser Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp

145 150 155 160

Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Lys Gln Gln Val Val Thr Val Met Asp

165 170 175

Asp Leu Cys Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Met Ser Leu Phe Cys Gln

180 185 190

Met Val Ser Thr Val Asp Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Glu

195 200 205

Lys Gly Val Ser Phe Thr Ser Lys Phe Val Ile Ala Ser Thr Asn Ala

210 215 220

Ser Asn Ile Val Val Pro Thr Val Ser Asp Ser Asp Ala Ile Arg Arg

225 230 235 240

Arg Phe Tyr Met Asp Cys Asp Ile Glu Val Thr Asp Ser Tyr Lys Thr

245 250 255

Asp Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly Arg Ala Ala Lys Leu Cys Thr Glu

260 265 270

Asn Asn Thr Ala Asn Phe Lys Arg Cys Ser Pro Leu Val Cys Gly Lys

275 280 285

Ala Ile Gln Leu Arg Asp Arg Lys Ser Lys Val Arg Tyr Ser Ile Asp

290 295 300

Thr Val Val Ser Glu Leu Ile Arg Glu Tyr Asn Asn Arg Ser Ala Ile

305 310 315 320

Gly Asn Thr Ile Glu Ala Leu Phe Gln

325

<210> 7

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Pro Leu Lys Phe Lys Pro Ile Arg Ile Ser Leu Glu Glu Lys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Asp Ala Ile Ser Asp Leu Leu Ala Ser Val Asp Ser Glu Glu

20 25 30

Val Arg Gln Tyr Cys Arg Glu Gln Gly Trp Ile Ile Pro Glu Thr Pro

35 40 45

Ala Asn Val Glu Arg His Leu Asn Arg Ala Val Leu Val Met Gln Ser

50 55 60

Ile Ala Thr Val Val Ala Val Val Ser Leu Val Tyr Val Ile Tyr Lys

65 70 75 80

Leu Phe Ala Gly Phe Gln

85

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Ala Tyr Ser Gly Ala Pro Lys Gln Ala Leu Lys Lys Pro Val Leu

1 5 10 15

Arg Thr Ala Thr Val Gln

20

<210> 9

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Ile Arg

1 5 10 15

Gln Val Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg Asp

20 25 30

Arg Leu Ala Val Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile Trp

35 40 45

Val Glu His Lys Leu Ile Asn Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val Asp

50 55 60

Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Val Thr Leu Asp Thr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Arg Asp Ile Thr Lys Phe Ile Pro Glu Thr Ile Thr Gly

85 90 95

Ala Ser Asp Ala Thr Leu Ile Ile Asn Thr Glu His Met Pro Ser Met

100 105 110

Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly Phe Leu Asn Leu Ser

115 120 125

Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys Ala

130 135 140

Gly Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Ile Ile Gly Val

145 150 155 160

His Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys Arg

165 170 175

Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gln

180

<210> 10

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Glu Ile Gln Trp Met Lys Pro Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu Asn

1 5 10 15

Val Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys Leu Glu Pro Ser Val Phe His Asp

20 25 30

Val Phe Glu Gly Ser Lys Glu Pro Ala Val Leu Thr Ser Lys Asp Pro

35 40 45

Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly

50 55 60

Asn Thr Leu His Glu Pro Asp Glu Tyr Val Thr Gln Ala Ala Leu His

65 70 75 80

Tyr Ala Asn Gln Leu Lys Gln Leu Asp Ile Asn Thr Asn Lys Met Ser

85 90 95

Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr Glu Tyr Leu Glu Ala Ile Asp Leu

100 105 110

His Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr Ser Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg

115 120 125

Asp Ile Leu Asp Pro Val Thr Arg Asp Thr Thr Lys Met Lys Phe Tyr

130 135 140

Met Asp Lys Tyr Gly Leu Asp Met Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp

145 150 155 160

Glu Leu Arg Ser Leu Asp Lys Ile Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile

165 170 175

Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser Val Tyr Leu Arg Met Thr Phe Gly

180 185 190

His Leu Tyr Glu Thr Phe His Ala Asn Pro Gly Thr Val Thr Gly Ser

195 200 205

Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Phe Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu

210 215 220

Leu Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser

225 230 235 240

Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala Leu Glu Val Val Leu Arg Glu Ile

245 250 255

Gly Tyr Ser Glu Glu Ala Val Ser Leu Ile Glu Gly Ile Asn His Thr

260 265 270

His His Val Tyr Arg Asn Lys Thr Tyr Cys Val Leu Gly Gly Met Pro

275 280 285

Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile

290 295 300

Ile Ile Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Phe Lys Gly Ile Asp Leu Asp

305 310 315 320

Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly Asp Asp Val Leu Ala Ser Tyr Pro

325 330 335

Phe Pro Ile Asp Cys Ser Glu Leu Ala Lys Thr Gly Lys Glu Tyr Gly

340 345 350

Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys Ser Pro Cys Phe Asn Glu Val Thr

355 360 365

Trp Glu Asn Ala Thr Phe Leu Lys Arg Gly Phe Leu Pro Asp His Gln

370 375 380

Phe Pro Phe Leu Ile His Pro Thr Met Pro Met Arg Glu Ile His Glu

385 390 395 400

Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Ala Arg Asn Thr Gln Asp His Val Arg

405 410 415

Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His Asn Gly Lys Glu Glu Tyr Glu Lys

420 425 430

Phe Val Ser Thr Ile Arg Ser Val Pro Ile Gly Lys Ala Leu Ala Ile

435 440 445

Pro Asn Phe Glu Asn Leu Arg Arg Asn Trp Leu Glu Leu Phe

450 455 460

<210> 11

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaaggtttg ggcagcagtc gggcgccata tatgtaggca actatagggt agtgaatcgg 60

catcttgcca cacacaacga ctgggcaaat cttgtgtggg aggacagctc tagagacctg 120

ttagtttctt ccaccactgc ccaggggtgc gataccatcg ctagatgcga ttgtcaagcc 180

ggagtatatt attgcaactc caagagaaaa cactacccgg ttagtttcac caagcccagc 240

ctggtatttg tggaggctag tgagtattac ccagctagat accaatccca ccttatgctt 300

gctgtaggcc attcagaacc tggcgactgt ggtggcatcc tcagatgcca acacggtgtg 360

ataggaattg tctccactgg tggcaatggt cttgtggggt ttgctgacat cagagatctc 420

ctgtggctgg atgaagaagc gatggagcaa 450

<210> 12

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggagtgtctg attatatcaa aggcctcggt gatgcttttg gcatgggctt cactgatgca 60

gtgtccaggg aagtggaggc attgaagaac cacttaatcg gttcagaagg ggctgttgaa 120

aaaattctga agaatttggt gaagctaatt tcagcattag tcatagtcgt taggagtgac 180

tatgacatgg tcaccctcac agccacgctt gccttgattg ggtgccatgg aagcccttgg 240

gcatggataa aagcgaagac agcctctatt cttggcattc ccatagtgca aaagcag 297

<210> 13

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agcgcttcat ggctaaagaa gtttaatgac atggctaatg ctgctaaggg acttgagtgg 60

atttctagta aaatcagtaa gtttattgat tggcttaagg aaaagattat cccagccgct 120

aaagagaagg ttgaattctt gaacaacttg aagcagcttc ccttactgga gaaccaaatt 180

tcgaatctcg aacagtctgc tgcctcgcag gaggatctag aagctatgtt tggtaacgtg 240

tcatatttgg cccacttttg ccgcaagttt cagccactct acgcaaccga agctaaacga 300

gtctatgcgc tggagaaaag gatgaacaac tacatgcagt tcaagagcaa acaccgtatt 360

gaacccgtat gtttgatcat cagaggctcc ccaggaacag gcaagtcgct tgccacgggc 420

atcatagcta gagccattgc cgataaatac cattctagtg tttactcact tcctccagac 480

ccagaccatt tcgatgggta caagcaacag gtagtcactg ttatggatga tctttgtcaa 540

aacccagatg gaaaggacat gtcactattt tgccagatgg tttctacagt ggatttcata 600

ccacccatgg catccctgga agagaaggga gtgtctttca cctctaagtt tgtcattgca 660

tcgaccaatg ctagcaacat agtagttccc acagtttcag actcagatgc gattcgcaga 720

cggttctaca tggactgtga tatagaggtg acagattcct acaagacaga ccttggccga 780

cttgatgcag gtagagccgc caagctttgc acggaaaata ataccgccaa ctttaagaga 840

tgcagcccac tagtgtgtgg caaagctatt caactaagag ataggaaatc caaagtgaga 900

tacagcattg atactgtagt atcggagcta atcagagagt acaacaatag atccgccatc 960

ggtaatacta tagaagctct cttccaa 987

<210> 14

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggacccctta agttcaagcc tataaggatt agccttgaag agaagccagc tccggatgcc 60

atcagtgacc tactagctag tgtggatagc gaagaggttc ggcaatactg cagggaacag 120

gggtggataa ttccagaaac accggccaat gtggaacgtc acctcaacag agcagtgcta 180

gtgatgcagt ctatcgccac cgtggttgca gttgtgtctc ttgtctatgt tatttacaaa 240

ttgttcgctg ggtttcag 258

<210> 15

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggtgcttatt ctggtgcgcc caaacaagct cttaagaagc ccgtgctaag aacagccacg 60

gttcaa 66

<210> 16

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggaccgagtt tagactttgc cttatccctt ttaaggcgta acattagaca ggtgcaaact 60

gatcaagggc acttcaccat gttaggggta cgggaccgcc tggctgttct gccacgccac 120

tcgcaaccag gaaaaactat ttgggtggaa cacaaattga ttaatgtgct agacgctgtt 180

gagttagtag atgaacaagg tgtgaatttg gaacttacac tagtaacttt agacaccaac 240

gaaaagttta gggacatcac caagtttatt ccagagacaa tcactggagc aagtgacgca 300

accttgatca tcaacactga gcatatgccc tcaatgttcg tcccagtggg tgatgttgta 360

caatatggat tcttgaatct tagcggtaag cccacacacc ggaccatgat gtataacttc 420

cccacaaagg caggacagtg tggaggagta gtcacctcag ttggtaagat cattggagtc 480

cacattggtg ggaacggccg tcaaggtttc tgtgctgggt tgaagaggag ctactttgcc 540

agtgaacag 549

<210> 17

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggagaaatcc agtggatgaa gcccaataag gagactggga gattgaatgt taatggcccg 60

acccgtacca aattagagcc tagtgtattc catgatgtgt ttgagggcag caaagaacca 120

gcagtcttaa ccagtaagga ccccagactc gaggttgatt ttgagcaagc tttgttttcc 180

aagtatgtgg gaaacacctt gcatgagcct gatgagtatg tgacgcaggc tgctctccac 240

tatgctaacc agttaaaaca attagacatc aatactaata agatgagcat ggaagaagca 300

tgttatggca ctgaatatct ggaggccata gaccttcata ccagtgctgg gtatccctat 360

agtgccttgg gcattaagaa aagggacata ctcgacccgg tcactagaga caccactaaa 420

atgaaattct acatggacaa atatgggtta gacatgccct attccactta tgtgaaagat 480

gagctcaggt ccttagataa gattaagaag gggaaatccc gtttgattga agccagcagc 540

ttgaatgatt cagtctatct taggatgacc tttgggcatc tctatgagac ttttcatgcc 600

aacccgggga ctgtgaccgg atctgcagta gggtgcaatc ctgatgtgtt ctggagtaaa 660

ttaccgatcc tgttaccggg gtcgctcttt gcatttgatt attcagggta tgatgcaagc 720

ctcagcccag tgtggttcag agctttagag gtggtcctcc gtgagattgg ttactcagag 780

gaggctgtgt cactaataga agggatcaac cacacccatc atgtgtatcg gaacaagaca 840

tattgtgtcc ttggtggaat gccctcaggt tgttccggca cttccatctt caactctatg 900

atcaataata taataatcag aactcttctg atcaaaacct ttaaggggat cgatttagat 960

gagttgaaca tggtagctta tggagatgat gtgctggcta gctatccatt ccctattgac 1020

tgttcggagt tggccaagac tggcaaagag tatggattaa caatgacacc tgctgacaaa 1080

tcaccctgct ttaacgaagt cacttgggag aatgctacat tcttaaagag aggcttcttg 1140

ccagatcacc agtttccatt ccttatccac cccaccatgc ctatgagaga gatccatgag 1200

tccattcgtt ggactaagga tgcacgcaac actcaggacc acgtgcgttc cttgtgccta 1260

ttagcatggc ataatgggaa ggaggagtat gaaaaatttg tgagcacaat tagatcggtt 1320

cctattggga aagccttggc tataccaaat tttgaaaacc tgagaagaaa ttggctcgaa 1380

ttattt 1386

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cyttgtgcgc ctgtttt 17

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

attgtcacca taagcagcc 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caagyacttc tgtmwcccc 19

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cccaaagtag tcggttcc 18

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

attggtgctc ccactacagc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

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Claims

1.柯萨奇病毒A16型毒株，其特征在于，其P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A16型毒株，其特征在于，所述毒株还含有非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D；

所述非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-10所示。

3.根据权利要求2所述的柯萨奇病毒A16型毒株，其特征在于，所述毒株的基因组中，P1结构蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的编码基因序列分别如SEQ ID NO.11-17所示。

4.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A16型毒株，其特征在于，其基因组序列如SEQ IDNO.3所示或如SEQ ID NO.3所示序列的互补序列所示。

5.根据权利要求1~4任一项所述的柯萨奇病毒A16型毒株，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19534。

6.生物材料，其特征在于，其为以下（1）-（8）中的任意一种：

（1）序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白；

（2）编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白的核酸分子；

（4）含有（2）或（3）中所述核酸分子的表达盒；

（5）含有（2）或（3）中所述核酸分子的重组载体；

（6）含有（2）或（3）中所述核酸分子的重组微生物；

（7）含有（2）或（3）中所述核酸分子的细胞系；

（8）检测（2）或（3）中所述核酸分子的引物或探针。

7.一种柯萨奇病毒A16型毒株的病毒样颗粒，其特征在于，其含有P1结构蛋白以及选自非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D中的任意一种或多种；

所述P1结构蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的序列，所述非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D分别具有如SEQ ID NO.4-10所示的序列。

8.权利要求1~5任一项所述的柯萨奇病毒A16型毒株或权利要求6所述的生物材料或权利要求7所述的病毒样颗粒的如下任意一种应用：

（1）在柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

（2）在柯萨奇病毒的免疫血清中和抗体含量检测中的应用；

（3）在柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；

（4）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

（6）在制备诊断柯萨奇病毒感染的试剂或试剂盒中的应用；

（7）在柯萨奇病毒的流行病学调查中的应用；

9.一种抗体或抗血清，其特征在于，以权利要求1~5任一项所述的柯萨奇病毒A16型毒株或权利要求6所述的生物材料或权利要求7所述的病毒样颗粒为免疫原制备得到。

10.一种产品，其特征在于，其含有以下（1）-（4）中的任意一种或多种的组合：

（1）权利要求1~5任一项所述的柯萨奇病毒A16型毒株；

（2）权利要求6所述的生物材料；

（3）权利要求7所述的病毒样颗粒；

（4）权利要求1~5任一项所述的柯萨奇病毒A16型毒株的抗体或抗血清。