CN108929877A

CN108929877A - 一种编码嵌合寨卡病毒的dna分子及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN108929877A
Application number: CN201710367347.3A
Authority: CN
Inventors: 秦成峰; 李晓峰; 王洪江; 董好龙; 邓永强
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2017-05-23
Publication date: 2018-12-04
Also published as: WO2018214692A1

Abstract

本发明属于生物工程领域，公开了一种编码嵌合寨卡病毒的DNA分子及其制备方法和用途，所述DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白C的编码序列、膜蛋白前体序列、缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列、包膜E蛋白β的羧基末端三个氨基酸残基的编码序列、非结构蛋白NS的编码序列和3’非编码区序列，其中，所述膜蛋白前体序列和包膜E蛋白α的编码序列来源于寨卡病毒；其余序列来源于乙脑病毒减毒株。所述嵌合病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与所述DNA分子的序列相同。本发明的DNA分子和/或嵌合病毒在预防寨卡病毒感染方面具有良好的应用前景。

Description

一种编码嵌合寨卡病毒的DNA分子及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种编码嵌合寨卡病毒的DNA分子及其制备方法和用途，具体地，涉及一种DNA分子及其制备方法与应用、嵌合病毒及其制备方法与应用。

背景技术

寨卡病毒(Zika Virus)是在1947年从非洲乌干达地区的Zika森林里的猴体中首次分离获得的。2007年以前，仅在非洲和亚洲地区报告了十余个寨卡感染人的病例。但在2007和2013年，西太平洋密克罗尼西亚的Yap岛和太平洋东南部的法属波利尼西亚相继出现大规模寨卡流行。2015年5月开始，巴西等美洲中南部国家和地区暴发了历史上最严重的寨卡疫情， WHO于2016年2月宣布此次疫情为“国际关注的突发公共卫生事件”。截止2016年11月，该病毒已波及全球70多个国家和地区，我国也先后报道了20多例输入性病例。新近的多项研究已经证实，该病毒感染与新生儿小头症和格林巴利综合症密切相关，并能够通过性传播。寨卡病毒已经突破了我们关于虫媒黄病毒的固有认识，其独特的致病性和传播方式引起全球关注，WHO也因此将其再次列为2017年需重点关注的病原体之一。

寨卡病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(flavivirus)，是一种可经蚊虫传播的黄病毒。黄病毒是有包膜的单股正链RNA病毒，包括许多重要的人畜共患病的病原体，如黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)、登革病毒和蜱传脑炎病毒等。黄病毒基因组含有一个单一开放读码框，编码3种结构蛋白：衣壳蛋白、膜蛋白(membrane protein，M)及其前体(precursor，prM)及包膜蛋白(envelope protein，E)，和7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。黄病毒的抗原蛋白主要是包膜蛋白、膜蛋白和非结构蛋白NS1。包膜E蛋白能诱导产生血凝抑制抗体和中和抗体，是主要的保护性抗原。prM蛋白见于未成熟的病毒颗粒，可能在病毒颗粒成熟过程中作为分子伴侣来协助包膜E蛋白的正确折叠。

疫苗是预防病毒性传染病最有效的手段。寨卡疫苗的研究进展十分迅速，先后有灭活疫苗、DNA疫苗和RNA疫苗完成临床前研究，显示出良好的应用前景，其中灭活疫苗也于2016 年7月在美国进入临床试验。与上述疫苗相比，减毒活疫苗因其成本低，特别是能模拟真实病毒感染，进而刺激产生有效的细胞和体液免疫应答而成为目前最有效的疫苗形式，黄热和乙脑减毒活疫苗即是成功的范例。然而，用于预防寨卡病毒感染的减毒活疫苗还有待进一步研究开发。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种新的能够用于制备预防寨卡病毒感染的减毒活疫苗的DNA分子与嵌合病毒及它们的制备方法和用途。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种DNA分子，该DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白C的编码序列、膜蛋白前体序列、缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列、包膜E蛋白β的羧基末端三个氨基酸残基的编码序列、非结构蛋白NS的编码序列和3’非编码区序列，其中，所述膜蛋白前体序列和包膜E蛋白α的编码序列来源于寨卡病毒；所述5’非编码区序列、衣壳蛋白C的编码序列、包膜E蛋白β的编码序列、非结构蛋白NS的编码序列和3’非编码区序列来源于乙脑病毒减毒株。

第二方面，本发明提供了一种制备上述DNA分子的方法，该方法包括将乙脑病毒减毒株基因组RNA对应的cDNA中缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白β的编码序列替换为寨卡病毒的膜蛋白前体序列和缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列。

第三方面，本发明提供了含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

第四方面，本发明提供了一种嵌合病毒，该嵌合病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与上述DNA分子的序列相同。

第五方面，本发明提供了一种制备上述嵌合病毒的方法，该方法包括将乙脑病毒减毒株的基因组中缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白β的编码序列替换为寨卡病毒的膜蛋白前体序列和缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列。

第六方面，本发明提供了一种疫苗，该疫苗的活性成分为上述嵌合病毒。

第七方面，本发明提供了上述DNA分子或者嵌合病毒在制备用于预防寨卡病毒感染的疫苗中的应用。

第八方面，本发明提供了一种预防寨卡病毒感染的方法，该方法包括为受试者接种上述疫苗。

本发明的DNA分子能够用于构建嵌合病毒，获得能够用于制备预防寨卡病毒感染的减毒活疫苗，其免疫原性和有效性俱佳。具体地，本发明提供的嵌合病毒具有如下多方面的优点：(1)安全性高；(2)减毒特征稳定，回复为野生型病毒的可能性极低；(3)所述嵌合病毒只在细胞质中复制(即RNA病毒基因组的复制、病毒的组装、成熟释放等过程均在细胞质中进行)，其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的危险；(4)能诱导产生针对所述嵌合病毒包膜蛋白所来源的黄病毒的良好的免疫应答；本发明所提供的嵌合病毒作为预防寨卡病毒感染具有良好的应用前景。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为ChinZIKV嵌合病毒全长cDNA克隆的构建示意图；

图2为ChinZIKV病毒特异蛋白的间接免疫荧光(IFA)结果图；

图3为ChinZIKV病毒在Vero细胞中的增殖特征图；

图4为ChinZIKV在Vero细胞中的遗传稳定性图；

图5为ChinZIKV感染小鼠后的病毒血症测试结果图；

图6为ChinZIKV诱导小鼠产生的体液免疫测试结果图；

图7为ChinZIKV诱导小鼠产生的中和抗体滴度结果；

图8为ChinZIKV免疫小鼠后对寨卡感染的保护效果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

第一方面，本发明提供的DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白C的编码序列、膜蛋白前体序列、缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列、包膜E蛋白β的羧基末端三个氨基酸残基的编码序列、非结构蛋白NS的编码序列和3’非编码区序列，其特征在于，所述膜蛋白前体序列和包膜E蛋白α的编码序列来源于寨卡病毒；所述5’非编码区序列、衣壳蛋白C的编码序列、包膜E蛋白β的编码序列、非结构蛋白NS的编码序列和3’非编码区序列来源于乙脑病毒减毒株。

其中，本发明中使用的“来源于”意指根据病毒的基因序列(RNA)构建某蛋白的编码序列(DNA)，并不限于从病毒基因组中提取获得基因序列，例如，来源于乙脑病毒减毒株的序列是指与乙脑病毒减毒株的基因序列具有90％以上(或92％以上、或95％以上、或96％以上、或97％以上、或98％以上、或99％以上，优选100％)的同一性的序列；“串联连接”是指将多核苷酸(或多肽)元件以有功能的方式连接，互不干涉表达或性能，被连接的多核苷酸(或多肽)序列是连续的。

本发明中，所述膜蛋白前体序列优选为能够编码蛋白质A的序列，所述蛋白质A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步优选地，所述膜蛋白前体序列为SEQ ID NO:2所示的序列或者与SEQ IDNO:2 具有90％以上(或92％以上、或95％以上、或96％以上、或97％以上、或98％以上、或99％以上，优选100％)的同一性的序列。

本发明中，来源于寨卡病毒的缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列优选为能够编码蛋白质B的序列，所述蛋白质B的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步优选地，来源于寨卡病毒的缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列为SEQ ID NO:4所示的序列或者与SEQ ID NO:4具有90％以上(或92％以上、或95％以上、或96％以上、或97％以上、或98％以上、或99％以上，优选100％)的同一性的序列。

本发明中，所述寨卡病毒优选为野生型的寨卡病毒，例如，寨卡病毒FSS13025株(Genebank登录号为：KU955593)。

本发明中，所述乙脑病毒减毒株优选为SA14-14-2减毒株。

SA14-14-2减毒株是由野毒株SA14通过在细胞和动物中不断传代和多轮空斑纯化最终获得。与野毒株SA14相比，SA14-14-2减毒株的毒力明显减弱，对成鼠和猴等动物的致病性几乎完全丧失。使用该减毒株研制的乙脑病毒减毒活疫苗在我国使用人群超过3亿，未见因疫苗接种而引发疾病的报告，安全性可靠。同时，本发明的发明人发现，SA14-14-2减毒株遗传特征稳定，基因组序列明确，与寨卡病毒具有十分类似的基因组结构特征，非常适合作为基因骨架用于嵌合疫苗的构建。SA14-14-2减毒株的基因组RNA对应的cDNA序列如SEQID NO:6所示。

本发明中，所述5’非编码区序列、衣壳蛋白C的编码序列、包膜E蛋白β的编码序列、非结构蛋白NS的编码序列和3’非编码区序列可以来源于同一株乙脑病毒减毒株，也可以来源于不同株的乙脑病毒减毒株。

所述5’非编码区序列可以为SEQ ID NO:6中第1-95位所示的序列。

所述衣壳蛋白C的编码序列可以为SEQ ID NO:6中第96-476位所示的序列。

所述包膜E蛋白β的羧基末端三个氨基酸残基的编码序列可以为SEQ ID NO:6中第2469-2477位所示的序列。

所述非结构蛋白NS的编码序列可以为SEQ ID NO:6中第2478-10394位所示的序列。

所述3’非编码区序列可以为SEQ ID NO:6中第10395-10977位所示的序列。

根据本发明最优选的实施方式，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

第二方面，本发明提供的制备上述DNA分子的方法包括将乙脑病毒减毒株基因组RNA 对应的cDNA中缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白β的编码序列替换为(串联连接的)寨卡病毒的膜蛋白前体序列和缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列，从而获得所述DNA分子。

第三方面，本发明还提供了含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

其中，所述表达盒可以通过将本领域常用的报道基因与本发明的DNA分子相连获得。

所述重组载体既可以为重组克隆载体，也可为重组表达载体。根据本发明的一种实施方式，所述重组载体可以为pANCR-L1载体的多克隆位点(如Asc I和Xho I)间插入有所述 DNA分子的重组载体。所述pANCR-L1载体的核苷酸序列例如，如SEQ ID NO:7所示。

所述pANCR-L1载体的构建方法可以包括以下步骤：

1)以克隆质粒pSP64为模板，扩增得到第2757-2982位的Phage sp6区的DNA片段；

2)以克隆质粒pACYC177为模板，扩增得到第1-2335位的DNA片段；

3)将步骤2)得到的DNA片段和步骤1)中得到的DNA片段顺次连接后，即得到pANCR-L1载体。

所述转基因细胞系可以为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可以通过将本发明的重组载体转入细胞(如BHK-21细胞或Vero细胞)中而获得。

所述重组菌可以为含有本发明的重组载体的菌株，例如，可以通过将本发明的重组载体转入感受态菌株(如大肠杆菌感受态菌株MC1061或Top10)中而获得。

本发明的重组病毒可以通过将所述重组载体导入离体的哺乳动物细胞(如BHK-21细胞) 中得到。

第四方面，本发明提供的嵌合病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与上述DNA分子的序列相同。

第五方面，本发明提供的制备上述嵌合病毒的方法包括将乙脑病毒减毒株的基因组中缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白β的编码序列替换为(串联连接的)寨卡病毒的缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列。

第六方面，本发明提供的疫苗的活性成分为上述嵌合病毒。其中，所述疫苗还可以含有本领域常规使用的各种佐剂，例如，铝盐佐剂和蛋白类佐剂等。

第八方面，本发明提供的预防寨卡病毒感染的方法包括为受试者接种上述疫苗。所述疫苗的接种量可以根据抗体产生情况进行确认。所述受试者可以为人和/或鼠。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。室温指25℃的温度下。

(乙脑病毒)SA14-14-2减毒株：购自成都生物制品研究所，在“吴永林、赵宇、黄玉仙等，乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在小鼠体内的动态分布，中国生物制品学杂志，2007年03期”一文中也有记载。

克隆质粒pSP64：购自Promega公司；克隆质粒pACYC177：购自Fermentas公司；pGEM-T-Easy克隆载体：Promega公司产品。

大肠杆菌感受态菌株MC1061：购自Invitrogen公司，产品目录号为CC66303；大肠杆菌感受态细菌Top10：天根生物技术公司产品。

BHK-21细胞：购自ATCC，产品目录号为CCL-10；Vero细胞：购自ATCC，产品目录号为CCL-81)。

ZIKV小鼠单抗：2A10G6(Dai,L.,et al.(2016)."Structures of the Zika VirusEnvelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly ProtectiveAntibody."Cell Host Microbe 19(5): 696-704.)；JEV病毒非结构蛋白NS1单抗购自abcam公司，产品目录号为ab416751；FITC 标记的羊抗鼠IgG抗体：中杉金桥公司，货号ZF-0512。

BALB/c小鼠：购自军事医学科学院实验动物中心。

实施例1

本实施例用来说明本发明的DNA分子及含有本发明的DNA分子的重组载体的构建方法。

(1)SA14-14-2减毒株基因组cDNA的制备

按照RNeasy试剂盒(Qiagen公司产品)说明提取SA14-14-2减毒株的基因组RNA(即： JEV-RNA)。具体提取步骤如下：

将210μl病毒悬液与700μl的RLT(RNeasy Lysis Buffer)和7μlβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)的混合液震荡混匀，加490μl无水乙醇后剧烈混匀，得到裂解液，将裂解液加入吸附柱，12000rpm离心15s；700μl的RW1(RNeasy Wash Buffer)洗柱一次，12000 rpm离心15s；500μl的RPE(RPE是RNeasy试剂盒中的洗涤液)洗柱2次，10000rpm离心30s；空柱10000rpm离心1min。加50μl无RNase的水，静置2min，12000rpm离心1min。加2μl RNase抑制剂。混匀后置-80℃下待用。

以测序引物R13为反转录引物进行cDNA的合成。

引物R13：5′-AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACA-3′(SEQ ID NO:8)。

反转录反应的组分如下：JEV-RNA 15μl；R13(10μM)1.25μl；dNTPs(2.5mM each)10μl；水(RNase free)6.25μl。将上述反应组分混合均匀，置65℃5min，冰浴2min。补加如下组分：5×First-strand Buffer 10μl；DDT(0.1mM)2.5μl；RNase抑制剂2.5μl；Superscript III 2.5μl。55℃60min；70℃，15min。加1μl(2U)RNase H，37℃，20min。-20℃保存待用。

(2)乙脑病毒SA14-14-2减毒株基因组5′半分子的构建与鉴定

以上述步骤(1)制备的乙脑病毒基因组cDNA为模板，以Asc I(+)和BspE I(-)为引物，用LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)进行PCR扩增。

Asc I(+)：5′-GCTGGCGCGCCatttaggtgacactatagagaagtttatctgtgtgaac-3′(SEQID NO:9，下划线部分为Asc I的识别序列，斜体为Sp6启动子，其后的序列为SEQ ID NO:6的第1-20位)

BspE I(-)：5′-CCGTACCAGCAGCCATTTTCTGTCCGGAATCGTAGG-3′(SEQ ID NO:10，该序列为SEQ ID NO:6的第3437-3472位，其中下划线部分为BspE I的识别序列)

PCR反应体系组成如下：10×LA Buffer 5μl；正向引物(10μM)2μl；反向引物(10μM) 2μl；dNTPs(2.5mM each)8μl；乙脑病毒基因组cDNA 3μl；LA Taq DNA聚合酶0.5μl；水29.5μl。

反应条件如下：94℃预变性4min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸3min 50s，30个循环，再于72℃10min。

凝胶回收PCR所得的大小约为3400bp的目的片段。用Asc I和BspE I酶切该目的片段，胶回收后将其与经过同样双酶切的克隆载体pANCR-L1骨架大片段相连，将连接产物转化大肠杆菌感受态菌株MC1061。提取质粒后用Asc I和BspE I进行酶切鉴定，将酶切图谱正确(得到大小约为3400bp和2600bp的两个片段)的质粒送英俊公司测序。测序结果表明在载体 pANCR-L1的Asc I和BspE I酶切位点间插入了序列表SEQ ID NO:6中第1位到3450位核苷酸所示的DNA片段序列，该DNA片段编码的蛋白质为SA14-14-2减毒株的衣壳蛋白C、缺失了包膜E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E蛋白(prM-EΔ3，该氨基酸序列的编码基因为序列表中SEQ ID NO:6的第477-2468位所示的DNA分子)、包膜E蛋白羧基末端的3 个氨基酸残基(E3)和非结构蛋白NS1，说明重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为 pANCR-JEV-5，将其作为JEV基因组5′半分子克隆。

其中，克隆载体pANCR-L1是按照如下方法构建得到的：

1)以克隆质粒pSP64为模板，用引物A和引物B进行PCR扩增，得到第2757-2982位的Phage sp6区，将扩增得到的DNA片段命名为pSP64-1；

引物A：5’-GACGTGTCGACGCGGCCGCGCTAGCGATGACCCTGCTG-3’(SEQ ID NO: 11，下划线部分为酶切位点Sal I)；

引物B：5’-TCAGTCCGGAGGCGCGCCCGTATGTGTATGATACATAAG-3’(SEQ ID NO: 12，下划线部分为酶切位点BspE I，斜体部分为Asc I的识别序列)。

2)以克隆质粒pACYC177为模板，用引物C和引物D进行PCR扩增，得到第1-2335 位区域，将扩增得到的DNA片段命名为pACYC177-2；

引物C：5’-TACGGGCGCGCCTCCGGACTCGAGCAAGACGTTTCC-3’(SEQ ID NO:13，下划线部分为酶切位点BspE I，斜体部分为Xho I的识别序列)；

引物D：5’-GCCGCGTCGACACGTCAGGTGGCACTTTTCG-3’(SEQ ID NO:14，下划线部分为酶切位点Sal I)。

3)将步骤(1)中获得的DNA片段pSP64-1和步骤(2)中获得的DNA片段pACYC177-2进行连接，步骤如下：

用BspE I和Sal I分别双酶切pSP64-1和pACYC177-2，将酶切所得片段连接后转化大肠杆菌感受态菌株MC1061，提取质粒后用Age I进行酶切鉴定，将酶切图谱正确(得到大小约为324bp和2265bp的片段)的质粒进行测序。测序结果表明该重组质粒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，其中第1-2335位为克隆质粒pACYC177的第1-2335位序列；第2350-2575位为克隆质粒pSP64的Phage sp6区；说明重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为pANCR-L1。

(3)SA14-14-2减毒株基因组3′半分子的构建与鉴定

以步骤1制备的乙脑病毒基因组cDNA为模板，用配对引物pBRJEV-7289(+)和pBRJEV-7289(-)，以及pBRJEV-7289-3U(+)和pBRJEV-7289-3U(-)分别进行PCR扩增。两对引物扩增的目的片段分别包含乙脑基因组cDNA(SEQ ID NO:6)的第3099-7299位核苷酸和第7278-10977位核苷酸区段。

pBRJEV-7289(+)：5′-GGCGCGCCGACACATGGAAACTTGAGAGGGCAGT-3′(SEQ ID NO:15，下划线部分为Asc I的识别序列，其后的序列为SEQ ID NO:6的第3099-3124位)；

pBRJEV-7289(-)：5′-GCCATCCCGGGAGCATGTA-3′(SEQ ID NO:16，下划线部分为XmaI的识别序列，该序列为SEQ ID NO:6的第7281-7299位的反向互补序列)；

pBRJEV-7289-3U(+)：5′-GGCGCGCCCTCGAGGGTACATGCTCCCGGGAT-3′(SEQ ID NO:17，下划线部分为Asc I的识别序列，斜体序列为SEQ ID NO:6的第7278-7296位，斜体下划线序列为Xma I的识别序列)；

pBRJEV-7289-3U(-)：5′-CTCGAGAGATCCTGTGTTCTTCCTCAC-3′(SEQ ID NO:18，下划线部分为Xho I的识别序列，其后的序列为SEQ ID NO:6的第10957-10977位的反向互补序列)。

PCR反应体系组成：10×LA buffer 5μl；正向引物(10μM)2μl；反向引物(10μM)2 μl；dNTPs(2.5mM each)8μl；乙脑病毒基因组cDNA 3μl；LA Taq DNA聚合酶0.5μl；水29.5μl。

反应条件：94℃预变性4min，94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸4min 30s，每个循环退火温度降0.5℃，共10个循环；退火温度降至58℃后再进行20个循环；最后于72℃10min。

凝胶回收PCR所得的大小约为4209bp(采用引物为pBRJEV-7289(+)和pBRJEV-7289(-)) 和3719bp(采用引物为pBRJEV-7289-3U(+)和pBRJEV-7289-3U(-))目的产物，分别将其连入pGEM-T-Easy克隆载体，转化大肠杆菌感受态细菌Top10，经蓝白斑筛选出重组质粒。将测序结果与预期一致的重组质粒分别命名为pT-3099-7299和pT-7279-10977。进一步用Asc I 和Xma I酶切pT-3099-7299和pT-7279-10977，分别回收4201bp和6716bp的目的片段后进行连接，转化大肠杆菌感受态细菌Top10。提取质粒后用Mlu I和Xho I进行酶切鉴定，将酶切图谱正确(得到大小约为2816bp和8079bp的两个片段)的重组质粒命名为pT-3099-10977。

用BspE I和Xho I酶切重组质粒pT-3099-10977，回收大小约为7532bp的片段，同时，用BspE I和Xho I酶切克隆载体pANCR-L1，回收大小约为2567bp的骨架片段，将回收的目的片段进行连接，进一步转化大肠杆菌感受态菌株MC1061，再用EcoR V酶切鉴定重组质粒，将酶切图谱正确(得到大小约为4129bp和5970bp的片段)的克隆进行测序。测序结果表明在载体pANCR-L1的BspE I和Xho I的酶切位点间插入了序列表SEQ ID NO:6中第 3445-10977位所示的DNA片段序列，该DNA片段编码的蛋白为SA14-14-2减毒株的部分非结构蛋白NS，说明重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为pANCR-JEV-3，将其作为JEV 基因组3′半分子克隆。

(4)含有JEV全长基因组的重组质粒pAJE70的构建与鉴定

用Asc I和BspE I分别酶切pANCR-JEV-5和pANCR-JEV-3半分子，分别回收3450bp和10895bp的片段，将回收的目的片段进行连接，进一步转化大肠杆菌感受态菌株MC1061，再用EcoR V酶切鉴定重组质粒，将酶切图谱正确(得到大小约为4129bp和5970bp的片段)的克隆进行测序。测序结果表明在载体pANCR-L1的Asc I和Xho I的酶切位点间插入了序列表SEQ ID NO:6中第1-10977位所示的DNA片段序列，该DNA片段为SA14-14-2减毒株的完整基因组，将该重组质粒命名为pAJE70。

(5)寨卡病毒基因组cDNA的制备

选取寨卡病毒(柬埔寨株，也称FSS13025株，其基因组序列的Genebank登录号为：KU955593)，按照RNeasy试剂盒(Qiagen公司产品)的说明书提取ZIKV的基因组RNA(即：ZIKV-RNA)。具体提取步骤参见步骤(1)中SA14-14-2减毒株基因组RNA的提取；

将获得的ZIKV-RNA按照步骤(1)的方式进行反转录，其中反转录引物为ZIKV-R14(如后所示)。

(6)包含ZIKV病毒prME基因的JEV/ZIKV嵌合片段的构建

选用Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)，以上述步骤(4)得到的ZIKV病毒基因组cDNA为模板，用引物ZIKV-prME-F1和ZIKV-prME-R1进行PCR扩增，获得2007bp 的ZIKV病毒的缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prME编码区段，命名为 ZIKV-prM-EΔ3；以SA14-14-2减毒株基因组5′半分子克隆pANCR-JEV-5为模板，用引物 ZIKV-NS1-F和BspEI(-)进行PCR扩增，获得994bp的目的片段，该片段编码的蛋白为JEV 的E蛋白羧基末端3个氨基酸残基和非结构蛋白NS，将其命名为JEV-NS；选用LA Taq DNA 聚合酶(TaKaRa公司产品)，将ZIKV-prME和JEV-NS通过融合PCR获得2989bp的包含 ZIKV病毒的缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prME编码区段(其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，该氨基酸序列的编码基因为序列表中SEQ ID NO:4所示的DNA分子)和JEV的包膜E蛋白羧基末端3个氨基酸残基和非结构蛋白NS的ChinZIKV嵌合片段，命名为JEV/ZIKV。

其中，相关引物序列如下：

ZIKV-prME-F1：5`-CATAGCTTGTGCAGGCGCCGTGGAGGTCACTAGACGTGGGAATGCAT- 3`(SEQ ID NO:19)

ZIKV-prME-R1：5`-CAGTGTCAGCATGCACGGCTGTGGATAAGAAGATCAACACTCCCCCTA -3`(SEQ ID NO:20)

ZIKV-NS1-F：5`-TAGGGGGAGTGTTGATCTTCTTATCCACAGCCGTGCATGCTGACACTG- 3`(SEQ ID NO:21)

BspEI(-)：5`-CCGTACCAGCAGCCATTTTCTGTCCGGAATCGTAGG-3`(SEQ ID NO:10)

扩增ZIKV-prME和JEV-NS的反应体系组成如下：

反应条件如下：98℃预变性4min，98℃变性15s、55℃退火20s、72℃延伸，延伸时间按2kb/min计算，共30个循环，再于72℃10min。

融合PCR扩增ChinZIKV嵌合片段的反应体系组成如下：

将片段ZIKV-prME和JEV-NS进行融合的反应条件如下：首先98℃预变性4min，98℃变性15s、55℃退火20s、72℃延伸2min，共10个循环；之后补加引物ZIKV-prME-F1和 BspEI(-)进行PCR扩增，反应条件为98℃预变性4min，98℃变性30s、55℃退火20s、72℃延伸2min，共30个循环；再于72℃10min。

(7)ChinZIKV嵌合病毒基因组全长cDNA克隆的构建与序列测定

用Kas I和BspE I依次酶切嵌合片段JEV/ZIKV和pAJE70，后者回收10584bp的片段，再与酶切处理的JEV/ZIKV进行连接反应，进而转化感受态菌株MC1061。挑取克隆后用EcoR V进行酶切鉴定，酶切后的片段大小分别为2782，5350和9479bp，与预期一致。病毒全基因测序的结果表明，重组质粒构建正确。将该重组质粒命名为pChinZIKV，将其作为JEV/ZIKV 型嵌合病毒全长cDNA克隆质粒，ChinZIKV嵌合病毒全长cDNA克隆的构建示意图如图1所示。

实施例2

本实施例用来说明ChinZIKV嵌合病毒的拯救，即制备ChinZIKV嵌合病毒。

(1)ChinZIKV嵌合病毒全长cDNA克隆的体外转录

用质粒大提试剂盒(购自Invitrogen公司)抽提嵌合病毒的全长cDNA克隆质粒pChinZIKV，经XhoI酶切后再用酚氯仿抽提，将线性化质粒定量并分装后置-20℃冻存待用。

以线性化后的嵌合病毒全长cDNA克隆质粒为模板，用SP6RiboMAX Express LargeScale RNA Production Systems(Promega公司产品)进行体外转录，得到转录体RNA。反应体系与条件如下：

37℃反应3h。补加2μl的DNase后于37℃作用30min。

(2)嵌合病毒的拯救

用脂质体Lipofectamin 3000(购自Invitrogen公司)将转录体RNA转染单层BHK-21细胞(购自ATCC，产品目录号为CCL-10)，方法如下：首先将250μl的OPTI-MEM与6μl的脂质体混匀，于室温放置5min后再与10μl的RNA(5μg)和250μl的OPTI-MEM混合，室温放置20min。将上述混合液加入到6孔板中的1孔，同时补加200μl的OPTI-MEM。37℃、 5％CO₂孵育6h。移去上清，补加含2％FBS的DMEM维持液，置37℃、5％CO₂孵箱。待细胞出现病变后，离心收集培养液上清。将上清重新接种于BHK-21细胞，待细胞出现病变后，离心收集上清。冻存于-80℃，作为ChinZIKV嵌合病毒种子液。

实施例3

本实施例用来检测ChinZIKV嵌合病毒特异蛋白，从而说明本发明的嵌合病毒能同时表达JEV病毒的非结构蛋白和ZIKV病毒的包膜E蛋白。

(1)ChinZIKV嵌合病毒感染的BHK-21细胞抗原片的制备

单层BHK-21细胞铺于载玻片，于37℃，5％的CO₂孵箱中培养12h。嵌合病毒感染后48h收取载玻片。之后将抗原片置于-20℃的丙酮中固定60min。晾干后放于-20℃冰箱密封待用。

(2)ZIKV病毒特异蛋白的检测

分别用鼠源ZIKV的E蛋白多克隆抗体和JEV的非结构蛋白NS1单抗，通过间接免疫荧光(IFA)对嵌合病毒感染的BHK-21细胞中的病毒特异蛋白进行检测。方法如下：将上述抗体按适当比例稀释，与抗原片中的BHK-21细胞在37℃孵育1-2h，PBS缓冲液(10mM K₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，135mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)振荡洗涤3次，每次10min，室温晾干。在病毒抗原片上加入PBS溶液800倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，置37℃作用 60min，然后将病毒抗原玻片放入PBS缓冲液振荡洗涤3次，每次10min，室温晾干，加入 DAPI(细胞核染料)，静置3min，移去DAPI，PBS缓冲液震荡洗涤一次，荧光显微镜下观察结果。间接免疫荧光的结果如图2所示，用ZIKV的E蛋白抗体能够同时在ChinZIKV和 ZIKV感染的BHK-21细胞中检测到阳性信号，JEV的NS1蛋白抗体仅能在ChinZIKV感染的细胞中检测到阳性信号。该结果表明，ChinZIKV能够同时表达ZIKV的E蛋白和JEV的非结构蛋白NS1。

实施例4

本实施例用来说明本发明的嵌合病毒在不同细胞内的增殖特征。

为了观察嵌合病毒在鼠类和灵长类细胞系中的增殖特征，将嵌合病毒以MOI(multiple of infection)＝1接种24孔板中的Vero细胞，置于37℃、5％CO₂的培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，补加含2％FBS的DMEM，置于37℃的5％CO₂的培养箱培养。于接种后第24、 48、72、96h收取细胞上清液，用空斑滴定法测定病毒滴度，绘制一步生长曲线(图3)。结果显示，嵌合病毒感染Vero细胞后在96h达到复制峰值，滴度为10^6.11PFU/ml。

实施例5

本实施例用来说明本发明的嵌合病毒的遗传稳定性。

通过如下步骤观察嵌合病毒在细胞连续传代后的基因毒力稳定性：

(1)嵌合病毒在Vero细胞上连续传代

将嵌合病毒以MOI＝0.01接种于铺于6孔板的单层Vero细胞，4d后收集细胞上清，再将 500μl上清接种于铺于6孔板的单层Vero细胞。按照上述方法连续传代6次后，将第三代和第六代的嵌合病毒命名为P3和P6(按照实施例4的方法得到P6的生长曲线如图3所示)。于-80℃冻存待用。

(2)不同代次嵌合病毒的空斑特征比较

分别将初始嵌合病毒以及ChinZIKV-P3和ChinZIKV-P6梯度稀释，与六孔板上观察空斑形态是否一致(方法同实施例4)。结果如图4，三个代次病毒均可形成大小均一，边缘明确的空斑，空斑直径不存在统计学差异，说明细胞传代不影响嵌合病毒的空斑形态。

(3)不同代次嵌合病毒prM和包膜E蛋白基因序列分析

提取第六代嵌合病毒的RNA，以ZIKV-R14为反转录引物制备cDNA，再分别以引物F405(+)和ZIKV-prME-R1、ZIKV-NS1-F和BspEI(-)扩增嵌合病毒的prM和包膜E蛋白编码区段并测序。将该代次病毒序列与第一代病毒进行序列比对，结果显示，经细胞传代后所得病毒的prME序列保持一致，这表明经过细胞传代，嵌合病毒均具有基因稳定性。其中，相关引物序列如下：

ZIKV-R14：5`-TTCTCCCTTTCCATGGATTGACC-3`(SEQ ID NO:22)

F405(+)：5`-AAAAGAGGAGGAAATGAAGGC-3`(SEQ ID NO:23)

ZIKV-prME-R1(-)：5`-CAGTGTCAGCATGCACGGCTGTGGATAAGAAGATCAACACTCC CCCTA-3`(SEQ ID NO:24)

实施例6

本实施例用来说明本发明的嵌合病毒在小鼠体内高度减毒

将10³PFU/只的剂量将野生型和嵌合病毒经腹部注射方式感染3周龄BALB/c小鼠，每组6只小鼠，同时以PBS作为阴性对照。于感染后1-3天连续尾静脉采血，通过实时定量PCR方法检测小鼠血清中的病毒载量。小鼠的病毒血症结果如图5所示，野生型寨卡病毒感染小鼠后能产生明显的病毒血症，病毒载量在感染后第一天达到峰值，并持续3天；嵌合病毒感染小鼠后未检测到病毒血症，表明嵌合寨卡病毒对小鼠致病性显著降低，具有明确的减毒特征。

实施例7

本实施例用来说明本发明的嵌合病毒的免疫原性和免疫保护效果。

通过以下步骤评价嵌合病毒的免疫原性：

(1)嵌合病毒经腹部皮下注射方式免疫BALB/c小鼠

首先将嵌合病毒(10⁵PFU/只)腹部皮下接种3周龄BALB/c小鼠，每组6只小鼠，同时以PBS作为阴性对照。免疫28天后，尾静脉取血。于4℃下静置3h后离心收取血清，56℃灭活30min，-20℃冻存待用。

(2)免疫小鼠血清中的ZIKV病毒特异IgG抗体效价的测定

将免疫血清制备成1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400和1:12800的稀释液，再通过酶联免疫法(ELISA)测定血清中的针对ZIKV病毒的IgG抗体效价，方法如下：将10⁵PFU的ZIKV病毒稀释到包被液中，100ul/孔加入到96孔ELISA板中(Costar)， 4℃静置过夜。移去包被液，PBST振荡清洗后，使用5％BSA(PBST稀释)封闭1h后，PBST 振荡清洗，加入梯度稀释的免疫血清后，37℃孵育1h，PBST振荡清洗三次，每次3min。加入辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠二抗(1:1000)，37℃孵育45min，PBST振荡清洗三次，每次3min。随后每孔加入100ul的TMB底物(Qiagen)，避光反应15min后加入50ul 5％H₂SO₄终止液终止反应，在450nm吸光值下读取数值。实验结果如图6所示，重组寨卡病毒免疫小鼠后能产生滴度为1/3675(几何平均值)的IgG抗体，显示出良好的免疫原性。

(3)免疫小鼠血清中的ZIKV病毒中和抗体效价的测定

采用空斑减少中和试验测定血清中的中和抗体效价。首先将免疫后第28d的小鼠血清制备成1:20、1:40、1:80、1：160和1:320的悬液，与等体积的含大约100PFU的ZIKV病毒悬液混合，37℃孵育1h。再将混合液接种于12孔板中的BHK-21细胞。通过空斑试验对血清病毒混合液中的病毒颗粒进行计数，计算血清中的中和抗体效价(图7)。结果显示，嵌合病毒诱导的中和抗体效价可达1:96(几何平均值)。上述数据表明，嵌合病毒还能有效诱发小鼠产生具有保护作用的中和抗体。

通过以下步骤评价嵌合病毒的免疫保护效果：

以10³PFU/只的剂量将野生型病毒感染免疫小鼠，于感染后1-3天连续尾静脉采血。通过实时定量RT-PCR法检测血清中的病毒载量。如图8所示，ChinZIKV免疫组的小鼠血清中为检测到病毒核酸，但PBS组的小鼠血清中则在感染后第一天即出现高水平的病毒RNA，并且持续3天。

以上实施例表明，本发明的嵌合病毒安全性高、减毒特征稳定且能诱导良好的免疫应答。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列

SEQ ID NO:1：ZIKV的膜蛋白前体序列的氨基酸序列

SEQ ID NO:2：ZIKV的膜蛋白前体序列的编码(核苷酸)序列

SEQ ID NO:3：ZIKV的prM-EΔ3的氨基酸序列

SEQ ID NO:4：ZIKV的prM-EΔ3的编码(核苷酸)序列

SEQ ID NO:5：重组DNA分子的核苷酸序列

SEQ ID NO:6：SA14-14-2减毒株的基因组RNA对应的cDNA序列

SEQ ID NO:7：pANCR-L1载体的核苷酸序列

SEQ ID NO:8：引物R13

SEQ ID NO:9：Asc I(+)

SEQ ID NO:10：BspE I(-)

SEQ ID NO:11：引物A

SEQ ID NO:12：引物B

SEQ ID NO:13：引物C

SEQ ID NO:14：引物D

SEQ ID NO:15：pBRJEV-7289(+)

SEQ ID NO:16：pBRJEV-7289(-)

SEQ ID NO:17：pBRJEV-7289-3U(+)

SEQ ID NO:18：pBRJEV-7289-3U(-)

SEQ ID NO:19：ZIKV-prME-F1

SEQ ID NO:20：ZIKV-prME-R1

SEQ ID NO:21：ZIKV-NS1-F

SEQ ID NO:22：ZIKV-R14

SEQ ID NO:23：F405(+)

SEQ ID NO:24：ZIKV-prME-R1(-) 。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120> 一种编码嵌合寨卡病毒的DNA分子及其制备方法和用途

<130> I44214JSY

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 168

<212> PRT

<213> ZIKV

<400> 1

Val Glu Val Thr Arg Arg Gly Asn Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Asp Arg

1 5 10 15

Ser Asp Ala Gly Glu Ala Ile Ser Phe Pro Thr Thr Met Gly Met Asn

20 25 30

Lys Cys Tyr Ile Gln Ile Met Asp Leu Gly His Met Cys Asp Ala Thr

35 40 45

Met Ser Tyr Glu Cys Pro Met Leu Asp Glu Gly Val Glu Pro Asp Asp

50 55 60

Val Asp Cys Trp Cys Asn Thr Thr Ser Thr Trp Val Val Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Cys His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr

85 90 95

Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp

100 105 110

Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Leu Ile Arg Val Glu Asn Trp

115 120 125

Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ile Ala Trp

130 135 140

Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val Met Ile

145 150 155 160

Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser

165

<210> 2

<211> 504

<212> DNA

<213> ZIKV

<400> 2

gtggaggtca ctagacgtgg gaatgcatac tatatgtact tggacagaag cgatgctggg 60

gaggccatat cttttccaac cacaatgggg atgaataagt gttatataca gatcatggat 120

cttggacaca tgtgtgatgc caccatgagc tatgaatgcc ctatgctgga tgagggggta 180

gaaccagatg acgtcgattg ttggtgcaac acgacgtcaa cttgggttgt gtacggaacc 240

tgccaccaca aaaaaggtga agcacggaga tctagaagag ctgtgacgct cccctcccat 300

tccactagga agctgcaaac gcggtcgcag acctggttgg aatcaagaga atacacaaag 360

cacctgatta gagtcgaaaa ttggatattc aggaaccctg gcttcgcgtt agcagcagct 420

gccatcgctt ggcttttggg aagctcaacg agccaaaaag tcatatactt ggtcatgata 480

ctgctgattg ccccggcata cagc 504

<210> 3

<211> 501

<212> PRT

<213> ZIKV

<400> 3

Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser

1 5 10 15

Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr

20 25 30

Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr

35 40 45

Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser

50 55 60

Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala

65 70 75 80

Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu

85 90 95

Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser

100 105 110

Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys

115 120 125

Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His

130 135 140

Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr

145 150 155 160

Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala

165 170 175

Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro

180 185 190

Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn

195 200 205

Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro

210 215 220

Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu

225 230 235 240

Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val

245 250 255

Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala

260 265 270

Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His

275 280 285

Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser

290 295 300

Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu

305 310 315 320

Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp

325 330 335

Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu

340 345 350

Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser

355 360 365

Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp

370 375 380

Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp

385 390 395 400

His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg

405 410 415

Gly Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly

420 425 430

Ser Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile

435 440 445

Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser

450 455 460

Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn Thr Lys

465 470 475 480

Asn Gly Ser Ile Ser Leu Met Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu Ile

485 490 495

Phe Leu Ser Thr Ala

500

<210> 4

<211> 1503

<212> DNA

<213> ZIKV

<400> 4

atcaggtgca taggagtcag caatagggac tttgtggaag gtatgtcagg tgggacttgg 60

gttgatgttg tcttggaaca tggaggttgt gttaccgtaa tggcacagga caaaccgact 120

gtcgacatag agctggttac aacaacagtc agcaacatgg cggaggtaag atcctactgc 180

tatgaggcat caatatcgga catggcttcg gacagccgct gcccaacaca aggtgaagcc 240

taccttgaca agcaatcaga cactcaatat gtctgcaaaa gaacgttagt ggacagaggc 300

tggggaaatg gatgtggact ttttggcaaa gggagcctgg tgacatgcgc taagtttgct 360

tgctctaaga aaatgaccgg gaagagcatc cagccagaga atctggagta ccggataatg 420

ctgtcagttc atggctccca gcacagtggg atgatcgtta atgatacagg acatgaaact 480

gatgagaata gagcgaaggt tgagataacg cccaattcac caagagccga agccaccctg 540

gggggttttg gaagcctagg acttgattgt gaaccgagga caggccttga cttttcagat 600

ttgtattact tgactatgaa taacaagcac tggttggttc acaaggagtg gttccacgac 660

attccattac cttggcatgc tggggcagac accggaactc cacactggaa caacaaagaa 720

gcactggtag agttcaagga cgcacatgcc aaaaggcaga ctgtcgtggt tctagggagt 780

caagaaggag cagttcacac ggcccttgct ggagctctgg aggctgagat ggatggtgca 840

aagggaaggc tgtcctctgg ccacttgaaa tgtcgcctga aaatggataa acttagattg 900

aagggcgtgt catactcctt gtgtaccgca gcgttcacat tcactaagat cccggctgaa 960

acactgcacg ggacagtcac agtggaggta cagtacgcag ggacagatgg accttgcaag 1020

gttccagctc agatggcggt ggacatgcaa actctgaccc cagttgggag gttgataacc 1080

gctaaccctg taatcactga aagcactgag aactccaaga tgatgctgga actggatcca 1140

ccatttgggg actcttacat tgtcatagga gtcggggaaa agaagatcac ccaccactgg 1200

cacaggagtg gcagcaccat tggaaaagca tttgaagcca ctgtgagagg tgccaagaga 1260

atggcagtct tgggagacac agcctgggac tttggatcag ttgggggtgc tctcaactca 1320

ctgggcaagg gcatccatca aatttttgga gcagctttca aatcattgtt tggaggaatg 1380

tcctggttct cacaaattct cattggaacg ttgctggtgt ggttgggtct gaatacaaag 1440

aatggatcta tttcccttat gtgcttggcc ttagggggag tgttgatctt cttatccaca 1500

gcc 1503

<210> 5

<211> 10992

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 5

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgtag agaagaatcg agagattagt 60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg 120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg 180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg gccagtacgt ttcgtgctgg 240

ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt tcaggccgat 300

ggaaagcagt ggaaaagagt gtggcaatga aacatcttac tagtttcaaa cgagaacttg 360

gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg 420

aaggctcaat catgtggctc gcgagcttgg cagttgtcat agcttgtgca ggcgccgtgg 480

aggtcactag acgtgggaat gcatactata tgtacttgga cagaagcgat gctggggagg 540

ccatatcttt tccaaccaca atggggatga ataagtgtta tatacagatc atggatcttg 600

gacacatgtg tgatgccacc atgagctatg aatgccctat gctggatgag ggggtagaac 660

cagatgacgt cgattgttgg tgcaacacga cgtcaacttg ggttgtgtac ggaacctgcc 720

accacaaaaa aggtgaagca cggagatcta gaagagctgt gacgctcccc tcccattcca 780

ctaggaagct gcaaacgcgg tcgcagacct ggttggaatc aagagaatac acaaagcacc 840

tgattagagt cgaaaattgg atattcagga accctggctt cgcgttagca gcagctgcca 900

tcgcttggct tttgggaagc tcaacgagcc aaaaagtcat atacttggtc atgatactgc 960

tgattgcccc ggcatacagc atcaggtgca taggagtcag caatagggac tttgtggaag 1020

gtatgtcagg tgggacttgg gttgatgttg tcttggaaca tggaggttgt gttaccgtaa 1080

tggcacagga caaaccgact gtcgacatag agctggttac aacaacagtc agcaacatgg 1140

cggaggtaag atcctactgc tatgaggcat caatatcgga catggcttcg gacagccgct 1200

gcccaacaca aggtgaagcc taccttgaca agcaatcaga cactcaatat gtctgcaaaa 1260

gaacgttagt ggacagaggc tggggaaatg gatgtggact ttttggcaaa gggagcctgg 1320

tgacatgcgc taagtttgct tgctctaaga aaatgaccgg gaagagcatc cagccagaga 1380

atctggagta ccggataatg ctgtcagttc atggctccca gcacagtggg atgatcgtta 1440

atgatacagg acatgaaact gatgagaata gagcgaaggt tgagataacg cccaattcac 1500

caagagccga agccaccctg gggggttttg gaagcctagg acttgattgt gaaccgagga 1560

caggccttga cttttcagat ttgtattact tgactatgaa taacaagcac tggttggttc 1620

acaaggagtg gttccacgac attccattac cttggcatgc tggggcagac accggaactc 1680

cacactggaa caacaaagaa gcactggtag agttcaagga cgcacatgcc aaaaggcaga 1740

ctgtcgtggt tctagggagt caagaaggag cagttcacac ggcccttgct ggagctctgg 1800

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aatcattgtt tggaggaatg tcctggttct cacaaattct cattggaacg ttgctggtgt 2400

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accctgagca tccataccgc acttggacat accacggaag ctatgaagtg aaggctactg 8640

gctcagccag ctctctcgtc aacggagtgg tgaagctcat gagcaaacct tgggacgcca 8700

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gggacacgcc atccccaaaa ccttgctcaa aaggagacac cactacagga gtctaccgaa 4680

ttatggctag agggattctt ggcacttacc aggccggcgt cggagtcatg tacgagaatg 4740

ttttccacac actatggcac acaactagag gagcagccat tgtgagtgga gaaggaaaat 4800

tgacgccata ctggggtagt gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc ccatggaggt 4860

ttgaccgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa ccggggaagg 4920

gcgcagtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac tcccttcggg gaggttgggg 4980

ctgttagtct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat tccaatggag 5040

acattatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac gtcagcgcca 5100

tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacacccca aacatgttga 5160

gaaagagaca gatgactgtg ctagatttgc accctggttc agggaaaacc aggaaaattc 5220

tgccacaaat aattaaggac gctatccagc agcgcctaag aacagctgtg ttggcaccga 5280

cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ttttgagagg gctcccagta cgatatcaaa 5340

cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg tgccacgcca 5400

ctctgaccca tagactgatg tcaccgaaca gagtgcccaa ctacaaccta tttgtcatgg 5460

atgaagctca tttcaccgac ccagccagta tagccgcacg aggatacatt gctaccaagg 5520

tggaattagg ggaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga accacggatc 5580

cttttcctga ctcaaatgcc ccaatccatg atttgcaaga tgagatacca gactgggcat 5640

ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg tttgtggcga 5700

gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcggggaaa aaggtcatcc 5760

aactcaaccg caagtcctat gacacagaat acccaaaatg taagaatgga gactgggatt 5820

ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggccaactt cggtgcgagc agggtcatcg 5880

actgtagaaa gagcgtgaaa cccaccatct tagaagaggg agaaggcaga gtcatcctcg 5940

gaaacccatc tcccataacc agtgcaagcg cagctcaacg gaggggcaga gtaggcagaa 6000

accccaatca agttggagat gaataccact atgggggggc taccagtgaa gatgacagta 6060

acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg cccaatggac 6120

tggtggccca gctctatgga ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat ggcgaatacc 6180

gtctcagagg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct gacctcccgg 6240

tgtggctggc ctacaaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga aagtggtgtt 6300

ttgatgggcc gcgtacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag atagtcaccc 6360

ggatgggtga gaggaaaatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagtt tatgcagatc 6420

accaggccct caagtggttc aaagactttg cagcagggaa gagatcagcc gttagcttca 6480

tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa gctttagaca 6540

ccatgtactt ggttgcaacg gctgagaaag gtgggaaagc acaccgaatg gctctcgaag 6600

agctgccaga tgcactggaa accatcacac ttactgtcgc cattactgtg atgacaggag 6660

gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt ggagctctag 6720

tgctcacact agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc aaaatagcag 6780

ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg gaaaaacaga 6840

ggtcacagac agataaccaa ctggcggtgt ttctcatctg tgtcttgacc gtggttggag 6900

tggtggcagc aaacgagtac gggatgctag aaaaaaccaa agcggatctc aagagcatgt 6960

ttggcggaaa gacgcaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca ctggacctgc 7020

gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt cgtgctaacc cctcttctga 7080

agcacctgat cacgtcggaa tacgtcacca catcgctagc ttcaattaac tcacaagctg 7140

gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc cttttaccga cctagacttg actgttggcc 7200

tcgtcttcct tggctgttgg ggtcaagtca ccctcacaac gtttctgaca gccatggttc 7260

tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca ctcagggctg 7320

cccagagaag gacagcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga atggtcgcca 7380

ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc ggacaggtgc 7440

tcctcatagg ggtaagcgtg gcagcgttcc tcgtcaaccc taatgtcacc actgtgagag 7500

aagcaggggt gttggtgacg gcggctacgc ttactttgtg ggacaatgga gccagtgccg 7560

tttggaattc caccacagcc acgggactct gccatgtcat gcgaggtagc tacctggctg 7620

gaggctccat tgcttggact ctcatcaaga acgcggataa gccctccttg aaaaggggaa 7680

ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc atgagtagag 7740

aagagttttt taaataccgg agagaggcca taatcgaggt ggaccgcact gaagcacgca 7800

gggccagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc tcagcaaaac 7860

tccgttggct cgtggagaaa ggatttgtct cgccaatagg aaaagtcatt gatctagggt 7920

gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag gaagtcagag 7980

gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag aaccgatgct catgcagagc tacggctgga 8040

acctggtctc cctgaagagt ggagtggacg tgttttacaa accttcagag cccagtgata 8100

ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtagaagaa caacgcacac 8160

tacgcgtcct agagatgaca tctgactggt tgcaccgagg acctagagag ttctgcatta 8220

aagttctctg cccttacatg cccaaggtta tagaaaaaat ggaagttctg cagcgtcgct 8280

tcggaggtgg gctagtgcgt ctccccctgt cccgaaactc caatcacgag atgtattggg 8340

ttagtggagc cgctggcaat gtggtgcacg ctgtgaacat gaccagccag gtattactgg 8400

ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga ggaagatgtc aacctaggga 8460

gcggaacaag agccgtggga aagggagaag tccatagcaa tcaggagaaa atcaagaaga 8520

gaatccagaa gcttaaagaa gaattcgcca caacgtggca caaagaccct gagcatccat 8580

accgcacttg gacataccac ggaagctatg aagtgaaggc tactggctca gccagctctc 8640

tcgtcaacgg agtggtgaag ctcatgagca aaccttggga cgccattgcc aacgtcacca 8700

ccatggccat gactgacacc accccttttg gacagcaaag agttttcaag gagaaagttg 8760

acacgaaggc tcctgagcca ccagctggag ccaaggaagt gctcaacgag accaccaact 8820

ggctgtgggc ctacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag gaagaattca 8880

ttaagaaagt taacagcaac gcggctcttg gagcagtgtt cgctgaacag aatcaatgga 8940

gcacggcgcg tgaggctgtg gatgacccgc ggttttggga gatggttgat gaagagaggg 9000

aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga aaaagagaga 9060

agaagcctgg agagtttgga aaagctaaag gaagcagggc catttggttc atgtggcttg 9120

gagcacggta tctagagttt gaagctttgg ggttcctgaa tgaagaccat tggctgagcc 9180

gagagaattc aggaggtgga gtggaaggct caggcgtcca aaagctggga tacatcctcc 9240

gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgataccgcc gggtgggaca 9300

ctagaattac cagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt actggagctc ctagacggtg 9360

aacaccgcat gctcgcccga gccataattg aactgactta caggcacaaa gtggtcaagg 9420

tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga gaagatcaaa 9480

gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc ttaacacttt cacgaacatc gctgtccagc 9540

tcgtcaggct gatggaggct gagggggtca ttggaccaca acacttggaa cagctaccta 9600

ggaaaaacaa gatagctgtc aggacctggc tctttgagaa tggagaggag agagtgacca 9660

ggatggcgat cagcggagac gactgtgccg tcaaaccgct ggacgacaga ttcgccacag 9720

ccctccactt cctcaacgca atgtcaaagg tcagaaaaga catccaggaa tggaagcctt 9780

cgcatggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgttc taaccatttt caggagattg 9840

tgatgaaaga tggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag ctgataggca 9900

gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc ctggccaaag 9960

catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgcag ggacttgcgt ctcatggcaa 10020

atgcgatttg ctcagcagtg ccagtagatt gggtgcccac aggcaggaca tcctggtcaa 10080

tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct gcaggtctgg aacagagttt 10140

ggattgaaga aaatgaatgg atgatggaca agactccaat cacaagctgg acagacgttc 10200

cgtatgtggg aaagcgcgag gacatctggt gtggcagcct catcggaacg cgatccagag 10260

caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt tagagctgtc attgggaaag 10320

aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga agacgtcttg atccaggaag 10380

acagggtcat ctagtgtgat ttaaggtaga aaagtagact atgtaaacaa tgtaaatgag 10440

aaaatgcatg catatggagt caggccagca aaagctgcca ccggatactg ggtagacggt 10500

gctgcctgcg tctcagtccc aggaggactg ggttaacaaa tctgacaaca gaaagtgaga 10560

aagccctcag aaccgtctcg gaagtaggtc cctgctcact ggaagttgaa agaccaacgt 10620

caggccacaa atttgtgcca ctccgctagg gagtgcggcc tgcgcagccc caggaggact 10680

gggttaccaa agccgttgag cccccacggc ccaagcctcg tctaggatgc aatagacgag 10740

gtgtaaggac tagaggttag aggagacccc gtggaaacaa caatatgcgg cccaagcccc 10800

ctcgaagctg tagaggaggt ggaaggacta gaggttagag gagaccccgc atttgcatca 10860

aacagcatat tgacacctgg gaatagactg ggagatcttc tgctctatct caacatcagc 10920

tactaggcac agagcgccga agtatgtagc tggtggtgag gaagaacaca ggatct 10976

<210> 7

<211> 2582

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 7

ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg 60

taagcagaca gttttattgt tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag 120

agattttgag acacaacgtg gctttgttga ataaatcgaa cttttgctga gttgaaggat 180

cagatcacgc atcttcccga caacgcagac cgttccgtgg caaagcaaaa gttcaaaatc 240

accaactggt ccacctacaa caaagctctc atcaaccgtg gctccctcac tttctggctg 300

gatgatgggg cgattcaggc ctggtatgag tcagcaacac cttcttcacg aggcagacct 360

cagcgctagc ggagtgtata ctggcttact atgttggcac tgatgagggt gtcagtgaag 420

tgcttcatgt ggcaggagaa aaaaggctgc accggtgcgt cagcagaata tgtgatacag 480

gatatattcc gcttcctcgc tcactgactc gctacgctcg gtcgttcgac tgcggcgagc 540

ggaaatggct tacgaacggg gcggagattt cctggaagat gccaggaaga tacttaacag 600

ggaagtgaga gggccgcggc aaagccgttt ttccataggc tccgcccccc tgacaagcat 660

cacgaaatct gacgctcaaa tcagtggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 720

gcgtttcccc ctggcggctc cctcgtgcgc tctcctgttc ctgcctttcg gtttaccggt 780

gtcattccgc tgttatggcc gcgtttgtct cattccacgc ctgacactca gttccgggta 840

ggcagttcgc tccaagctgg actgtatgca cgaacccccc gttcagtccg accgctgcgc 900

cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggaaaga catgcaaaag caccactggc 960

agcagccact ggtaattgat ttagaggagt tagtcttgaa gtcatgcgcc ggttaaggct 1020

aaactgaaag gacaagtttt ggtgactgcg ctcctccaag ccagttacct cggttcaaag 1080

agttggtagc tcagagaacc ttcgaaaaac cgccctgcaa ggcggttttt tcgttttcag 1140

agcaagagat tacgcgcaga ccaaaacgat ctcaagaaga tcatcttatt aaggggtctg 1200

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 1260

tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 1320

agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 1380

gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 1440

agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 1500

cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 1560

ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 1620

cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt 1680

cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 1740

ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 1800

tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 1860

catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 1920

gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata 1980

gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 2040

tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 2100

catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 2160

aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 2220

attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 2280

aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtgtcga 2340

cgcggccgcg ctagcgatga ccctgctgat tggttcgctg accatttccg ggtgcgggac 2400

ggcgttacca gaaactcaga aggttcgtcc aaccaaaccg actctgacgg cagtttacga 2460

gagagatgat agggtctgca tcagtaagcc agatgctaca caattaggct tgtacatatt 2520

gtcgttagaa cgcggctaca attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgggcgcg 2580

cc 2582

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 8

agatcctgtg ttcttcctca ccaccagcta ca 32

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 9

gctggcgcgc catttaggtg acactataga gaagtttatc tgtgtgaac 49

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 10

ccgtaccagc agccattttc tgtccggaat cgtagg 36

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 11

gacgtgtcga cgcggccgcg ctagcgatga ccctgctg 38

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 12

tcagtccgga ggcgcgcccg tatgtgtatg atacataag 39

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 13

tacgggcgcg cctccggact cgagcaagac gtttcc 36

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 14

gccgcgtcga cacgtcaggt ggcacttttc g 31

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 15

ggcgcgccga cacatggaaa cttgagaggg cagt 34

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 16

gccatcccgg gagcatgta 19

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 17

ggcgcgccct cgagggtaca tgctcccggg at 32

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 18

ctcgagagat cctgtgttct tcctcac 27

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 19

catagcttgt gcaggcgccg tggaggtcac tagacgtggg aatgcat 47

<210> 20

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 20

cagtgtcagc atgcacggct gtggataaga agatcaacac tcccccta 48

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 21

tagggggagt gttgatcttc ttatccacag ccgtgcatgc tgacactg 48

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 22

ttctcccttt ccatggattg acc 23

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 23

aaaagaggag gaaatgaagg c 21

<210> 24

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is synthesized.

<400> 24

cagtgtcagc atgcacggct gtggataaga agatcaacac tcccccta 48

Claims

1.一种DNA分子，该DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白C的编码序列、膜蛋白前体序列、缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列、包膜E蛋白β的羧基末端三个氨基酸残基的编码序列、非结构蛋白NS的编码序列和3’非编码区序列，其中，所述膜蛋白前体序列和包膜E蛋白α的编码序列来源于寨卡病毒；所述5’非编码区序列、衣壳蛋白C的编码序列、包膜E蛋白β的编码序列、非结构蛋白NS的编码序列和3’非编码区序列来源于乙脑病毒减毒株。

2.根据权利要求1所述的DNA分子，其中，所述膜蛋白前体序列为能够编码蛋白质A的序列，所述蛋白质A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

优选地，所述膜蛋白前体序列为SEQ ID NO:2所示的序列或者与SEQ ID NO:2具有90％以上的同一性的序列。

3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其中，来源于寨卡病毒的缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列为能够编码蛋白质B的序列，所述蛋白质B的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

优选地，来源于寨卡病毒的缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列为SEQ ID NO:4所示的序列或者与SEQ ID NO:4具有90％以上的同一性的序列。

4.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其中，所述寨卡病毒为野生型的寨卡病毒。

5.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其中，所述乙脑病毒减毒株为SA14-14-2减毒株。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的DNA分子，其中，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

7.一种制备权利要求1-6中任意一项所述的DNA分子的方法，其特征在于，该方法包括将乙脑病毒减毒株基因组RNA对应的cDNA中缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白β的编码序列替换为寨卡病毒的膜蛋白前体序列和缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列。

8.含有权利要求1-6中任意一项所述的DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

9.一种嵌合病毒，其特征在于，该嵌合病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与权利要求1-6中任意一项所述的DNA分子的序列相同。

10.一种制备权利要求9所述的嵌合病毒的方法，其特征在于，该方法包括将乙脑病毒减毒株的基因组中缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白β的编码序列替换为寨卡病毒的膜蛋白前体序列和缺失了羧基末端三个氨基酸残基的包膜E蛋白α的编码序列。

11.一种疫苗，其特征在于，该疫苗的活性成分为权利要求9所述的嵌合病毒。

12.权利要求1-6中任意一项所述的DNA分子或者权利要求9所述的嵌合病毒在制备用于预防寨卡病毒感染的疫苗中的应用。