CN102796749A - 以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒及其应用。本发明提供了一个DNA分子，是将乙脑病毒的基因组RNA对应的cDNA中的蛋白质A的编码基因替换为蛋白质B的编码基因得到的重组DNA；所述蛋白质A为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述蛋白质B为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明所提供的以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒为含有所述DNA分子的重组病毒。本发明所提供的乙脑/登革2型嵌合病毒作为登革疫苗用于预防登革病毒感染也具有良好的应用前景。

Description

以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒及其应用

技术领域

本发明涉及以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒及其应用。

背景技术

登革病毒(Dengue virus，DENV)属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，该属还包括流行性乙型脑炎病毒(简称乙脑病毒)，也称日本脑炎病毒(Japanese Encephalitisvirus，JEV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、蜱传脑炎病毒(Tick-borne Encephalitisvirus，TBEV)和黄热病毒(Yellow Fever virus，YFV)等，其中大多数病毒为重要的人畜共患病病原体，主要通过蚊、蜱等媒介传播。

登革病毒分为4个血清型，每个血清型病毒感染均可导致登革热(dengue fever，DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome，DSS)。全球有约30亿人受到登革病毒感染的威胁，每年大约有近1亿人感染登革热。其中登革出血热病例达50万，死亡约2万余人，对人类健康和公共卫生安全构成重要威胁。登革热与登革出血热的流行区起初主要分布于热带和亚热带地区，尤以东南亚最为严重。但是随着全球气候变暖和国际交往的日益频繁，近年来登革热发病范围已在全球逐渐扩大，爆发频率也不断增加。

登革病毒是有包膜的单股正链RNA病毒，其基因组含有一个单一开放读码框，依次编码3种结构蛋白：衣壳蛋白(capsid protein，C)、膜蛋白及其前体(membrane protein and itsprecursor，M/prM)及包膜蛋白(envelope protein，E)，和7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。登革病毒的抗原蛋白主要是包膜蛋白E、膜蛋白M和非结构蛋白NS1。其中，E蛋白具有多种B细胞和T细胞表位，能诱导产生血凝抑制抗体和中和抗体。prM蛋白见于未成熟的病毒颗粒，可能在病毒颗粒成熟过程中作为分子伴侣来协助包膜E蛋白的正确折叠，在此过程中进一步经宿主细胞的蛋白酶切割后成为M蛋白。非结构蛋白NS1是一种可溶性补体蛋白，可诱导产生中和抗体。

疫苗接种是预防病毒性疾病的最有效途径，但目前仍无安全有效的登革疫苗用于临床。登革疫苗研制主要面临以下挑战。第一，登革病毒感染导致登革出血热以及登革休克综合征等病症的具体致病机制尚不清楚，抗体依赖的感染增强作用(antibody-dependent enhancement，ADE)被认为在登革发病机制中起重要作用。该观点认为，当已被登革感染的机体再次感染不同血清型的登革病毒时，其体内的非中和或亚浓度中和抗体可与该异型病毒形成抗原抗体复合物，进而增强病毒对靶细胞的感染，最终导致病情加重。基于上述理论，登革疫苗要求能同时诱导针对登革病毒4个血清型的均衡的免疫应答，且应答水平需足够高。另一方面，无论是小鼠还是非人灵长类动物，其感染登革病毒后仅能出现与人感染后相似的免疫应答，但其发病特征与人感染后的病症相去甚远。因此，缺乏合适的动物模型使得登革疫苗的研制较为缓慢。

然而，随着病毒学、分子生物学及相关学科技术的发展，登革疫苗的研究已经取得了很大进展。登革疫苗的研制始于20世纪二十年代，当时尝试采用登革热患者的灭活血清作为疫苗。由于此类疫苗免疫原性差，且需多次免疫，安全性亦未完全明确，因此难以应用于临床。近些年来，一些新型的登革疫苗，如重组亚单位疫苗、DNA疫苗和复制子疫苗进展迅速。登革病毒prM-E和NS1蛋白是重组亚单位疫苗和DNA疫苗的重要靶标。大量的研究显示，重组亚单位疫苗和DNA疫苗均能诱导小鼠和猴体产生有效的免疫应答，并能提供部分或完全的免疫保护。美国夏威夷生物科技公司利用果蝇表达系统开发了一种重组亚单位疫苗，在小鼠和猴模型中均可诱导高水平的免疫应答和完全的免疫保护。

与上述疫苗类型相比，减毒活疫苗因其具有完整的病毒感染过程，进而能全面诱发机体产生体液和细胞免疫应答而更具优势。起初通过传代法制备减毒活疫苗，但该方法效率低，减毒效果差，获得的减毒株也易发生回复突变；特别是针对登革病毒4种血清型的免疫效力并不均衡，因此该项尝试业已终止。上世纪八十年代以来，随着反向遗传学技术的兴起，基因突变和嵌合减毒技术逐渐取代了传统减毒方法。目前在登革病毒结构和非结构蛋白中已发现多个可能的毒力相关位点，对其进行定点诱变后获得了诸多减毒疫苗候选株。其中较为成功的是美国国立卫生研究院(NIH)NIAID传染病实验室构建的登革4型病毒3′-非编码区(UTR)缺失30个核苷酸的突变株，其在小鼠模型和猴体中均产生减毒，并可诱导产生中和抗体及免疫保护。

黄病毒属成员具有相似的基因结构和功能相近的病毒蛋白，因此可以通过反向遗传学技术将不同黄病毒进行相互嵌合，最终可获得具有感染性的嵌合黄病毒颗粒。由于嵌合基因间存在功能的不协调，进而会影响病毒增殖的各个环节而使其毒力减弱，因此基因嵌合也是构建减毒株的有效途径。当嵌合区段为prM-E而骨架为减毒株时，即可获得针对外源病毒的减毒疫苗候选株。

乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2是由野毒株SA14通过在细胞和动物中不断传代和多轮空斑纯化最终获得。与野毒株SA14相比，SA14-14-2的毒力明显减弱，对成鼠和猴等动物的致病性几乎完全丧失。使用该减毒株研制的乙脑减毒活疫苗在我国使用人群超过3亿，未见因疫苗接种而引发疾病的报告，安全性可靠。同时，SA14-14-2遗传特征稳定，基因组序列明确，与登革病毒基因组具有十分类似的结构特征，非常适合作为基因骨架用于嵌合疫苗的构建。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种DNA分子。

本发明所提供的DNA分子，是将乙脑病毒的基因组RNA对应的cDNA中的蛋白质A的编码基因替换为蛋白质B的编码基因得到的重组DNA；

所述蛋白质A为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述蛋白质B为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

所述蛋白质A的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)序列表中序列3所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白质A的DNA分子；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白质A的DNA分子。

所述蛋白质B的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)序列表中序列4所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白质B的DNA分子；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白质B的DNA分子。

所述乙脑病毒为乙脑病毒SA14-14-2减毒株；

所述重组病毒的基因组RNA对应的cDNA序列如序列表中序列6所示。

所述重组DNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。

含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

所述重组载体为是在pANCR-L1载体的多克隆位点间插入所述DNA分子得到的重组载体；

所述pANCR-L1载体的构建方法，包括以下步骤：

1)以克隆质粒pSP64为模板，扩增得到第2757位-2982位的phage sp6区的DNA片段；

2)以克隆质粒pACYC177为模板，扩增得到第1位-2335位的DNA片段；

3)将步骤2)得到的DNA片段和步骤1)中得到的DNA片段顺次连接后，即得到pANCR-L1载体。

所述重组病毒为将所述重组载体导入离体的哺乳动物细胞中得到的病毒。

本发明的另一个目的是提供一种重组病毒。

本发明所提供的重组病毒，其基因组RNA对应的cDNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。

本发明的另一个目的是提供一种疫苗。

本发明所提供的疫苗，其活性成分为所述重组病毒。

所述重组病毒在制备疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

所述疫苗为预防登革病毒感染的疫苗。

本发明提供的乙脑/登革2型嵌合病毒具有如下多方面优点：(1)所述乙脑/登革2型嵌合病毒是充分减毒的，因此安全性很高；(2)所述乙脑/登革2型嵌合病毒减毒特征稳定，回复为野生型病毒的可能性极低；(3)所述乙脑/登革2型嵌合病毒只在细胞质中复制(即RNA病毒基因组的复制、病毒的组装、成熟释放等过程均在细胞质中进行)，其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的危险；(4)所述乙脑/登革2型嵌合病毒能诱导产生针对所述乙脑/登革2型嵌合病毒包膜蛋白所来源的黄病毒的良好的免疫应答；(5)所述乙脑/登革2型嵌合病毒能够在动物模型中保护动物免受致死剂量的所述外源黄病毒的攻击。本发明所提供的乙脑/登革2型嵌合病毒作为登革疫苗用于预防登革病毒感染也具有良好的应用前景。

附图说明

图1为乙脑/登革2型嵌合病毒全长cDNA克隆的构建示意图。

图2为从乙脑/登革2型嵌合病毒RNA中扩增乙脑和登革2型病毒特异序列的RT-PCR结果。

图3为检测乙脑/登革2型嵌合病毒表达乙脑和登革病毒特异蛋白的IFA结果。。

图4为乙脑/登革2型嵌合病毒RNA的分段RT-PCR扩增结果。

图5为乙脑/登革2型嵌合病毒的空斑形态和直径大小。

图6为乙脑/登革2型嵌合病毒在不同温度下的生长特征。

图7为乙脑/登革2型嵌合病毒(CJD2)在不同细胞系中的增殖特征。

图8为乙脑/登革2型嵌合病毒(CJD2)免疫血清对乳鼠的保护试验结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、构建以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒

该实施例以乙脑病毒SA14-14-2减毒株为基因骨架构建乙脑/登革嵌合病毒，其中乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2的基因组RNA对应的cDNA序列如序列表中序列6所示，自5′端第1位-95位为5′UTR；第96-476位为衣壳蛋白C的编码基因(C)；第477-2468位为缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E蛋白的编码基因(prM-EΔ3)；第2469-2477位为E蛋白羧基末端的3个氨基酸残基的编码基因(E3)；第2478位-10394位为非结构蛋白NS的编码基因(NS)；第10395-10977位为3′UTR(图1)。

一、乙脑SA14-14-2减毒株基因组5′和3′半分子的构建与鉴定

乙脑SA14-14-2减毒株病毒基因组5′和3′半分子的构建与鉴定分为如下几个步骤：

1、乙脑SA14-14-2减毒株基因组cDNA的制备

按照RNeasy试剂盒(Qiagen公司产品)说明提取乙脑SA14-14-2减毒株(购自成都生物制品研究所)的基因组RNA(即：JEV-RNA)。提取步骤如下：

将210μl病毒悬液与700μl RLT(RNeasy Lysis Buffer)和7μl β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)的混合液震荡混匀，加490μl无水乙醇后剧烈混匀，得到裂解液，将裂解液加入吸附柱，12000rpm离心15s；700μl RW1(RNeasy wash buffer)洗柱一次，12000rpm离心15s；500μl RPE(RPE是RNeasy试剂盒中的洗涤液)洗柱2次，10000rpm 30s；空柱10000rpm离心1min。加50μl无RNase的水，静置2min，12000rpm离心1min。加2μl RNaseinhibitor。混匀后置-80℃待用。

以测序引物R13为反转录引物进行cDNA的合成。

引物R13：AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACA。

反转录反应的组分与反应条件如下：

将上述反应组分混合均匀，置65℃5min，冰浴2min。补加如下组分：

55℃60min；70℃，15min。加1μl(2U)RNase H，37℃，20min。-20℃保存待用。

2、乙脑病毒SA14-14-2减毒株基因组5′半分子的构建与鉴定

以上述步骤1制备的乙脑病毒基因组cDNA为模板，Asc I(+)和BspE I(-)为引物，用LATaq DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)进行PCR扩增。引物序列如下：

引物名称

序列(5′-3′)

Asc I(+)	GCTGGCGCGCCatttaggtgacactatagagaagtttatctgtgtgaac
		BspE I(-)	ccgtaccagcagccattttctgtccggaatcgtagg

PCR反应体系组成如下：

反应条件如下：94℃变性4min，94℃30s、60℃退火30s、72℃延伸3min 50s，30个循环，再于72℃10min。

凝胶回收PCR所得的大小约为3400bp的目的片段。用Asc I和BspE I酶切该目的片段，同时，用Asc I和BspE I酶切克隆载体pANCR-L1回收载体大片段，将回收的目的产物连接后转化感受态菌株MC1061(购自Invitrogen公司，产品目录号为CC66303)。提取质粒后用Asc I和BspE I进行酶切鉴定，将酶切图谱正确(得到3400bp和2600bp的两个片段)的质粒送英俊公司测序。测序结果表明在载体pANCR-L1的Asc I和BspE I酶切位点间插入了序列表序列6中第1位到3450位所示的DNA片段序列，该DNA片段编码的蛋白质为乙脑病毒SA14-14-2减毒株的衣壳蛋白C、缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E蛋白(prM-EA3，其氨基酸序列如序列表中序列1所示，该氨基酸序列的编码基因为序列表中序列3所示的DNA分子)、E蛋白羧基末端的3个氨基酸残基(E3)和非结构蛋白NS1，说明重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为pANCR-JEV-5，将其作为JEV基因组5′半分子克隆。

克隆载体pANCR-L1的构建方法如下：

1)以克隆质粒pSP64(购自Promega公司)DNA为模板，用引物A和引物B进行PCR扩增，得到第2757-2982位的phage sp6区，将扩增得到的DNA片段命名为pSP64-1，其核苷酸序列如序列表中序列7所示；

引物A：5’-gacgtgtcgacgcggccgcgctagcgatgaccctgctg-3’(下划线部分为酶切位点Sa1I)，

引物B：5’-tcagtccggaggcgcgcccgtatgtgtatgatacataag-3’(下划线部分为酶切位点BspEI)。

2)以克隆质粒pACYC177(购自Fermentas公司)为模板，用引物C和引物D进行PCR扩增，得到第1-2335位区域，将扩增得到的DNA片段命名为pACYC177-2，其核苷酸序列如序列表中序列8所示；

引物C：5’-tacgggcgcgcctccggactcgagcaagacgtttcc-3’(下划线部分为酶切位点BspEI)，

引物D：5’-gccgcgtcgacacgtcaggtggcacttttcg-3’(下划线部分为酶切位点SalI)。

3)将1)和2)中获得的片段进行连接：

用BspEI和SalI分别酶切pSP64-1和pACYC177-2，将酶切所得片段连接后转化MC1061细菌，提取质粒后用Age I进行酶切鉴定，将酶切图谱正确(得到324bp和2265bp的片段)的质粒进行测序。测序结果表明该重组质粒的核苷酸序列如序列表中序列9所示，其中第1-2335位为克隆质粒pACYC177的第1-2335位序列；第2350-2575位为克隆质粒pSP64的phage sp6区；说明重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为pANCR-L1。

3.乙脑SA14-14-2减毒株基因组3′半分子的构建与鉴定

以乙脑病毒基因组cDNA为模板，用配对引物pBRJEV-7289(+)，pBRJEV-7289(-)和pBRJEV-7289-3U(+)，pBRJEV-7289-3U(-)进行PCR扩增。两对引物扩增的目的片段分别包含乙脑基因组cDNA的第3099-7299nt和第7279-10976nt区段。引物序列组成如下：

引物名称	序列(5′-3′)
		pBRJEV-7289(+)	GGCGCGCCGACACATGGAAACTCGAGAGGGCAGT
pBRJEV-7289(-)	GCCATCCCGGGAGCATGTA
		pBRJEV-7289-3U(+)	GGCGCGCCCTCGAGGGTACATGCTCCCGGGAT
pBRJEV-7289-3U(-)	CTCGAGAGATCCTGTGTTCTTCCTCAC

PCR反应体系组成如下：

反应条件如下：94℃变性4min，94℃ 30s、62℃退火30s、72℃延伸4min 30s或4min，每个循环退火温度降0.5℃，共10个循环；退火温度降至58℃后再进行20个循环；最后于72℃ 10min。

凝胶回收PCR所得的4209bp(该PCR片段中包含有有内切酶识别的8bp序列)和3719bp(该PCR片段中包含3700bp的乙脑基因组序列，以及19bp的内切酶识别序列)目的产物，分别将其连入pGEM-T-Easy克隆载体(Promega公司产品)，转化Top10感受态细菌(天根生物技术公司产品)，经蓝白斑筛选出重组质粒。将测序结果与预期一致的重组质粒分别命名为pT-3099-7299和pT-7279-10976。进一步用Asc I和Xma I酶切pT-3099-7299和pT-7279-10976，分别回收4201bp和6716bp的目的片段后进行连接，转化Top10感受态细菌。用MluI和XhoI对重组质粒进行酶切鉴定，将酶切图谱正确(得到2816bp和8079bp的两个片段)的重组质粒命名为pT-3099-10976。

用BspE I和XhoI酶切重组质粒pT-3099-10976，回收7532bp的片段，同时，用BspE I和XhoI酶切克隆载体pANCR-L1，回收2567bp的片段，将回收的目的片段进行连接，进一步转化MC1061感受态细菌，再用EcoR V酶切鉴定重组质粒，将酶切图谱正确(得到4129bp和5970bp的片段)的克隆进行测序。测序结果表明在载体pANCR-L1的Asc I和BspE I酶切位点间插入了序列表序列6中第3445位到10976位所示的DNA片段序列，该DNA片段编码的蛋白为乙脑病毒SA14-14-2减毒株的部分非结构蛋白NS，说明重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为pANCR-JEV-3，将其作为JEV基因组3′半分子克隆。

二、乙脑/登革2型嵌合病毒全长cDNA克隆的构建与鉴定

该克隆的构建与鉴定分为如下几个步骤：

1、登革2型病毒基因组cDNA的制备

选取登革2型病毒-43株(Genebank登录号为：AF204178)(DENV2-43)，扩增嵌合病毒的prM-EΔ3基因。DENV2-43基因组RNA的提取以及cDNA的制备方法与上述是实验一中的步骤1相同。其中反转录引物为DV2-NS5-R，序列如下：5’-GAAGGTTCCCATTGT-3’。

2、包含登革2型病毒prME基因的JEV/DV2嵌合片段的构建

选用Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)，以上述步骤1得到的登革2型病毒基因组cDNA为模板，用引物DV2-prME(+)和DV2-prME(-)进行PCR扩增，获得2012bp的登革2型病毒的缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prME编码区段，命名为DV2-prM-EΔ3；以JEV基因组cDNA为模板，用引物DV2-J-BspEI(+)和DV2-J-BspEI(-)进行PCR扩增，获得1018bp的目的片段，该片段编码的蛋白为JEV的E蛋白羧基末端3个氨基酸残基和非结构蛋白NS，将其命名为JEV-NS；选用LATaq DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)，将DV2-prME和JEV-NS通过融合PCR获得2981bp的包含登革2型病毒的缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prME编码区段(其氨基酸序列如序列表中序列2所示，该氨基酸序列的编码基因为序列表中序列4所示的DNA分子)和JEV的E蛋白羧基末端3个氨基酸残基和非结构蛋白NS的JEV/DV2嵌合片段。

其中，相关引物序列如下：

引物名称	序列(5′-3′)
		DV2-prME(+)	tgtgcaggcgccTTCCATTTAaccacacgtaacggag
DV2-prME(-)	atggcacatccagtgtcagcatgcacCATAACTCCcaaatacagcgtca
		DV2-J-BspEI(+)	tgacgctgtatttgGGAGTTATGgtgcatgctgacactggatgtgccat
DV2-J-BspEI(-)	cagccattttctgtccggaatcgta

扩增D2-prME和JEV-NS的反应体系组成如下：

反应条件如下：94℃变性4min，94℃30s、55℃退火30s、72℃延伸，延伸时间按1kb/min计算，共30个循环，再于72℃10min。

融合PCR扩增JEV/DV2嵌合片段的反应体系组成如下：

将片段DV2-prME和JEV-NS进行融合的反应条件如下：首先94℃变性4min，94℃30s、55℃退火30s、72℃延伸2min，共10个循环；之后补加引物DV2-prME(+)和DV2-J-BspEI(-)进行PCR扩增，反应条件为94℃变性4min，94℃30s、57℃退火30s、72℃延伸3min，共30个循环；再于72℃10min。

3、缺失prM-E基因的JEV基因组5′半分子的构建与鉴定

选用Pyrobest DNA聚合酶，以JEV基因组cDNA为模板，用引物Asc I(+)和J-REP-kas(-)进行PCR扩增，得到526bp的目的片段(其核苷酸序列为序列表中序列6第1位到477位所示)，将其命名为的J-REP-kas；同时，以JEV基因组cDNA为模板，用引物J-REP-kas(+)和J-REP-Bgl II(-)扩增得到211bp的目的片段(其核苷酸序列为序列表中序列6第2469位到2659位所示)，将其命名为J-REP-Bgl II。再用引物Asc I(+)和J-REP-Bgl II(-)将J-REP-kas和J-REP-Bgl II融合获得缺失JEV prM-EΔ3的737bp的目的片段(其核苷酸序列为序列表中序列6第1位到477和第2469到2659位所示)，命名为JEV-ΔprM-EΔ3。

扩增J-REP-kas和J-REP-Bgl II的反应体系组成如下：

反应条件如下：94℃变性4min，94℃30s、55℃退火30s、72℃延伸，延伸时间按1kb/min计算，共30个循环，再于72℃10min。

融合PCR扩增JEV-ΔprM-EΔ3的反应体系组成如下：

首先将片段J-REP-kas和J-REP-Bgl II进行融合，反应条件为94℃变性4min，94℃ 30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共10个循环；之后补加引物Asc I(+)和J-REP-Bgl II(-)进行PCR扩增，反应条件为94℃变性4min，94℃ 30s、57℃退火30s、72℃延伸50s，共30个循环；再于72℃ 10min。

进一步用Asc I和Bgl II酶切JEV-ΔprM-EΔ3和实验一中步骤2得到的JEV基因组5′半分子pANCR-JEV-5，凝胶回收目的片段。再将二者连接后转化感受态菌株MC1061。提取重组质粒后用Kas I和Bgl II进行酶切鉴定，得到186bp和3870bp的片段，说明酶切图谱正确。将该重组质粒命名为pANCR-J-ΔprME-5。将该重组质粒用于下一步构建嵌合病毒的5′半分子。相关引物序列如下：

4、乙脑/登革2型嵌合病毒5′半分子的构建与鉴定

用Kas I和BspE I依次酶切嵌合片段JEV/DV2和半分子pANCR-J-ΔprME-5，分别回收2960bp和3100bp的目的片段并进行连接，再转化感受态菌株MC1061。提取重组质粒后用Kas I和Sca I进行酶切鉴定，得到670bp和5390bp的片段，说明酶切图谱正确。将该重组质粒命名pANCR-CJD2-5。

5、乙脑/登革2型嵌合病毒基因组全长cDNA克隆的构建与序列测定

用BspE I和Xho I酶切上述步骤4得到的乙脑/登革2型嵌合病毒5′半分子重组质粒pANCR-CJD2-5，回收6060bp的片段，同时用BspE I和Xho I酶切JEV基因组3′半分子pANCR-JEV-3，回收7530bp的片段，将回收的目的片段连接后转化感受态菌株MC1061。提取重组质粒后用Hind III进行酶切鉴定，得到3534bp、1396bp、610bp、2000bp、613bp和6100bp的片段，说明酶切图谱正确。将酶切图谱正确的克隆进行测序。测序结果表明，在载体pANCR-L1的AscI和XhoI酶切位点间插入了序列表中序列5所示的核苷酸序列，其中第96位-476位编码乙脑病毒SA14-14-2减毒株的衣壳蛋白C(图1中重组质粒pANCR-CJD2中的C)，第477位-2450位编码登革2型病毒的缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E蛋白(图1中重组质粒pANCR-CJD2中的DV2-prM-EΔ3)，第2451位-2459位编码乙脑病毒SA14-14-2 E蛋白羧基末端的3个氨基酸残基(图1中重组质粒pANCR-CJD2中的E3)，第2460位-10376位编码非结构蛋白(图1中重组质粒pANCR-CJD2中的NS)，第1位-95位和第10377位-10959位为病毒RNA的非编码区。酶切和测序结果表明，重组质粒构建正确。将该重组质粒命名为pANCR-CJD2，将其作为乙脑/登革2型嵌合病毒全长cDNA克隆质粒。

三、乙脑/登革2型嵌合病毒的拯救

1、乙脑/登革2型嵌合病毒全长cDNA克隆的体外转录

用质粒中提试剂盒(Qiagen公司产品)抽提嵌合病毒的全长cDNA克隆质粒pANCR-CJD2，经XhoI酶切后再用酚氯仿抽提，将线性化质粒定量并分装后置-20℃冻存待用。

以线性化后的嵌合病毒全长cDNA克隆质粒为模板，用SP6RiboMAX Express Large ScaleRNAProduction Systems(Promega公司产品)进行体外转录。反应体系与条件如下：

37℃反应3h。补加2μl DNase后于37℃作用30min。依照RNeasy mini kit(Qiagen公司产品)操作说明纯化转录体RNA后定量，分装后置-80℃冻存待用。

2、嵌合病毒的拯救

用脂质体Lipofectamin 2000(购自Invitrogen公司)将转录体RNA转染单层BHK-21细胞(购自ATCC，产品目录号为CCL-10)，方法如下：首先将50μl OPTI-MEM与4μl脂质体混匀，于室温放置5min后再与10μl RNA(5μg)和50μl OPTI-MEM混合，室温放置20min。将上述混合液加入到6孔板中的1孔，同时补加450μl OPTI-MEM。37℃，5％CO2孵育6h。移去上清，补加含有2％FBS的DMEM维持液，置37℃，5％CO2孵箱。待细胞出现病变后，离心收集培养液上清。将上清重新接种于BHK-21细胞，待细胞出现病变后，离心收集上清。冻存于-80℃，作为乙脑/登革2型嵌合病毒种子液。

四、乙脑/登革2型嵌合拯救病毒的RNA检测

通过如下步骤检测嵌合拯救病毒的RNA是否同时含有乙脑和登革2型病毒特异序列：

1、乙脑/登革2型嵌合恢复病毒全长cDNA的制备

用RNeasy mini kit提取乙脑/登革2型嵌合病毒种子液的病毒RNA，并制备其cDNA。相应方法与实验一中的步骤1相同。

2、嵌合拯救病毒RNA中乙脑和登革2型病毒特异序列的检测

以嵌合病毒cDNA为模板，分别用登革2型病毒E蛋白特异引物DV2-E(+)和DV2-E(-)，登革2型病毒E蛋白和乙脑非结构蛋白NS1特异引物DV2-2020(+)和DV2-J-BspEI(-)(引物DV2-J-BspEI(-)序列见实验一中的步骤2)，以及乙脑非结构蛋白NS5特异引物J-NS5-F12(+)和J-NS5-R12(-)进行PCR扩增。并对目的片段进行测序。相关引物序列如下：

PCR反应体系为：

反应条件如下：94℃变性4min，94℃30s、55℃退火30s、72℃延伸，延伸时间以1kb/min计算，共30个循环，再于72℃10min。

PCR扩增结果显示，三对引物均能扩增出与预期大小一致的目的片段(图2)。测序结果表明：引物DV2-E(+)和DV2-E(-)的扩增产物具有序列5的第789位-2100位所示的核苷酸序列；引物DV2-2020(+)和DV2-J-BspEI(-)的扩增产物具有序列5的第2022位-3454位所示的核苷酸序列；引物J-NS5-F12(+)和J-NS5-R12(-)的扩增产物具有序列5的第8803位-10029位所示的核苷酸序列；也显示所得目的片段为病毒的特异序列。上述结果表明，乙脑/登革2型嵌合拯救病毒的RNA中同时包含乙脑和登革病毒的特异序列。

五、乙脑/登革2型嵌合病毒的病毒特异蛋白的检测

通过如下步骤观察嵌合病毒能否同时表达乙脑非结构蛋白和登革2型病毒包膜E蛋白：

1、乙脑/登革2型嵌合病毒感染的BHK-21细胞抗原片的制备

将嵌合病毒感染单层BHK-21细胞，于感染后24-72h收取细胞，重悬于含有10％FBS的DMEM培养液，再铺于载玻片。于37℃，5％的CO2孵箱中培养8-12h。之后将抗原片置于-20℃的丙酮中固定30-60min。晾干后放于-20℃冰箱密封待用。依同样的方法制备乙脑SA14-14-2减毒株和登革2型病毒-43株的抗原片。

2、乙脑和登革2型病毒特异蛋白的检测

分别用乙脑病毒包膜E蛋白(购自abcam公司，产品目录号为ab41671)和非结构蛋白NS5多抗，登革2型病毒E蛋白单抗(购自Millipore公司，产品目录号为MAB87102)，通过间接免疫荧光(IFA)对嵌合病毒感染的BHK-21细胞中的病毒特异蛋白进行检测。方法如下：将上述抗体按适当比例稀释，与抗原片中的BHK-21细胞在37℃孵育1-2h，PBS缓冲液(10mM K₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，135mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)振荡洗涤3次，每次10min，室温晾干。在病毒抗原片上加入用0.02％伊文思兰溶液800倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，置37℃作用60min，然后将病毒抗原玻片放入PBS缓冲液振荡洗涤3次，每次10min，室温晾干，荧光显微镜下观察结果。

间接免疫荧光的结果显示(图3，JEV-E和JEV-NS5分别是乙脑E蛋白和NS5蛋白多抗，DV2-E是登革2型病毒E蛋白单抗)，乙脑/登革嵌合病毒感染的BHK-21细胞中可检测到登革2型病毒E蛋白和乙脑病毒非结构蛋白NS5，而检测不到乙脑病毒包膜E蛋白。

NS5蛋白多抗的制备方法如下：

以乙脑SA14-14-2减毒株基因组的cDNA为模板，用NS5的特异引物J-NS5-F和J-NS5-R，引物序列如下：

J-NS5-F：5′-ccgggatccggaaggcctgggggcaggacgctaggg-3′，

J-NS5-R：5′-cgcctcgagtcagatgaccctgtcttcctggatcaa-3′，

进行PCR扩增，得到NS5编码序列的DNA片段(具有序列表中序列5的第7659-10373位所示的核苷酸序列)，并将其连入原核表达载体pET-28a(购自Novagen公司)，获得重组表达质粒pET-28a-NS5。将该质粒转化表达菌株BL21-DE3(购自天根生物技术公司)，并在IPTG为0.1mM，16℃的条件下进行蛋白的诱导表达。离心收集菌体并超声裂解，将上清经0.4μm滤膜过滤后，依照His融合蛋白纯化试剂盒(购自Pierce公司)操作说明书进行纯化。

用纯化的NS5重组蛋白免疫4周龄BALB/C雌性小鼠，基础免疫剂量为25μg/只，与等体积弗氏完全佐剂混合制成乳剂，采用背部皮下多点注射，间隔2周后以同等免疫剂量与等体积弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫，共加强3次，小鼠尾静脉取血，获得含有NS5多抗的免疫血清。

六、乙脑/登革2型嵌合病毒基因组全序列测定与分析

1、嵌合病毒基因组5′和3′末端序列测定(5′和3′RACE法)

通过5′RACE法扩增嵌合病毒基因组5′端序列。首先用引物5′-1(-)将病毒RNA反转录获得cDNA，再通过TdT在其3′末端添加dATP同聚物。以之为模板，采用寡聚d(T)锚定引物和引物5′-1(-)进行第一次PCR扩增，扩增条件如下：94℃变性4min，94℃15s、62℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，再于72℃10min。将该PCR产物回收后作为模板，通过5′PCR锚定引物和引物5′-2(-)以同样扩增条件进行套式扩增，扩增条件中退火温度改为60℃。将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体后进行序列测定。测序结果表明，PCR产物具有序列5的自5′端第1-287位所示的核苷酸序列。

采用3′-RACE法扩增基因组3′末端序列。首先通过Poly(A)RNA聚合酶在病毒RNA 3′末端添加poly(A)尾，通过引物3′-1(+)和3′寡聚d(T)锚定引物进行初次扩增，条件如下：94℃变性4min，94℃30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环，再于72℃10min。继续以PCR产物为模板，通过引物3′-2(+)和PCR锚定引物以同样扩增条件进行套式PCR，退火温度改为55℃。将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体并进行序列测定。测序结果表明，PCR产物具有序列5的自5′端第10711-10959位所示的核苷酸序列。

相关引物序列如下：

2、嵌合病毒基因组全序列的分段扩增和序列测定

以嵌合病毒基因组cDNA为模板，用引物F1(+)-R1(-)～F13(+)-R13(-)将基因组分为13段进行扩增。相关引物序列见表1(标有“*”的引物同时用于扩增和测序)。

表1用于乙脑/登革2型嵌合拯救病毒全基因组分段扩增和测序引物

PCR反应体系如下：

反应条件为：94℃变性4min，94℃30s、60℃退火30s、72℃延伸1min 20s，每个循环退火温度降0.5℃，共10个循环；退火温度降至55℃后再进行20个循环；最后于72℃10min。将PCR产物进行序列测定。

PCR扩增结果显示，13对引物均可扩增出大小与预期一致的目的片段(图4，其中M为DNA marker DL2000，从上至下依次为2000和1000bp。第1到11泳道所用引物对依次为[F 1(+)，DV2-E(-)]，[DV2-2020(+)，R4(-)]，[F5(+)，R5(-)]，[F6(+)，R6(-)]，[F7(+)，R7(-)]，[F8(+)，R8(-)]，[F9(+)，R9(-)]，[F10(+)，R10(-)]和[F13(+)，R13(-)])；序列测定的结果也显示，所得片段为乙脑和登革2型病毒的特异序列。

以上测序结果表明乙脑/登革2型嵌合病毒全长cDNA序列如序列表中序列5所示。

七、乙脑/登革2型嵌合病毒的空斑特征

为了观察嵌合病毒的空斑形态特征，将乙脑/登革2型嵌合病毒以10倍比稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，10^-5、10^-6和10^-7以500μl/孔接种于铺于6孔板的单层BHK-21细胞。吸附1-2h后，弃去病毒液，添加含有DMEM培养基(2％FBS)的1％的琼脂盖，置于37℃，5％CO₂的孵箱中培养。3d后用4％的甲醛室温固定1h，弃琼脂盖，结晶紫室温染色10min，观察空斑形态，并计算空斑形成单位(PFU)。以相同方法对乙脑和登革2型病毒的空斑进行分析。

空斑试验的结果显示，乙脑/登革嵌合病毒能形成大小均一，边缘清晰的空斑，直径为0.32±0.04mm(n＝50)；登革2型病毒-43株也能形成大小较为均一的空斑，其直径为0.48±0.15mm(n＝25)；而乙脑SA14-14-2减毒株的空斑较大，直径为2.52±0.21mm(n＝30)。上述结果表明，乙脑/登革嵌合病毒的空斑直径明显小于乙脑SA14-14-2减毒株，因此其具有显著的小斑(small plaque，sp)特征(图5)。

八、乙脑/登革2型嵌合病毒的温度敏感(temperature sensitive，ts)特征

为了观察嵌合病毒在不同温度下的增殖特征，将嵌合病毒以感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)约为0.01接种铺于24孔板中的BHK-21细胞，置于37℃，5％CO₂的培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，补加2％FBS的DMEM维持液，分别置于33℃、37℃和39℃的5％CO₂的培养箱培养。于接种后第24、48、72、96、120和144h收取细胞上清液，用空斑滴定法测定病毒滴度，绘制一步生长曲线(图6)。

一步生长曲线的结果显示，当培养温度为39℃时，嵌合病毒于感染细胞后48h达到复制顶点，病毒滴度为10^2.23PFU/ml。当培养温度为37℃时，嵌合病毒在感染后72h达到复制高峰，病毒滴度为10^4.15PFU/ml。而当培养温度为33℃时，嵌合病毒于感染后120h达到复制顶点，滴度可达10^5.87PFU/ml。上述结果显示，嵌合病毒在33℃的复制能力是39℃时的1000倍以上。

九、乙脑/登革2型嵌合病毒的在不同细胞内的增殖特征

为了观察嵌合病毒在鼠类、灵长类和蚊虫类细胞系中的增殖特征，分别将嵌合病毒、乙脑和登革2型病毒以MOI＝0.01接种24孔板中的BHK-21、Vero(购自ATCC，产品目录号为CCL-81)、PHK(购自成都生物制品研究所提供)和C6/36细胞(购自ATCC，产品目录号为CRL-1660)，置于37℃，5％CO₂的培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，补加2％FBS的DMEM或1640维持液(C6/36细胞)，置于37℃或28℃的5％CO₂的培养箱培养。于接种后第24、48、72、96和120h收取细胞上清液，用空斑滴定法测定病毒滴度，绘制一步生长曲线(图7)。

一步生长曲线的结果显示，嵌合病毒在C6/36细胞中的复制能力最强，在48h达到复制高峰，滴度为10^5.08PFU/ml，在BHK-21、Vero和PHK细胞中分别于感染后第72h、72h和96h达到复制高峰，滴度分别为10^4.15PFU/ml、10^4.8PFU/ml和10^5.11PFU/ml。这表明嵌合病毒可在不同细胞系中有效复制。

十、乙脑/登革2型嵌合病毒的乳鼠神经毒力特征

为了观察嵌合病毒的乳鼠神经毒力特征，将嵌合病毒和乙脑病毒以1000PFU、100PFU、10PFU和1PFU的剂量，登革2型病毒以63PFU、6.3PFU、、0.63PFU和0.063PFU的剂量颅内接种1-2d龄BALB/c乳鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)，接种后24h内死亡视为非特异性死亡。观察21天内的小鼠发病和死亡情况，并计算病毒的乳鼠半数致死剂量(LD₅₀)和平均存活时间。

结果显示，1000PFU和100PFU的嵌合病毒分别能使75％和20％的乳鼠死亡，相同剂量的乙脑SA14-14-2减毒株则均可使100％乳鼠死亡。在此剂量下，感染嵌合病毒的乳鼠平均存活时间分别为7.7和9.0天，而感染乙脑病毒的乳鼠平均存活时间为7.2和8.6天。乙脑病毒、登革2型病毒和嵌合病毒乳鼠LD50神经毒力分别为245.47PFU、2.14PFU和4.97PFU，前两者的乳鼠神经毒力分别比嵌合病毒强100倍和50倍以上。上述结果表明，嵌合病毒的乳鼠神经毒力显著弱于乙脑和登革2型病毒亲本株，具有明显的减毒特征(表2)。

表2乙脑/登革2型嵌合病毒(CJD2)的乳鼠神经毒力特征

十一、乙脑/登革2型嵌合病毒的遗传稳定性

通过如下步骤观察嵌合病毒在细胞和乳鼠脑内连续传代后的基因和乳鼠神经毒力稳定性：

1、嵌合病毒在BHK-21细胞和乳鼠脑内连续传代

将嵌合病毒以MOI＝0.01接种于单层BHK-21细胞，3d后收集细胞上清，通过空斑试验测定病毒滴度。再以MOI＝0.01接种于单层BHK-21细胞。如此连续传代5次后，将第五代的嵌合病毒命名为J/DV2-P5。于-80℃冻存待用。

将嵌合病毒以1000PFU/只的剂量颅内接种1-2d龄BALB/c乳鼠，每天观察乳鼠生存状况，于乳鼠呈濒死状态时拉颈处死，无菌条件下解剖取脑，称重后加入2％FBS DMEM制成10％的脑悬液。再将脑悬液稀释10倍后颅内接种1-2d龄BalB/c乳鼠。如此连续在脑内传代5次，将第五代的嵌合病毒命名为J/DV2-MB5。于-80℃冻存待用。

2、不同代次乙脑/登革2型嵌合病毒prM和E蛋白基因序列分析

分别提取第五代嵌合病毒CJD2-P5和CJD2-MB5的RNA，以引物R13(-)制备cDNA，再分别以引物F405(+)和J-D2-R1(-)、J-D2-F2(+)和J-D2-R2(-)以及DV2-2020(+)和BspEI(-)扩增嵌合病毒的prM和E蛋白编码区段并测序。将该代次病毒序列与第一代病毒进行序列比对，结果显示，经细胞和鼠脑传代后所得病毒的prME序列保持一致，这表明无论是经细胞传代还是鼠脑传代，嵌合病毒均具有基因稳定性。

3、不同代次乙脑/登革2型嵌合病毒的乳鼠神经毒力特征

测定第五代嵌合病毒CJD2-P5和CJD2-MB5的乳鼠神经毒力。方法与实验十中相同。结果显示，细胞和鼠脑传代后的嵌合病毒的乳鼠LD50分别为223.9PFU/ml和213.8PFU/ml。与嵌合拯救种子病毒相比，乳鼠神经毒力无明显升高(表3，CJD2-BHK-P5和CJD2-SMB-P5分别表示经BHK细胞和乳鼠脑内连续传代5次后获得的病毒)。这表明嵌合病毒的乳鼠神经毒力减毒特征并不会随细胞或鼠脑传代而增强，具有良好的稳定性。

表3乙脑/登革2型嵌合病毒(CJD2)经细胞和鼠脑传代后的乳鼠神经毒力特征。

十二、乙脑/登革2型嵌合病毒的免疫原性

通过以下步骤评价嵌合病毒的免疫原性：

1、嵌合病毒经腹部皮下注射方式免疫BALB/c小鼠

首先使用不同剂量的嵌合病毒(10⁷、10⁶、10⁵和10⁴PFU/只)腹部皮下接种4周龄BALB/c小鼠，每组5只小鼠，同时以PBS作为阴性对照。分别于免疫后第14d和28d剪尾取血。于4℃静置3h后离心收取血清，56℃灭活30min，-20℃冻存待用。

2、免疫小鼠血清中的登革2型病毒特异IgG抗体效价的测定

将免疫血清制备成1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280和1∶2560的稀释液，再通过间接免疫荧光试验测定血清中的IgG抗体效价。间接免疫荧光试验的具体方法与实验五中步骤相同。间接免疫荧光试验中的抗原为登革2型病毒43株。将在显微镜视野下可观察到特异绿色荧光判定为阳性。间接免疫荧光的结果显示(表4)，10⁷、10⁶、10⁵和10⁴PFU/只剂量组的小鼠在免疫后第14d的血清中IgG抗体均有显著升高，抗体效价依次为1∶1280、1∶640、1∶320和1∶160，PBS组小于1∶20。免疫后第28d时，各组IgG抗体效价仍分别维持在上述水平。上述结果表明，不同剂量的嵌合病毒免疫小鼠后，可有效激发小鼠产生高水平且持久的登革2型病毒特异的IgG抗体，该嵌合病毒具有良好的免疫原性。

表4乙脑/登革2型嵌合病毒(CJD2)免疫小鼠后的IgG抗体和中和抗体效价

3、免疫小鼠血清中的登革2型病毒中和抗体效价的测定

采用空斑减少中和试验测定血清中的中和抗体效价。首先将各免疫组在免疫后第14d和28d的血清制备成1∶20、1∶40、1∶80、1∶160和1∶320的悬液，与等体积的含大约100PFU的登革2型病毒悬液混合，37℃孵育1.5h。再将混合液接种于12孔板中的BHK-21细胞。通过空斑试验对血清病毒混合液中的病毒颗粒进行计数，计算血清中的中和抗体效价。结果显示(表4)，各剂量组均能诱发小鼠产生效价大于或等于1∶20的中和抗体，且其效价与免疫剂量呈正相关，其中最高剂量组(10⁷PFU/只)的中和抗体效价可达1∶90以上。此外，高水平的中和抗体能维持4周以上。上述数据表明，嵌合病毒还能有效诱发小鼠产生具有保护作用的中和抗体。

十三、乙脑/登革2型嵌合病毒的免疫保护性

通过免疫血清与病毒在体外中和后，再经脑内感染乳鼠的试验对嵌合病毒的免疫保护性进行评价。首先分别将嵌合病毒免疫组和PBS免疫组的小鼠血清用PBS缓冲液稀释20倍，与等体积的登革2型病毒ATCC AR-1584(购自美国典型菌种保藏中心ATCC)混合后制备成10LD₅₀/30μl的病毒悬液，37℃孵育1.5h。将混合液以30μl/只的剂量颅内接种1-2d BALB/c乳鼠，每日观察乳鼠的存活状况，共21天。

结果显示(图8)，PBS免疫组的乳鼠分别在第12天和第11天全部死亡，而只嵌合病毒免疫组的乳鼠在21天全部存活，保护率为100％。这表明，以致死剂量颅内攻击乳鼠的情况下，嵌合病毒免疫组的的小鼠血清可为乳鼠提供完全保护，进一步表明嵌合病毒具有良好的免疫保护性。

Claims (10)

1.一种DNA分子，是将乙脑病毒的基因组RNA对应的cDNA中的蛋白质A的编码基因替换为蛋白质B的编码基因得到的重组DNA；

所述蛋白质A为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述蛋白质B为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述蛋白质A的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)序列表中序列3所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白质A的DNA分子；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白质A的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于：所述蛋白质B的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)序列表中序列4所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白质B的DNA分子；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白质B的DNA分子。

4.根据权利要求1-3中任一所述的DNA分子，其特征在于：

所述乙脑病毒的基因组RNA对应的cDNA序列如序列表中序列6所示。

5.根据权利要求1-4中任一所述的DNA分子，其特征在于：

所述重组DNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。

6.含有权利要求1-5中任一所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

7.一种重组病毒，其基因组RNA对应的cDNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。

8.一种疫苗，其活性成分为权利要求7所述的重组病毒。

9.权利要求7所述的重组病毒在制备疫苗中的应用。

10.根据权利要求8所述的疫苗或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述疫苗为预防登革病毒感染的疫苗。

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