CN109234241A

CN109234241A - 一种柯萨奇病毒cva16型强毒株cva16-b6-714及其应用

Info

Publication number: CN109234241A
Application number: CN201810960458.XA
Authority: CN
Inventors: 申硕; 王泽鋆; 孟胜利; 邓咪; 郭靖; 卢佳
Original assignee: WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Current assignee: WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Priority date: 2018-08-22
Filing date: 2018-08-22
Publication date: 2019-01-18

Abstract

本发明是关于一种柯萨奇病毒CVA16型强毒株CVA16‑B6‑714及其应用，其特征在于，其基因组编码结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，由VP4、VP2、VP3、VP1及非结构蛋白2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D组成；2A蛋白第2位氨基酸为K、第31位氨基酸为L；2C蛋白第112位氨基酸为M。

Description

一种柯萨奇病毒CVA16型强毒株CVA16-B6-714及其应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种柯萨奇病毒CVA16型强毒株CVA16-B6-714及其应用。

背景技术

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16，CVA16)属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒属 (Enterovirus)，其病毒颗粒呈20面体立体对称的球形结构，直径约23-30nm，由内部的核酸和衣壳蛋白质组成，无脂质包膜。其核酸为单股正链RNA，全长约7410个核苷酸。RNA两端为5'-和3'-非编码区(UTRs)，中间的开放阅读框(ORF)编码一个多聚前体蛋白，经蛋白酶水解为P1、P2和P3三个前体蛋白。P1进一步酶解为VP1、VP2、VP3和VP4，共同组成病毒衣壳，VP1含病毒主要的中和抗原决定簇。

CVA16与肠道病毒71型(EV71)是引起手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原体。 HFMD多发生于5岁以下婴幼儿，其临床特征为发热和手、足、口腔等部位皮疹或疱疹，少数患儿可出现心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，重症患儿病情发展较快，甚至死亡。HFMD是全球性传染病，英国、德国、日本、新加坡、马来西亚等许多国家均有此病流行的报道。1957年新西兰首次报道该病，1958 年从患儿标本中分离出CVA16。1972年，美国加利福尼亚州爆发HFMD疫情，随后世界范围内每年都会发生该病的流行，发病率和死亡人数逐年攀升。

中国大陆1981年在上海始见本病，2008-2014年,手足口病报告11,814,830例,平均总和增长率125.55/10 万,发病率较高，迄今为止中国大陆除西藏外其他各省市均有HFMD报道，已成为HFMD高流行区。CVA16 与EV71常混合或交替流行，近年EV71相关研究进展迅速，针对CVA16的研究还相对较少。然而CVA16 引起的重症和死亡病例呈明显增长趋势，英格兰、新加坡、中国大陆部分地区和台湾地区都先后出现过主要由 CVA16引起的HFMD疫情。CVA16已成为中国大陆地区HFMD的主要病原之一。有报道称CVA16能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎、迟缓性麻痹、心肌炎、肺炎、自然流产等严重疾病。此外CVA16与EV71 混合感染还会加重患者病情，甚至导致病毒基因重组，从而使HFMD的防控更加困难。因此，对于HFMD 的防控不能只依赖于EV71单价疫苗，CVA16和EV71双价疫苗的研发迫在眉睫。

动物模型是研究病毒致病机理、药物筛选和评价疫苗保护效果的重要工具。在EV71疫苗研发中，乳鼠、食蟹猴和恒河猴等模型逐步建立并不断完善，证明了疫苗诱导产生的中和抗体对机体的保护作用，从而有力促进了EV71疫苗的研发。因此，建立CVA16动物模型是疫苗和特异性抗病毒药物研发的重要环节。

CVA16动物模型的建立将为研究CVA16致病机理、免疫反应机理及疫苗免疫效果评价提供坚实的理论基础。

脊髓灰质炎(Poliovirus，PV)和EV71均属于小核糖核酸病毒科、肠道病毒属病毒，CVA16病毒结构与其高度相似。目前研究中PV的毒力位点比较明确。PV的内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)区域与其毒力密切相关，在蛋白翻译及宿主细胞终止蛋白合成中起重要作用，该部位核苷酸突变可严重影响甚至消除病毒毒力。有报道称在PV Sabin株该区域第480(A-G)、481(G-A)、472(C-U) 位核苷酸改变均导致病毒毒力下降。IRES区域的点突变可能对病毒二级结构造成影响，使RNA与核糖体结合受阻，从而抑制蛋白合成。McGoldrick等人发现PV的5'-UTR和病毒RNA依赖的RNA聚合酶3D (3Dpol)基因，可决定其神经毒性。在结构蛋白中也有毒力位点相关报道，如在其VP1中143和316位氨基酸突变导致病毒在猕猴体内的神经毒性降低。

在EV71毒力位点相关研究中，也有研究者发现在IRES和3Dpol区域的核苷酸突变对病毒毒力有影响。Li等人对56株EV71进行全序列比对，发现VP1、2A和5'-UTR上均存在毒力位点，即VP1(P729)、 2A(P930)、5'-UTR(P272、P488和P700)。Huang等人发现VP1第145位和VP2第149位氨基酸突变可提高病毒毒力。此外，还有报道认为在5'-UTR、VP2和2C区域发生突变使EV71产生嗜神经性。

以上研究均表明，肠道病毒的核苷酸序列可能与其毒力密切相关，但关于CVA16毒力位点及减毒机理的研究目前还较少。在Yang等人研究发现，CVA16G20-D株5'-UTR 212位点却发生T-C改变,使其在乳鼠体内毒力增强。关于CVA16毒力位点的确认还需要进行进一步研究。

发明内容

本发明目的是提供一种致死性柯萨奇病毒CVA16型强毒株及其应用。

本发明首先涉及一种可引起大日龄小鼠死亡的柯萨奇病毒CVA16型强毒株，所述的强毒株由结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1及非结构蛋白2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D组成；以野生型柯萨奇病毒CVA16 型毒株的基因组为基础，所述强毒株的2A蛋白第2位氨基酸突变为K、第31位氨基酸突变为L；2C蛋白第112位氨基酸突变为M。

进一步的，所述的柯萨奇病毒CVA16型强毒株为CVA16-B6-714，其基因组编码的结构蛋白的全氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，其中，

VP4蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1-69位所示氨基酸序列；

VP2蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第70-323位所示氨基酸序列；

VP3蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第324-552位所示氨基酸序列；

VP1蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第553-860位所示氨基酸序列；

2A蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第861-1010位所示氨基酸序列；

2B蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1011-1109位所示氨基酸序列；

2C蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1110-1438位所示氨基酸序列；

3A蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1439-1524位所示氨基酸序列；

3B蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1525-1546位所示氨基酸序列；

3C蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1547-1729位所示氨基酸序列；

3D蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1730-2191位所示氨基酸序列。

所述的柯萨奇病毒CVA16型强毒株的编码基因为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

本发明还涉及所述的柯萨奇病毒CVA16型强毒株CVA16-B6-714的培养方法，其特征在于，使用Vero 细胞作为宿主培养所述柯萨奇病毒CVA16型强毒株CVA16-B6-714。

本发明还涉及所述柯萨奇病毒CVA16-B6型强毒株CVA16-B6-714在研究柯萨奇病毒致病机理中的应用。

本发明还涉及所述柯萨奇病毒CVA16-B6型强毒株CVA16-B6-714在测试柯萨奇病毒疫苗保护效力中的应用；

所述的疫苗包括活疫苗或灭活疫苗、单价或多价疫苗。

本发明优点：

通过病毒细胞培养技术，获得了柯萨奇病毒CVA16型强毒株(CVA16-B6-714)可致最大日龄达19 日龄小鼠死亡。该小鼠适应株为研究柯萨奇病毒CVA16型致病机理、疫苗研发和抗病毒药物的筛选提供了工具。

本发明建立的是柯萨奇病毒CVA16型强毒株大日龄小鼠致死动物模型，有利于试验的稳定评估。

附图说明

图1、发病的14日龄昆明鼠(图中箭头所示分别为发病小鼠出现后肢瘫痪、眼部刺激症状)。

图2、发病小鼠匀浆液在Vero感染3天后产生的细胞病变(CPE)。

图3、CVA16空斑纯化。

图4、感染小鼠存活率、临床评分和体重变化(4A、存活率变化；4B、平均临床评分变化；4C、体重变化；4D、发病小鼠照片；4E、对照组小鼠照片)。

图5、感染小鼠各组织器官的病理学变化(图中箭头所指出即典型组织病变)。

图6、小鼠主动免疫方案。

具体实施方式

Vero细胞和RD细胞，由武汉生物制品研究所有限责任公司肠道病毒疫苗室提供。

CVA16-P4株由武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室提供，于2010年分离于湖北恩施一名临床确诊手足口病的一岁女婴疱疹液。

实施例1、CVA16-B6强毒株的诱导及制备

1、小鼠适应株第一代(CVA16-B)的建立

将CVA16-P4株稀释至1×10⁶、1×10⁵和1×10⁴CCID₅₀/ml三个稀释度，分别通过颅内途径(20μl/只)接种3组1日龄昆明鼠，每组8只。同时设立阴性对照组，颅内途径注射DMEM病毒维持液，观察期为14天。在小鼠发病最严重的时间点将小鼠取回，用75％酒精表面消毒，在无菌条件下取出鼠脑。加入DMEM病毒维持液研磨鼠脑，制备成10％(W/V)的匀浆液，4℃，3,000×g离心10min，取上清，接种100μl至Vero细胞培养扩增一代，即为小鼠适应株第一代(CVA16-B)。

2、小鼠适应株二至六代(CVA16-B2～CVA16-B6)的建立

将CVA16-B株稀释至1×10⁶、1×10⁵和1×10⁴CCID₅₀/ml三个稀释度，通过颅内(20μl/只)和腹腔(200μl/ 只)途径分别接种7日龄昆明鼠，每个剂量、每种途径分别注射1组，9只/组。同时为测定CVA16-B株在更大日龄昆明鼠体内的毒力，选取1×10⁶CCID₅₀/ml稀释度的病毒液通过颅内(20μl/只)和腹腔(200μl/只) 途径接种2组14日龄昆明鼠，9只/组。同时设立阴性对照组，观察期为14天。取3只14日龄发病小鼠的脑、后肢肌肉、心、肝、脾、肺、肾和小肠，其他14日龄发病小鼠取脑组织和肌肉组织，制备成10％的组织匀浆液，4℃，3,000×g离心10min后取上清，每只小鼠的各组织匀浆分别冻存于-70℃。

将上述14日龄发病小鼠肌肉匀浆接种于Vero细胞扩增一代，即为小鼠适应株第二代(CVA16-B1，见图 1)。此后将CVA16-B1通过腹腔注射途径在14-21日龄昆明鼠上连续传代5次后得到小鼠适应株CVA16-B6～ B6株，每次传代将病毒进行10倍梯度稀释后分别感染小鼠，回收发病小鼠的后肢肌肉进行后续传代。

实施例2、CVA16-B6强毒株的毒性检测

1、连续三次空斑纯化(图2、3)

(1)将CVA16-B6株病毒液10倍梯度稀释10^-1至10^-6六个稀释度。

(2)取长满单层Vero细胞的六孔板，弃培养液后用PBS清洗细胞表面，将不同稀释度的病毒液分别加入六孔板中，200μl/孔，每个稀释度重复两孔，放置于37℃，5％CO₂孵箱中孵育1h。

(3)取1％琼脂糖覆盖液加入六孔板中，3ml/孔，待琼脂糖凝固后置于37℃，5％CO₂孵箱中培养3～5 天。

(4)将六孔板置于倒置显微镜下观察，待观察到典型CVA16蚀斑时，加入0.01％中性红染色液，2ml/ 孔，放置于37℃，5％CO₂孵箱中染色过夜。

(5)用微量移液器挑取单个散在的蚀斑，置于200μl病毒维持液中吹打混匀，放于-70℃冰箱保存或用相同方法稀释后进行第二轮、第三轮空斑纯化。

(6)将挑选出的单克隆病毒株置于200μl病毒维持液中，放入-70℃冰箱保存。

2、CVA16-B6病毒克隆株扩大培养

(1)取生长状态良好的Vero细胞(T25)，倒掉原瓶培养基后用PBS清洗细胞表面，加入病毒液和少量病毒维持液，置于37℃，5％CO₂孵育1h后补足病毒维持液至5ml，置于37℃，5％CO₂孵箱培养。每个单克隆株接种一瓶细胞。接种量为50μl。

(2)待细胞病变达到80-90％时反复冻融3次后离心收获病毒液，分装冻存，即为P1代。

(3)将15个克隆株P1代分别接种Vero细胞(T25)，接种和收获方法同(1)、(2)，获得P2代。

(4)将15个克隆株P2代分别接种Vero细胞(T75)，接种量为15μl，收获方法同前，获得P3代。

(5)对收获的15个CVA16-B6病毒克隆株P3代进行滴定，实验重复三次，计算均值±标准差。(后续实验中所用病毒克隆株均为P3代。)

3、CVA16-B6病毒克隆株的毒力比较

(1)将筛选出的15个CVA16-B6病毒克隆株分别稀释至3×10⁴CCID₅₀/300μl，分别通过腹腔注射途径感染15日龄昆明鼠，每组6只，每只注射300μl。另设一组小鼠注射DMEM病毒维持液作为阴性对照组。

(2)观察小鼠发病和死亡情况，观察期14天。剔除乳鼠因体质、生存环境等外来因素造成的非特异性死亡。能致同日龄小鼠发病早、发病症状严重、死亡率高的毒株即为强毒株，反之为弱毒株，选出的毒株分别命名为CVA16-B6-714、CVA16-B6-212、CVA16-B6-412和CVA16-B6-811，其中CVA16-B6-714为强毒株、CVA16-B6-811为弱毒株。

4、CVA16-B6病毒克隆株LD₅₀的测定

将CVA16-B6-714、CVA16-B6-212、CVA16-B6-412和CVA16-B6-811分别按一定梯度稀释后通过腹腔注射途径接种19日龄BALB/c小鼠，每组6只小鼠，另设一组小鼠注射病毒维持液为阴性对照，连续观察并记录小鼠发病和死亡情况14天，按Reed-Muench法计算得到各克隆株的LD₅₀，每个毒株重复测定3次。

Reed-Muench法：10^L×接种病毒液体积为待测病毒半数致死剂量，其中L的反对数＝(高于50％死亡百分数的病毒稀释度对数+距离比例×稀释系数的对数)，距离比＝(高于50％的死亡百分数-50％)/(高于50％的死亡百分数-低于50％的死亡百分数)。

实施例3、CVA16-B6-714强毒株的序列测定

1、病毒RNA提取

(1)取收获病毒液140μl，加入560μl buffer AVL，涡旋振荡器混匀15s，室温静置10min，瞬时离心。

(2)在上述混合液中加入无水乙醇560μl，涡旋振荡器混匀15s，瞬时离心。

(3)取上述混合液630μl小心加入column，6,000×g离心1min，弃废液。

(4)重复步骤(3)。

(5)小心加入500μl buffer AW1，6,000×g离心1min，弃废液。

(6)小心加入500μl buffer AW2，21,000×g离心3min，弃废液。

(7)将column放入新的2ml收集管中，26,000×g离心1min。

(8)将column放入新的1.5ml离心管中，加入60μl ddH₂O，室温溶解1min。

(9)6,000×g离心1min，回收病毒RNA。

2、逆转录合成cDNA

(1)在PCR管中加入以下试剂：

混合均匀后放入PCR仪中，65℃反应5min，然后迅速放在冰上骤冷。

(2)往上述反应液中再加入以下试剂：

混合均匀后放入PCR仪，30℃，15min；42℃，60min；70℃，15min。

3、PCR扩增

(1)扩增引物：CVA16全序列测定引物见表1。

表1CVA16全序列测定引物(注：F表示Forward primer；R表示Reverse primer。)

(2)在PCR管中加入以下试剂并混匀。

(3)设置PCR仪反应程序如下：

4、琼脂糖凝胶电泳

待反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR扩增条带。PCR产物鉴定正确后，将剩余扩增产物送生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将测序结果拼接后用MegAlign软件进行序列比对。

测序结果显示，CVA16-B6-714强毒株的全基因组序列为SEQ ID NO.1所示序列，其中，5'-UTR序列为 SEQ ID NO.2所示序列、VP4蛋白序列为SEQ ID NO.3所示序列、VP2蛋白序列为SEQ ID NO.4所示序列、 VP3蛋白序列为SEQ ID NO.5所示序列、VP1蛋白序列为SEQID NO.6所示序列、2A蛋白序列为SEQ ID NO.7 所示序列、2B蛋白序列为SEQ ID NO.8所示序列、2C蛋白序列为SEQ ID NO.9所示序列、3A蛋白序列为SEQ ID NO.10所示序列、3B蛋白序列为SEQ ID NO.11所示序列、3C蛋白序列为SEQ ID NO.12所示序列、3D蛋白序列为SEQID NO.13所示序列、3'-UTR序列为SEQ ID NO.14所示序列。

CVA16-B6-714强毒株的氨基酸全序列如SEQ ID NO.15所示，其中，1-69为VP4蛋白序列(69aa)，70-323 为VP2蛋白序列(254aa)、324-552为VP3蛋白序列(229aa)、553-862为VP1蛋白序列(310aa)、863-1012 为2A蛋白序列(150aa)、1013-1111为2B蛋白序列(99aa)、1112-1440为2C蛋白序列(329aa)、1441-1526 为3A蛋白序列(86aa)、1527-1548为3B蛋白序列(22aa)、1549-1731为3C蛋白序列(183aa)、1732-2193 为3D蛋白序列(462aa)。

实施例4、CVA16-B6强毒株的应用

1、感染小鼠存活率、临床评分和体重变化

柯萨奇病毒A16型强毒株感染19日龄BALB/c小鼠。强毒株CVA16-B6-714组小鼠自攻毒后第4天，平均临床评分随小鼠发病越来越严重开始逐渐升高，直至第8天小鼠全部死亡，平均临床评分达到5分(临床评分标准为：0，健康；1，嗜睡、活动减少；2，体重减轻；3，后肢无力、震颤；4，后肢瘫痪；5，濒死或死亡)(图4)。在攻毒后第1天，CVA16-B6-714组小鼠平均体重逐日下降，直至全部死亡。结果显示，在19日龄BALB/c小鼠感染后的14天观察期内，强毒株CVA16-B6-714组小鼠临床评分显著高于弱毒株 CVA16-B6-811组，且体重显著下降，而CVA16-B6-811组小鼠临床评分和体重变化与对照组接近，即仅在感染初期出现轻微临床症状，体重略有下降，之后逐渐恢复正常。

CVA16-B6-714和CVA16-B6-811组小鼠感染后第5天组织病理切片如图5所示(200倍放大)。结果显示， CVA16-B6-714组感染小鼠后肢肌肉切片中可见骨骼肌纤维坏死、充血和炎性细胞浸润，而CVA16-B6-811 组仅出现炎性细胞浸润。CVA16-B6-714组感染小鼠肺部出现毛细血管扩张和明显充血，CVA16-B6-811组未出现明显变化。CVA16-B6-714组肝脏切片显示肝索拥挤、紊乱，肝窦扭曲、狭窄甚至消失。

2、利用柯萨奇病毒A16型强毒株评估CVA16灭活疫苗产生的保护效果

10窝6日龄BALB/c小鼠被随机分为3组，3～4窝为一组，每组12～13只。主动免疫方案如图6所示。免疫攻毒组和免疫不攻毒组小鼠分别于第1、8天通过腹腔注射途径接种1.5μg疫苗，纯度为99％的 CVA16-P4-731 FP，每剂中氢氧化铝浓度为1mg/ml)，佐剂攻毒组接种相同浓度的氢氧化铝佐剂，注射体积相同。第13天时(即小鼠19日龄)每组分别眼球取血处死3只小鼠，分离血清。免疫攻毒组和佐剂攻毒组剩余小鼠用CVA16-B6-714进行腹腔攻毒，200μl/只，攻毒量为66LD₅₀(1.42×10⁶CCID₅₀/只)。免疫不攻毒组小鼠注射相同体积的DMEM病毒维持液。每天监测并记录各组小鼠存活率、临床评分和体重变化，连续监测14天。观察期结束后，免疫攻毒组和免疫不攻毒组每组分别眼球取血处死3只小鼠。观察期结束后14天和21天再分别对各组剩余小鼠进行眼球毛细管采血。将血样置于37℃静置2h，3,000×g离心10min。取上清于56℃金属浴灭活30min，进行血清中和效价检测或分装后保存于-70℃冰箱。

对BALB/c小鼠分别于第7、14日龄时进行两针免疫后，可在19日龄时检测到较高水平的中和抗体，免疫攻毒组和免疫不攻毒组小鼠血清中和效价分别可达949和755，随着小鼠日龄增加，抗体水平逐渐下降，但持续至40日龄时仍有一定的中和抗体，分别为239和77，见表2。

表2小鼠血清中和效价测定结果

可见免疫结束后抗体水平逐渐下降，但有一定的持久性。因此本发明可以用于评估CVA16灭活疫苗的保护效果。

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对保护范围的限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉生物制品研究所有限责任公司

<120> 一种柯萨奇病毒CVA16型强毒株CVA16-B6-714及其应用

<130> CP11802305C

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7410

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgaaacagc ctgtgggttg ttcccaccca caggtttcac tgaggcgcta gcacactgat 60

tctgcgggat ctttgtgcgc ctgttttata acccttcccc taagcagcaa cttagaagct 120

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ctgacgtttt gacagaggta ggcgtttttg gtcaaaatgc tcagttccat tacctgtatc 1260

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ttgactcagc tctcaaccac tgcaactttg gtttactggt catcccggtg gtgccattag 1620

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atccaacccc gcctatacat ataccagggg aagtacacaa cctattggaa atatgcagag 1860

tggagaccat tctggaagtc aataacctaa agactaatga gaccaccccc atgcagcgct 1920

tgtgctttcc agtgtcggta cagagcaaaa caggcgaatt atgtgctgcc ttcagagcag 1980

atcctggaag agatggtccg tggcagtcca caatactagg tcaactctgt aggtactaca 2040

cccagtggtc aggttcactg gaggtgacat tcatgtttgc aggctcattc atggccacag 2100

gcaaaatgct cattgcctac accccacctg ggggaaatgt gcctgcggac agaatcacag 2160

caatgctagg aacacatgta atctgggact tcggattgca atcttctgtg acgttagtcg 2220

tgccatggat cagtaataca cactacaggg cacatgcccg cgctgggtac tttgactatt 2280

acaccactgg cattataacc atatggtatc aaactaacta tgtcgtaccc attggtgctc 2340

ccactacagc atatatcgtg gctttggcag cagctcagga taatttcact atgaaactgt 2400

gcaaggatac ggaggacatt gagcaaacgg ctaacataca aggggatccc attgcagata 2460

tgatcgacca aactgtgaac aatcaagtga atcgctcctt gactgcgttg caagtactac 2520

ctacagctgc caacactgag gcaagtagtc acagattagg cactggtgtt gtgccagcac 2580

tgcaagccgc ggagacaggg gcgtcatcta atgctagtga caagaatctc attgagacta 2640

gatgtgtgtt gaatcaccac tccacgcagg agacagccat tgggaatttc tttagccgtg 2700

ctggtcttgt cagcatcatc acaatgccca ccacgggtac acagaataca gatggctatg 2760

ttaattggga cattgatttg atgggatatg ctcagctgcg gcggaagtgc gagttattta 2820

cctacatgcg ctttgatgct gaattcacat ttgtcgtagc caaacccaat ggtgagttag 2880

tcccccaatt actgcagtac atgtatgtcc cgccaggggc tccgaaacct acttccagag 2940

attcgtttgc ttggcagact gccaccaacc catctgtgtt tgtgaaaatg acggacccgc 3000

cagctcaagt gtcggtcccc ttcatgtcac cagctagtgc ttaccaatgg ttttatgatg 3060

gttatcccac cttcggtgag cacctccaag caaatgacct agattatggc caatgcccga 3120

ataatatgat gggcactttt agcattagga cagtagggac tgagaagtca ccacactcca 3180

ttaccctgag ggtatacatg agaatcaaac acgtcagggc atggatccca agacctctga 3240

gaaatcaacc ctatttgttt aagaccaatc caaattataa aggaaatgat attaagtgta 3300

ctagcactag tagagacaag ataacaacgc taggaaagtt tggacagcaa tcaggcgcca 3360

tatatgtggg caactatagg gtagtgaatc gacaccttgc cacacacaac gactgggcaa 3420

accttgtgtg ggaggacagc tctagggact tgttagtctc ttccaccact gcccaggggt 3480

gcgacaccat cgctaggtgc aattgtcaaa ccggtgtata ctattgcagc tccaaaagga 3540

aacactaccc ggttagtttc accaagccca gtctgatatt tgtggaagct agtgagtatt 3600

acccagctag gtatcaatcc catctcatgc ttgctgtggg tcactcggaa cctggtgact 3660

gtggtggcat cctcaggtgc cagcatggtg tggtaggaat tgtctccact ggaggaaatg 3720

gtcttgtagg gtttgccgat gtcagagacc ttctatggct ggatgaagaa gcaatggaac 3780

aaggagtgtc tgactatatc aaaggcctcg gtgacgcttt tggtatgggc ttcactgatg 3840

cagtgtctag ggaagtagag gcattgaaga accatttaat tggctcagaa ggagctgttg 3900

agaagatctt gaagaacttg gtgaagctaa tctcggcttt agtcatagtc gttaggagtg 3960

actatgacat ggtcaccctc acggctacgc tagctctgat tgggtgtcat ggaagccctt 4020

gggcatggat taaagcgaag acagcctcta ttcttggtat tcccatagtg caaaaacaga 4080

gcgcttcatg gctaaagaag tttaatgata tggccaacgc cgcgaaaggg cttgagtgga 4140

tttctagtaa aatcagcaag ttcattgatt ggcttaagga aaagattatt ccggccgcca 4200

aagagaaagt tgaattctta aacaacctga aacagcttcc cctgttggag aaccaaatct 4260

caaatcttga acagtctgct gcctcgcaag aggatctaga agctatgttt ggcaatgtgt 4320

catacttagc ccacttctgt cgcaagttcc agccactcta tgcggttgaa gccaaaagag 4380

tttatgccct agagaaaagg atgaataact acatgcagtt caagagcaaa caccgtattg 4440

aacctgtatg cttaatcatt agaggctccc caggaacagg taagtcactt gctacgggca 4500

tcattgctag agctattgct gacaaatacc actctagcgt ttactcactc cctccagacc 4560

cagaccattt tgatggatac aagcaacaag tagtcactgt tatggatgat ctctgtcaaa 4620

acccagatgg aaaggacatg tccctatttt gccaaatggt ttctacagtg gactttatac 4680

cacccatggc atcactggaa gagaaaggag tgtctttcac ctccaagttt gtcatcgcat 4740

caaccaatgc tagtaatatt gtagttccca cagtttcaga ctctgatgcg attcgcaggc 4800

ggttttatat ggactgcgat atagaggtga cagactctta caagacggac cttggccgac 4860

tcgacgcagg cagggccgct aagctttgca cagaaaacaa cactgctaac tttaagagat 4920

gcagcccact agtgtgtggc aaggccattc aattaagaga caggaagtct aaagtgagat 4980

atagtattga cactgtggtg tcagagctaa tcagagagta taataatagg tctgccattg 5040

ggaacaccat agaagccctc ttccaaggac cccttaagtt caggcctata agaattagcc 5100

ttgaagaaaa gccggcccca gatgccatca gtgacttact tgctagtgtg gatagtgagg 5160

aggttcgaca atactgcagg gaacaagggt ggataattcc agaaacatcg accaatgtgg 5220

aacgtcacct caacagagca gtgttggtga tgcagtccat tgccaccgtg gttgcggttg 5280

tgtccctcgt ctatgtcatc tataaattgt ttgctggatt ccaaggtgcc tattctggtg 5340

cacctaagca atcccttaaa aaacctgtgc taaggacagc cacagtccaa ggaccgagct 5400

tagactttgc cttatccctc ctaaggcgca acatcagaca ggtgcaaact gatcaaggac 5460

attttactat gttaggagtg cgagatcgcc tagctatttt gccgcgccac tcgcaaccag 5520

gaaaaactat ttgggtggaa cacaaattaa tcaatgtgct agatgctgtt gaattggtgg 5580

atgagcaagg tgtaaatttg gaactcacac tagtaacctt ggacaccaac gaaaaattta 5640

gagatgtcac caagtttatt ccagagacga tcaccggggc aagcgacgca accttgatca 5700

tcaacactga gcacatgccc tcaatgttcg ttccagtggg tgatgttgta cagtatgggt 5760

ttctaaatct cagcggtaag cccacacacc gaaccatgat gtacaatttc cccacaaagg 5820

cagggcagtg tggaggtgtg gtcacctcag ttggtaagat tattggaatt catatcggtg 5880

ggaatggacg ccaaggcttc tgtgctggac tgaagagagg ctactttgcc agtgaacaag 5940

gagagatcca atggatgaag tccaataaag aaactgggag actgaacatt aatggtccaa 6000

cacgtaccaa attggagccc agtgcattct atgatgtgtt tgagggcagc aaagaaccag 6060

cagtcttaac cggtaaggat cctagacttg aggttgattt tgagcaagct ttgttttcca 6120

aatatgtagg aaacaccctg catgagcctg acgaatatgt gacacaggct gctctccact 6180

atgcaaacca gctaaagcaa ttagatataa acattaataa gatgagtatg gaggaagcat 6240

gctacggcac tgaatatcta gaggctatag acttgcacac cagtgccggg tacccctata 6300

gtgccctggg tgtcaagaaa agagacatac ttgacccaat cactagagac actaccaaaa 6360

tgaaattcta catggataaa tatgggttag acttgcccta ttccacctat gtgaaagatg 6420

agcttagatc cctagataag attaagaaag ggaaatcccg cttgattgaa gccagtagtc 6480

taaatgactc agtctacctt aggatgactt ttgggcatct ctatgaaact tttcatgcca 6540

acccggggac tgtgactggg tctgcagtag ggtgtaatcc tgatgtgttc tggagtaaat 6600

taccgatcct gctgccagga tcgctctttg catttgacta ttcaggatat gatgcaagtc 6660

tcagcccagt gtggtttaga gctttggagg tggttctccg agagatcggc tactcagagg 6720

aggctgtatc actaatagaa gggatcaacc acacccatca tgtgtatcgg aacaggacat 6780

attgtgtcct tggtggaatg ccttcaggtt gttccggtac ttccatcttc aattccatga 6840

tcaataacat aataatcaga acccttttga ttaaaacttt taaggggatt gacttagatg 6900

agctgaatat ggtagcttat ggagatgatg tgttagctag ctatccattc cctattgact 6960

gctcggagct agccagaact ggtaaagagt acggattgac aatgacaccc gctgataagt 7020

caccttgctt taatgaagtt acctgggaaa atgccacatt cttaaagaga ggtttcctgc 7080

cagatcacca gttcccattt cttatccacc ctaccatgcc catgagggag atccacgagt 7140

ccattcgttg gactaaagat gcacgcaaca ctcaggatca cgtgcgctct ctgtgcctct 7200

tagcgtggca taatgggaag gaggaatatg aaaaatttgt gagcacaatt aggtcagttc 7260

ccattggaaa agccttggct ataccaaatt ttgagaactt gagaagaaat tggctcgagt 7320

tattttaata tacagtttaa agctgaaccc caccagaagt ctggtcgtgt taatgactgg 7380

tgggggtaaa tttgttataa ccagaatagc 7410

<210> 2

<211> 746

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgaaacagc ctgtgggttg ttcccaccca caggtttcac tgaggcgcta gcacactgat 60

tctgcgggat ctttgtgcgc ctgttttata acccttcccc taagcagcaa cttagaagct 120

ttgtacaatc acgaccaata gtgggcgtgg cgcgccagtc acgtcttggt caagcacttc 180

tgtatccccg gactgagtat caatagactg cttacgcggt tgaaggagaa aacgttcgtt 240

acccggctaa ctacttcgag aaacctagta gcaccatgaa agttgcggag tgtttcgctc 300

agcacttccc ccgtgtagat caggtcgatg agtcactgta aaccccacgg gcgaccgtga 360

cagtggctgc gttggcggcc tgcccatggg gtaacccatg ggacgctcta atacagacat 420

ggtgcgaaga gtctattgag ctagttagca gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatcct 480

aactgcggag cgcgcaccct caacccaggg ggcggcgtgt cgtaatgggt aactctgcag 540

cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt ccttttattc tttattggct gcttatggtg 600

acaattgaaa agttgttacc atatagctat tggattggcc atccggtgtc taacagagct 660

attgtttacc tatttattgg atacgtccct cttaatctca aggccattca aactcttgat 720

tatatattgc tccttaactg taggaa 746

<210> 3

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggggtcac aagtctccac ccagcgatcc gggtcacatg agaactcaaa ctctgcatcg 60

gagggctcga ccataaatta cacaactata aactactaca aggatgcata cgctgcaagt 120

gcggggcgcc aggatatgtc ccaagacccg aagaaattta ctgaccctgt catggacgtt 180

atacatgaga tggccccacc gctaaag 207

<210> 4

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctccaagcg ccgaggcatg tggttacagt gatcgtgtgg ctcagcttac cattgggaac 60

tccaccatca cgacacagga agcagctaat atagttatag cctatgggga gtggcctgag 120

tactgcccag acacagatgc aacggctgtc gacaaaccca ctcgacctga cgtatcagtg 180

aacagatttt tcacgttaga cactaagtct tgggccaagg attcaaaggg ttggtattgg 240

aaattccctg acgttttgac agaggtaggc gtttttggtc aaaatgctca gttccattac 300

ctgtatcgat ctgggttttg cgtgcacgtt cagtgcaacg ctagtaaatt tcaccagggc 360

gctttactgg tggctgtgct gcctgagtac gtactcggca ctatcgcagg agggaccggg 420

aacgagaatt ctcatcctcc ctacgctact acacagcctg gtcaggttgg tgcagttctg 480

acgcaccctt acgtgctaga tgcagggatc cctttgagcc aactaactgt gtgcccacat 540

cagtggatta acttaagaac taataattgt gcaaccatca tagttccata tatgaacaca 600

gttccttttg actcagctct caaccactgc aactttggtt tactggtcat cccggtggtg 660

ccattagatt tcaacgcagg tgccacatct gaaattccca tcacagtcac catagctccc 720

atgtgcgcgg aatttgcggg tctacgccag gcggtaaagc aa 762

<210> 5

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtataccaa cagagcttaa acctggtacc aatcagtttc ttactactga tgatggtgtt 60

tccgcaccaa ttctgccagg tttctatcca accccgccta tacatatacc aggggaagta 120

cacaacctat tggaaatatg cagagtggag accattctgg aagtcaataa cctaaagact 180

aatgagacca cccccatgca gcgcttgtgc tttccagtgt cggtacagag caaaacaggc 240

gaattatgtg ctgccttcag agcagatcct ggaagagatg gtccgtggca gtccacaata 300

ctaggtcaac tctgtaggta ctacacccag tggtcaggtt cactggaggt gacattcatg 360

tttgcaggct cattcatggc cacaggcaaa atgctcattg cctacacccc acctggggga 420

aatgtgcctg cggacagaat cacagcaatg ctaggaacac atgtaatctg ggacttcgga 480

ttgcaatctt ctgtgacgtt agtcgtgcca tggatcagta atacacacta cagggcacat 540

gcccgcgctg ggtactttga ctattacacc actggcatta taaccatatg gtatcaaact 600

aactatgtcg tacccattgg tgctcccact acagcatata tcgtggcttt ggcagcagct 660

caggataatt tcactatgaa actgtgc 687

<210> 6

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaggatacgg aggacattga gcaaacggct aacatacaag gggatcccat tgcagatatg 60

atcgaccaaa ctgtgaacaa tcaagtgaat cgctccttga ctgcgttgca agtactacct 120

acagctgcca acactgaggc aagtagtcac agattaggca ctggtgttgt gccagcactg 180

caagccgcgg agacaggggc gtcatctaat gctagtgaca agaatctcat tgagactaga 240

tgtgtgttga atcaccactc cacgcaggag acagccattg ggaatttctt tagccgtgct 300

ggtcttgtca gcatcatcac aatgcccacc acgggtacac agaatacaga tggctatgtt 360

aattgggaca ttgatttgat gggatatgct cagctgcggc ggaagtgcga gttatttacc 420

tacatgcgct ttgatgctga attcacattt gtcgtagcca aacccaatgg tgagttagtc 480

ccccaattac tgcagtacat gtatgtcccg ccaggggctc cgaaacctac ttccagagat 540

tcgtttgctt ggcagactgc caccaaccca tctgtgtttg tgaaaatgac ggacccgcca 600

gctcaagtgt cggtcccctt catgtcacca gctagtgctt accaatggtt ttatgatggt 660

tatcccacct tcggtgagca cctccaagca aatgacctag attatggcca atgcccgaat 720

aatatgatgg gcacttttag cattaggaca gtagggactg agaagtcacc acactccatt 780

accctgaggg tatacatgag aatcaaacac gtcagggcat ggatcccaag acctctgaga 840

aatcaaccct atttgtttaa gaccaatcca aattataaag gaaatgatat taagtgtact 900

agcactagta gagacaagat aacaacgcta 930

<210> 7

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggaaagtttg gacagcaatc aggcgccata tatgtgggca actatagggt agtgaatcga 60

caccttgcca cacacaacga ctgggcaaac cttgtgtggg aggacagctc tagggacttg 120

ttagtctctt ccaccactgc ccaggggtgc gacaccatcg ctaggtgcaa ttgtcaaacc 180

ggtgtatact attgcagctc caaaaggaaa cactacccgg ttagtttcac caagcccagt 240

ctgatatttg tggaagctag tgagtattac ccagctaggt atcaatccca tctcatgctt 300

gctgtgggtc actcggaacc tggtgactgt ggtggcatcc tcaggtgcca gcatggtgtg 360

gtaggaattg tctccactgg aggaaatggt cttgtagggt ttgccgatgt cagagacctt 420

ctatggctgg atgaagaagc aatggaacaa 450

<210> 8

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggagtgtctg actatatcaa aggcctcggt gacgcttttg gtatgggctt cactgatgca 60

gtgtctaggg aagtagaggc attgaagaac catttaattg gctcagaagg agctgttgag 120

aagatcttga agaacttggt gaagctaatc tcggctttag tcatagtcgt taggagtgac 180

tatgacatgg tcaccctcac ggctacgcta gctctgattg ggtgtcatgg aagcccttgg 240

gcatggatta aagcgaagac agcctctatt cttggtattc ccatagtgca aaaacag 297

<210> 9

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agcgcttcat ggctaaagaa gtttaatgat atggccaacg ccgcgaaagg gcttgagtgg 60

atttctagta aaatcagcaa gttcattgat tggcttaagg aaaagattat tccggccgcc 120

aaagagaaag ttgaattctt aaacaacctg aaacagcttc ccctgttgga gaaccaaatc 180

tcaaatcttg aacagtctgc tgcctcgcaa gaggatctag aagctatgtt tggcaatgtg 240

tcatacttag cccacttctg tcgcaagttc cagccactct atgcggttga agccaaaaga 300

gtttatgccc tagagaaaag gatgaataac tacatgcagt tcaagagcaa acaccgtatt 360

gaacctgtat gcttaatcat tagaggctcc ccaggaacag gtaagtcact tgctacgggc 420

atcattgcta gagctattgc tgacaaatac cactctagcg tttactcact ccctccagac 480

ccagaccatt ttgatggata caagcaacaa gtagtcactg ttatggatga tctctgtcaa 540

aacccagatg gaaaggacat gtccctattt tgccaaatgg tttctacagt ggactttata 600

ccacccatgg catcactgga agagaaagga gtgtctttca cctccaagtt tgtcatcgca 660

tcaaccaatg ctagtaatat tgtagttccc acagtttcag actctgatgc gattcgcagg 720

cggttttata tggactgcga tatagaggtg acagactctt acaagacgga ccttggccga 780

ctcgacgcag gcagggccgc taagctttgc acagaaaaca acactgctaa ctttaagaga 840

tgcagcccac tagtgtgtgg caaggccatt caattaagag acaggaagtc taaagtgaga 900

tatagtattg acactgtggt gtcagagcta atcagagagt ataataatag gtctgccatt 960

gggaacacca tagaagccct cttccaa 987

<210> 10

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggacccctta agttcaggcc tataagaatt agccttgaag aaaagccggc cccagatgcc 60

atcagtgact tacttgctag tgtggatagt gaggaggttc gacaatactg cagggaacaa 120

gggtggataa ttccagaaac atcgaccaat gtggaacgtc acctcaacag agcagtgttg 180

gtgatgcagt ccattgccac cgtggttgcg gttgtgtccc tcgtctatgt catctataaa 240

ttgtttgctg gattccaa 258

<210> 11

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggtgcctatt ctggtgcacc taagcaatcc cttaaaaaac ctgtgctaag gacagccaca 60

gtccaa 66

<210> 12

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggaccgagct tagactttgc cttatccctc ctaaggcgca acatcagaca ggtgcaaact 60

gatcaaggac attttactat gttaggagtg cgagatcgcc tagctatttt gccgcgccac 120

tcgcaaccag gaaaaactat ttgggtggaa cacaaattaa tcaatgtgct agatgctgtt 180

gaattggtgg atgagcaagg tgtaaatttg gaactcacac tagtaacctt ggacaccaac 240

gaaaaattta gagatgtcac caagtttatt ccagagacga tcaccggggc aagcgacgca 300

accttgatca tcaacactga gcacatgccc tcaatgttcg ttccagtggg tgatgttgta 360

cagtatgggt ttctaaatct cagcggtaag cccacacacc gaaccatgat gtacaatttc 420

cccacaaagg cagggcagtg tggaggtgtg gtcacctcag ttggtaagat tattggaatt 480

catatcggtg ggaatggacg ccaaggcttc tgtgctggac tgaagagagg ctactttgcc 540

agtgaacaa 549

<210> 13

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggagagatcc aatggatgaa gtccaataaa gaaactggga gactgaacat taatggtcca 60

acacgtacca aattggagcc cagtgcattc tatgatgtgt ttgagggcag caaagaacca 120

gcagtcttaa ccggtaagga tcctagactt gaggttgatt ttgagcaagc tttgttttcc 180

aaatatgtag gaaacaccct gcatgagcct gacgaatatg tgacacaggc tgctctccac 240

tatgcaaacc agctaaagca attagatata aacattaata agatgagtat ggaggaagca 300

tgctacggca ctgaatatct agaggctata gacttgcaca ccagtgccgg gtacccctat 360

agtgccctgg gtgtcaagaa aagagacata cttgacccaa tcactagaga cactaccaaa 420

atgaaattct acatggataa atatgggtta gacttgccct attccaccta tgtgaaagat 480

gagcttagat ccctagataa gattaagaaa gggaaatccc gcttgattga agccagtagt 540

ctaaatgact cagtctacct taggatgact tttgggcatc tctatgaaac ttttcatgcc 600

aacccgggga ctgtgactgg gtctgcagta gggtgtaatc ctgatgtgtt ctggagtaaa 660

ttaccgatcc tgctgccagg atcgctcttt gcatttgact attcaggata tgatgcaagt 720

ctcagcccag tgtggtttag agctttggag gtggttctcc gagagatcgg ctactcagag 780

gaggctgtat cactaataga agggatcaac cacacccatc atgtgtatcg gaacaggaca 840

tattgtgtcc ttggtggaat gccttcaggt tgttccggta cttccatctt caattccatg 900

atcaataaca taataatcag aacccttttg attaaaactt ttaaggggat tgacttagat 960

gagctgaata tggtagctta tggagatgat gtgttagcta gctatccatt ccctattgac 1020

tgctcggagc tagccagaac tggtaaagag tacggattga caatgacacc cgctgataag 1080

tcaccttgct ttaatgaagt tacctgggaa aatgccacat tcttaaagag aggtttcctg 1140

ccagatcacc agttcccatt tcttatccac cctaccatgc ccatgaggga gatccacgag 1200

tccattcgtt ggactaaaga tgcacgcaac actcaggatc acgtgcgctc tctgtgcctc 1260

ttagcgtggc ataatgggaa ggaggaatat gaaaaatttg tgagcacaat taggtcagtt 1320

cccattggaa aagccttggc tataccaaat tttgagaact tgagaagaaa ttggctcgag 1380

ttattt 1386

<210> 14

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

taatatacag tttaaagctg aaccccacca gaagtctggt cgtgttaatg actggtgggg 60

gtaaatttgt tataaccaga atagc 85

<210> 15

<211> 2193

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

1 5 10 15

Asn Ser Ala Ser Glu Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ala Tyr Ala Ala Ser Ala Gly Arg Gln Asp Met Ser Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Asp Pro Val Met Asp Val Ile His Glu Met

50 55 60

Ala Pro Pro Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Ile Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Phe Thr Leu Asp Thr Lys Ser Trp Ala Lys Asp Ser

130 135 140

Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Val Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Val His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Leu Pro Glu Tyr Val Leu Gly Thr Ile Ala Gly Gly Thr

195 200 205

Gly Asn Glu Asn Ser His Pro Pro Tyr Ala Thr Thr Gln Pro Gly Gln

210 215 220

Val Gly Ala Val Leu Thr His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro

225 230 235 240

Leu Ser Gln Leu Thr Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr

245 250 255

Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Val Pro Tyr Met Asn Thr Val Pro Phe

260 265 270

Asp Ser Ala Leu Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Ile Pro Val

275 280 285

Val Pro Leu Asp Phe Asn Ala Gly Ala Thr Ser Glu Ile Pro Ile Thr

290 295 300

Val Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala

305 310 315 320

Val Lys Gln Gly Ile Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe

325 330 335

Leu Thr Thr Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe Tyr

340 345 350

Pro Thr Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Asn Leu Leu Glu

355 360 365

Ile Cys Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Leu Lys Thr Asn

370 375 380

Glu Thr Thr Pro Met Gln Arg Leu Cys Phe Pro Val Ser Val Gln Ser

385 390 395 400

Lys Thr Gly Glu Leu Cys Ala Ala Phe Arg Ala Asp Pro Gly Arg Asp

405 410 415

Gly Pro Trp Gln Ser Thr Ile Leu Gly Gln Leu Cys Arg Tyr Tyr Thr

420 425 430

Gln Trp Ser Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Ala Gly Ser Phe

435 440 445

Met Ala Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Asn

450 455 460

Val Pro Ala Asp Arg Ile Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp

465 470 475 480

Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Val Pro Trp Ile Ser

485 490 495

Asn Thr His Tyr Arg Ala His Ala Arg Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Tyr

500 505 510

Thr Thr Gly Ile Ile Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro

515 520 525

Ile Gly Ala Pro Thr Thr Ala Tyr Ile Val Ala Leu Ala Ala Ala Gln

530 535 540

Asp Asn Phe Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Thr Glu Asp Ile Glu Gln

545 550 555 560

Thr Ala Asn Ile Gln Gly Asp Pro Ile Ala Asp Met Ile Asp Gln Thr

565 570 575

Val Asn Asn Gln Val Asn Arg Ser Leu Thr Ala Leu Gln Val Leu Pro

580 585 590

Thr Ala Ala Asn Thr Glu Ala Ser Ser His Arg Leu Gly Thr Gly Val

595 600 605

Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser

610 615 620

Asp Lys Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn His His Ser Thr

625 630 635 640

Gln Glu Thr Ala Ile Gly Asn Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Ser

645 650 655

Ile Ile Thr Met Pro Thr Thr Gly Thr Gln Asn Thr Asp Gly Tyr Val

660 665 670

Asn Trp Asp Ile Asp Leu Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Cys

675 680 685

Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Val

690 695 700

Ala Lys Pro Asn Gly Glu Leu Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Tyr

705 710 715 720

Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Thr Ser Arg Asp Ser Phe Ala Trp

725 730 735

Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Met Thr Asp Pro Pro

740 745 750

Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp

755 760 765

Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Leu Gln Ala Asn Asp

770 775 780

Leu Asp Tyr Gly Gln Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Ile

785 790 795 800

Arg Thr Val Gly Thr Glu Lys Ser Pro His Ser Ile Thr Leu Arg Val

805 810 815

Tyr Met Arg Ile Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Leu Arg

820 825 830

Asn Gln Pro Tyr Leu Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp

835 840 845

Ile Lys Cys Thr Ser Thr Ser Arg Asp Lys Ile Thr Thr Leu Gly Lys

850 855 860

Phe Gly Gln Gln Ser Gly Ala Ile Tyr Val Gly Asn Tyr Arg Val Val

865 870 875 880

Asn Arg His Leu Ala Thr His Asn Asp Trp Ala Asn Leu Val Trp Glu

885 890 895

Asp Ser Ser Arg Asp Leu Leu Val Ser Ser Thr Thr Ala Gln Gly Cys

900 905 910

Asp Thr Ile Ala Arg Cys Asn Cys Gln Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

915 920 925

Ser Lys Arg Lys His Tyr Pro Val Ser Phe Thr Lys Pro Ser Leu Ile

930 935 940

Phe Val Glu Ala Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser His Leu

945 950 955 960

Met Leu Ala Val Gly His Ser Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly Ile Leu

965 970 975

Arg Cys Gln His Gly Val Val Gly Ile Val Ser Thr Gly Gly Asn Gly

980 985 990

Leu Val Gly Phe Ala Asp Val Arg Asp Leu Leu Trp Leu Asp Glu Glu

995 1000 1005

Ala Met Glu Gln Gly Val Ser Asp Tyr Ile Lys Gly Leu Gly Asp

1010 1015 1020

Ala Phe Gly Met Gly Phe Thr Asp Ala Val Ser Arg Glu Val Glu

1025 1030 1035

Ala Leu Lys Asn His Leu Ile Gly Ser Glu Gly Ala Val Glu Lys

1040 1045 1050

Ile Leu Lys Asn Leu Val Lys Leu Ile Ser Ala Leu Val Ile Val

1055 1060 1065

Val Arg Ser Asp Tyr Asp Met Val Thr Leu Thr Ala Thr Leu Ala

1070 1075 1080

Leu Ile Gly Cys His Gly Ser Pro Trp Ala Trp Ile Lys Ala Lys

1085 1090 1095

Thr Ala Ser Ile Leu Gly Ile Pro Ile Val Gln Lys Gln Ser Ala

1100 1105 1110

Ser Trp Leu Lys Lys Phe Asn Asp Met Ala Asn Ala Ala Lys Gly

1115 1120 1125

Leu Glu Trp Ile Ser Ser Lys Ile Ser Lys Phe Ile Asp Trp Leu

1130 1135 1140

Lys Glu Lys Ile Ile Pro Ala Ala Lys Glu Lys Val Glu Phe Leu

1145 1150 1155

Asn Asn Leu Lys Gln Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Ser Asn

1160 1165 1170

Leu Glu Gln Ser Ala Ala Ser Gln Glu Asp Leu Glu Ala Met Phe

1175 1180 1185

Gly Asn Val Ser Tyr Leu Ala His Phe Cys Arg Lys Phe Gln Pro

1190 1195 1200

Leu Tyr Ala Val Glu Ala Lys Arg Val Tyr Ala Leu Glu Lys Arg

1205 1210 1215

Met Asn Asn Tyr Met Gln Phe Lys Ser Lys His Arg Ile Glu Pro

1220 1225 1230

Val Cys Leu Ile Ile Arg Gly Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu

1235 1240 1245

Ala Thr Gly Ile Ile Ala Arg Ala Ile Ala Asp Lys Tyr His Ser

1250 1255 1260

Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr

1265 1270 1275

Lys Gln Gln Val Val Thr Val Met Asp Asp Leu Cys Gln Asn Pro

1280 1285 1290

Asp Gly Lys Asp Met Ser Leu Phe Cys Gln Met Val Ser Thr Val

1295 1300 1305

Asp Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Glu Lys Gly Val Ser

1310 1315 1320

Phe Thr Ser Lys Phe Val Ile Ala Ser Thr Asn Ala Ser Asn Ile

1325 1330 1335

Val Val Pro Thr Val Ser Asp Ser Asp Ala Ile Arg Arg Arg Phe

1340 1345 1350

Tyr Met Asp Cys Asp Ile Glu Val Thr Asp Ser Tyr Lys Thr Asp

1355 1360 1365

Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly Arg Ala Ala Lys Leu Cys Thr Glu

1370 1375 1380

Asn Asn Thr Ala Asn Phe Lys Arg Cys Ser Pro Leu Val Cys Gly

1385 1390 1395

Lys Ala Ile Gln Leu Arg Asp Arg Lys Ser Lys Val Arg Tyr Ser

1400 1405 1410

Ile Asp Thr Val Val Ser Glu Leu Ile Arg Glu Tyr Asn Asn Arg

1415 1420 1425

Ser Ala Ile Gly Asn Thr Ile Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Leu

1430 1435 1440

Lys Phe Arg Pro Ile Arg Ile Ser Leu Glu Glu Lys Pro Ala Pro

1445 1450 1455

Asp Ala Ile Ser Asp Leu Leu Ala Ser Val Asp Ser Glu Glu Val

1460 1465 1470

Arg Gln Tyr Cys Arg Glu Gln Gly Trp Ile Ile Pro Glu Thr Ser

1475 1480 1485

Thr Asn Val Glu Arg His Leu Asn Arg Ala Val Leu Val Met Gln

1490 1495 1500

Ser Ile Ala Thr Val Val Ala Val Val Ser Leu Val Tyr Val Ile

1505 1510 1515

Tyr Lys Leu Phe Ala Gly Phe Gln Gly Ala Tyr Ser Gly Ala Pro

1520 1525 1530

Lys Gln Ser Leu Lys Lys Pro Val Leu Arg Thr Ala Thr Val Gln

1535 1540 1545

Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Ile

1550 1555 1560

Arg Gln Val Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val

1565 1570 1575

Arg Asp Arg Leu Ala Ile Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys

1580 1585 1590

Thr Ile Trp Val Glu His Lys Leu Ile Asn Val Leu Asp Ala Val

1595 1600 1605

Glu Leu Val Asp Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Val

1610 1615 1620

Thr Leu Asp Thr Asn Glu Lys Phe Arg Asp Val Thr Lys Phe Ile

1625 1630 1635

Pro Glu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Asp Ala Thr Leu Ile Ile Asn

1640 1645 1650

Thr Glu His Met Pro Ser Met Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val

1655 1660 1665

Gln Tyr Gly Phe Leu Asn Leu Ser Gly Lys Pro Thr His Arg Thr

1670 1675 1680

Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys Ala Gly Gln Cys Gly Gly Val

1685 1690 1695

Val Thr Ser Val Gly Lys Ile Ile Gly Ile His Ile Gly Gly Asn

1700 1705 1710

Gly Arg Gln Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys Arg Gly Tyr Phe Ala

1715 1720 1725

Ser Glu Gln Gly Glu Ile Gln Trp Met Lys Ser Asn Lys Glu Thr

1730 1735 1740

Gly Arg Leu Asn Ile Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys Leu Glu Pro

1745 1750 1755

Ser Ala Phe Tyr Asp Val Phe Glu Gly Ser Lys Glu Pro Ala Val

1760 1765 1770

Leu Thr Gly Lys Asp Pro Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln Ala

1775 1780 1785

Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly Asn Thr Leu His Glu Pro Asp Glu

1790 1795 1800

Tyr Val Thr Gln Ala Ala Leu His Tyr Ala Asn Gln Leu Lys Gln

1805 1810 1815

Leu Asp Ile Asn Ile Asn Lys Met Ser Met Glu Glu Ala Cys Tyr

1820 1825 1830

Gly Thr Glu Tyr Leu Glu Ala Ile Asp Leu His Thr Ser Ala Gly

1835 1840 1845

Tyr Pro Tyr Ser Ala Leu Gly Val Lys Lys Arg Asp Ile Leu Asp

1850 1855 1860

Pro Ile Thr Arg Asp Thr Thr Lys Met Lys Phe Tyr Met Asp Lys

1865 1870 1875

Tyr Gly Leu Asp Leu Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp Glu Leu

1880 1885 1890

Arg Ser Leu Asp Lys Ile Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu

1895 1900 1905

Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser Val Tyr Leu Arg Met Thr Phe Gly

1910 1915 1920

His Leu Tyr Glu Thr Phe His Ala Asn Pro Gly Thr Val Thr Gly

1925 1930 1935

Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Phe Trp Ser Lys Leu Pro

1940 1945 1950

Ile Leu Leu Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe Asp Tyr Ser Gly Tyr

1955 1960 1965

Asp Ala Ser Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala Leu Glu Val Val

1970 1975 1980

Leu Arg Glu Ile Gly Tyr Ser Glu Glu Ala Val Ser Leu Ile Glu

1985 1990 1995

Gly Ile Asn His Thr His His Val Tyr Arg Asn Arg Thr Tyr Cys

2000 2005 2010

Val Leu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe

2015 2020 2025

Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile Ile Ile Arg Thr Leu Leu Ile Lys

2030 2035 2040

Thr Phe Lys Gly Ile Asp Leu Asp Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr

2045 2050 2055

Gly Asp Asp Val Leu Ala Ser Tyr Pro Phe Pro Ile Asp Cys Ser

2060 2065 2070

Glu Leu Ala Arg Thr Gly Lys Glu Tyr Gly Leu Thr Met Thr Pro

2075 2080 2085

Ala Asp Lys Ser Pro Cys Phe Asn Glu Val Thr Trp Glu Asn Ala

2090 2095 2100

Thr Phe Leu Lys Arg Gly Phe Leu Pro Asp His Gln Phe Pro Phe

2105 2110 2115

Leu Ile His Pro Thr Met Pro Met Arg Glu Ile His Glu Ser Ile

2120 2125 2130

Arg Trp Thr Lys Asp Ala Arg Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser

2135 2140 2145

Leu Cys Leu Leu Ala Trp His Asn Gly Lys Glu Glu Tyr Glu Lys

2150 2155 2160

Phe Val Ser Thr Ile Arg Ser Val Pro Ile Gly Lys Ala Leu Ala

2165 2170 2175

Ile Pro Asn Phe Glu Asn Leu Arg Arg Asn Trp Leu Glu Leu Phe

2180 2185 2190

Claims

1.一种可引起大日龄小鼠死亡的柯萨奇病毒CVA16型强毒株，其特征在于，

(1)所述的强毒株由结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1及非结构蛋白2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D组成；

(2)以野生型柯萨奇病毒CVA16型毒株的基因组为基础，所述的强毒株2A蛋白第2位氨基酸突变为K、第31位氨基酸突变为L；2C蛋白第112位氨基酸突变为M。

2.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒CVA16型强毒株，其特征在于，其基因组编码的结构蛋白的全氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

3.根据权利要求2所述的柯萨奇病毒CVA16型强毒株，其特征在于，所述的强毒株的各个组成蛋白的氨基酸序列分别为，

VP4蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1-69位所示氨基酸序列；

VP2蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第70-323位所示氨基酸序列；

VP3蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第324-552位所示氨基酸序列；

VP1蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第553-860位所示氨基酸序列；

2A蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第861-1010位所示氨基酸序列；

2B蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1011-1109位所示氨基酸序列；

2C蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1110-1438位所示氨基酸序列；

3A蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1439-1524位所示氨基酸序列；

3B蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1525-1546位所示氨基酸序列；

3C蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1547-1729位所示氨基酸序列；

3D蛋白为SEQ ID NO.15所示序列第1730-2191位所示氨基酸序列。

4.权利要求1或2所述的柯萨奇病毒CVA16型强毒株的编码基因。

5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

6.权利要求1或2所述的柯萨奇病毒CVA16型强毒株的培养方法，其特征在于，使用Vero细胞作为宿主培养所述柯萨奇病毒A16型强毒株。

7.权利要求1或2所述的柯萨奇病毒CVA16型强毒株在研究柯萨奇病毒致病机理中的应用。

8.权利要求1或2所述的柯萨奇病毒CVA16型强毒株在测试柯萨奇病毒疫苗保护效力中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的疫苗包括活疫苗或灭活疫苗、单价或多价疫苗。