WO2015039271A1 - 蛋白a1g_01780在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 - Google Patents

蛋白a1g_01780在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 Download PDF

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WO2015039271A1
WO2015039271A1 PCT/CN2013/001588 CN2013001588W WO2015039271A1 WO 2015039271 A1 WO2015039271 A1 WO 2015039271A1 CN 2013001588 W CN2013001588 W CN 2013001588W WO 2015039271 A1 WO2015039271 A1 WO 2015039271A1
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protein
rickettsia
seq
group
dna molecule
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PCT/CN2013/001588
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龚文平
熊小路
温博海
齐永
段长松
焦俊
杨小梅
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中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
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    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59

Definitions

  • the present invention relates to the use of a protein 01780 for the immunoprotection of rickettsia.
  • Ricket tsia rickettsii is a Gram-negative bacterium with strict intracellular parasites and is the pathogen of Rocky Mountain Spotted Fever (RMSF).
  • the strain is mainly distributed in North America. It is the most venomous species of spotted fever group rickettsia (SFGR) and is classified as a biological warfare agent and a potential bioterrorist.
  • RMSF Rocky Mountain spotted fever
  • RMSF first appeared in Idaho and Montana in the northwestern United States.
  • Maxey reported the first clinical case of RMSF.
  • Ricketts first conducted an etiological study of the disease, and he confirmed that Angstrom was the vector of the disease.
  • RMSF mainly fever, headache and myalgia.
  • blood pressure may drop.
  • Patients who have not received treatment may develop pneumonia, tissue necrosis and circulatory failure, and have heart and brain sequelae.
  • death can occur due to a sudden stop of the heartbeat.
  • antibiotic treatment is effective against the Rocky Mountain spotting heat, it is difficult to control once the epidemic is spread because the Rickettsia can be transmitted in the form of an aerosol.
  • the early symptoms of RMSF lack specificity, and it is difficult to distinguish it from other diseases. It is difficult to find early treatment early. Therefore, effective weekly vaccines are the most effective means of preventing the occurrence and prevalence of RMSF.
  • the A1G-0180 protein provided by the present invention is a protein represented by any one of the following (1) to (3) - (1) a protein represented by amino acids 164 to 402 from the N-terminus in SEQ ID No. 1, ;
  • the coding gene is at least one of the following: - 1) a D molecule represented by nucleotides 490 to 1206 from the 5th end in SEQ ID No. 3;
  • a recombinant vector, expression cassette, transgenic cell line or recombinant strain ffi containing any of the above-described coding genes is within the scope of the present invention.
  • the disease is Rocky Mountain spot heat.
  • the product is a vaccine.
  • the organ is a spleen, liver and/or lung.
  • Figure 1 shows the electrophoresis surge in the chamber.
  • Figure 2 shows protein electrophoresis detection and Western blotting.
  • Figure 3 is a real-time quantitative PCR assay for the implication of Rickettsia in the spleen of immunized mice.
  • Figure 4 shows real-time fluorescent quantitative PCR for detection of Rickettsia copy number in liver tissue of immunized mice.
  • Figure 5 is a real-time quantitative PCR assay for the implication of Rickettsia in lung tissue of immunized mice. The best way to implement the invention
  • the reagents in the following copper implementations were purchased from Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. unless otherwise specified.
  • Vector pET 32a (+) was purchased from Novagen, catalog number 69015.
  • Big II bacillus BL21 was purchased from Novagen, catalog number 69450.
  • C3H/HeN mice 34 weeks old, male were purchased from Beijing Vital Lihua Company.
  • CFA Freund's Complete Adjuvant
  • Ni ⁇ agarose gel (Ni ⁇ ' ⁇ ) kit was purchased from Qiagen, catalog number 30230.
  • the DNA extraction kit was purchased from Qiagen, Inc., catalog number 69506.
  • Horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG was purchased from Zhongkeruitai Co., Ltd., catalog number ZB ⁇ 2305. Restriction enzymes were purchased from Dalian TaKaRa.
  • the Rickettsia rickettsii) used in the examples are all Rickettsia rickettsii (Shei la Smith strain), which is in the literature "Ell i son DW, Clai'k T' R, Sturdevant DE, Virtaneva K, Porcella SF, hackstadt T, Genomic compari son of virulent Rickettsia rickettsii Shei la Smith and avirul ent Rickettsia, rickettsii Iowa. Infect Inimun. 2008 Feb ; 76 (2) : 542- 50, Epub 2007 Nov 19, "Disclosed in the public, the public can be obtained from the Institute of Microbiology and Epidemiology of the Academy of Military Medical Sciences of the People's Liberation Army.
  • Soluble expression form The preparation of the buffer required for the purification of the target protein is as follows
  • PBS buffer (0, Olmol/i-., H 7, 2): 2, 86g ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 0 4 ⁇ 12 8.5g NaCl, 2, 86g Na Chat 4 2H 2 0 added to lLddH 2 0, completely dissolved , adjust the pH to 7.2.
  • the PBS buffer in the examples was 0, 01 mol/L, pH 7.2 PBS buffer.
  • the coloring solution A ⁇ B ⁇ C was purchased from Wuhan Boster Company.
  • Example 1 Construction of recombinant plasmid
  • step (2) Using the genomic DNA extracted in step (1) as a template, the primer pair consisting of j3 ⁇ 4 Fl and R1 is subjected to PCR amplification to obtain a l/f ⁇ gene fragment.
  • amino acid sequence of the A1G 01780 protein is shown in SEQ ID No. 1 from amino acids 164 to 402 from the _N terminus; ⁇ the nucleotide sequence of the gene is SEQ ID No. 3 from the 5th, the 490th position A DNA molecule as indicated by nucleotides 1206.
  • the PCR amplification product size was as expected.
  • the product was amplified by restriction endonuclease digestion with Bar and 3 ⁇ 4oI to obtain a gene fragment; the vector pET--32a (+) was digested with restriction endonuclease and 3 ⁇ 4oI to obtain a large fragment of the vector; The gene fragment was ligated to a large fragment of the vector to obtain a recombinant plasmid A. The recombinant plasmid was sent to the sequencing and sequenced correctly.
  • the gene forms a fusion gene with the Hi s tag on the vector backbone, the fusion protein is expressed, and further purification can be performed by Ni-NTA.
  • step (2) Using the genomic DNA extracted in step (1) as a template, a primer pair consisting of F2 and R2 is subjected to PCR amplification to obtain a gene fragment.
  • R2 5' - CCGTCGAC ACTCTTCTTCAGGACTA 3'.
  • PCR reaction system 25 ⁇ 1 (The sequence indicated by the underline is the enzyme recognition recognition site)
  • the PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the results are shown in lane 2 in Fig. 1.
  • the amino acid sequence of the ToIC protein is shown in SEQ ID No, 2 from amino acid position 164 to position 579; the nucleotide sequence of the gene is SEQ ID No, 4 from position 490 to 1737 from the 5' end.
  • the PCR amplification product size was as expected.
  • the product was amplified by restriction endonuclease MI and 53 ⁇ 471 double-cutting PCR to obtain a gene fragment; the vector pET 32a (+) was digested with restriction endonucleases fe/rf l and -/1 to obtain a vector. Large fragment; the gene fragment is ligated to a large fragment of the vector to obtain a recombinant plasmid B. The recombinant plasmid was sent to the sequencing and sequenced correctly.
  • the structure of the recombinant plasmid B was described as follows: Between the vector pET-32a ( ⁇ ) and the Sail restriction site, the nucleus from the 490th to the 1737th from the end of the SEQ ID No. 4 was inserted. A DNA molecule represented by a glycoside.
  • the fusion protein Since the gene forms a fusion gene with the Hi s tag on the vector backbone, the fusion protein is expressed, and thus can be further purified by ⁇ - ⁇ .
  • the recombinant plasmid A was introduced into Escherichia coli BL2 L to obtain a recombinant strain.
  • Verification method of recombinant bacteria The strain is connected to LB solid medium plate (containing 200mg/L ampicillin), pick a single clone and transfer it to LB liquid medium, 37 ⁇ culture and extract the plasmid for sequencing, if the extracted plasmid is The recombinant plasmid A is the recombinant strain of interest.
  • the recombinant bacteria were added to LB liquid medium (containing 200 mg/L ampicillin), and cultured overnight at 37 ⁇ :, 200 rpm. The next day, according to the inoculation amount of 1% by volume, was transferred to the LB liquid medium containing the same concentration of ampicillin, and cultured at 37 ⁇ , 200 rpm until the OD600 value was 0.6, and the IPTG inducer was added to the end. At a concentration of 0, 1 mM, induction expression was continued for 8 h at 25 ° C and 200 rpm to obtain a fermentation broth.
  • the recombinant plasmid B was introduced into Escherichia coli BL2:i to obtain a recombinant strain.
  • Verification method of recombinant bacteria The strain is connected to LB solid medium plate (containing 200mg/L ampicillin), picked up the monoclonal and transferred to LB liquid medium, cultured at 37'C and extracted the plasmid for sequencing, if extracted The plasmid is recombinant plasmid B, which is the recombinant strain of interest.
  • the recombinant bacteria were added to LB liquid medium (containing 2G0iag/L ampicillin), and cultured at 37 ° C, 20 Grpm overnight. The next day, according to the inoculation amount of 1% by volume, was transferred to the LB liquid medium containing the same concentration of ampicillin, and cultured at 37 ⁇ , 200 rpm until the OD600 value was 0.6, and the IPTG inducer was added to the final concentration of 0. ⁇ ⁇ , induction expression was continued for 4 h at 37 ° C and 200 rpm to obtain a fermentation broth.
  • LB liquid medium containing 2G0iag/L ampicillin
  • step 2 The next day, the overnight mixture obtained in step 2 was mixed with 2 ml of Ni--NTA, and shaken at 200 rpm for 4 h to allow the target protein (protein B) to fully bind to Ni NTA, and then the mixture was transferred to a purification column for inclusion body protein. Wash buffer 3 times, 10 ml each time (flow rate controlled to 3 ml/min). Then, it was eluted 5 times with inclusion body protein elution buffer, 500 ul each time (flow rate control was Sml/min), and the collected eluate was combined and the protein concentration was measured to obtain a protein B solution. The protein A solution and the protein B solution were subjected to 12% polyacrylamide gel electrophoresis, and the results are shown in Fig. 2A.
  • M Protein Marker
  • 1 Protein A
  • 2 Protein B
  • Figure 2A shows that the protein solution showed only a 44KD band, which was consistent with expectations.
  • Protein B solution showed only a 63KD band, which was consistent with expectations.
  • Example 3 Western blot assay
  • M protein Marker
  • 1 protein A
  • 2 protein B
  • Figure 2B shows that protein A and protein B are the proteins of interest.
  • Example 4 Protective evaluation of antigenic protein A1G_-01780
  • C3H mice Twenty four-week-old male C3H/HeN mice (hereinafter referred to as C3H mice) were equally distributed in body weight to four experimental groups of five C3H mice.
  • the groups received the first, second and third immunizations on days 0, 28 and 42 respectively.
  • the first immunization reagent is a mixture of lOOul PBS buffer and lOOul CFA adjuvant, and the immunological method is subcutaneous injection;
  • the second immunization reagent is a mixture of lOOul PBS buffer and lOOul IFA adjuvant, and the immunization method is intraperitoneal injection;
  • the third immunization The reagent was a mixture of lOOul PBS buffer and lOOulIFA adjuvant, and the immunological method was intraperitoneal injection.
  • each group of C3H mice was infected by intraperitoneal injection with Rickettsia at a dose of 6 X 10 s /head.
  • the load of the neutral rickettsia of each organ in each group was analyzed by RT-PCR, and statistical analysis was performed to compare and evaluate the protective properties of each recombinant protein.
  • the primers and probe sequences used for real-time PCR are as follows:
  • TaqMan MGB probe 5 ' FTg TgT TCA TAA CgC TCA CP 3 ' (F in the sequence represents the fluorescent group FAM, P represents the quenching group TAQMAN--MGB);
  • ⁇ represents the copy number.
  • the R 2 values of the three standard curve equations are all greater than 99%.
  • Figure 4 and Figure 5 PBS represent the negative control group
  • A1G-01780 represents the experimental group
  • WCA represents the positive control group
  • tolC represents the negative protein group.
  • the experimental group can reduce the number of rickettsia in the spleen, liver and lung tissues by 91, 7%, 60, 1% and 90.4%; The number of rickettsia in the spleen, liver and lung tissues was reduced by 96, 0%, 74.1% and 80.0%.
  • the immunoprotective effect of A1 G- 01780 protein in the spleen accounts for the immunoprotective ratio of whole bacteria protein: 91. 7%/96. 0%-95. 5%; immunity of liver A1G- 01780 protein
  • the ratio of protective to immunoprotective activity of whole bacterium is: 60. 1%/74. 1%-81.
  • the above results showed that the immunoprotective effect of the antigen A1G-01780 can reach more than 81. 1% of the total protein immunoprotective.
  • the protein of the rickettsia chinensis protein A1G _ 01780 of the present invention can be used as an antigenic protein to stimulate the body to produce an immune response against the Rickettsia virus strain, and can be used as a protective function of the Rocky Mountain spot heat vaccine function. antigen.
  • the protein AIG 01780 can be prepared by genetic engineering, and the protein AIG 01780 is used as a vaccine compared with the Rickettsia whole body protein vaccine, which has the advantages of simple preparation method, low cost, high yield and safety, and the present invention is applicable to Rocky Mountain. The prevention and treatment of spotted fever is of great value.

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Abstract

本发明公开了一种蛋白A1G—01780在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用，所述A1G—01780蛋白的序列如SEQ ID No.1中自N端起第164位至第402位氨基酸所示。

Description

蛋白 A1G— 01780在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 技术领域
本发明涉及一种蛋白 01780在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。
背景技术
立氏立克次体 Ricket tsia rickettsii) 是一种严格胞内寄生的革兰氏阴性菌， 是落基山斑点热 （Rocky Mountain Spotted Fever, RMSF ) 的病原体。 该菌主要分布 在北美洲， 其为斑点热群立克次体 (spotted fever group rickettsia, SFGR)中毒力 最强的一个种， 被列为生物战剂和潜在的生物恐怖剂。
落基山斑点热是一种严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病。 RMSF最早发 现在美国西北部的爱达荷州和蒙大拿州， 1899年 Maxey报告了第一例 RMSF临床病例。在 1906到 1909年之间， Ri cketts首先对该病进行了病原学研究， 他证实了安氏革蜱为该 病的传播媒介。
RMSF的早期临床表现主要有发热， 头痛和肌痛。后期病情严重者可出现血压下降， 未接受治疗者可产生肺炎， 组织坏死和循环衰竭， 并发心和脑后遗症。 在暴发型病铜 中可因心跳突然停止而死亡。 虽然抗生素治疗对落基山斑点热有效， 但由于立氏立克 次体能以气溶胶的形式传播， 一旦流行难以控制。 并且 RMSF早期症状缺乏特异性， 很 难与其他疾病相区别， 难以做到早发现早治疗。 因此采周有效的疫苗作为预防接种是 防止 RMSF发生和流行的最有效手段。
二十世纪中期到末期， RMSF疫苗的研制主要集中在灭活疫苗上。 1970年美国陆军 传染病医学研究所用鸡胚成纤维细胞培养立氏立克次体并通过蔗糖密度梯度离心获得 纯化的病原体， 将纯化立克次体甲醛灭活后制成疫苗， 在 1983年进行的人体保护性试 验中证明该疫苗可以保护 25%的接种者， 可减轻患者的发热反应， 并能使四环素的治疗 效果更快更好。 但是该灭活疫苗仅提供有限的保护作用， 远没有达到有效疫苗保护标 准。 另外制备立氏立克次体灭活疫苗通常需要鸡胚或者细胞大量培养立克次体， 但是 提取纯化立克次体的防护要求高， 工艺复杂， 成本昂贵， 因此难以大量制备和推广使 用。
随着对 RMSF疫苗研究的不断深入以及蛋白质组学的飞速发展，人们将目光转向了 亚单位。研究发现立氏立克次体外膜蛋白 A (OmpA)、外膜蛋白 B (OmpB)以及普氏立克次 体外膜蛋白 B (0 pB)免疫产生的抗体可以中和立克次体对小鼠的致死毒性， 给予 OmpA 及 OmpB 的单克隆抗体可以保护豚鼠有效抵抗致死剂量的立氏立克次体的感染并交叉 保护小鼠抵抗致死剂量的康氏立克次体 conorii)的感染。 这些外膜蛋白尽管有一 定的保护作^, 但是其免疫保护效果有限， 目前难以代替灭活 RMSF疫苗。 因此， 鉴定 立氏立克次体的保护性抗原， 研发更加安全、 有效、 持久的亚单位疫苗对预防 RMSF 具有重大的意义。
发明公开
本发明的目的是提供一种蛋白 A1G— 01780 在抗立氏立克次体的免疫保护中的应 用。
本发明提供的 A1G— 01780蛋白， 为如下 （1) - (3) 任一所示的蛋白- (1) SEQ ID No, 1中自 N端起第 164位至第 402位氨基酸所示的蛋白；
(2) SEQ ID No. 1所示的蛋白；
(3) 将 （1) 或 （2) 所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和 /或添加且具有相同功能的蛋白质。
上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述基因中， 所述编码基因为如下中至少一种 - 1) SEQ ID No.3中自 5， 末端起第 490位至第 1206位核苷酸所示的 D 分子；
2) SEQ ID No.3所示的 DNA分子；
3)在严格条件下与 1 )或 2) 限定的 DNA分子杂交且编码所述蛋白质的 DNA分子；
4) 与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA分子具有 90%以上的同一性且编码所述蛋白质 的 DNA分子。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌 ffi属于 本发明的保护范围。
上述蛋白在制备预防和 /或治疗立氏立克次体引起的疾病的产品中的应用也属于 本发明的保护范围。
上述应用中， 所述疾病为落基山斑点热。
上述任一所述的应用中， 所述产品为疫苗。
上述蛋白在制备降低被立氏立克次体感染的动物的脏器组织内立氏立克次体数 量的产品中的应用 ¾属于本发明的保护范围。
上述应用中， 所述脏器为脾脏、 肝脏和 /或肺脏。
图 1为廳电泳检湧。 图 2为蛋白电泳检测和免疫印迹实验 （Western blot )。
图 3为实时荧光定量 PCR检涵免疫小鼠脾组织内立氏立克次体拷贝数。
图 4为实时荧光定量 PCR 检测免疫小鼠肝组织内立氏立克次体拷贝数。
图 5为实时荧光定量 PCR检涵免疫小鼠肺组织内立氏立克次体拷贝数。 实施发明的最佳方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
下述实施铜中所周的试剂如无特殊说明， 均购自国药集团化学试剂公司。
下述实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平均值。
以下实施铜中利周仪器 NA 0DR0P 1000分光光度计 （购自 Thermo Scientif ic公 司） 进行蛋白浓度的测定； 利用仪器 7300 Real Time PCR System (购自 Appl ied Bio systems公司） 进行立氏立克次体拷贝数的测定。
载体 pET 32a (+)购自 Novagen 公司， 产品目录号为 69015。
大 II杆菌 BL21购自 Novagen 公司， 产品目录号为 69450。
C3H/HeN小鼠 （3 4周龄， 雄性） 购自北京维通利华公司。
弗氏完全佐剂 （CFA ) 购自 Si gma公司， 产品目录号为 F 5881。
弗氏不完全佐剂 ( IFA ) 购自 Sigma公司， 产品目录号为 F 5506。
镍… ΝΊΆ琼脂糖凝胶 （Ni · 'Α) 试剂盒购自 Qiagen公司， 产品目录号为 30230。 DNA提取试剂盒购自 Qiagen公司， 产品目录号为 69506。
辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG购自中科瑞泰公司， 产品目录号为 ZB ·2305。 限制性内切酶均购自大连 TaKaRa公司。
实施例中所用的立氏立克次体 Rickettsia rickettsii) 均为立氏立克次体 Sheila Smith 株 ( Rickettsia rickettsii, Shei la Smith strain) , 该菌株在文献 "Ell i son DW, Clai'k T'R, Sturdevant DE, Virtaneva K, Porcella SF, Hackstadt T, Genomic compari son of virulent Rickettsia rickettsii Shei la Smith and avirul ent Rickettsia, rickettsii Iowa. Infect Inimun. 2008 Feb ; 76 (2) : 542- 50, Epub 2007 Nov 19, " 中公开过， 公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行 病研究所获得。
主要试剂的配制：
PCR反应周 2 X Mix的配制 （Iral) - 试剂名称 体积
Ta<:[ DNA聚合酶 （5ί]/μ1) ΙΟμΙ
lOXBuffer (Mg2+) 200μ1
dNTP Mixture 160μ1
加去离子水定容至 lnil。
可溶性表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制如
一、 可溶性蛋白裂解缓冲液 ρΗ8.0 (1000ml)：
组成 质量
50 ΪΓ'Μ NaH2P0i 7.80g Na P04 * 2H20 (丽 156. Olg/mol)
300 mM NaCi 17, 54g MaCl (MW 58.44g/mol)
10 mM 咪唑 0.68g 咪唑 （MW 68.08g/moi) 称取上述质量的各试剂， 去离子水溶解并定容到 lOOOnil , NaOH调节 pH至 8,0 二、 可溶性蛋白洗涤缓冲液 PH8, 0 (1000ml):
¾d..f¾½ Mm
50 siM Na.H2PG4 7.80g NaH2P04 " 2H20 (MW 156. Olg/niol)
300 raM NaCl 17.54g NaCi (MW 58.44g/moi)
20 mM 咪唑 1, 36g 味唑 （MW 68.08g/mol) 称取上述质量的各试剂， 用去离子水溶解并定容到 lOOOml, NaOH调节 pH至 8,0: 王、 可溶性蛋白洗脱缓冲液 pH8, 0 (1000ml);
1ϋ
50 RiM NaH2P04 7.80g ΝΕΗ2Ρ04 * H20 (MW 137.99g/mol)
300 EM NaCl 17, 54g NaCl (MW 58.44g/mol) 体积百分含量为 30%的甘油 300ml i00%甘油
250 raM 味 ¾ 17. OOg 咪唑 （MW 68.08g/moi) 称取或量取上述各试剂， 用去离子水溶解并定容到 1000ml, NaOH调节 pi 至 8.0: 包涵体表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制如下：
一、 包涵体蛋白裂解缓冲液 pH8, 0 (1000ml):
组成 剂量
100 mM NaHzPO-. 15.60g Na P04 ' 2H20 (MW 156.01g/siol)
10 raM Tris碱 1.21g Tris碱（MW 121.14g/moi) 体积百分含量为 0.05% 的 Tvreen 20 500ul IVeen 20
8 M尿素 480g Urea (MW 60.06g/½ol) 称取或量取上述各试剂， 用去离子水溶解并定容到 lOOOml, NaOH调节 pH至 8,0: 二、 包涵体蛋白洗涤缓冲液 pH6.3 (1000ml);
1ϋ
100 mM NaH2P04 】5.60g Na P04 <■ 2H20 (MW 156. Olg/mol)
10 mM Tris碱 I.2ig Tris碱（MW 121. I4g/mol) 体积百分含量为 0.05% 的 Tween 20 500ui Tween 20
8 M尿素 480g Urea. (MW 60, 06g/inol)
称取或量取上述各试剂， 用去离子水溶解并定容到 1000ml, NaOH调节 pH至 6, 3。
包涵体蛋白洗脱缓冲液 pM.5 (lOOOnii)：
组成 剂量
100 mM NaHzPOi 15.60g Na P04 ' 2H20 (MW 156.01g/siol)
10 raM Tris碱 1.21g Tris碱（MW 121.14g/moi)
体积百分含量为 0.05% 的 T een 20 500ul Tween 20
8 M尿素 480g Urea. (MW 60. OSg/siol)
称取或量取上述各试剂， 用去离子水溶解并定容到 —OOOml, NaOH调节 pH至 4, 5。 每升转移缓冲液的制备：称取 2, 9g甘氨酸、 5.8g Tris碱、 0.37gSDS,并加入 200ml 甲醇， 加水定容至 : 1丄。
PBS缓冲液 (0, Olmol/i— .、 H 7, 2) 的劍备： 2, 86g Ν¾ΗΡ04 β 12 8.5g NaCl、 2, 86g Na聊 4 2H20加入到 lLddH20中， 完全溶解， 调节 pH至 7.2。 实施例中的 PBS 缓冲液均为 0, 01mol/L、 pH 7.2 PBS缓冲液。
每 100ml封闭液的制备： 称取 lg牛血清白蛋白 （BSA), 溶于 100ml PBS缓冲液 (0. Olmoi/L, pH 7.2) 中。
6周龄雌性 C3H/HeN小鼠购自北京维通利华公司。
立氏立克次体全菌蛋白的制备方法见文献 "Aramerman NC, Beier~Sexton M, Azad AF (2008) Laboratory maintenance of Rickettsia rickettsii. Curr Protoc Microbiol Chapter 3： Unit 3 A 5. "
立氏立克次体免疫血清的制备： 将 6周龄雌性 C3H/iieN小鼠分别在第 0天、 第 28 天和第 42天进行立氏立克次体全菌蛋白免疫。首次免疫采用皮下注射免疫（每只小鼠 免疫剂量： lOOul含 20ug立氏立克次体全菌蛋白的溶液与 lOOul弗氏完全佐剂的混合 物）； 第二次和第 Ξ次免疫均采周腹部注射免疫 （每只小鼠免疫剂量： lOOul 含 lOug 立氏立克次体全菌蛋白的溶液与 lOOul弗氏不完全佐剂的混合物）。 末次免疫后第 14 天通过眼眶静脉取血， 分离血清备用。
显色液 A\B\C购自武汉博士德公司。 实施例 1、 重组质粒的构建
-、 重组质粒甲的构建 (一） 提取立氏立克次体的基因组 DNA。
(二） 以步骤（一）提取的基因组 DNA为模板， j¾ Fl和 R1组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 l/f ^基因片段。
F1： 5' -GGG GAT CCA TGA AAC TGA TTG TCT TA 3' ；
R1 - 5' -GGC TCG AGT TTA ATC TTA GCA TCT TC 3' 。
(下划线所示序列为酶切识别位点）
PCR反应体系 25μ1 :
模板 ΐμΐ , 2 Χ Μίχ 12, 5 μΐ , 上、 下游引物各 Ιμΐ (50μΜ/μ1) , 加水至 25μ1。
PCR扩增条件：
94°C预变性 5min ; 951： 30sec , 55 °C 30sec， 72 X： 1. 5min, 循环 30次; 72°C延 伸 7min。
(三） 将 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 结果如图 1中的泳道 1所示。
A1G 01780蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No. 1中自 _N端起第 164位至 402位氨基 酸所示； ^基因的核苷酸序列如 SEQ ID No. 3中自 5， 末端起第 490位至 1206 位核苷酸所示的 DNA分子。
PCR扩增产物大小与预期一致。
(四）用限制性内切醇 Bar 和 ¾oI双酶切 PCR扩增产物， 得到基因片段； 用限 制性内切酶 和 ¾oI双酶切载体 pET- - 32a (+) , 得到载体大片段； 将基因片段与 载体大片段连接， 得到重组质粒甲。 将重组质粒甲送测序， 测序正确。
根据测序结果， 对重组质粒甲进行结构描述如下： 在载体 pET- 32a (+)的^ ill和
Xhol酶切位点之间插入了 SEQ ID No, 3自 5， 末端起第 490位至 1208位核苷酸所示的 DNA分子。
由于 基因与载体骨架上的 Hi s标签形成融合基因， 表达融合蛋白， 从 而可用 Ni- NTA进行进一步纯化。
二、 重组质粒乙的构建
(一） 提取立氏立克次体的基因组 DNA。
(二）以步骤（一）提取的基因组 DNA为模板， 用 F2和 R2组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 基因片段。
F2- 5' -CCGGATCCACTGAAGGGTATAAGAA 3' ；
R2: 5' - CCGTCGAC ACTCTTCTTCAGGACTA 3' 。
(下划线所示序列为酶切识别位点） PCR反应体系 25μ1 :
模板 ΐ μΐ , 2 X Mix 12. 5 μΐ , 上、 下游引 l各 1 μ1 (50μΜ/μ1) , 加水至 25μ1。
PCR扩增条件：
94°C预变性 5min; 95 °C 30sec, 55 °C 30sec, 72V L 5min, 循环 30次； 72°C延 伸 7min。
(三）将 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 结果如图 1中的泳道 2所示。 ToIC蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No, 2中自 N端起第 164位至 579位氨基酸所示； '基因的核苷酸序列如 SEQ ID No, 4中自 5 ' 末端起第 490位至 1737位核苷酸所示 的 DNA分子。
PCR扩增产物大小与预期一致。
(四）用限制性内切酶 MI和 5¾71双醸切 PCR扩增产物， 得到基因片段； 用限 制性内切酶 fe/rf l和 -/1双酶切载体 pET 32a (+)， 得到载体大片段； 将基因片段与 载体大片段连接， 得到重组质粒乙。 将重组质粒乙送测序， 测序正确。
根据测序结果， 对重组质粒乙进行结构描述如下： 在载体 pET- 32a (÷)的 和 Sail酶切位点之间插入了 SEQ ID No. 4中自 5， 末端起第 490位至 1737位核苷酸所示 的 DNA分子。
由于 基因与载体骨架上的 Hi s标签形成融合基因，表达融合蛋白， 从而可用 ΝΪ--ΝΤΑ进行进一步纯化。
实施例 2、 重组蛋白的制备
一、 蛋白 A1G—01780 (又称为蛋白甲） 的制备
(一） 重组菌的制备
将重组质粒甲导入大肠杆菌 BL2 L 得到重组菌。
重组菌的验证方法： 将菌株接入 LB固体培养基平板 （含 200mg/L氨苄青霉素）， 挑取单克隆并转接入 LB液体培养基， 37Ό培养并提取质粒进行测序， 如果提取的质粒 为重组质粒甲， 即为目的重组菌。
(二） 蛋白甲的表达
将重组菌接入 LB液体培养基（含 200mg/L氨苄青霉素）， 37 τ：、 200rpm培养过夜。 次日按照体积百分含量为 1%的接种量转接入含有相同浓度氨苄青霉素的 LB液体培养 基中， 在 37Ό、 200rpm条件下培养至 OD600值 ^0. 6时， 加入 IPTG诱导剂至终浓度 0, ImM, 在 25'C、 200rpm条件下继续进行诱导表达 8h， 得到发酵液。
(三） 蛋白甲的纯化 1、 政发酵液 100ral， 5000rpm离心 lOmin , 收集菌体沉淀。
2、 用 3(½1可溶性蛋白裂解缓冲液重悬菌体， 吹打混匀后冰浴条件下进行超声， 超声条件为： 工作 4, 5sec,间隔 9sec,共超声 2(½in,功率为 125W。 将超声裂解物以 12， 000 §离心2(½ ， 吸取上清备, 。
3、 取 10ml上清， 与 2m:LNi Ά混合, 室温 200rPm振荡混匀 4h， 使得目的蛋白
(蛋白甲）与 Ni - Ν'ΓΑ充分结合， 然后将混合物移入纯化柱内， 用可溶性蛋白洗涤缓冲 液洗涤 3次， 每次 10ml (流速控制为 3ml/min：)。 然后用可溶性蛋白洗脱缓冲液洗脱 5 次， 每次 500ul (流速控制为 3ml/iain )， 合并收集的洗脱液并测蛋白浓度， 得到目的 蛋白溶液即为蛋白甲溶液。
二、 蛋白 TolC (又称为蛋白乙） 的制备
(一） 重组菌的劍备
将重组质粒乙导入大肠杆菌 BL2:i , 得到重组菌。
重组菌的验证方法： 将菌株接入 LB固体培养基平板 （含 200mg/L氨苄青霉素）， 挑取单克隆并转接入 LB液体培养基， 37'C培养并提取质粒进行测序，如果提取的质粒 为重组质粒乙， 即为目的重组菌。
(二） 蛋白乙的表达
将重组菌接入 LB液体培养基（含 2G0iag/L氨苄青霉素）， 37 °C , 20Grpm培养过夜。 次日按照体积百分含量为 1%的接种量转接入含有相同浓度氨苄青霉素的 LB液体培养 基中， 在 37Ό、 200rpm条件下培养至 OD600值 0 6时， 加入 IPTG诱导剂至终浓度 0. Ιη Μ, 在 37°C、 200rpm条件下继续进行诱导表达 4h, 得到发酵液。
(王） 蛋白乙的纯化
1、 取发酵液 lOOral , 5000-rpm离心 lOmin, 收集菌体沉淀。
2、 用 30ml可溶性蛋白裂解缓冲液重悬菌体， 吹打混匀后冰浴条件下进行超声， 超声条件为： 工作 4. 5sec，间隔 9sec,共超声 60mi n,功率为 125W。 将超声裂解物以 12， 000 X g离心 20min， 弃去上清， 将 10ml包涵体蛋白裂解缓冲液加入沉淀部分， 并 且充分吹打混匀， 室温放置过夜。
3、次日将步骤 2得到的过夜混合物与 2mlNi- - NTA混合，室温 200rpm振荡混勾 4h, 使得目的蛋白 （蛋白乙）与 Ni NTA充分结合， 然后将混合物移入纯化柱内， 用包涵体 蛋白洗涤缓冲液洗涤 3次， 每次 10ml (流速控制为 3ml/min)。 然后用包涵体蛋白洗脱 缓冲液洗脱 5次， 每次 500ul (流速控制为 Sml/min) , 合并收集的洗脱液并测蛋白浓 度， 得到目的蛋白溶液即为蛋白乙溶液。 将蛋白甲溶液和蛋白乙溶液进行 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳， 结果如图 2A所示。 图 2A中， M: 蛋白 Marker; 1 : 蛋白甲； 2： 蛋白乙
图 2A表明， 蛋白甲溶液只显示一条 44KD的条带， 与预期相符合。 蛋白乙溶液只 显示一条 63KD的条带， 与预期相符合。 实施例 3、 免疫印迹实验 (Western blot assay)
、 -卞- I '.、专 口
(一） 戴上手套， 切滤纸和硝酸纤维素膜。
(二）将硝酸纤维素膜置于一个盛有 20 l甲醇的培养皿中，浸泡 30s 60s后用镊 子取出， 放入事先配劍好的转移缓冲液中。 同时将滤纸放入另一个盛有转移缓冲液的 培养皿中， 赶走气泡。
( ）将转移装置擦拭干净后， 从下向上依次放置滤纸一 PAGE胶一銷酸纤维素膜一 滤纸， 每放一层都要用试管赶走气泡和多余的液体。
(四）将阳极放在夹层物上， 接通电源， 60 ·7(ΜΑ电流电转印 75min。 断电， 将凝 胶用考马斯亮蓝 G- 250染色， 检査是否转印完全。
二、 结合一抗
(一） 将电转印之后的硝酸纤维素膜用镊子轻轻夹起放入一个干净的塑封袋中， 然后向其中加入封闭液 30ml。
(二） 封闭过夜。 弃去封闭液， 加入事先配制好的一抗混合物 （即： 取新鲜的封 闭液 10ml左右， 向其中加入 lOOul立氏立克次体免疫血清， 混匀， 加入到塑封袋中即 可）， 摇床蜉育 lh。
(三） 弃去一抗混合液， 取一个千净的培养皿， 向其中加入适量去离子水， 然后 将硝酸纤维素膜放入， 轻轻漂洗。
(四） 弃去培养皿中的去离子水， 用 PBST漂洗 3次， 每次 10min。
三、 结合二抗
弃去培养皿中的 PBST, 向其中加入 10ml二抗混合液 （即： 取新鲜的封闭液 lOnil 左右， 向其中加入 lOOul辣根过氧化物醇标记的羊抗鼠 IgG, 混匀， 加入到塑封袋中 即可）， 摇床孵育 lh。 弃去二抗混合液， 用 PBST漂洗 3次， 每次 10min。
四、 DAB显色
取 3ml去离子水， 向其中先后加入显色液 A\B\C (武汉博士德公司） 各 3滴， 混 匀后倒入盛有硝酸纤维素膜的培养皿中。 轻轻摇晃， 细心观察显色反应， 一旦蛋白条 带的颜色达到要求， 周水漂洗。 拍照。 结果如图 2B所示。
图 2B中, M: 蛋白 Marker; 1 : 蛋白甲； 2： 蛋白乙
图 2B表明， 蛋白甲和蛋白乙是目的蛋白。 实施例 4、 抗原蛋白 A1G_— 01780的保护性评价
一、 小鼠免疫
将 3 4周龄的雄性 C3H/HeN小鼠（以下简称 C3H小鼠） 20只按照体重等量地分配 到 4个实验组中， 每组 5只 C3H小鼠。
组别设置： 实验组： A1G—01780蛋白加佐剂； 阴性对照组： PBS加佐剂； 阳性对照 组： 全菌蛋白加佐剂； 阴性蛋白组： TolC蛋白加佐剂。
各组分别在第 0天、 第 28天和第 42天进行第： 次、 第 2次和第 3次免疫。
除^性对照组外， 各组的免疫方案均如表： 所示。
表 1 免疫方案
蛋白溶液体积 总体积
免疫次数 天数 佐剂 佐剂体积（ul ) 蛋白齐 U量 (ug) 免疫方式
( ul ) ( ul )
28 CFA 100 30 100 200 皮下
2 14 TFA 100 20 100 200 腹腔
3 1 4 IFA 100 20 100 200 腹腔 阴性对照组在第 ΰ天、 第 28天和第 42天进行第 1次、 第 2次和第 3次免疫。 第
1次免疫的试剂为 lOOulPBS缓冲液与 lOOulCFA佐剂的混合物， 免疫方式为皮下注射； 第 2次免疫的试剂为 lOOulPBS缓冲液与 lOOulIFA佐剂的混合物， 免疫方式为腹腔注 射； 第 3次免疫的试剂为 lOOulPBS缓冲液与 lOOulIFA佐剂的混合物， 免疫方式为腹 腔注射。
二、 立氏立克次体攻击 C3H小鼠
末次免疫后第 14天， 用立氏立克次体通过腹腔注射感染各组 C3H小鼠， 剂量为 6 X 10s个 /只。 攻毒 5天后， 将各组小鼠处死， 摘取脾脏、 肺脏、 肝脏。
三、 RT- PCR检测各脏器中立氏立克次体拷贝数
(一） 将各组小鼠的各个脏器表面的粘连组织剥离干净， 然后称重并记录。 将剥 离干净的各个脏器分别与 ImlPBS放入研磨器中充分研磨， 研磨液移入 EP管并用 PBS 定容至 1。 5ml 0 从各个 EP管中取出 10mg脾脏或 20mg肝脏或 20mg肺赃组织对应的研 磨液进行 DM提取。
利用 RT-PCR检涵各组各个脏器中立氏立克次体的载量，进行统计分析， 比较和评 价各重组蛋白的保护性。
实时荧光定量 PCR所用的引物及探针序列如下：
Fp - 5 ? -TgA AgA TAG TAG CTT Agg gTT CAT CAC TA 3 '
Rp t 5， -ACC ggC ATT AAg CgT AAg gTT 3， ；
TaqMan MGB 探针： 5 ' FTg TgT TCA TAA CgC TCA CP 3 ' (序列中 F代表报告 荧光基团 FAM, P代表淬灭基团 TAQMAN- -MGB ) ;
标准品序列： 5 ' -TGTTGTTCATAACGCTCA--3 '
取 lul标准品作为模板， 以 Fp和 Rp为引物， 以 TaqMan MGB 探针进行实时荧光 定量 PCR绘劍标准曲线； 同^， 取 lul各组各小鼠脾组织 （10mg ) 提取的 DNA作为模 板、 以 Fp和 Rp为引物， 以 TaqMan MGB探针进行同一批次的实时荧光定量 PCR。 得到 与脾组织进行同一批次实时荧光定量 PCR的标准曲线方程为 Ct 3, 36 X logC0÷37. 79。 通过标准曲线将各组小鼠脾组织的实时荧光定量 PCR结果换算为立氏立克次体的拷贝 数。
取 l ul标准品作为模板， 以 Fp和 为引物， 以 TaqMan MGB 探针进行实时荧光 定量 PCR绘制标准曲线； 同时， 取 lul各组各小鼠肝组织 （20iag ) 提取的 DNA作为模 板、 以 Fp和 Rp为引物， 以 TaqMan MGB探针进行同一批次的实时荧光定量 PCR。 与肝 组织进行同一批次实时荧光定量 PCR的标准曲线方程为 Ct=- 3。 38 X l ogCo+38, 13。通过 标准曲线将各组小鼠肝组织的实时荧光定量 PCR结果换算为立氏立克次体的拷贝数。
取 lul标准品作为模板， 以 Fp和 Rp为引物， 以 TaqMan MGB 探针进行实时荧光 定量 PCR绘制标准曲线； 同时， 取 lul各组各小鼠肺组织 （20mg ) 提取的 DNA作为模 板、 以 Fp和 Rp为引物， 以 TaqMan MGB探针进行同一批次的实时荧光定量 PCR。 与肺 组织进行同一批次实时荧光定量 PCR的标准曲线方程为 Ct 3. 10 X l ogCo+37. 74。通过 标准曲线将各组小鼠肺组织的实时荧光定量 PCR结果换算为立氏立克次体的拷贝数。
三个标准曲线方程中， ^均代表拷贝数。 三个标准曲线方程的 R2值均大于 99%。 对各组织各小组的实时定量 PCR 结果运周 SAS9, 1 软件进行单因素多水平定量资 料的假设检验 （根据是否同时满足正态性及方差齐性， 选择一元方差分析或者 Kruskal -Wal i i s秩和检验）及 SNK法进行两两之间的比较（相同字母表示组间没有显 著性差异）。
脾组织中立氏立克次体拷贝数检测结果如表 2和图 3所示。 肝组织中立氏立克次体拷贝数检测结果如表 3和图 4所示。
肺组织中立氏立克次体拷贝数检测结果如表 4和图 5所示。
表 2 脾组织检测结果
ί氏立克次体拷贝数
阴性对照组 27073 + 25141
实验组 2248 ± 1422
阴性蛋白组 9889 + 3149
阳性对照组 1074±627 表 3 肝组织检测结果
组别 立氏立克次体拷贝数
阴性对照组 12015±3234
实验组 4796 ± 1696
阴性蛋白组 27794± 11102
阳性对照组 3117±975 表 4 肺组织检测结果
组别 立氏立克次体拷贝数
阴性对照组 38421 + 14462
实验组 3698 ± 1440
阴性蛋白组 26707 + 15836
阳性对照组 7674土 2117 图 3、 图 4和图 5中的 PBS代表阴性对照组， A1G— 01780代表实验组， WCA代表阳 性对照组， tolC代表阴性蛋白组。
统计学分析显示， 对脾脏的检湧中， 实验组和阳性对照组与阴性对照组及阴性蛋 白组有显著性差异 （P^I 0016)， 而阴性蛋白组与阴性对照组之间无显著性差异。
对肝賍的检涵中， 实验组和阳性对照组与阴性对照组及阴性蛋白组有显著性差异 (P =0. 0010 ) , 而^性蛋白组与阴性对照组之间也有显著性差异， 且阴性蛋白 TolC 能够促进立氏立克次体的繁殖。
对肺脏的检测中， 实验组和阳性对照组与阴性对照组及阴性蛋白组有显著性差异 (ρ< ooi ), 而阴性蛋白组与阴性对照组之间无显著性差异。
与^性对照组相比， 实验组可减少立氏立克次体在脾组织、 肝组织及肺组织中数 量的 9 1, 7%、 60, 1%和 90. 4%; 阳性对照组可减少立克次体在脾组织、 肝组织及肺组织 中数量的 96, 0%、 74. 1%和 80. 0%。 由此可知， 脾脏中 A1 G— 01780蛋白的免疫保护性占 全菌蛋白免疫保护性的比例为： 91. 7%/96. 0%-95. 5%； 肝脏中 A1G—— 01780蛋白的免疫保 护性占全菌蛋白免疫保护性的比例为： 60. 1%/74. 1%-81. 1%； 肺脏中 A1G_— 01780蛋白的 免疫保护性占全菌蛋白免疫保护性的比例为： 90, 4%/80. 0%=113%。综合以上结果表明， 抗原 A1G— 01780的免疫保护性可达到全菌蛋白免疫保护性的 81. 1%以上。
工业应用
本发明的立氏立克次体的蛋白 A1G _ 01780可以作为一种抗原蛋白， 能够刺激机体 产生免疫应答对抗立氏立克次体毒株攻击， 可以作为具有落基山斑点热疫苗功能的保 护性抗原。 蛋白 AIG 01780可通过基因工程制备， 用蛋白 AIG 01780作为疫苗与立氏 立克次体全菌蛋白疫苗相比， 具有制备方法简单、 成本低、 产量高、 更安全等优点， 本发明对于落基山斑点热的防疫和治疗具有重大价值。

Claims

权利要求
1、 A1GJ1780蛋白， 为如下 （1) (3) 任一所示的蛋白：
(1) SEQ ID No.1中自 N端起第 164位至第 402位氨基酸所示的蛋白；
(2) SEQ ID No.1所示的蛋白；
(3) 将 （1) 或 （2) 所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和
/或添加且具有相同功能的蛋白质。
2、 权利要求 1所述蛋白的编码基因。
3、 根据权利要求 2所述的编码基因， 其特征在于： 所述编码基因为如下中至少 ——禾中：
1 ) SEQ ID No, 3中自 5' 末端起第 490位至第 1206位核苷酸所示的 DNA分子；
2) SEQ ID No.3所示的 DNA分子；
3)在严格条件下与 1)或 2)限定的 DNA分子杂交且编码所述蛋白质的 DNA分子；
4) 与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA分子具有 90%;以上的同一性且编码所述蛋白质 的 DNA分子。
4、 含有权利要求 2或 3所述编码基因的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重 组菌。
5、 权利要求 1所述的蛋白在制备预防和 /或治疗立氏立克次体引起的疾病的产品
6、 根据权利要求 5所述的应 其特征在于： 所述疾病为落基山斑点热。
7、 根据权利要求 5或 6所述的应用， 其特征在于： 所述产品为疫苗。
8、权利要求 1所述的蛋白在制备降低被立氏立克次体感染的动物的脏器组织内立 氏立克次体数量的产品中的应周。
9、 根据权利要求 8所述的应 j¾, 其特征在于： 所述脏器为脾脏、 肝脏和 /或肺脏。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106967174B (zh) * 2017-03-21 2019-09-06 中国人民解放军第三〇九医院 多肽融合蛋白gwp在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用
CN108794636B (zh) * 2018-06-28 2020-05-22 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种表位多肽串联混合物在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用
CN114231513B (zh) * 2022-02-23 2022-05-10 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种可抑制蛋白酶体psmb5亚基活性的短肽及其在抗立克次体感染中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102716474A (zh) * 2012-06-27 2012-10-10 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 蛋白Rh054_01780在抗黑龙江立克次体的免疫保护中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102716474A (zh) * 2012-06-27 2012-10-10 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 蛋白Rh054_01780在抗黑龙江立克次体的免疫保护中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL 1 March 2012 (2012-03-01), JOHNSON SL ET AL.: "AFB29948.1" *
WU, DEPING ET AL.: "Cloning, Expression and Immunogenicity of Outer Membrane Protein H Gene Fragment of Rickettsia Rickettsii in E.coli.", PROGRESS IN MODERN BIOMEDICINE, vol. 11, no. 6, 31 March 2011 (2011-03-31), pages 1063 - 1067 *
WU, DEPING ET AL.: "Expression of the genes encoding protein antigens of Rickettesia rickettesii and the analysis of the recombinant protein antigens by immunoblotting.", CHINESE JOURNAL OF ZOONOSES, vol. 25, no. 10, 18 April 2012 (2012-04-18), pages 931 - 934 AND 939 *

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