CN103450353B - 蛋白a1g_01780在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 - Google Patents
蛋白a1g_01780在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种蛋白A1G_01780在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。本发明公开的A1G_01780蛋白，其序列如SEQ ID No.1中自N端起第164位至第402位氨基酸所示。蛋白A1G_01780可通过基因工程制备，用蛋白A1G_01780作为疫苗与立氏立克次体全菌蛋白疫苗相比，具有制备方法简单、成本低、产量高、更安全等优点，本发明对于落基山斑点热的防疫和治疗具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白A1G_01780在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。
背景技术
立氏立克次体（Rickettsia rickettsii）是一种严格胞内寄生的革兰氏阴性菌，是落基山斑点热（Rocky Mountain Spotted Fever,RMSF）的病原体。该菌主要分布在北美洲，其为斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)中毒力最强的一个种，被列为生物战剂和潜在的生物恐怖剂。
落基山斑点热是一种严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病。RMSF最早发现在美国西北部的爱达荷州和蒙大拿州，1899年Maxey报告了第一例RMSF临床病例。在1906到1909年之间，Ricketts首先对该病进行了病原学研究，他证实了安氏革蜱为该病的传播媒介。
RMSF的早期临床表现主要有发热，头痛和肌痛。后期病情严重者可出现血压下降，未接受治疗者可产生肺炎，组织坏死和循环衰竭，并发心和脑后遗症。在暴发型病例中可因心跳突然停止而死亡。虽然抗生素治疗对落基山斑点热有效，但由于立氏立克次体能以气溶胶的形式传播，一旦流行难以控制。并且RMSF早期症状缺乏特异性，很难与其他疾病相区别，难以做到早发现早治疗。因此采用有效的疫苗作为预防接种是防止RMSF发生和流行的最有效手段。
二十世纪中期到末期，RMSF疫苗的研制主要集中在灭活疫苗上。1970年美国陆军传染病医学研究所用鸡胚成纤维细胞培养立氏立克次体并通过蔗糖密度梯度离心获得纯化的病原体，将纯化立克次体甲醛灭活后制成疫苗，在1983年进行的人体保护性试验中证明该疫苗可以保护25%的接种者，可减轻患者的发热反应，并能使四环素的治疗效果更快更好。但是该灭活疫苗仅提供有限的保护作用，远没有达到有效疫苗保护标准。另外制备立氏立克次体灭活疫苗通常需要鸡胚或者细胞大量培养立克次体，但是提取纯化立克次体的防护要求高，工艺复杂，成本昂贵，因此难以大量制备和推广使用。
随着对RMSF疫苗研究的不断深入以及蛋白质组学的飞速发展，人们将目光转向了亚单位。研究发现立氏立克次体外膜蛋白A(OmpA)、外膜蛋白B(OmpB)以及普氏立克次体外膜蛋白B(OmpB)免疫产生的抗体可以中和立克次体对小鼠的致死毒性，给予OmpA及OmpB的单克隆抗体可以保护豚鼠有效抵抗致死剂量的立氏立克次体的感染并交叉保护小鼠抵抗致死剂量的康氏立克次体（R.conorii）的感染。这些外膜蛋白尽管有一定的保护作用，但是其免疫保护效果有限，目前难以代替灭活RMSF疫苗。因此，鉴定立氏立克次体的保护性抗原，研发更加安全、有效、持久的亚单位疫苗对预防RMSF具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白A1G_01780在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。
本发明提供的A1G_01780蛋白，为如下（1）-（3）任一所示的蛋白：
（1）SEQ ID No.1中自N端起第164位至第402位氨基酸所示的蛋白；
（2）SEQ ID No.1所示的蛋白；
（3）将（1）或（2）所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
1）SEQ ID No.3中自5’末端起第490位至第1206位核苷酸所示的DNA分子；
2)SEQ ID No.3所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
上述蛋白在制备预防和/或治疗立氏立克次体引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述疾病为落基山斑点热。
上述任一所述的应用中，所述产品为疫苗。
上述蛋白在制备降低被立氏立克次体感染的动物的脏器组织内立氏立克次体数量的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述脏器为脾脏、肝脏和/或肺脏。
本发明的立氏立克次体的蛋白A1G_01780可以作为一种抗原蛋白，能够刺激机体产生免疫应答对抗立氏立克次体毒株攻击，可以作为具有落基山斑点热疫苗功能的保护性抗原。蛋白A1G_01780可通过基因工程制备，用蛋白A1G_01780作为疫苗与立氏立克次体全菌蛋白疫苗相比，具有制备方法简单、成本低、产量高、更安全等优点，本发明对于落基山斑点热的防疫和治疗具有重大价值。
附图说明
图1为DNA电泳检测。
图2为蛋白电泳检测和免疫印迹实验（Western blot）。
图3为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾组织内立氏立克次体拷贝数。
图4为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠肝组织内立氏立克次体拷贝数。
图5为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠肺组织内立氏立克次体拷贝数。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的试剂如无特殊说明，均购自国药集团化学试剂公司。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下实施例中利用仪器NANODROP1000分光光度计（购自Thermo Scientific公司）进行蛋白浓度的测定；利用仪器7300Real Time PCR System（购自Applied Biosystems公司）进行立氏立克次体拷贝数的测定。
载体pET-32a(+)购自Novagen公司，产品目录号为69015。
大肠杆菌BL21购自Novagen公司，产品目录号为69450。
C3H/HeN小鼠（3-4周龄，雄性）购自北京维通利华公司。
弗氏完全佐剂（CFA）购自Sigma公司，产品目录号为F-5881。
弗氏不完全佐剂（IFA）购自Sigma公司，产品目录号为F-5506。
镍-NTA琼脂糖凝胶(Ni-NTA)试剂盒购自Qiagen公司，产品目录号为30230。
DNA提取试剂盒购自Qiagen公司，产品目录号为69506。
辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自中科瑞泰公司，产品目录号为ZB-2305。
限制性内切酶均购自大连TaKaRa公司。
实施例中所用的立氏立克次体（Rickettsia rickettsii）均为立氏立克次体Sheila Smith株（Rickettsia rickettsii，Sheila Smith strain），该菌株在文献“Ellison DW,Clark TR,Sturdevant DE,Virtaneva K,Porcella SF,Hackstadt T.Genomic comparison of virulent Rickettsia rickettsii Sheila Smith andavirulent Rickettsia rickettsii Iowa.Infect Immun.2008Feb;76(2):542-50.Epub2007Nov19.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
主要试剂的配制：
PCR反应用2×Mix的配制(1ml)：
加去离子水定容至1ml。
可溶性表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制如下：
一、可溶性蛋白裂解缓冲液pH8.0(1000ml)：
称取上述质量的各试剂，用去离子水溶解并定容到1000ml，NaOH调节pH至8.0。
二、可溶性蛋白洗涤缓冲液 pH8.0 (1000ml)：
称取上述质量的各试剂，用去离子水溶解并定容到1000ml，NaOH调节pH至8.0。
三、可溶性蛋白洗脱缓冲液pH8.0(1000ml)：
称取或量取上述各试剂，用去离子水溶解并定容到1000ml，NaOH调节pH至8.0。包涵体表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制如下：
一、包涵体蛋白裂解缓冲液pH8.0(1000ml)：
称取或量取上述各试剂，用去离子水溶解并定容到1000ml，NaOH调节pH至8.0。
二、包涵体蛋白洗涤缓冲液pH6.3(1000ml)：
称取或量取上述各试剂，用去离子水溶解并定容到1000ml，NaOH调节pH至6.3。
三、包涵体蛋白洗脱缓冲液pH4.5(1000ml)：
称取或量取上述各试剂，用去离子水溶解并定容到1000ml，NaOH调节pH至4.5。
每升转移缓冲液的制备：称取2.9g甘氨酸、5.8g Tris碱、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水定容至1L。
PBS缓冲液（0.01mol/L、pH7.2）的制备：2.86g Na2HPO4·12H2O、8.5g NaCl、2.86g NaH2PO4·2H2O加入到1L ddH2O中，完全溶解，调节pH至7.2。实施例中的PBS缓冲液均为0.01mol/L、pH7.2PBS缓冲液。
每100ml封闭液的制备：称取1g牛血清白蛋白（BSA），溶于100ml PBS缓冲液（0.01mol/L、pH7.2）中。
6周龄雌性C3H/HeN小鼠购自北京维通利华公司。
立氏立克次体全菌蛋白的制备方法见文献“Ammerman NC,Beier-Sexton M,AzadAF(2008)Laboratory maintenance of Rickettsia rickettsii.Curr ProtocMicrobiol Chapter3:Unit3A5.”
立氏立克次体免疫血清的制备：将6周龄雌性C3H/HeN小鼠分别在第0天、第28天和第42天进行立氏立克次体全菌蛋白免疫。首次免疫采用皮下注射免疫（每只小鼠免疫剂量：100ul含20ug立氏立克次体全菌蛋白的溶液与100ul弗氏完全佐剂的混合物）；第二次和第三次免疫均采用腹部注射免疫（每只小鼠免疫剂量：100ul含10ug立氏立克次体全菌蛋白的溶液与100ul弗氏不完全佐剂的混合物）。末次免疫后第14天通过眼眶静脉取血，分离血清备用。
显色液A\B\C购自武汉博士德公司。
实施例1、重组质粒的构建
一、重组质粒甲的构建
（一）提取立氏立克次体的基因组DNA。
（二）以步骤（一）提取的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到A1G_01780基因片段。
F1：5’-GGG GAT CCA TGA AAC TGA TTG TCT TA-3’；
R1：5’-GGC TCG AGT TTA ATC TTA GCA TCT TC-3’。
（下划线所示序列为酶切识别位点）
PCR反应体系25μl：
模板1μl，2×Mix12.5μl，上、下游引物各1μl(50μM/μl)，加水至25μl。
PCR扩增条件：
94℃预变性5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸7min。
（三）将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1中的泳道1所示。
A1G_01780蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1中自N端起第164位至402位氨基酸所示；A1G_01780基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3中自5’末端起第490位至1206位核苷酸所示的DNA分子。
PCR扩增产物大小与预期一致。
（四）用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切PCR扩增产物，得到基因片段；用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切载体pET-32a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒甲。将重组质粒甲送测序，测序正确。
根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在载体pET-32a(+)的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID No.3自5’末端起第490位至1206位核苷酸所示的DNA分子。
由于A1G_01780基因与载体骨架上的His标签形成融合基因，表达融合蛋白，从而可用Ni-NTA进行进一步纯化。
二、重组质粒乙的构建
（一）提取立氏立克次体的基因组DNA。
（二）以步骤（一）提取的基因组DNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到TolC基因片段。
F2：5’-CCGGATCCACTGAAGGGTATAAGAA-3’；
R2：5’-CCGTCGACAAACTCTTCTTCAGGACTA-3’。
（下划线所示序列为酶切识别位点）
PCR反应体系25μl：
模板1μl，2×Mix12.5μl，上、下游引物各1μl(50μM/μl)，加水至25μl。
PCR扩增条件：
94℃预变性5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸7min。
（三）将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1中的泳道2所示。
TolC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第164位至579位氨基酸所示；TolC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4中自5’末端起第490位至1737位核苷酸所示的DNA分子。
PCR扩增产物大小与预期一致。
（四）用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切PCR扩增产物，得到基因片段；用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切载体pET-32a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒乙。将重组质粒乙送测序，测序正确。
根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：在载体pET-32a(+)的BamHI和SalI酶切位点之间插入了SEQ ID No.4中自5’末端起第490位至1737位核苷酸所示的DNA分子。
由于TolC基因与载体骨架上的His标签形成融合基因，表达融合蛋白，从而可用Ni-NTA进行进一步纯化。
实施例2、重组蛋白的制备
一、蛋白A1G_01780（又称为蛋白甲）的制备
（一）重组菌的制备
将重组质粒甲导入大肠杆菌BL21，得到重组菌。
重组菌的验证方法：将菌株接入LB固体培养基平板（含200mg/L氨苄青霉素），挑取单克隆并转接入LB液体培养基，37℃培养并提取质粒进行测序，如果提取的质粒为重组质粒甲，即为目的重组菌。
（二）蛋白甲的表达
将重组菌接入LB液体培养基（含200mg/L氨苄青霉素），37℃、200rpm培养过夜。次日按照体积百分含量为1%的接种量转接入含有相同浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养至OD600值≈0.6时，加入IPTG诱导剂至终浓度0.1mM，在25℃、200rpm条件下继续进行诱导表达8h，得到发酵液。
（三）蛋白甲的纯化
1、取发酵液100ml，5000rpm离心10min，收集菌体沉淀。
2、用30ml可溶性蛋白裂解缓冲液重悬菌体，吹打混匀后冰浴条件下进行超声，超声条件为：工作4.5sec,间隔9sec,共超声20min,功率为125W。将超声裂解物以12,000×g离心20min，吸取上清备用。
3、取10ml上清，与2mlNi-NTA混合，室温200rpm振荡混匀4h，使得目的蛋白（蛋白甲）与Ni-NTA充分结合，然后将混合物移入纯化柱内，用可溶性蛋白洗涤缓冲液洗涤3次，每次10ml（流速控制为3ml/min）。然后用可溶性蛋白洗脱缓冲液洗脱5次，每次500ul（流速控制为3ml/min），合并收集的洗脱液并测蛋白浓度，得到目的蛋白溶液即为蛋白甲溶液。
二、蛋白TolC（又称为蛋白乙）的制备
（一）重组菌的制备
将重组质粒乙导入大肠杆菌BL21，得到重组菌。
重组菌的验证方法：将菌株接入LB固体培养基平板（含200mg/L氨苄青霉素），挑取单克隆并转接入LB液体培养基，37℃培养并提取质粒进行测序，如果提取的质粒为重组质粒乙，即为目的重组菌。
（二）蛋白乙的表达
将重组菌接入LB液体培养基（含200mg/L氨苄青霉素），37℃、200rpm培养过夜。次日按照体积百分含量为1%的接种量转接入含有相同浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养至OD600值≈0.6时，加入IPTG诱导剂至终浓度0.1mM，在37℃、200rpm条件下继续进行诱导表达4h，得到发酵液。
（三）蛋白乙的纯化
1、取发酵液100ml，5000rpm离心10min，收集菌体沉淀。
2、用30ml可溶性蛋白裂解缓冲液重悬菌体，吹打混匀后冰浴条件下进行超声，超声条件为：工作4.5sec,间隔9sec,共超声60min,功率为125W。将超声裂解物以12,000×g离心20min，弃去上清，将10ml包涵体蛋白裂解缓冲液加入沉淀部分，并且充分吹打混匀，室温放置过夜。
3、次日将步骤2得到的过夜混合物与2mlNi-NTA混合，室温200rpm振荡混匀4h，使得目的蛋白（蛋白乙）与Ni-NTA充分结合，然后将混合物移入纯化柱内，用包涵体蛋白洗涤缓冲液洗涤3次，每次10ml（流速控制为3ml/min）。然后用包涵体蛋白洗脱缓冲液洗脱5次，每次500ul（流速控制为3ml/min），合并收集的洗脱液并测蛋白浓度，得到目的蛋白溶液即为蛋白乙溶液。
三、蛋白的鉴定
将蛋白甲溶液和蛋白乙溶液进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图2A所示。
图2A中，M：蛋白Marker；1：蛋白甲；2：蛋白乙
图2A表明，蛋白甲溶液只显示一条44KD的条带，与预期相符合。蛋白乙溶液只显示一条63KD的条带，与预期相符合。
实施例3、免疫印迹实验（Western blot assay）
一、半干转印
（一）戴上手套，切滤纸和硝酸纤维素膜。
（二）将硝酸纤维素膜置于一个盛有20ml甲醇的培养皿中，浸泡30s-60s后用镊子取出，放入事先配制好的转移缓冲液中。同时将滤纸放入另一个盛有转移缓冲液的培养皿中，赶走气泡。
(三)将转移装置擦拭干净后，从下向上依次放置滤纸→PAGE胶→硝酸纤维素膜→滤纸，每放一层都要用试管赶走气泡和多余的液体。
（四）将阳极放在夹层物上，接通电源，60-70mA电流电转印75min。断电，将凝胶用考马斯亮蓝G-250染色，检查是否转印完全。
二、结合一抗
（一）将电转印之后的硝酸纤维素膜用镊子轻轻夹起放入一个干净的塑封袋中，然后向其中加入封闭液30ml。
（二）封闭过夜。弃去封闭液，加入事先配制好的一抗混合物（即：取新鲜的封闭液10ml左右，向其中加入100ul立氏立克次体免疫血清，混匀，加入到塑封袋中即可），摇床孵育1h。
（三）弃去一抗混合液，取一个干净的培养皿，向其中加入适量去离子水，然后将硝酸纤维素膜放入，轻轻漂洗。
（四）弃去培养皿中的去离子水，用PBST漂洗3次，每次10min。
三、结合二抗
弃去培养皿中的PBST，向其中加入10ml二抗混合液（即：取新鲜的封闭液10ml左右，向其中加入100ul辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，混匀，加入到塑封袋中即可），摇床孵育1h。弃去二抗混合液，用PBST漂洗3次，每次10min。
四、DAB显色
取3ml去离子水，向其中先后加入显色液A\B\C（武汉博士德公司）各3滴，混匀后倒入盛有硝酸纤维素膜的培养皿中。轻轻摇晃，细心观察显色反应，一旦蛋白条带的颜色达到要求，用水漂洗。拍照。结果如图2B所示。
图2B中，M：蛋白Marker；1：蛋白甲；2：蛋白乙
图2B表明，蛋白甲和蛋白乙是目的蛋白。
实施例4、抗原蛋白A1G_01780的保护性评价
一、小鼠免疫
将3-4周龄的雄性C3H/HeN小鼠（以下简称C3H小鼠）20只按照体重等量地分配到4个实验组中，每组5只C3H小鼠。
组别设置：实验组：A1G_01780蛋白加佐剂；阴性对照组：PBS加佐剂；阳性对照组：全菌蛋白加佐剂；阴性蛋白组：TolC蛋白加佐剂。
各组分别在第0天、第28天和第42天进行第1次、第2次和第3次免疫。
除阴性对照组外，各组的免疫方案均如表1所示。
表1 免疫方案
阴性对照组在第0天、第28天和第42天进行第1次、第2次和第3次免疫。第1次免疫的试剂为100ulPBS缓冲液与100ulCFA佐剂的混合物，免疫方式为皮下注射；第2次免疫的试剂为100ulPBS缓冲液与100ulIFA佐剂的混合物，免疫方式为腹腔注射；第3次免疫的试剂为100ulPBS缓冲液与100ulIFA佐剂的混合物，免疫方式为腹腔注射。
二、立氏立克次体攻击C3H小鼠
末次免疫后第14天，用立氏立克次体通过腹腔注射感染各组C3H小鼠，剂量为6×106个/只。攻毒5天后，将各组小鼠处死，摘取脾脏、肺脏、肝脏。
三、RT-PCR检测各脏器中立氏立克次体拷贝数
（一）将各组小鼠的各个脏器表面的粘连组织剥离干净，然后称重并记录。将剥离干净的各个脏器分别与1mlPBS放入研磨器中充分研磨，研磨液移入EP管并用PBS定容至1.5ml。从各个EP管中取出10mg脾脏或20mg肝脏或20mg肺脏组织对应的研磨液进行DNA提取。
利用RT-PCR检测各组各个脏器中立氏立克次体的载量，进行统计分析，比较和评价各重组蛋白的保护性。
实时荧光定量PCR所用的引物及探针序列如下：
Fp：5’-TgA AgA TAC TAC CTT Agg gTT CAT CAC TA-3’；
Rp：5’-ACC ggC ATT AAg CgT AAg gTT-3’；
TaqMan MGB探针：5’-FTgT TgT TCA TAA CgC TCA CP-3’（序列中F代表报告荧光基团FAM，P代表淬灭基团TAQMAN-MGB）；
标准品序列：5’-TGTTGTTCATAACGCTCA-3’
取1ul标准品作为模板，以Fp和Rp为引物，以TaqMan MGB探针进行实时荧光定量PCR绘制标准曲线；同时，取1ul各组各小鼠脾组织（10mg）提取的DNA作为模板、以Fp和Rp为引物，以TaqMan MGB探针进行同一批次的实时荧光定量PCR。得到与脾组织进行同一批次实时荧光定量PCR的标准曲线方程为Ct=-3.36×logC0+37.79。通过标准曲线将各组小鼠脾组织的实时荧光定量PCR结果换算为立氏立克次体的拷贝数。
取1ul标准品作为模板，以Fp和Rp为引物，以TaqMan MGB探针进行实时荧光定量PCR绘制标准曲线；同时，取1ul各组各小鼠肝组织（20mg）提取的DNA作为模板、以Fp和Rp为引物，以TaqMan MGB探针进行同一批次的实时荧光定量PCR。与肝组织进行同一批次实时荧光定量PCR的标准曲线方程为Ct=-3.38×logC0+38.13。通过标准曲线将各组小鼠肝组织的实时荧光定量PCR结果换算为立氏立克次体的拷贝数。
取1ul标准品作为模板，以Fp和Rp为引物，以TaqMan MGB探针进行实时荧光定量PCR绘制标准曲线；同时，取1ul各组各小鼠肺组织（20mg）提取的DNA作为模板、以Fp和Rp为引物，以TaqMan MGB探针进行同一批次的实时荧光定量PCR。与肺组织进行同一批次实时荧光定量PCR的标准曲线方程为Ct=-3.10×logC0+37.74。通过标准曲线将各组小鼠肺组织的实时荧光定量PCR结果换算为立氏立克次体的拷贝数。
三个标准曲线方程中，C0均代表拷贝数。三个标准曲线方程的R2值均大于99%。
对各组织各小组的实时定量PCR结果运用SAS9.1软件进行单因素多水平定量资料的假设检验（根据是否同时满足正态性及方差齐性，选择一元方差分析或者Kruskal-Wallis秩和检验）及SNK法进行两两之间的比较（相同字母表示组间没有显著性差异）。
脾组织中立氏立克次体拷贝数检测结果如表2和图3所示。
肝组织中立氏立克次体拷贝数检测结果如表3和图4所示。
肺组织中立氏立克次体拷贝数检测结果如表4和图5所示。
表2 脾组织检测结果
表3 肝组织检测结果
表4 肺组织检测结果
图3、图4和图5中的PBS代表阴性对照组，A1G_01780代表实验组，WCA代表阳性对照组，tolC代表阴性蛋白组。
统计学分析显示，对脾脏的检测中，实验组和阳性对照组与阴性对照组及阴性蛋白组有显著性差异（P=0.0016），而阴性蛋白组与阴性对照组之间无显著性差异。
对肝脏的检测中，实验组和阳性对照组与阴性对照组及阴性蛋白组有显著性差异（P=0.0010），而阴性蛋白组与阴性对照组之间也有显著性差异，且阴性蛋白TolC能够促进立氏立克次体的繁殖。
对肺脏的检测中，实验组和阳性对照组与阴性对照组及阴性蛋白组有显著性差异（P<0.001），而阴性蛋白组与阴性对照组之间无显著性差异。
与阴性对照组相比，实验组可减少立氏立克次体在脾组织、肝组织及肺组织中数量的91.7%、60.1%和90.4%；阳性对照组可减少立克次体在脾组织、肝组织及肺组织中数量的96.0%、74.1%和80.0%。由此可知，脾脏中A1G_01780蛋白的免疫保护性占全菌蛋白免疫保护性的比例为：91.7%/96.0%=95.5%；肝脏中A1G_01780蛋白的免疫保护性占全菌蛋白免疫保护性的比例为：60.1%/74.1%=81.1%；肺脏中A1G_01780蛋白的免疫保护性占全菌蛋白免疫保护性的比例为：90.4%/80.0%=113%。综合以上结果表明，抗原A1G_01780的免疫保护性可达到全菌蛋白免疫保护性的81.1%以上。
Claims (5)
1.SEQ ID No.1中自N端起第164位至第402位氨基酸所示的蛋白在制备预防立氏立克次体引起的疾病的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述疾病为落基山斑点热。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为疫苗。
4.SEQ ID No.1中自N端起第164位至第402位氨基酸所示的蛋白在制备降低被立氏立克次体感染的动物的脏器组织内立氏立克次体数量的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述脏器为脾脏、肝脏或肺脏。
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