CN106795499A - 稳定的冷适应的温度敏感性嵌合肠道病毒的开发 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及嵌合病毒毒株，特别是稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株EV71:eTLLβP20和EV71:TLLeC5以及稳定的嵌合肠道病毒毒株TLLeCA16。本发明还涉及包含这些毒株的核苷酸序列的载体和包含这些毒株的疫苗。

Description

稳定的冷适应的温度敏感性嵌合肠道病毒的开发
相关申请的交叉引用
本申请涉及2014年6月12日提交的美国临时专利申请系列号62/011,406，并要求其优先权。该申请援引加入本文。
序列提交
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表题为2577236PCTSequenceListing.txt，2015年4月23日创建，并且大小为62kb。电子格式的序列表的信息整体援引加入本文。
发明背景
本发明涉及嵌合病毒毒株，特别是稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株EV71:eTLLβP20和EV71:TLLeC5以及稳定的嵌合肠道病毒毒株TLLeCA16。本发明还涉及包含这些毒株的核苷酸序列的载体和包含这些毒株的疫苗。
本文中用来说明本发明的背景或提供关于实践的额外细节的出版物和其他材料援引加入本文，并且为了方便，分别分组在参考文献中。
手足口病(HFMD)是发热性疾病复合体，其特征在于手和脚的手掌和脚掌上的皮肤疹(皮疹)，同时发生影响口的皮肤粘膜水疱溃疡性损伤(粘膜疹)。该疾病是由许多肠道病毒引起的，柯萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)为主要病原体(1)。除了HFMD，EV71与一系列其他临床疾病有关，包括非特异性发热性疾病、急性幼儿呼吸道感染、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样急性弛缓性麻痹(1-3)。如其他肠道病毒，EV71和CA16是直径28-30nm的小无包膜病毒。病毒衣壳是二十面体对称的，并且由60个相同的单元(原体)组成，每个单元由一个拷贝的4个病毒结构蛋白VP1-VP4组成。衣壳围绕约7,450个核苷酸(nt)的单链正义RNA基因组的核心。病毒基因组由单开放阅读框组成，其编码约2200个氨基酸的多聚蛋白，并且在其5’端侧面为约750nt的长非翻译区，在其3’端侧面为约85nt的短非翻译区，在其3’末端具有可变长度的poly-A段(tract)。人肠道病毒71(HEV71)被归类为小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)内的肠道病毒属(Enterovirus)下的人肠道病毒A(HumanEnterovirus A)物种(2、3)。基于其主要衣壳蛋白(VP1)基因的系统发育分析，EV71分为3个主要基因群(genogroup)(A、B和C)，并且基因群B和C分别进一步细分为基因型B1-B5和C1-C5(4)。
在最近15年中，EV71的活性和毒力增加，特别是在亚太地区内，引起HFMD的严重爆发并影响中枢神经系统，具有神经后遗症和死亡，特别是在幼儿中。目前，没有用于治疗由于EV71的疾病的特异性抗病毒药物，也没有用于控制和预防感染的任何有效疫苗。减毒活口服和灭活亲代脊髓灰质炎病毒疫苗在预防脊髓灰质炎中的成功表明通过免疫接种预防由于EV71的疾病的潜力(28)。已报道许多以前开发EV71疫苗的尝试，并且一些已达到临床试验的各种阶段(29-49)。但是，对控制和防止HFMD爆发的有效疫苗需要解决几个挑战(50-52)。首先，HFMD是由许多肠道病毒引起的，EV71和CA16为主要病原体，特别是在爆发情况下(5-27)。最近公开的Chou等人(2012)的研究已证实针对EV71引起的抗体不会针对CA16感染交叉保护，反之亦然(50)。高度需要靶向EV71和CA16的多价疫苗以防止由于这两种主要病原体的HFMD爆发。第二，据发现EV71在最近15年中快速进化，并且已知一种以上的EV71基因型共循环并引起世界各地的爆发。已发现感染特异性基因型之后各种基因型之间的交叉保护免疫是非均质的，并且候选EV71疫苗需要解决这个问题以提供针对所有已知循环基因型的交叉保护。
最近已开发EV71的稳定的冷适应的温度敏感性减毒毒株EV71:TLLβP20。参见2013年1月18日提交的国际申请号PCT/SG2013/000027，其整体援引加入本文。病毒不会在39.5℃的温度(人体高热温度)下温育的培养细胞中复制，甚至当用高感染复数(m.o.i)的病毒接种物接种培养细胞时也是如此。EV71:TLLβP20在确定的培养条件下是表型和遗传稳定的。通过温度回复研究中的多个世代确定稳定性。最近已在猴的研究中证实这种潜在的候选EV71疫苗的安全性、免疫原性和有效性(中和抗体)。但是，猴研究中EV71:TLLβP20诱导的中和抗体表现出针对相似基因群内的EV71基因型的高中和抗体滴度，但是针对属于不同基因群的基因型具有低中和滴度。该发现证实以前公开的在日本国立传染病研究所(NIID)进行的猴研究的发现，其显示一种基因型诱导的中和抗体赋予针对同源基因群的EV71毒株的高中和抗体滴度，但是具有较低的针对属于异源基因群的毒株的中和滴度(32)。
因此，需要开发嵌合病毒毒株，其可用于开发针对由于EV71和/或CA16的HFMD的疫苗。
发明概述
本发明涉及嵌合病毒毒株，特别是稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株EV71:eTLLβP20和EV71:TLLeC5以及稳定的嵌合肠道病毒毒株TLLeCA16，以及它们的灭活形式。本发明还涉及包含这些毒株的核苷酸序列的载体和包含这些毒株的疫苗。
因此，在一方面，本发明提供稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株和稳定的嵌合肠道病毒毒株，以及它们的灭活形式。在一实施方案中，稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株是如本文所述的EV71:eTLLβP20。在另一实施方案中，稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株是如本文所述的EV71:TLLeC5，其携带EV71基因型C5的衣壳蛋白。在一额外的实施方案中，稳定的嵌合肠道病毒毒株是如本文所述的TLLeCA16，其携带CA16的衣壳蛋白。
在第二方面，本发明提供一种组合物，其包含本文所述的肠道病毒71毒株和嵌合肠道病毒毒株中的一种或多种，单独或与国际申请号PCT/SG2013/000027中描述的亲代稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株EVL:TLLβP20组合。如这个上下文中所用，“单独”表示所述组合物包含病毒毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种。还如这个上下文中所用，“与…组合”表示所述组合物包含病毒毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种以及亲代EV71:eTLLβP20。在一实施方案中，所述组合物包含有效量的一种或多种本文所述的病毒毒株，单独或与亲代EVL:TLLβP20组合。在一些实施方案中，一种、一些或所有毒株可以是病毒毒株的灭活形式。在另一实施方案中，所述组合物包含一种或多种生理或药学可接受的载体。在另一实施方案中，所述组合物为疫苗。利用技术人员公知的技术制备包含一种或多种本文所述的病毒毒株(单独或与亲代EVL:TLLβP20组合)的疫苗。如这个上下文中所用，“单独”表示所述疫苗包含病毒毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种。还如这个上下文中所用，“与…组合”表示所述疫苗包含病毒毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种以及亲代EV71:eTLLβP20。在一实施方案中，所述疫苗包含活毒株。在另一实施方案中，所述活毒株是减毒的。在一额外的实施方案中，所述疫苗包含灭活毒株。在另一实施方案中，所述疫苗可以是口服疫苗。利用技术人员公知的技术，这类疫苗可用于通过给个体如人个体施用所述疫苗来提供针对亲代病毒毒株的免疫。
在第三方面，本发明提供一种引发个体如人个体中的保护性免疫应答的方法，所述方法包括给个体施用预防或治疗或免疫有效量的一种或多种本文所述的病毒毒株，单独或与亲代EVL:TLLβP20组合。在一实施方案中，所述保护性免疫应答保护个体防止肠道病毒71和或柯萨奇病毒CA16引起的疾病。在一实施方案中，所述疾病为手足口病。在另一实施方案中，所述疾病为无菌性脑膜炎。在一额外的实施方案中，所述疾病为脑炎。在另一实施方案中，所述疾病为脊髓灰质炎样麻痹。在一实施方案中，将一种或多种本文所述的病毒毒株作为疫苗单独或与亲代EVL:TLLβP20组合施用。在一额外的实施方案中，所述个体已暴露于野生型肠道病毒71和/或柯萨奇病毒CA16。在另一实施方案中，单独或与亲代EVL:TLLβP20组合施用一种或多种本文所述的病毒毒株防止个体如人个体患上肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒CA16相关疾病。在一额外的实施方案中，所述个体已暴露于野生型肠道病毒71和/或柯萨奇病毒CA16。在另一实施方案中，单独或与亲代EVL:TLLβP20组合施用一种或多种本文所述的病毒毒株延迟病毒感染的个体如人个体中肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒CA16相关疾病的发作或减缓其发展速度。在一些实施方案中，一种、一些或所有毒株是灭活的。
在第四方面，本发明提供与本文所述的病毒毒株相关的疫苗技术。在一实施方案中，本文所述的病毒毒株用于制备疫苗的方法。在另一实施方案中，包含SEQ ID NO:84、SEQID NO:86、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:83中示出的核苷酸序列的核酸用于制备疫苗的方法。在一额外的实施方案中，本文所述的肠道病毒71毒株或其灭活形式用于疫苗开发。在另一实施方案中，包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:83中示出的核苷酸序列的核酸用于疫苗开发。
附图说明
图1示出代表工程化的稳定的冷适应的温度敏感性EV71:eTLLβP20的基因组结构和各自编码的蛋白的示意图。深黑色条表示病毒基因组的编码区(P1、P2和P3)，而较浅的条表示病毒基因组的5’和3’非编码(NC)区。灰色表示翻译的多聚蛋白和切割之后的各病毒蛋白。
图2a和2b示出代表EV71:eTLLβP20和基因型C的EV71的基因组结构的示意图。图2a代表EV71:eTLLβP20的基因组结构(黑色)和翻译的多聚蛋白(灰色)。图2b代表基因型C5的EV71的基因组结构(具有点图案的黑色)。
图2c示出代表工程化的稳定的冷适应的温度敏感性嵌合肠道病毒71，EV71:TLLeC5的基因组结构和各自编码的蛋白的示意图。EV71:TLLeC5的衣壳蛋白基因(P1)(具有点图案的黑色)和翻译的蛋白(VP1,2,3,4)(具有点图案的灰色)源自基因型C5的EV71。
图3a和3b示出代表EV71:eTLLβP20和柯萨奇病毒CA16的基因组结构的示意图。图3a代表EV71:eTLLβP20的基因组结构(黑色)和翻译的多聚蛋白(灰色)。图3b代表柯萨奇病毒CA16的基因组结构(具有垂直线图案的黑色)。
图3c示出代表工程化的稳定的冷适应的温度敏感性嵌合肠道病毒TLLeCA16的基因组结构和各自编码的蛋白的示意图。TLLeCA16的衣壳蛋白基因(P1)(具有垂直线图案的黑色)和翻译的蛋白(VP1,2,3,4)(具有垂直线图案的灰色)源自柯萨奇病毒CA16。
发明详述
本发明涉及嵌合病毒毒株，特别是稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株EV71:eTLLβP20和EV71:TLLeC5以及稳定的嵌合毒株TLLeCA16。本发明还涉及包含这些毒株的核苷酸序列的载体和包含这些毒株的疫苗。
因此，在一方面，本发明提供肠道病毒71毒株和嵌合毒株。在一实施方案中，稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株是如本文所述的EV71:eTLLβP20。在另一实施方案中，稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株是如本文所述的EV71:TLLeC5，其携带EV71基因型C5的衣壳蛋白基因。在一额外的实施方案中，稳定的嵌合肠道病毒毒株是如本文所述的TLLeCA16，其携带CA16的衣壳蛋白基因。国际公开号PCT/SG2013/000027中描述的亲代毒株EV71:TLLβP20于2012年10月25日在布达佩斯条约的条款下存储在位于10801University Boulevard,Manassas,Virginia 20110的美国典型培养物保藏中心，并且分配登录号PTA-13285。EV71:eTLLβP20于2014年5月30日在布达佩斯条约的条款下存储在位于Wuhan University,Wuhan 430072Peoples Republic of China的中国典型培养物保藏中心，并且分配登录号CCTCC V201414。EV71:TLLeC5于2014年5月30日在布达佩斯条约的条款下存储于中国典型培养物保藏中心，并且分配登录号CCTCC V201415。TLLeCA16于2014年5月30日在布达佩斯条约的条款下存储于中国典型培养物保藏中心，并且分配登录号CCTCC V201416。
在第二方面，本发明提供一种组合物，其包含一种或多种本文所述的病毒毒株，单独或与国际申请号PCT/SG2013/000027中描述的亲代EV71毒株EVL:TLLβP20组合。如这个上下文中所用，“单独”表示所述组合物包含病毒毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种。还如这个上下文中所用，“与…组合”表示所述组合物包含EV71毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种以及亲代EV71:eTLLβP20。在一实施方案中，所述组合物包含有效量的一种或多种本文所述的病毒毒株，单独或与亲代EV71:TLLβP20组合。在一些实施方案中，一种、一些或所有毒株可以是病毒毒株的灭活形式。在另一实施方案中，所述组合物包含一种或多种生理或药学可接受的载体。在另一实施方案中，所述组合物为疫苗。利用技术人员公知的技术制备包含一种或多种本文所述的病毒毒株(单独或与亲代EVL:TLLβP20组合)的疫苗。如这个上下文中所用，“单独”表示所述疫苗包含病毒毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种。还如这个上下文中所用，“与…组合”表示所述疫苗包含病毒毒株EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16中的一种或多种以及亲代EV71:eTLLβP20。在一实施方案中，所述疫苗包含活毒株。在另一实施方案中，所述活毒株是减毒的。在一额外的实施方案中，所述疫苗包含灭活毒株。在另一实施方案中，所述疫苗可以是口服疫苗。利用技术人员公知的技术，这类疫苗可用于通过给个体如人个体施用所述疫苗来提供针对亲代病毒毒株的免疫。
应当理解当用来引发个体中的保护性免疫应答或者防止个体患上病毒相关疾病或者延迟病毒相关疾病的发作或减缓其发展速度时，将本文所述的病毒毒株以组合物的形式给个体施用，所述组合物额外地包含一种或多种生理或药学可接受的载体。药学可接受的载体是技术人员公知的，并且包括但不限于0.01M-0.1M且优选0.05M磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲盐水(PBS)或0.9％盐水中的一种或多种。这类载体还包括水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液、盐水和缓冲介质。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液和不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂如基于林格氏葡萄糖的那些等。固体组合物可以包含无毒的固体载体如葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素或纤维素衍生物、碳酸钠以及碳酸镁。为了在气雾剂中施用，如用于肺部和/或鼻内递送，物质或组合物优选用无毒的表面活性剂如C6-C22脂肪酸的酯或部分酯或者天然甘油酯，以及抛射剂配制。可以包括额外的载体如卵磷脂以促进鼻内递送。药学可接受的载体可以进一步包括少量的辅助物质如湿润或乳化剂、防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂和螯合剂，其增加活性成分的保质期和/或有效性。如本领域公知的，可以配制本发明的组合物，以便在给个体施用之后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
在第三方面，本发明提供一种引发个体如人个体中的保护性免疫应答的方法，所述方法包括给个体施用预防或治疗或免疫有效量的一种或多种本文所述的病毒毒株，单独或与亲代EVL:TLLβP20组合，或者其灭活毒株。在一实施方案中，所述保护性免疫应答保护个体防止肠道病毒71和/或柯萨奇病毒CA16引起的疾病。在一实施方案中，所述疾病为手足口病。在另一实施方案中，所述疾病为无菌性脑膜炎。在一额外的实施方案中，所述疾病为脑炎。在另一实施方案中，所述疾病为脊髓灰质炎样麻痹。在一实施方案中，将一种或多种本文所述的病毒毒株作为疫苗单独或与亲代EVL:TLLβP20组合施用。在一额外的实施方案中，所述个体已暴露于野生型肠道病毒71和/或柯萨奇病毒CA16。在另一实施方案中，单独或与亲代EVL:TLLβP20组合施用一种或多种本文所述的病毒毒株防止个体如人个体患上肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒CA16相关疾病。在一额外的实施方案中，所述个体已暴露于野生型肠道病毒71和/或和/或柯萨奇病毒CA16。在另一实施方案中，单独或与亲代EVL:TLLβP20组合施用一种或多种本文所述的病毒毒株延迟病毒感染的个体如人个体中肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒CA16相关疾病的发作或减缓其发展速度。
如本文所用，“施用”表示利用任何本领域技术人员已知的各种方法和递送系统递送。施用可以例如腹腔内、大脑内、静脉内、口服、经粘膜、皮下、透皮、皮内、肌肉内、体表、肠胃外、通过植入物、鞘内、淋巴管内、病灶内、心包或硬膜外进行。物质或组合物还可以在气雾剂中施用，如用于肺部和/或鼻内递送。施用可以进行例如一次、许多次和/或在一个或多个延长的时间中进行。
引发个体中的保护性免疫应答可以例如通过给个体施用初级剂量的疫苗，然后在合适的时间之后一次或多次后续施用所述疫苗来完成。疫苗施用之间的合适的时间可以由本领域技术人员容易地确定，并且通常大约几周至几个月。但是，本发明并不限于施用的任何特定方法、途径或频率。
“预防有效剂量”或“免疫有效剂量”是任何量的疫苗，当给倾向于病毒感染或倾向于患上病毒相关病症的个体施用时，其在所述个体中诱导保护所述个体防止病毒感染或患上疾病的免疫应答。“保护”个体表示减少个体感染病毒的可能性，或者减少个体中病毒发作的可能性至少2倍，优选至少10倍。例如，如果个体具有1％机会感染病毒，则个体感染病毒的可能性的2倍减少会导致个体具有0.5％机会感染病毒。更优选地，“预防有效剂量”在个体中诱导完全防止个体感染病毒或完全防止个体中的病症发作的免疫应答。
任何即时免疫和治疗方法的某些实施方案可以进一步包括给个体施用至少一种佐剂。“佐剂”应当表示适合增强抗原的免疫原性和促进个体中的免疫应答的任何物质。包括颗粒佐剂在内的许多佐剂适合用于基于蛋白和核酸的疫苗，并且合并佐剂与抗原的方法是技术人员公知的。适合用于蛋白免疫的佐剂包括但不限于明矾、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、明矾佐剂、基于皂草苷的佐剂如Quil A和QS-21等。
在第四方面，本发明提供与本文所述的病毒毒株相关的疫苗技术。在一实施方案中，本文所述的病毒毒株用于制备疫苗的方法。在另一实施方案中，包含SEQ ID NO:84、SEQID NO:86、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:83中示出的核苷酸序列的核酸用于制备疫苗的方法。在一额外的实施方案中，本文所述的病毒毒株或其灭活形式用于疫苗开发。在另一实施方案中，包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:83中示出的核苷酸序列的核酸用于疫苗开发。
本发明还提供一种试剂盒，其用本文所述的稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株或其灭活形式，和/或本文所述的稳定的嵌合肠道病毒毒株或其灭活形式免疫个体。在一些实施方案中，所述试剂盒包含两种或更多种本文所述的稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株或其灭活形式，有或无本文所述的稳定的嵌合肠道病毒毒株。所述试剂盒包含本文所述的稳定的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，和/或本文所述的稳定的嵌合肠道病毒毒株或其灭活形式，药学可接受的载体，涂药器及其使用的指导材料。本发明包括技术人员已知的试剂盒的其他实施方案。说明书可以提供可用于指导施用本文所述的稳定的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式的任何信息。
除非另有说明，本发明的实施采用本领域技术内的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术。参见，例如，Maniatis et al.,1982,Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Sambrookand Russell,2001,Molecular Cloning,3rd Ed.(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New York)；Green and Sambrook,2012,Molecular Cloning,4th Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Ausubel et al.,1992,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,including periodic updates)；Glover,1985,DNA Cloning(IRL Press,Oxford)；Russell,1984,Molecular biology of plants:a laboratory coursemanual(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)；Anand,Techniques forthe Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Guthrie andFink,Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology(Academic Press,New York,1991)；Harlow and Lane,1988,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription AndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized CellsAnd Enzymes(IRLPress,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；thetreatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MethodsInEnzymology,Vols.154and 155(Wu et al.eds.),Immunochemical Methods InCell AndMolecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；HandbookOf Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir andC.C.Blackwell,eds.,1986)；Riott,Essential Immunology,6th Edition,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988；Fire et al.,RNA InterferenceTechnology:From Basic Science to DrugDevelopment,Cambridge UniversityPress,Cambridge,2005；Schepers,RNAInterference in Practice,Wiley–VCH,2005；Engelke,RNA Interference(RNAi):TheNuts&Bolts of siRNATechnology,DNA Press,2003；Gott,RNA Interference,Editing,andModification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),HumanPress,Totowa,NJ,2004；Sohail,Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application,CRC,2004.
实施例
参考以下实施例描述本发明，所述实施例通过说明的方式提供而不是为了以任何方式限制本发明。利用本领域公知的标准技术或下文特别描述的技术。
实施例1、材料和方法
细胞系和病毒：这个研究中使用的所有细胞系均获得自美国典型培养物保藏中心使细胞系在补充了10％(v/v)胎牛血清(FBS,Singapore)和0.22％(w/v)碳酸氢钠(NaHCO3,SigmaUSA)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM,USA)中生长。除非另有说明，在37℃的温育温度培养并维持Vero细胞(ATCC,CCL81)。感染之前，用1％DMEM替换10％DMEM的培养基，随后将感染的细胞在各自的实验温育温度下于加湿的5％CO2环境中温育。将Vero细胞中增殖的实验室建立的肠道病毒71的稳定的冷适应的温度敏感性毒株(EV71:TLLβP20)、基因型C5的临床肠道病毒71分离株以及属于基因群B(谱系2)的柯萨奇病毒A16的临床分离株用来产生嵌合肠道病毒的稳定的冷适应的温度敏感性毒株(EV71:TLLeC5和TLLeCA16)。
源自实验室建立的肠道病毒71的稳定的冷适应的温度敏感性毒株(EV71:TLLβP20)的全长病毒RNA基因组用来产生肠道病毒71(EV71)的感染性cDNA克隆，命名为EV71:eTLLβP20，其在特制的特异性限制性酶识别的病毒基因组的两个特异性位点包含工程化的核苷酸变化。随后EV71:eTLLβP20的感染性cDNA克隆用来产生嵌合病毒EV71:TLLeC5和嵌合病毒TLLeCA16的感染性cDNA克隆。
病毒滴定：在Vero细胞中按照世界卫生组织的脊髓灰质炎病毒实验室手册2004中描述的方法与少量修改通过微量滴定测定确定病毒滴度，并且按照Reed&Munch(1938)的方法，病毒滴度计算为50％细胞培养感染剂量(CCID50)/毫升(53-55)。简单地说，用等体积的氯仿处理以分散病毒聚集体之后，在包含1％FCS的DMEM中制备澄清的病毒上清液的10-倍系列稀释液。用100μl系列稀释的病毒原液接种96-孔平底组织培养板中的Vero细胞单层(104个细胞/孔)，并且在各自的温育温度下于5％CO2的环境中温育。每天观察接种的培养板，持续5天，观察CPE的存在。
温度敏感性表型测定：两种方法用来评价Vero细胞中的病毒毒株在28℃、37℃和39.5℃的温育温度下的生长特征。第一种方法评价病毒毒株引起接种的单层细胞中的完全CPE所用的天数(感染细胞死亡的动力学)，而第二种方法评价在每个特定测试温度下温育的接种细胞上清液中的病毒毒株的滴度。简单地说，在第一种方法中，用维持培养基(具有1％FCS的DMEM)替换包含相似年龄和细胞密度的汇合的单层Vero细胞的3个T-25组织培养瓶的生长培养基。然后通过置于各培养箱中1小时来允许每瓶中的培养基平衡至待测试的指定温度，随后用病毒毒株以10感染复数(m.o.i)的剂量接种。如果在10-天培养结束时未注意到CPE，则将上清液转至新的新鲜制备的单层Vero细胞瓶中，并且相似地再温育10天。如果在第二次传代之后未注意到CPE，则视为没有病毒复制。在第二种方法中，将密度104个细胞/100μl的Vero细胞悬浮液接种于3个96-孔细胞培养板的每个孔中，并且在37℃下于5％CO2的环境中温育。温育10小时之后，通过置于各培养箱中1小时来允许每个细胞培养板平衡至待测试的特定温度。随后用100μl的病毒毒株的10-倍系列稀释液接种每个孔中的细胞，然后转移至各温育温度的培养箱。每天观察接种的培养板，持续5天，观察CPE的存在，并且按照Reed&Munch(1938)的方法，病毒滴度计算为50％细胞培养感染剂量(CCID50)/毫升(40)。
遗传稳定性和温度敏感性回复测定：为了评价在指定的培养环境和细胞-类型下培养的病毒毒株的遗传稳定性，将病毒毒株在Vero细胞中以5m.o.i的病毒接种物进一步传代20次，并且在28℃的温育温度下温育。在20代结束时，通过如上文所述在28℃、37℃和39.5℃的温育温度下培养来评价病毒毒株的温度敏感性表型特征。随后测序它们各自基因组的完整核苷酸序列，并且相对于它们各自亲代病毒的原始来源基因组序列分析。
在稳定的冷适应的温度敏感性嵌合病毒毒株上进行温度敏感性回复表型测定以评价它们会如何快速回复至它们的原始野生型的表型特征。简单地说，将所选毒株在T-25烧瓶中培养的Vero细胞单层中连续传代5次，并且在37℃的温度下于5％CO2的环境中温育。每个世代使用10m.o.i的病毒接种物。通过如上文对温度敏感性表型测定描述的相似方法，在Vero细胞中于28℃、37℃和39.5℃的温育温度下评价每个世代衍生的病毒毒株的生长特征。在37℃的温度下温育的Vero细胞中6次连续传代之后，通过Sanger方法测序传代3和6次的病毒毒株的完整基因组，并且分析可能已回复至它们各自的亲代毒株的遗传序列的突变。
实施例2、分子克隆的试剂、载体(质粒)和一般方法
大肠杆菌(E.coli)菌株TOP10(Invitrogen)用于制备pZErOTM-2质粒(Invitrogen)，所述pZErOTM-2质粒用作保持载体(holding vector)以克隆源自病毒基因组的RT-PCR或5'cDNA末端快速扩增(5’-RACE)的DNA片段。XL10-Gold ultracompetent大肠杆菌菌株(Agilent Technologies)用于制备质粒(pACYC177)(New England Biolabs)，所述质粒(pACYC177)用于构建各工程化的嵌合肠道病毒的感染性cDNA克隆。限制性酶BamHI和AatII(New England Biolabs)用于将EV71:TLLβP20的近端和远端片段克隆入pACYC177质粒中的位点特异性消化，随后将其分别用于构建EV71:eTLLβ的感染性cDNA克隆。限制性酶对ClaI和XmaI(New England Biolabs)用于PCR扩增的EV71基因型C5的P1遗传区进入pACYC177质粒的位点特异性消化。限制性酶对NheI和XhoI(New England Biolabs)用于PCR扩增的CA16的P1遗传区进入pACYC177质粒的位点特异性消化。限制性酶对MluI和EagI(NewEngland Biolabs)用于来自携带各自的插入物的pACYC177质粒的C5和CA16的P1遗传区的位点特异性消化，用于随后克隆入携带EV71:eTLLβ的全长cDNA基因组的pACYC177质粒以产生各自的嵌合病毒。
DNA片段的所有连接均利用T4DNA连接酶(Fermentas)进行。位点定向诱变(SDM)利用iProof高保真DNA聚合酶(Bio-Rad)进行。SDM之后，进行DpnI消化之前利用离心柱(Geneaid Biotech,Taiwan)纯化PCR反应。通过用40U DpnI(New England Biolabs)酶处理，在37℃下温育6小时然后在80℃下灭活20分钟，去除甲基化的质粒。然后利用离心柱(Geneaid Biotech,Taiwan)纯化反应产物并转化入XL10-Gold ultracompetent大肠杆菌细胞。将转化的细菌细胞平板接种于包含100ug/ml氨苄西林和35ug/ml卡那霉素的LB平板上以筛选并选择在SDM位点具有所需要的变化的克隆。QIAGEN质粒Maxi试剂盒(Qiagen,Germany)用来从所选克隆大量提取质粒。利用BigDye Terminator v3.0循环测序反应试剂盒(Applied Biosystems,USA)进行DNA测序，并且利用BioEdit程序分析结果(56,57)。
RNA提取、RT-PCR和测序的一般分子方法：利用QIAamp病毒RNA Mini试剂盒(Qiagen,Germany)从分别用EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5或TLLeCA16感染的Vero细胞的培养上清液提取病毒RNA。利用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)以及随机六聚体或各自的下游特异性引物通过逆转录进行第一链cDNA合成。第一链cDNA随后用作模板用于病毒基因组的靶片段的PCR扩增，利用GoTaq Green PCR混合物(Promega,USA)和各自的特异性引物对。将产生的扩增片段直接测序或克隆入保持质粒载体pZErOTM-2，并且利用BigDyeTerminator测序试剂盒(Applied Biosystems,USA)将纯化质粒中的插入物测序。进行5’-RACE以确定病毒基因组的5’-端(非翻译区)的核苷酸序列，利用引物Race-2R来合成单链cDNA。将单链cDNA酚-氯仿提取，纯化并连接至寡核苷酸RACE-DT88，3'端cordecypin阻断的接头(58)。利用与寡核苷酸RACE-DT88互补的引物RACE-DT89和引物Race-3R扩增连接的产物。还利用引物对EV71-19F和oligo-(dT)15进行3’-RACE以确定3’-UTR病毒序列。将PCR扩增的产物克隆入pZErOTM-2载体(Invitrogen)并转化入大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen)。利用BigDyeTerminator测序试剂盒(Applied Biosystems,USA)将提取质粒内的插入物测序。
携带病毒基因组的全长cDNA插入物的质粒的转染：利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)进行携带各工程化/嵌合病毒的全长cDNA基因组的质粒的转染。将由转染试剂、携带各工程化/嵌合病毒(EV71:eTLLβ、EV71:TLLeC5或TLLeCA16)的病毒基因组的全长cDNA的质粒以及表达T7聚合酶的质粒组成的混合物转移至24-孔板中新鲜接种的Vero细胞上。在37℃下温育5小时之后，去除混合物，并且将细胞用无菌PBS洗涤两次。最后一次洗涤之后，用1％DMEM替换并且在28℃下于5％二氧化碳的环境中温育。温育10天之后，将24-孔板的孔中的细胞和上清液转移至6-孔板上新鲜接种的新Vero细胞上。只要接种的Vero细胞达到完全的细胞病变效应(CPE)，随后将包含病毒的培养上清液转移至T25烧瓶中培养的新鲜接种的Vero细胞上。
引物：本文所述实施例中使用的引物在表1-4中示出。
表1、常用于运行病毒毒株eTLLβP20、EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16的PCR和测序工作的引物
表2、用于运行涉及病毒：eTLLβ、EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16的P1区的PCR和测序工作的引物
表3、在测序EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16的5’和3’末端序列中常用来运行5’RACE和3’RACE的引物
表4、用于构建EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16的感染性cDNA克隆的引物
注意：黑体和下划线的字母表示限制性酶位点。斜体和下划线的字母表示另一限制性酶位点。斜体的字母表示T7RNA聚合物序列。黄色高亮的字母(浅色高亮)表示位置中的核苷酸变化以提供限制性位点。绿色高亮的字母(深色高亮)表示导致氨基酸变化的位置中的核苷酸变化。
实施例3、EV71:eTLLβP20的感染性cDNA克隆的构建
RNA提取和cDNA合成：利用QIAamp病毒RNA Mini试剂盒(Qiagen,Germany)并根据制造商的说明书进行提取病毒RNA(EV71:TLLβP20)。利用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)进行单链cDNA合成。简单地说，将5ug提取的RNA、100pmol特异性引物(用于产生5’-近端片段的EV71-9R_2011B或用于产生3’-远端片段的ACYC-TLLb-D-R)和5ul的10mMdNTP混合物添加至不含核酸酶的水中，将反应体积调整至60ul。将反应混合物在65℃下温育10min，并且在冰(4℃)中急冷(quench)5min。随后，将20ul的5X第一链缓冲液、10ul的0.1M DTT和5ul的RNase抑制剂(40U/ul)添加至反应混合物中，并且允许在42℃下温育5min。之后，添加5ul的SuperScript II RT(200U/ul)，并且将所得的混合物在46℃下温育30min，然后在50℃下再温育30min。通过将反应混合物在72℃下温育15min来停止反应。然后通过添加6.5ul的RNaseH(1.5U/ul)并在37℃下温育25min来去除与cDNA链互补的RNA。利用标准酚-氯仿提取方案提取并纯化合成的单链cDNA。
用于构建病毒基因组的全长cDNA拷贝的片段的PCR扩增：通过以两个片段RT-PCR扩增病毒RNA基因组，然后将病毒基因组的近端(5’)cDNA片段(约3500bp)连接至其扩增的远端(3’)cDNA片段(约4000bp)，产生约7500bp的病毒基因组(EV71:eTLLβP20)的全长cDNA拷贝。引物对ACYC-TLLb-Pf-F(正向引物)和ACYC-TLLb-Pf-R(反向引物)用来通过PCR扩增单链cDNA产生近端片段，所述单链cDNA是通过利用引物EV71-9R_2011B逆转录病毒基因组合成的。引物对ACYC-TLLb-D-F(正向引物)和ACYC-TLLb-D-R(反向引物)用来通过PCR扩增单链cDNA产生远端(3’)片段，所述单链cDNA是利用引物ACYC-TLLb-D-R合成的。利用iProof高保真预混液(Bio-Rad)进行PCR反应，98℃的初始变性温度2min，然后98℃10sec、65℃30sec和72℃2min的10个循环，随后再继续98℃10sec和72℃2.5min的35个循环，以及72℃的最后延伸5min。如国际专利申请号PCT/SG2013/000027中公开的EV71:TLLβP20的核苷酸序列在SEQ ID NO:83中示出。
将EV71:TLLβP20的近端和远端片段克隆至pACYC177：将PCR产生的近端和远端片段分别用限制性酶BamHI和AatI消化并克隆入用同一组限制性酶相似消化的质粒pACYC177中。简单地说，通过在37℃下温育2hr将4ug的pACYC177(其具有BamHI和AatII的独特切割位点)以及约1ug的近端和远端PCR产物分别用50U的BamHI和AatII双消化，然后在65℃下灭活30min。将消化的DNA片段分别凝胶纯化。然后利用5U T4DNA连接酶(Fermentas)在20ul反应混合物中将消化的PCR产物连接至消化的pACYC177，将反应混合物在22℃下温育1hr，之后在70℃下灭活5min。然后，通过在100ul反应液中电穿孔，之后在400ul的SOC培养基中于30℃下温育2hr，将十微升(10ul)的连接混合物转化入XL10电转感受态大肠杆菌细胞。之后，将150ul电转化的细胞平板接种至包含100ug/ml氨苄西林和35ug/ml卡那霉素的LB平板上。然后筛选阳性克隆中正确插入物的存在并选择用于制备大量质粒。常规进行测序以确认成功连接至载体的插入物的全长序列。将携带EV71:TLLβP20基因组的近端和远端部分的cDNA拷贝的pACYC177质粒分别命名为pACYC177(TLLβP20proximal)和pACYC177(TLLβP20distal)。
pACYC177(TLLβP20proximal)的位点定向诱变(SDM)：在包含病毒基因组的近端片段的质粒上进行基于PCR的位点定向诱变以引入位于VP4基因区的5'端的独特限制性酶(MluI)识别位点。产生MluI和EagI限制性酶切割位点以促进随后克隆柯萨奇病毒A16或肠道病毒71基因型C5的P1区，用于产生各嵌合病毒。利用包含引物SDM-pACYC-Pf-F和SDM-pACYC-Pf-R连同100ng质粒的iProof高保真DNA聚合酶(Bio-Rad)进行反应。98℃的初始变性2min之后，反应进行98℃10sec、65℃30sec和72℃4min的35个循环，然后72℃的最后延伸5min。然后通过用40UDpnI(New England Biolabs)在37℃下处理2hr然后在80℃下灭活20min来去除甲基化的质粒。然后将反应混合物离心柱纯化并通过电穿孔转化入XL10电转感受态大肠杆菌细胞，并且如上文所述回收转化的大肠杆菌细胞。随后进行筛选以选择在SDM位点具有所需要的核苷酸变化的克隆。QIAGEN质粒maxi试剂盒(Qiagen,Germany)用来从这些选择的具有所需要的核苷酸变化的克隆提取大量质粒。
EV71:eTLLβP20的全长感染性cDNA克隆的构建：将包含近端和远端片段的质粒分别用40U的限制性酶BamHI和EagI(New England Biolabs)消化并凝胶纯化，然后利用离心柱提取。通过使用2U的T4DNA连接酶(Fermentas)将“游离的”具有所需要的SDM位点的近端片段连接至消化的携带EV71:TLLβP20的远端片段的质粒pACYC177(TLLβP20distal)。将连接的质粒转化入XL10电转感受态大肠杆菌细胞，平板接种至100ug/ml氨苄西林和35ug/ml卡那霉素LB平板上，并且在30℃下温育。然后筛选并选择菌落用于大量制备包含病毒基因组的全长cDNA拷贝的质粒。利用整套TLLbP20引物进行测序以确认将具有工程化的限制性酶(MluI和EagI)位点的EV71:TLLβP20的全长基因组(命名为EV71:eTLLβP20)成功克隆入载体。将携带修改的EV71:TLLβP20的全长cDNA拷贝的pACYC177质粒命名为pACYC177(EV71:eTLLβP20)。EV71:eTLLβP20的核苷酸序列在SEQID NO:84中示出。
回收工程化的EV71:eTLLβP20病毒：利用包含1:2比例的总计800ngpACYC177(EV71:eTLLβ)质粒和T7聚合酶质粒的Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)在24孔板中3x 104个细胞/孔的接种密度的过夜接种的Vero-81细胞上进行转染。简单地说，将混合物与OPTI-MEM中稀释的2ulLipofectamine在室温下温育20分钟。之后，将混合物复合物添加至细胞上，并且在37℃下温育5hr。然后去除混合物复合物，将细胞洗涤并用1％DMEM替换，并且在28℃下温育。感染后10天之后，将细胞和上清液转移至6-孔板上接种的新鲜Vero细胞上。当达到完全细胞病变效应时，随后将细胞和上清液转移至T25烧瓶中培养的新鲜Vero细胞上。将病毒在28℃下温育的Vero细胞中进一步传代20世代(EV71:eTLLβP20)以确认其遗传和表型稳定性。
实施例4、嵌合病毒EV71:TLLeC5的感染性全长cDNA克隆的构建
病毒和RNA：使属于基因型C5的肠道病毒71毒株(EV71:C5)(C5/3437/SIN-06)在Vero细胞中进行15世代，所述Vero细胞在补充了1％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中于30℃的温育温度下在包含5％CO2的加湿环境中生长。利用QIAamp病毒RNAMini试剂盒(Qiagen,Germany)并根据制造商的说明书进行提取病毒RNA。
衣壳蛋白基因(P1)的PCR扩增：利用引物pACYC-C5-P1-F和pACYC-C5-P1-R RT-PCR扩增EV71基因型C5的整个衣壳蛋白基因(P1)区。包含工程化的ClaI和MluI限制性酶识别序列的pACYC-C5-P1-F引物以及包含工程化的XmaI和EagI限制性酶识别序列的引物pACYC-C5-P1-R用来促进EV71基因型C5的衣壳蛋白基因最初克隆入pACYC177载体和随后克隆入EV71:eTLLβP20的全长cDNA克隆。利用iProof高保真预混液(Bio-Rad)进行这个2.6kbp衣壳蛋白基因(P1)区的扩增。未修改的EV71C5的P1基因的核苷酸序列在SEQ ID NO:85中示出。
将C5-P1片段消化并克隆入pACYC177：将pACYC177和C5RT-PCR扩增的产物分别用20U ClaI和XmaI在37℃下消化2小时。通过将反应混合物在65℃下灭活20分钟来终止酶促反应。凝胶纯化消化的pACYC177。进行离心柱纯化以便在用限制性核酸内切酶消化之后获得包含突出的“粘性末端”的C5-P1PCR扩增产物。然后在20ul反应混合物中通过2U T4DNA连接酶(Fermentas)将纯化的C5DNA连接至消化的pACYC177，将反应混合物在22℃下温育1hr，随后在70℃下灭活5min。通过电穿孔将10微升纯化的携带C5-P1DNA的pACYC177(现在命名为pACYC177(C5-P1))转化入XL10电转感受态大肠杆菌细胞，并且如上文所述回收转化的大肠杆菌细胞。然后筛选并选择携带具有正确插入物的质粒的阳性克隆用于制备大量质粒。还进行测序以确认将全长插入物成功克隆入载体。
位点定向诱变EV71:C5P1基因：在携带C5的P1区的质粒上进行位点定向诱变以将第858个氨基酸从丙氨酸改变为苏氨酸。利用引物pACYC-C5P1-TITTL-F和pACYC-C5P1-TITTL-R连同50ng的质粒pACYC177(C5-P1)进行PCR位点定向诱变。利用iProof高保真DNA聚合酶(Bio-Rad)进行反应，98℃的初始变性2min，然后98℃10sec、66℃30sec和72℃4min的15个循环，继续98℃10sec、69℃30sec和72℃4min的35个循环，以及72℃的最后延伸5min。然后在进行DpnI消化之前离心柱纯化PCR反应。通过40U DpnI(New England Biolabs)，在37℃下温育6hr然后在80℃下灭活20min，去除甲基化的质粒。然后如上文所述将反应混合物离心柱纯化并转化入XL10电转感受态大肠杆菌细胞。进行筛选以选择具有所需要的SDM位点的克隆。QIAGEN质粒Maxi试剂盒(Qiagen,Germany)用来从这些克隆提取大量质粒。在位点定向诱变携带所需要的核苷酸变化的质粒命名为pACYC177(eC5-P1)。
EV71:TLLeC5的感染性全长cDNA克隆的构建：将纯化的质粒pACYC177(EV71:eTLLβP20)和pACYC177(eC5-P1)分别用20U MluI和EagI消化，在37℃下温育6小时，然后在65℃下灭活30分钟以终止消化。凝胶纯化消化的产物。在20ul反应混合物中利用2U T4DNA连接酶(Fermentas)将源自pACYC177(eC5-P1)的包含eC5的P1区的消化片段连接至没有原始P1区的消化的pACYC177(EV71:eTLLβP20)，将反应混合物在22℃下温育1hr，然后在70℃下灭活5min。通过在100ul反应液中电穿孔，之后在400ul的SOC培养基中于30℃下温育2hr，将连接产物转化入XL10电转感受态大肠杆菌细胞。之后，将150ul电转化的细胞平板接种至包含100ug/ml氨苄西林和35ug/ml卡那霉素的LB平板上。筛选阳性克隆并且随后相应进行全基因组测序。将携带全长cDNA基因组的质粒pACYC177命名为pACYC177(EV71:TLLeC5)。EV71:TLLeC5的核苷酸序列在SEQ ID NO:86中示出。
回收工程化的嵌合EV71:TLLeC5病毒：通过如前面对回收工程化的EV71:eTLLβP20病毒描述的相似实验室方法，通过在Vero细胞上转染pACYC177(EV71:TLLeC5)质粒来回收工程化的嵌合EV71:TLLeC5病毒。将病毒在28℃下温育的Vero细胞中进一步传代20世代以确认其遗传和表型稳定性。
实施例5、嵌合病毒TLLeCA16的感染性全长cDNA克隆的构建
CA16的衣壳蛋白基因(P1)(CA16-P1)的PCR扩增：以如对EV71基因型C5的RNA提取描述的相似方式提取CA16病毒RNA。利用引物pACYC-CA16P1-F和pACYC-CA16-P1-R进行CA16的P1(衣壳蛋白基因)区的扩增。包含工程化的NheI和MluI限制性酶识别序列的ThepACYC-CA16-P1-F引物以及包含工程化的XhoI和EagI限制性酶识别序列的引物pACYC-CA16-P1-R用来促进CA16的衣壳蛋白基因克隆入pACYC177载体和随后克隆入EV71:eTLLβP20“骨架”的全长cDNA。利用iProof高保真预混液(Bio-Rad)进行这个2.6kbp衣壳蛋白基因(P1)区的扩增。未修改的CA16的P1基因的核苷酸序列在SEQ ID NO:87中示出。
将PCR扩增的片段CA16-P1区克隆入pACYC177：将pACYC177和CA16-P1区的PCR扩增产物分别用50U NheI和XhoI在37℃的反应温度下消化2小时。将酶促反应在65℃灭活30分钟。将消化的pACYC177和CA16-P1凝胶纯化。然后在20ul反应混合物中利用5U T4DNA连接酶(Fermentas)将限制性核酸内切酶(RE)消化的CA16-P1DNA连接至消化的pACYC177，将反应混合物在22℃下温育1hr，随后在70℃下灭活5min。通过电穿孔将10微升纯化的携带CA16-P1DNA的pACYC177(现在命名为pACYC177(CA16-P1))转化入XL10电转感受态大肠杆菌细胞，并且如上文所述回收转化的大肠杆菌细胞。
位点定向诱变CA16P1基因：在携带CA16的P1区的质粒上进行位点定向诱变以将第858个氨基酸从赖氨酸改变为苏氨酸。将引物pACYC-CA16P1-TITTL-F和pACYC-CA16P1-TITTL-R与50ng的质粒pACYC177(CA16-P1)一起运行，利用iProof高保真DNA聚合酶(Bio-Rad)，98℃的初始变性2min，然后98℃10sec、66℃30sec和72℃4min的15个循环，继续98℃10sec、69℃30sec和72℃4min的35个循环，以及72℃的最后延伸5min。然后在进行DpnI消化之前离心柱纯化PCR反应。通过40U DpnI(New England Biolabs)，在37℃下温育6hr然后在80℃下灭活20min，去除甲基化的质粒。然后如上文所述将反应混合物离心柱纯化并转化入XL10电转感受态大肠杆菌细胞。进行筛选以选择具有所需要的SDM位点的克隆。QIAGEN质粒Maxi试剂盒(Qiagen,Germany)用来从这些克隆提取大量质粒。在位点定向诱变携带所需要的核苷酸变化的质粒命名为pACYC177(eCA16-P1)。
TLLeCA16的感染性全长cDNA克隆的构建：将纯化的质粒pACYC177(EV71:eTLLβP20)和pACYC177(eCA16-P1)分别用20U MluI和EagI消化，在37℃下温育6小时。之后，通过在65℃下灭活30分钟来终止消化。凝胶纯化消化的产物。在20ul反应混合物中利用2UT4DNA连接酶(Fermentas)将源自pACYC177(eCA16-P1)的包含CA16的P1区的消化片段连接至没有原始P1区的消化的pACYC177(EV71:eTLLβP20)。将反应混合物在22℃下温育1hr，然后在70℃下灭活5min。通过在100ul反应液中电穿孔，之后在400ul的SOC培养基中于30℃下温育2hr，将连接产物转化入XL10电转感受态大肠杆菌细胞。之后，将150ul电转化的细胞平板接种至包含100ug/ml氨苄西林和35ug/ml卡那霉素的LB平板上。筛选阳性克隆并且随后相应进行全基因组测序。将携带感染性全长cDNA基因组的质粒pACYC177命名为pACYC177(TLLeCA16)。TLLeCA16的核苷酸序列在SEQ ID NO:88中示出。
回收工程化的嵌合TLLeCA16病毒：通过如前面对利用Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen)转染来回收工程化的EV71:eTLLβP20描述的相似实验室方法，通过将pACYC177(TLLeCA16)质粒转染入Vero细胞来回收工程化的嵌合TLLeCA16病毒。将病毒在28℃下温育的Vero细胞中进一步传代20世代以确认其遗传和表型稳定性。
实施例6、EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16的cDNA拷贝和回收的病毒
pACYC177(EV71:eTLLβP20)质粒携带EV71:eTLLβP20的完整基因组的感染性cDNA拷贝。通过如前所述在Vero细胞中转染pACYC177(EV71:eTLLβ)质粒来回收病毒毒株。随后将回收的病毒在28℃下温育的Vero细胞中另外传代20世代(EV71:eTLLβP20)以确认其遗传和表型稳定性。
pACYC177(EV71:TLLeC5)质粒携带EV71:TLLeC5的完整基因组的感染性cDNA拷贝。通过如前面对回收工程化的EV71:eTLLβ病毒描述的相似实验室方法，通过将pACYC177(EV71:TLLeC5)质粒转染入Vero细胞来回收工程化的嵌合EV71:TLLeC5病毒。将回收的病毒在28℃下温育的Vero细胞中相似地另外传代20世代以确认其遗传和表型稳定性。
pACYC177(TLLeCA16)质粒携带TLLeCA16的完整基因组的感染性cDNA拷贝。通过如前面对利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)回收工程化的EV71:eTLLβ描述的相似实验室方法，通过将pACYC177(TLLeCA16)质粒转染入Vero细胞来回收工程化的嵌合TLLeCA16病毒。将回收的病毒在28℃下温育的Vero细胞中相似地另外传代20世代以确认其遗传和表型稳定性。
实施例7、工程化的肠道病毒的基因组结构
代表工程化的稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒(EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16)的基因组结构和各自编码的蛋白的示意图在图1、2和3中示出。示意性地，EV71:eTLLβP20的各基因组结构和编码的蛋白与EV71:TLLβP20没有不同，除了在核苷酸水平，其中将两个特异性限制性核酸内切酶(MluI和EagI)序列(ACGCGT和CGGCCG)工程化入基因组，一个在蛋白编码基因区开始处周围的VP4基因序列中(nt 770-775)，而另一个在VP1和2A基因连接处周围的2A基因序列中(nt 3341-3346)。在引入的MluI位点(ACGCGT)处的核苷酸变化(小写字母，gCGatc)导致氨基酸变化(丝氨酸>缬氨酸，S10V)，而在引入的EagI位点(CGGCCG)处的核苷酸变化(小写字母，tGGCCa)导致在病毒多聚蛋白的氨基酸位置867处的氨基酸变化(谷氨酰胺>精氨酸，Q867R)。EV71:TLLeC5和TLLeCA16在两个引入的特异性限制性核酸内切酶(MluI和EagI)位点处保留与EV71:eTLLβP20相同的核苷酸序列。此外，如图2和3中的不同模式图(分别为虚线条和垂直线条)所示，EV71:TLLeC5的衣壳蛋白基因(P1)区的核苷酸序列整个源自属于基因型C5的EV71分离株的基因组的等同区域，而TLLeCA16的衣壳蛋白基因(P1)区的核苷酸序列源自柯萨奇病毒A16(基因群B，谱系2)的等同核苷酸序列。
实施例8、工程化的肠道病毒的遗传变化
将在28℃下温育的Vero细胞中20世代之后的遗传工程化的稳定的冷适应的温度敏感性肠道病毒(EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16)的完整基因组完全测序，并且在各基因中它们各自与原始来源基因组序列(EV71:TLLβP20除了P1区，其用EV71基因型C5和CA16各自的P1区代替)的核苷酸和氨基酸差异在表5、6和7中示出。黑体和括号内的编号是由于为了特定目的有意引入的变化。EV71:eTLLβP20的基因组与其原始基因组来源序列具有9个核苷酸差异(有意引入6个以产生特异性限制性核酸内切酶的位点)，并且导致3个氨基酸变化(引入2个)(表5)。不导致氨基酸变化的EV71:eTLLβP20基因组中的一个自发突变(A 2966G)发生在VP1基因中。导致氨基酸变化(丝氨酸>亮氨酸，S3L)的另外2个自发突变(C 754T,C 3362A)发生在VP4基因中。
表5、与EV71:TLLβP20的基因组相比，在EV71:eTLLP20的每个基因组区段中发生的核苷酸(NT)和相应的氨基酸(AA)突变的数量
*黑体和括号内的图数字是这样的变化，其是有意引入突变。
表6、与EV71:TLLβP20的基因组相比，EV71:TLLeC5的每个基因组区段中发生的核苷酸(NT)和相应的氨基酸(AA)突变的数量(除了P1区，其相对于EV71基因型C5的原始P1区进行比较)
*黑体和括号内的图数字是这样的变化，其是有意引入突变。
表7、与EV71:TLLβP20的基因组相比，TLLeCA16的每个基因组区段中发生的核苷酸(NT)和相应的氨基酸(AA)突变的数量(除了P1区，其相对亲代柯萨奇病毒CA16的原始P1区进行比较)
*黑体和括号内的图数字是这样的变化，其是有意引入突变。
EV71:TLLeC5的基因组与其原始基因组来源序列的不同之处在于8个核苷酸和5个氨基酸(表6)。其中，仅2个核苷酸(C 3362A,A 5044T)和1个氨基酸(天冬酰胺>异亮氨酸，N1433I)是由于自发突变。TLLeCA16的基因组与其原始基因组来源序列的不同之处在于14个核苷酸和5个氨基酸(表7)。其中，7个核苷酸是由于自发突变，导致氨基酸的3个变化。导致从苏氨酸至丙氨酸的氨基酸变化(T156A)的一个自发核苷酸突变(A 1212G)发生在VP2基因中。导致从丙氨酸至缬氨酸的氨基酸变化(A465V)的两个自发突变(C 2140T、G 2405A)发生在VP3基因中。发生在VP1基因中的两个自发突变(T 3341C、G 3344C)未导致任何氨基酸变化。但是，发生在2A基因中的两个自发突变(C 3362T、C 3424G)导致从丝氨酸至半胱氨酸的氨基酸变化(S893C)。
实施例9、工程化的肠道病毒的表型特征
遗传修饰(EV71:eTLLβP20)和工程化的嵌合(EV71:TLLeC5和TLLeCA16)肠道病毒保留如它们的原始亲代病毒毒株(EV71:TLLβP20)的在Vero细胞中的冷适应的温度敏感性生长特征。所有病毒毒株均证实与在37℃下温育的细胞相比，在28℃下温育的Vero细胞中更高效的复制(感染的细胞以更快速度获得完全CPE并且在培养上清液中产生更高病毒滴度)。如培养10天之后在接种的细胞中不存在CPE和病毒抗原的阴性检测所示，与它们的原始亲代病毒相似，所有毒株均不能在39.5℃下温育的Vero细胞中复制。通过将各自所得的培养上清液盲传入在28℃、37℃和39.5℃下温育的Vero细胞的新鲜培养物之后在接种的细胞中没有CPE和病毒抗原的阴性检测证实培养上清液中不存在病毒子代。
28℃和37℃的温育温度用来评价这3种遗传工程化的冷适应的毒株的病毒复制特征，并且测定重复至少4次。在28℃的温育温度下温育的Vero细胞中20世代之后，EV71:eTLLβP20在28℃和37℃下温育的培养Vero细胞单层中分别用3和7天诱导完全CPE。当滴定的培养物在28℃和37℃下温育时，EV71:eTLLβP20的滴度分别为2.15X107CCID50/ml和4.64X106CCID50/ml(表8)。EV71:TLLeC5在28℃和37℃下温育的培养Vero细胞单层中也分别用3和7天诱导完全CPE。EV71:TLLeC5在28℃的温育温度下于感染的Vero细胞培养上清液中达到2.15X108CCID50/ml的病毒滴度，并且在37℃下达到2.15X107CCID50/ml的滴度(表9)。
TLLeCA16在28℃和37℃下温育的培养Vero细胞单层中分别用3和4天诱导完全CPE。TLLeCA16在28℃的温育温度下获得4.64X107CCID50/ml的病毒滴度，并且在37℃下获得2.15X106CCID50/ml的滴度(表10)。总的来说，对于在28℃下温育的接种的Vero细胞，全部3种遗传工程化的冷适应的毒株用较少天数引起完全细胞死亡，并且在培养上清液中达到高约一个对数的病毒滴度。
表8、在37℃下温育的Vero细胞中6次连续传代之后从EV71:eTLLβP20的冷适应的温度敏感性表型回复的评价*
*在28℃、37℃和39.5℃的温育温度下的Vero细胞中培养或滴定每个世代的病毒的生长特征和滴度。
P1：世代1，IFA：间接免疫荧光测定。在这个上下文中CPE指细胞死亡。表9、在37℃下温育的Vero细胞中6次连续传代之后从EV71:TLLeC5的冷适应的温度敏感性表型回复的评价*
*在28℃、37℃和39.5℃的温育温度下的Vero细胞中培养或滴定每个世代的病毒的生长特征和滴度。
P1：世代1，IFA：间接免疫荧光测定。在这个上下文中CPE指细胞死亡。
表10、在37℃下温育的Vero细胞中6次连续传代之后从TLLeC5A16的冷适应的温度敏感性表型回复的评价*
*在28℃、37℃和39.5℃的温育温度下的Vero细胞中培养或滴定每个世代的病毒的生长特征和滴度。
P1：世代1，IFA：间接免疫荧光测定。在这个上下文中CPE指细胞死亡。实施例10、温度依赖性生长敏感性回复的研究
通过将这3种遗传工程化的冷适应的温度敏感性毒株在37℃下温育的Vero细胞中6次连续传代进行对基于温度依赖性生长敏感性的病毒表型特征回复的评价。接种的细胞一达到完全CPE就将37℃下的每个连续世代的澄清的培养上清液重新接种入Vero细胞的新鲜培养物。在28℃、37℃和39.5℃的温育温度下细胞死亡和病毒滴度的动力学方面，源自各自每个世代的病毒毒株在37℃下温育的Vero细胞中的生长特征在表8、9和10中示出。EV71:eTLLβP20在37℃下温育的细胞中3次连续传代之后不能在39.5℃的温育温度下的Vero细胞中产生活的感染性颗粒(缺少阳性免疫荧光染色的细胞)。EV71:TLLeC5在37℃下温育的细胞中3次连续传代之后也不能在39.5℃的温育温度下的Vero细胞中产生活的感染性颗粒。
TLLeCA16在37℃下温育的细胞中2次连续传代之后不能在39.5℃的温育温度下的Vero细胞中产生活的感染性颗粒(缺少阳性免疫荧光染色的细胞)。
实施例11、温度回复测定中EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16基因组中的突变
在37℃下温育的Vero细胞中6次连续传代之后将第3和6世代的EV71:eTLLβP20、EV71:TLLeC5和TLLeCA16的完整基因组测序并分析遗传突变。作为在37℃的温育温度下的Vero细胞中6次连续传代的结果，第3和6世代的EV71:eTLLβP20和EV71:TLLeC5的各自每个基因区段的核苷酸和相应氨基酸突变的数量在表11和12中示出。在第3代，发生在病毒2A基因中的核苷酸位置3346处的回复突变至其野生型病毒基因组序列(G 3346 A)导致在EV71:eTLLβP20多聚蛋白的氨基酸位置867处氨基酸从精氨酸改变为谷氨酰胺(R867Q)。在第6代的EV71:eTLLβP20中保持了至其野生型基因组序列的相同回复突变。此外，导致5个氨基酸的缺失和氨基酸天冬酰胺至组氨酸的变化(N667H)的15个核苷酸的缺失发生在第6代测序的约58％(7/12)的EV71:eTLLβP20基因组的VP1基因中(表11)。有趣的是，发生在病毒2A基因中的核苷酸位置3346处的相同回复突变至其野生型病毒基因组序列(G 3346 A)导致在EV71:eTLLβP20多聚蛋白中注明的氨基酸位置867处氨基酸从精氨酸改变为谷氨酰胺(R867Q)，在第3和6代也发生在EV71:TLLeC5的共有基因组序列中。除了回复突变，在温度回复研究中，在第3和6代EV71:TLLeC5的基因组序列在病毒2C基因中具有自发突变(C4566T)，导致氨基酸从组氨酸改变为赖氨酸(H1274Y)。在第3和6代，在TLLeCA16的共有基因组序列中未检测到突变，虽然在测序其完整基因组时核苷酸鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A)的混合群体出现在核苷酸位置1212。将PCR扩增的包含核苷酸序列混合群体的产物克隆入质粒pZErOTM-2并转化入大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen)。筛选大肠杆菌的23个所选菌落的质粒的突变。23个菌落中的13个保留鸟嘌呤残基，而10个具有质粒的菌落携带腺嘌呤残基，但是核苷酸突变未导致病毒共有基因组的任何氨基酸变化。
表11、与EV71:eTLLβP20的基因组相比，在源自温度敏感性回复研究的病毒毒株的每个基因组区段中发生的核苷酸(NT)和相应的氨基酸(AA)突变的数量
表12、与EV71:TLLeC5的基因组相比，在源自温度敏感性回复研究的病毒毒株的每个基因组区段中发生的核苷酸(NT)和相应的氨基酸(AA)突变的数量
除非本文另有说明或显然违背上下文，在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个(a)”和“一个(an)”和“这个”以及相似指称的使用应当理解为覆盖单数和复数。除非另有说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当理解为开放性术语(即，表示“包括但不限于”)。除非本文中另有说明，本文中值的范围的列举仅是为了用作单独指范围内的每个不同值的简略方法，并且每个不同值如其在本文中单独列举一样并入本说明书。例如，如果公开范围10-15，则还公开11、12、13和14。除非本文另有说明或其他地方显然违背上下文，本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外要求保护，本文提供的任何和所有实例或者示例性语言(例如，“如”)的使用仅为了更好地说明本发明，并不对本发明的范围构成限制。本说明书中没有语言应当理解为说明对于本发明的实施必要的任何未要求保护的元素。
应当理解本发明的方法和组合物可以以各种实施方案的形式并入，本文仅公开了一些。本文描述了本发明的实施方案，包括发明人已知的进行本发明的最佳模式。在阅读前面的描述时，那些实施方案的变化对于本领域技术人员可以变得显而易见。发明人希望技术人员适当采用这类变化，并且发明人计划不像本文具体描述地实施本发明。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中列举的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或其他地方显然违背上下文，本发明涵盖其所有可能的变化中的上述元素的任何组合。
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gacacagagg acattgagca aacagc 26
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 60
tttctcaaag gccttgggat ccatgcc 27
<210> 61
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 61
tgatggttat cccaccttyg gwgagc 26
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 62
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<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 63
gaagagaagg tggaaatggc gttttgg 27
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> oligonucleotide primer
<400> 65
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
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tttttttttt ttttt 15
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 68
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> oligonucleotide primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> oligonucleotide primer
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<211> 62
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<213> Artificial Sequence
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<223> oligonucleotide primer
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gatcgacgtc tttttttttt tttttttttt tttttgctat tctggtaata acaaatttac 60
cc 62
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<223> oligonucleotide primer
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<213> Enterovirus 71, strain EV71:TLLeC5
<400> 86
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ccgatgaaca atttccattc cttatccacc ctaccatgcc aatgaaagaa atccacgagt 7140
ccatacggtg gaccaaggac gcgcgaaata cccaagatca cgtgcggtcc ttgtgccttc 7200
tggcatggca caatggtaaa caggaatatg aaaagtttgt gagcgcaatt agatcagtac 7260
cagtaggaaa agtattggct attccaaatt atgagaatct gagacgcaat tggctcgaac 7320
tattttagag gttaagtata tacctcaacc ccaccaggaa tctggtcgtg aacatgactg 7380
gtgggggtaa atttgttatt accagaatag caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 7437
<210> 87
<211> 2586
<212> DNA
<213> Coxsackievirus A16
<400> 87
atggggtcac aagtctccac tcagcgatcc gggtcacatg agaactcaaa ctctgcatcg 60
gaaggctcga ccataaatta cacaactata aactactaca aggatgcata cgctgcgagt 120
gcagggcgcc aggatatgtc ccaagacccg aagaaattta ccgaccctgt catggacgtt 180
atacatgaga tggctccacc gctcaagtct ccaagcgctg aggcatgtgg ttatagtgat 240
cgtgtggctc aacttaccat tggaaactct accatcacga cacaggaagc agctaacata 300
gttatagcct atggggagtg gcctgagtac tgcccagaca cagatgcaac ggcagtcgac 360
aaacccacac gacccgacgt gtcagtgaac agatttttca cgctagacac taaatcttgg 420
gccaaggatt caaagggatg gtattggaaa ttccctgatg ttttgacaga agtaggtgtt 480
tttggtcaaa acgctcagtt ccactacctg tatcgatctg gattttgcgt gcacgttcag 540
tgtaatgcaa gtaaattcca ccagggcgct ttactggtgg ctgtgctgcc tgagtatgtg 600
ctcggcacta tcgcaggagg gaccggggat gagaatactc atcctcccta cgccactaca 660
cagcctggtc aggttggtgc agtcctgacg cacccttacg tgctagatgc agggatccct 720
ttgagccaat tacctgtgtg cccacatcag tggatcaacc tgagaaccaa taattgtgca 780
accattatag ttccatatat gaacacagtt ccatttgact cagctctcaa ccactgcaat 840
tttggtctac tggtcatccc ggtagtacca ttggatttca atgcaggcgc cacatctgaa 900
attcccatta cagtcaccat agcccccatg tgtgcggaat ttgcgggtct gcgccaggca 960
gtaaagcaag gcataccaac agagcttaaa cctggcacca atcagttcct tactaccgat 1020
gatggtgttt ctgcaccaat tttgccaggt ttccacccaa ctccacctat acacatacca 1080
ggggaagtac acaacctatt ggaaatatgc agagtggaga ccatcttgga ggttaacaac 1140
ctgaagacca atgagaccac ccccatgcag cgcttgtgct ttccagtgtc ggtgcagagc 1200
aaaacgggcg agttatgtgc tgcctttaga gcagaccctg gaagagatgg tccgtggcag 1260
tccacaatac tgggccaact ctgcaggtac tacacccagt ggtcaggttc attggaggtg 1320
acattcatgt ttgcgggctc attcatggct acaggtaaga tgctcatcgc ctacacccca 1380
cctgggggaa atgcgcctgt ggacagaatc acagcaatgc taggaacgca tgtgatctgg 1440
gacttcggat tacagtcttc tgtgacgttg gtcgtgccat ggattagtaa cacacactat 1500
agggcacacg cccgtgctgg gtactttgac tattacacca ctggcattat aaccatatgg 1560
tatcaaacta actatgtagt acccattggt gctcccacta cagcatacat cgtagctttg 1620
gcagcagccc aggacaactt caccatgaaa ctatgcaagg acacagagga cattgagcaa 1680
acagctaata tacaagggga tcctattgca gacatgattg accagactgt gaataatcaa 1740
gtgaaccgct ccttaactgc attgcaagta ctacctacag ctgccaatac tgaagcaagt 1800
agtcacagat taggcactgg tgttgtacca gcactacaag ccgcggagac aggggcgtcg 1860
tcaaatgcta gtgacaagaa tctcattgag actagatgtg tgttgaacca tcactccaca 1920
caggagacag ccattgggaa tttctttagc cgtgccggtt tggttagcat tattacaatg 1980
cccaccacag gtacacagaa cacagatggt tacgttaact ggggcattga tttgatggga 2040
tatgctcaac tgcggcggaa gtgcgagttg tttacctaca tgcgctttga tgctgaattc 2100
acatttgtcg tagccaaacc caatggtgag ctagtccccc aattactgca gtacatgtat 2160
gtcccgccag gggctccgaa acccacttcc agagattcat ttgcctggca aactgctacc 2220
aacccatctg tgtttgtgaa aatgacggac ccaccagctc aagtgtcagt ccccttcatg 2280
tcaccagcca gtgcatacca atggttttat gatggttatc ccaccttcgg agagcatctc 2340
caagcagatg acctagatta tggtcaatgc ccgaataata tgatgggcac ttttagcatt 2400
aggacagtag ggactgagaa gtcaccacac tccatcaccc tgagggtata catgaggatt 2460
aaacacgtca gggcatggat cccaaggcct ttgagaaatc aaccctattt gtttaagacc 2520
aatccaaatt ataaaggaaa tgatattaag tgcactagca ctagtagaga caagataaca 2580
acattg 2586
<210> 88
<211> 7439
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chimeric virus strain TLLeCA16
<400> 88
ttaaaacagc ctgtgggttg cacccactca cagggcccac gtggcgctag cactctgatt 60
ctacggaatc tttgtgcgcc tgttttacaa ccccccccaa tttgcaactt agaagcaata 120
cacaacactg atcaacagca ggcatggcgc accagccatg tcttgatcaa gcacttctgt 180
ttccccggac tgagtatcaa tagactgctc acgcggttga aggagaaagc gtccgttatc 240
cggctaacta cttcgagaaa cctagtagca ccattgaaac tgcggagtgt ttcgctcggc 300
acttcccccg tgtagatcag gtcgatgagt cactgcaatc cccacgggcg accgtggcag 360
tggctgcgct ggcggcctgc ctatggggca acccatagga cgctctaatg tggacatggt 420
gcgaagagtc tattgagcta gttagtagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaac 480
tgcggagcac atgccctcaa cccagagggt agtgtgtcgt aacgggcaac tctgcagcgg 540
aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttcct tttattctta cattggctgc ctatggtgac 600
aatcgcagaa ttgttaccat atagctattg gattggccat ccggtgtgca atagagctat 660
tatataccta tttgttggct ttgtaccatt aaccttaaaa tctataacta ccctcaactt 720
tgtattaact ctcaatacag tcaaacatgg gctcacaagt gtctactcaa cgcgtcgggt 780
cacatgagaa ctcaaactct gcatcggaag gctcgaccat aaattacaca actataaact 840
actacaagga tgcatacgct gcgagtgcag ggcgccagga tatgtcccaa gacccgaaga 900
aatttaccga ccctgtcatg gacgttatac atgagatggc tccaccgctc aagtctccaa 960
gcgctgaggc atgtggttat agtgatcgtg tggctcaact taccattgga aactctacca 1020
tcacgacaca ggaagcagct aacatagtta tagcctatgg ggagtggcct gagtactgcc 1080
cagacacaga tgcaacggca gtcgacaaac ccacacgacc cgacgtgtca gtgaacagat 1140
ttttcacgct agacactaaa tcttgggcca aggattcaaa gggatggtat tggaaattcc 1200
ctgatgtttt ggcagaagta ggtgtttttg gtcaaaacgc tcagttccac tacctgtatc 1260
gatctggatt ttgcgtgcac gttcagtgta atgcaagtaa attccaccag ggcgctttac 1320
tggtggctgt gctgcctgag tatgtgctcg gcactatcgc aggagggacc ggggatgaga 1380
atactcatcc tccctacgcc actacacagc ctggtcaggt tggtgcagtc ctgacgcacc 1440
cttacgtgct agatgcaggg atccctttga gccaattacc tgtgtgccca catcagtgga 1500
tcaacctgag aaccaataat tgtgcaacca ttatagttcc atatatgaac acagttccat 1560
ttgactcagc tctcaaccac tgcaattttg gtctactggt catcccggta gtaccattgg 1620
atttcaatgc aggcgccaca tctgaaattc ccattacagt caccatagcc cccatgtgtg 1680
cggaatttgc gggtctgcgc caggcagtaa agcaaggcat accaacagag cttaaacctg 1740
gcaccaatca gttccttact accgatgatg gtgtttctgc accaattttg ccaggtttcc 1800
acccaactcc acctatacac ataccagggg aagtacacaa cctattggaa atatgcagag 1860
tggagaccat cttggaggtt aacaacctga agaccaatga gaccaccccc atgcagcgct 1920
tgtgctttcc agtgtcggtg cagagcaaaa cgggcgagtt atgtgctgcc tttagagcag 1980
accctggaag agatggtccg tggcagtcca caatactggg ccaactctgc aggtactaca 2040
cccagtggtc aggttcattg gaggtgacat tcatgtttgc gggctcattc atggctacag 2100
gtaagatgct catcgcctac accccacctg ggggaaatgt gcctgtggac agaatcacag 2160
caatgctagg aacgcatgtg atctgggact tcggattaca gtcttctgtg acgttggtcg 2220
tgccatggat tagtaacaca cactataggg cacacgcccg tgctgggtac tttgactatt 2280
acaccactgg cattataacc atatggtatc aaactaacta tgtagtaccc attggtgctc 2340
ccactacagc atacatcgta gctttggcag cagcccagga caacttcacc atgaaactat 2400
gcaaagacac agaggacatt gagcaaacag ctaatataca aggggatcct attgcagaca 2460
tgattgacca gactgtgaat aatcaagtga accgctcctt aactgcattg caagtactac 2520
ctacagctgc caatactgaa gcaagtagtc acagattagg cactggtgtt gtaccagcac 2580
tacaagccgc ggagacaggg gcgtcgtcaa atgctagtga caagaatctc attgagacta 2640
gatgtgtgtt gaaccatcac tccacacagg agacagccat tgggaatttc tttagccgtg 2700
ccggtttggt tagcattatt acaatgccca ccacaggtac acagaacaca gatggttacg 2760
ttaactgggg cattgatttg atgggatatg ctcaactgcg gcggaagtgc gagttgttta 2820
cctacatgcg ctttgatgct gaattcacat ttgtcgtagc caaacccaat ggtgagctag 2880
tcccccaatt actgcagtac atgtatgtcc cgccaggggc tccgaaaccc acttccagag 2940
attcattcgc ctggcaaact gctaccaacc catctgtgtt tgtgaaaatg acggacccac 3000
cagctcaagt gtcagtcccc ttcatgtcac cagccagtgc ataccaatgg ttttatgatg 3060
gttatcccac cttcggagag catctccaag cagatgacct agattatggt caatgcccga 3120
ataatatgat gggcactttt agcattagga cagtagggac tgagaagtca ccacactcca 3180
tcaccctgag ggtatacatg aggattaaac acgtcagggc atggatccca aggcctctga 3240
gaaatcaacc ctatttgttt aagaccaatc caaattataa aggaaatgat attaagtgca 3300
ctagcactag tagagacacg ataacaacat tgggagagtt cggccagcaa tctggggcca 3360
tttacgtggg caacttcaga gtggttaatc gtcacctcgc tactcataat gactgggcga 3420
attgcgtctg ggaggacagc tcccgcgacc tactagtgtc gtctactact gcccagggct 3480
gtgatacaat tgcacgttgt gactgtcaaa caggagtgta ctattgtaac tctaagagaa 3540
agcactatcc agtcagcttc tctaaaccta gcctcactta tgtggaagct agcgagtatt 3600
accctgctag ataccagtct catctcatgc ttgcggcggg tcattctgaa ccaggagatt 3660
gtggtggcat ccttaggtgc cagcacggtg ttgtcggcat tgtgtccact ggtggcaacg 3720
ggcttgttgg ctttgcagat gtcagggatc tcctatggtt ggatgaagaa gcaatggagc 3780
agggtgtgtc cgactacatt aagggacttg gtgatgcgtt tggaactggc ttcaccgatg 3840
cagtttccag agaagttgag gctcttaaga gccaccttat tgggtctgaa ggagttgtcg 3900
agaagatcct aaagaatttg atcaaattaa tctctgcttt agtcatcgtg attaggagtg 3960
attatgacat ggtcactctc acagcaactt tagctctgat agggtgccac ggtagtccct 4020
gggcatggat taaagcaaaa acagcttcca ttctaggcat ccctattgcc cagaagcaaa 4080
gtgcgtcctg gcttaaaaaa tttaacgata tggccaacgc cgccaagggg ttagagtgga 4140
tctccagtaa gattagtaaa ttcatcgatt ggctcaaaga gaaaatcata ccagcggcta 4200
gggagaaggt ggagtttctg aacaacttaa aacagttgcc gttgctggag aatcagatct 4260
caaatctaga gcagtctgct gcttcacaag aaaatctcga agccatgttc ggaaatgtgt 4320
cgtacctagc tcacttctgc cgcaaattcc aaccactgta cgctacagaa gccaaaaggg 4380
tctatgcttt ggagaaaaga atgaacaact acatgcagtt caagagcaaa caccgaattg 4440
aacctgtatg tcttattatt aggggttctc cgggcaccgg gaaatcacta gcaactggca 4500
tcattgctcg ggcaatagca gacaagtatc actcaagtgt gtactcactc ccaccagacc 4560
cggaccactt tgatggatac aaacagcagg tggtcacggt catggatgac ttatgtcaga 4620
accctgacgg caaagatatg tcattgttct gccagatggt gtccacagtg gatttcatcc 4680
caccaatggc ttccctagaa gagaaaggag tttctttcac atctaaattt gtcattgcat 4740
ctactaattc cagcaacatc atagtaccaa cagtgtctga ttctgatgca attcgccgta 4800
ggttctatat ggattgtgat atcgaagtca cggattcata caaaacggac ttgggtaggt 4860
tagatgctgg gcgagccgcc aaattgtgct ctgagaataa cacagcaaat ttcaagcgtt 4920
gtagcccact agtgtgtggg aaggccattc agctgagaga tagaaagtcc aaggtcaggt 4980
acagtgtgga cacggtggtt tctgagctca taagggaata caacaacagg tctgctatcg 5040
gtaacacaat tgaagcacta ttccaaggtc cgcctaagtt taaacccata aggattagtc 5100
ttgaagaaaa gccagcccca gacgccatta gtgaccttct tgctagtgtg gatagcgagg 5160
aggtacgcca gtactgtaga gatcaaggtt ggatcattcc agagactcct acaaatgttg 5220
aacggcacct caacagagct gtgctagtca tgcaatccat cactacagtt gtggcagtcg 5280
tttcactggt gtacgtcatc tacaagctct tcgctggatt ccaaggcgcg tactctggtg 5340
ctcccaagca gatactcaag aaacccgttc tccgcacggc aacagtgcag ggtccaagtc 5400
tcgatttcgc tctgtctcta ctaaggagga atatcaggca agtgcaaaca gatcaaggac 5460
attttaccat gctgggtgtc agggaccgtt tggctgttct tccacgccac tcccagcccg 5520
gcaaaacaat ctgggtagag cacaaactcg taaacattct ggacgctgtt gaactggtgg 5580
atgaacaagg ggtcaatttg gagctaaccc taatcaccct tgacactaat gagaaattca 5640
gagacattac taagttcatc ccggagagca tcagcactgc aagcgatgct accctagtga 5700
tcaacacaga gcacatgccc tcaatgtttg tgccggtggg ggacgttgtg caatatggtt 5760
ttctcaacct tagtggaaag ccaacccacc gtaccatgat gtacaacttt cccaccaagg 5820
cagggcagtg tggaggggtg gtgacatcag ttggaaaggt cattggtata cacataggtg 5880
gtaacggcag acaaggtttc tgtgcgggac ttaagaggag ctatttcgcc agcgagcaag 5940
gagagatcca gtgggtcaag cccaataaag aaactgggag actcaacatc aatgggccaa 6000
ctcgcactaa gctcgaaccc agtgtatttc atgatgtttt tgagggaaac aaggagccag 6060
cagttctaca cagtaaagat ccccgcctcg aggtggattt tgagcaggct ttgttctcca 6120
agtacgtagg gaatacacta tatgagcctg atgattacat taaggaggca gctcttcact 6180
acgcaaatca gttgaaacag ctggacattg acacctccca gatgagcatg gaggaagcct 6240
gttacggcac tgagaacctt gaggccattg atcttcacac tagtgcaggt tacccataca 6300
gtgctctagg aataaagaaa agagacatcc tagattctac tactagggat gtgagcaaga 6360
tgaaatttta tatggacaag tatggcttgg acctacccta ctccacctat gtcaaggatg 6420
agctacgctc gatagataag atcaagaaag ggaagtctcg tttgattgaa gccagcagct 6480
taaatgattc tgtgtacctt aggatgactt ttgggcacct ttatgaaacc ttccatgcaa 6540
accctggaac tgtgaccggt tcagccgtgg gatgcaatcc ggatacattc tggagtaaac 6600
tacccatctt actccctggc tcactctttg ctttcgacta ttcaggatat gatgctagtc 6660
ttagccctgt ctggttcagg gcattagaat tagttcttag ggaaataggc tacagtgagg 6720
aagcagtttc acttgttgag gggatcaatc acacgcacca tgtataccgc aacaaaactt 6780
actgtgtgct tggtggcatg ccctctggtt gctcaggaac atccatattc aattcaatga 6840
tcaataacat tattattaga gcactgctca tcaaaacgtt caagggcatt gatttagacg 6900
agctcaacat ggttgcctat ggggatgatg tgcttgccag ttaccctttt ccaattgact 6960
gcttggagtt ggcaagaaca ggcaaggagt acggtttaac catgactcct gcagacaaat 7020
ccccatgctt caatgaagtc aattgggata acgcaacctt tctcaaaaga ggcttcttgc 7080
ccgatgaaca atttccattc cttatccacc ctaccatgcc aatgaaagaa atccacgagt 7140
ccatacggtg gaccaaggac gcgcgaaata cccaagatca cgtgcggtcc ttgtgccttc 7200
tggcatggca caatggtaaa caggaatatg aaaagtttgt gagcgcaatt agatcagtac 7260
cagtaggaaa agtattggct attccaaatt atgagaatct gagacgcaat tggctcgaac 7320
tattttagag gttaagtata tacctcaacc ccaccaggaa tctggtcgtg aacatgactg 7380
gtgggggtaa atttgttatt accagaatag caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 7439

Claims (37)

1.一种冷适应的温度敏感性病毒毒株。
2.权利要求1的冷适应的温度敏感性病毒毒株，其中所述毒株为EV71:eTLLβP20。
3.权利要求1的冷适应的温度敏感性病毒毒株，其中所述毒株为EV71:TLLeC5。
4.权利要求1的冷适应的温度敏感性病毒毒株，其中所述毒株为TLLeCA16。
5.一种组合物，其包含一种或多种权利要求1-3中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株。
6.权利要求5的组合物，其进一步包含冷适应的温度敏感性肠道病毒71毒株EV71:TLLβP20。
7.权利要求5或6的组合物，其进一步包含药学可接受的载体。
8.权利要求5、6或7的组合物，其进一步包含佐剂。
9.权利要求5-8中任一项的组合物，其为疫苗。
10.权利要求9的组合物，其中所述疫苗是口服减毒活疫苗。
11.权利要求9的组合物，其中所述疫苗是灭活疫苗。
12.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或权利要求5-11中任一项的组合物，用于在个体中引发保护性免疫应答。
13.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或权利要求5-11中任一项的组合物，用于预防个体患上肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒A16相关疾病。
14.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或权利要求5-11中任一项的组合物，用于延迟肠道病毒71感染的个体和/或柯萨奇病毒A16感染的个体中肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒A16相关疾病的发作或者减缓其速度。
15.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，或者权利要求5-11中任一项的组合物在制备在个体中引发保护性免疫应答的药物中的用途。
16.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，或者权利要求5-11中任一项的组合物在制备预防个体患上肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒A16相关疾病的药物中的用途。
17.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，或者权利要求5-11中任一项的组合物在制备延迟肠道病毒71感染的个体和/或柯萨奇病毒A16感染的个体中肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒A16相关疾病的发作或者减缓其速度的药物中的用途。
18.一种在个体中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括给所述个体施用预防、治疗或免疫有效量的权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，或者权利要求5-11中任一项的组合物。
19.权利要求18的方法，其中所述个体已暴露于野生型肠道病毒71和/或柯萨奇病毒A16。
20.一种预防个体患上肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒A16相关疾病的方法，所述方法包括给所述个体施用预防、治疗或免疫有效量的权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，或者权利要求5-11中任一项的组合物。
21.权利要求20的方法，其中所述个体已暴露于野生型肠道病毒71和/或柯萨奇病毒A16。
22.一种延迟肠道病毒71感染的个体中的肠道病毒71相关疾病和/或柯萨奇病毒A16感染的个体中的柯萨奇病毒A16相关疾病的发作或者减缓其速度的方法，所述方法包括给所述个体施用预防、治疗或免疫有效量的权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，或者权利要求5-11中任一项的组合物。
23.权利要求18-22中任一项的方法，其中所述个体为人个体。
24.一种用冷适应的温度敏感性病毒毒株免疫个体的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，或者权利要求5-11中任一项的组合物，药学可接受的载体，以及其使用说明材料。
25.权利要求24的试剂盒，其进一步包含涂药器。
26.一种制备疫苗的方法，所述方法包括使用权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式。
27.一种制备疫苗的方法，所述方法包括使用包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86或SEQID NO:88中示出的核苷酸序列的一种或多种核酸。
28.权利要求27的方法，所述方法进一步包括使用包含SEQ ID NO:83中示出的核苷酸序列的核酸。
29.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式在疫苗开发中的用途。
30.包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:88中示出的核苷酸序列的一种或多种核酸在疫苗开发中的用途。
31.权利要求30的用途，所述用途进一步包括包含SEQ ID NO:83中示出的核苷酸序列的核酸。
32.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式，用于疫苗开发。
33.包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:88中示出的核苷酸序列的核酸，用于疫苗开发。
34.权利要求1-4中任一项的冷适应的温度敏感性病毒毒株或其灭活形式的用途。
35.包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:88中示出的核苷酸序列的核酸的用途。
36.一种分离的核酸，其包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:88中示出的核苷酸序列。
37.一种病毒载体，其包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:88中示出的核苷酸序列。
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