CN107325166A - 柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag6所编码的重组蛋白及其应用 - Google Patents

柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag6所编码的重组蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6所编码的重组蛋白，属于分子生物学和动物疫苗领域。该重组蛋白可在原核系统中表达，具有良好的反应原性，对鸡具有较强的免疫保护力，在相对增重、降低感染鸡的盲肠病变及抗球虫指数方面的效果要优于其它SAG基因，对于鸡球虫病新的药物和疫苗研制具有重要的意义。

Description

柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6所编码的重组蛋白及其 应用
技术领域
本发明属于分子生物学和动物疫苗领域，涉及柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)表面抗原基因SAG6所编码的重组蛋白，本发明还涉及该重组蛋白的应用。
背景技术
鸡球虫病是一种呈世界性分布，严重危害养鸡业发展的寄生虫病。柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是致病性最为严重的鸡球虫之一，主要寄生于鸡肠道内并引起以肠道病变为主要特征的鸡球虫病并严重危害养禽业的发展。目前控制球虫病还是主要依赖抗球虫药，但由于对球虫的细胞和分子生物学等缺乏详尽的了解，迄今尚无理想的控制鸡球虫病的药物和疫苗，寻找新的药物和疫苗靶位对于鸡球虫病的防治具有重要的意义。
柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因(SAG)在虫体粘附和入侵宿主细胞过程中扮演着重要的作用，是一类比较重要的疫苗候选基因。作为一种重要的表面抗原基因，SAG6基因主要在卵囊时期(孢子化卵囊)和裂殖生殖阶段(裂殖子)具有较高的表达量，这表明，SAG6基因可能被子孢子释放于宿主细胞表面，从而参与了虫体粘附，而后入侵；另外，无性生殖阶段是虫体入侵肠道上皮细胞的重要阶段，而SAG6基因在此阶段也有较高的表达量，表明此基因可能参与了虫体在肠上皮细胞的繁殖。综上所述，SAG6基因是一种很有前景的疫苗候选分子。
发明内容
本发明的第一个目的是将柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6在大肠杆菌表达系统中高效表达获得重组蛋白。
本发明的第二个目的是提供上述重组蛋白在制备抗鸡球虫病疫苗中的应用。
本发明采用的技术方案如下：
(1)柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6的获得：利用聚合酶链式反应(PCR)的方法，以柔嫩艾美耳球虫总RNA为模板，反转录成cDNA，经PCR得到柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6。
(2)柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6重组蛋白的制备：根据已报道的登录号为XM_013375899.1的柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6扩增得到其开放阅读框(ORF)序列，将获得的序列与大肠杆菌表达载体构建重组表达质粒pET-28a-SAG6，转化至大肠杆菌BL21中，抗生素卡那青霉素筛选高抗性的转化子，并用0.8mmol/L IPTG于37℃诱导4h。收集上述IPTG诱导表达的菌液，对其进行分离纯化的蛋白即为编码了柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6的重组蛋白。
(3)Western blot方法检测重组蛋白的表达：利用His标签抗体和鸡多克隆抗体对纯化后蛋白样品进行免疫印迹反应，结果表明pET-28a-SAG6重组质粒可以在原核中表达。
(4)重组蛋白的免疫保护实验：使用重组蛋白对实验动物鸡进行二次免疫后，人工感染柔嫩艾美耳球虫，通过相对增重率、卵囊数统计、盲肠病变值和抗球虫指数综合评价重组蛋白的免疫保护力，结果表明pET-28a-SAG6重组蛋白对实验动物鸡具有一定的免疫保护力，在相对增重、降低感染鸡的盲肠病变及抗球虫指数方面的效果要优于其它SAG基因。
附图说明
图1为基因SAG6扩增电泳图。1：从柔嫩艾美耳球虫总cDNA中扩增含有同源臂的目的基因；M：DNA分子量标准。
图2为重组质粒pET-28a-SAG6的菌液PCR鉴定。1-6：重组表达质粒的菌液PCR鉴定；M：DNA分子量标准。
图3为基因SAG6的重组表达产物定性分析的SDS-PAGE电泳结果。1：未诱导的pET-28a-SAG6表达产物；2：IPTG诱导的pET-28a-SAG6表达产物；M：蛋白质分子质量标准。
图4为基因SAG6的重组表达产物提取的SDS-PAGE电泳结果。1：表达菌裂解液的上清；2：表达菌裂解液的包涵体；M：蛋白质分子质量标准。
图5为基因SAG6纯化后的重组表达产物的SDS-PAGE电泳结果。1：纯化后的重组表达产物；M：蛋白质分子质量标准。
图6为基因SAG6重组蛋白的Western blot鉴定。1：重组蛋白与His标签抗体反应；2：重组蛋白与鸡多克隆抗体反应。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：柔嫩艾美耳球虫总RNA的提取
1)将含有约1×108个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊悬液3000rpm离心5min，弃上清；
2)沉淀加入1ml TRIzol重悬后用1ml无RNA酶的匀浆器研磨20min，至90％的子孢子破囊。研磨后转移到一个无RNA酶的1.5ml离心管中，室温(15-30℃)放置10min，使核酸蛋白复合物完全分离；
3)向悬液中加入0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡15sec，室温放置5min；
4)4℃、12000rpm离心15min，将上层无色清液转移至一个新的无RNA酶的1.5ml离心管中，弃中间层和下层；
5)用等体积预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA，混匀后置-20℃沉淀60min；
6)4℃、12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀；
7)4℃12000rpm离心10min，弃上清；
8)冰上晾干，根据RNA的量加入25-100μl无RNase的水，用移液器吸打几次使RNA溶解，提取的RNA于-80℃保存。
实施例2：柔嫩艾美耳球虫总cDNA的合成
使用Thermo公司的RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit，以提取的柔嫩艾美耳球虫总RNA为模板进行反转录，具体操作步骤为：
①在Microtube中配制下列混合液
②在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应：
65℃ 5min ↓ 冰上急冷
③在上述Microtube管中配制下列反转录反应液：
上述变性退火后反应液
④在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：
反转录所得的cDNA放-20保存备用。
实施例3：柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6的获得
1)引物设计
根据NCBI/GenBank上报道的柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6序列信息(XM_013375899.1)和真核表达载体pET-28a的图谱设计一对引物(pET-28a-SAG6-F和pET-28a-SAG6-R)扩增得到柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6，具体如下：
pET-28a-SAG6-F：5’-TGACTGGTGGACAGCAAATGACAATCAAGTACACTGCTTC-3’pET-28a-SAG6-R：5’-TTAGCAGCCGGATCTCATCAGATGGCGGCTGACGCTGACC-3’
2)PCR扩增：以柔嫩艾美耳球虫cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL，PCR反应体系如下：
PCR反应条件：98℃预变性5min；循环为98℃变性5min，57℃退火15sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。
3)PCR产物的电泳检测与回收：PCR产物在1.8％琼脂糖凝胶电泳，调节电压至150V，电泳15min，照相记录电泳结果(图1)，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带。用凝胶回收试剂盒(OMEGA)回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行。
实施例4：重组表达载体的构建及鉴定
1)重组表达载体pET-28a-SAG6的构建
将用扩增得到的目的基因SAG6与同样用pET-28a载体进行体外连接，连接体系如下：
目的基因 4μl
pET-28a载体 1μl
Total 5μl
将上述液体混匀后，PCR仪中25℃恒温连接20min，冰上放置5min后即可进行转化。无菌条件下加入到50μl大肠杆菌BL21感受态细胞中，温和的反复吹打混匀，冰上放置30min。42℃热激90s，之后立即冰上放置2min使之冷却。转移菌液至装有500μl预热至37℃的LB培养液中，180rpm、37℃温和振荡45min，使细菌恢复抗药性。室温下8000rpm离心2min，弃400μl上清液，用剩余的液体重悬沉淀，均匀涂布于含氨苄青霉素(AMP)(100μg/ml)的LB琼脂平板上，倒置平皿于37℃恒温培养箱培养12～16h。
2)重组表达载体的鉴定
随机挑取单菌落进行扩大培养后用表达引物进行菌液PCR鉴定。反应体系为50μL，PCR反应体系如下：
PCR反应条件：98℃预变性5min；循环为98℃变性5min，57℃退火15sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。扩增后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。
实施例5：重组蛋白的表达及纯化
1)重组质粒的原核表达
①将目的片段重组原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37℃倒置培养8-10h；
②挑取含原核表达质粒的单菌落置于3mL相应抗性的LB液体培养基中，37℃180rpm振荡培养过夜；
③按1:100将过夜培养的菌液转接入4mL上述LB液体培养中，37℃、180rpm振荡培养3h至对数生长期(OD600为0.5-0.6)；
④取2mL菌液转移至新的细菌培养瓶中，并加入诱导剂IPTG(终浓度为0.8mmol/L)进行诱导表达，连同剩余的2mL菌液(在原瓶中)一起，37℃、180rpm继续振荡培养4h；
⑤分别取诱导和未诱导菌液1mL，室温8000rpm离心2min，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上使液体流尽；
⑥菌体沉淀用40μL dH2O重悬，剧烈涡旋使菌体分散，向离心管中加入50uL 2×SDS上样缓冲液和10μL DTT，混匀后，沸水煮10min，冰上冷却5min；
⑦取10μL进行SDS-PAGE凝胶电泳检测分析。
2)SDS-PAGE凝胶电泳
①取SDS-PAGE电泳凝胶制备的双层玻璃板和凝胶梳进行清水冲洗，用吸水纸洗干玻璃表面的水，安置于电泳槽中；
②在一干净的50mL烧杯中配制一定浓度的SDS-PAGE下层胶(分离胶)，取7mL灌注于安装好的玻璃板之间，避免产生气泡，加入500μL无水乙醇将胶面压平，室温放置15-30min待胶凝固；
③将凝胶表面的无水乙醇弃掉，并用清水冲洗去掉残存的乙醇，吸水纸吸干残留在凝胶表面的水；
④配制SDS-PAGE上层胶(积层胶)，并取2.5mL立即灌注在玻璃板的剩余空间内，并插入凝胶梳，室温放置15-30min待上层胶凝固；
⑤向电泳槽内加入新鲜配制的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，并将凝胶梳拔出；
⑥向加样孔中加入处理好的蛋白质样品，将正负极分别连接入电源，上层胶用100V稳压进行电泳，下层胶用150V稳压电泳；
⑦带样品的溴酚蓝指示迁移至下层胶底部时，关闭电源，取出凝胶进行考马斯亮蓝染色4h以上，再将凝胶放入脱色液中进行脱色至可见清晰条带为止。
柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6的重组表达产物定性分析的SDS-PAGE电泳结果见图3(诱导表达和非诱导表达结果)和图4(上清液和包涵体检测结果)。
3)His融合蛋白的包涵体纯化
①将过夜培养的His融合蛋白表达菌按1:100转接入1L相应的LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养3h至对数生长期；
②向菌液中加入IPTG使其终浓度为0.8mmol/L，28℃、100rpm振荡培养12h，进行诱导表达；
③将诱导后的菌液在室温下8000rpm离心10min，弃上清，用50mL平衡缓冲液重悬沉淀；
④室温8000rpm离心10min，弃上清，用20mL平衡缓冲液重悬沉淀；
⑤将菌体悬液进行压力破碎，4℃、8000rpm离心10min分离上清和包涵体，将上清转移至新的50mL离心管中；沉淀用同体积Buffer A溶液重悬；
⑥4℃、8000rpm离心10min，弃上清；沉淀用20mL PBS洗涤；重复一次；
⑦沉淀中加入19.7mL Buffer A溶液，19.7ul的DTT(0.5M/L)以及0.3mL的20％SKL(十二烷基肌氨酸钠)，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置2h；
⑧4℃、8000rpm离心10min，取上清；
⑨加入210ul的20％PEG4000(聚乙二醇)，420ul的50mM的氧化型谷胱甘肽，420ul的100mM的还原型谷胱甘肽，室温静置2h；
⑩将样品进行透析处理。
4)纯化蛋白的透析与浓缩
①取未处理的透析袋剪成适当长度，在大体积的2％(W/V)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(pH＝8.0)溶液中将其煮沸10min，用dH2O彻底清洗后，放入1mmol/L EDTA(pH＝8.0)溶液中再次煮沸10min，用dH2O清洗后可以用于蛋白透析；
②将纯化后的蛋白溶液加入到透析袋中，并用夹子将透析袋两侧封住，并检查其是否出现漏洞；
③将透析袋置于PBS(pH＝7.4)中透析72h，期间每8-12h更换一次透析液；
④将透析袋置于蔗糖上进行浓缩，待蔗糖全部浸湿后应更换新鲜干燥的蔗糖，浓缩至初始体积的1/3-1/5即可；
⑤处理透析、浓缩后的样品进行SDS-PAGE检测。
纯化后的重组蛋白SDS-PAGE检测结果见图5。
实施例6：重组蛋白的Western blot检测
利用His标签抗体和鸡多克隆抗体对纯化后蛋白样品进行免疫印迹反应，结果显示pET-28a-SAG6重组质粒可在原核中表达(图6)。
实施例7：重组蛋白的动物保护实验
每组7只，按表1进行免疫。首免时，重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫；二免时与弗氏不完全佐剂乳化后免疫。重组蛋白用Elution Buffer稀释至所需的浓度后经胸部肌肉注射免疫。14日龄首免，21日龄二免。28日龄逐羽称重，经口感染孢子化卵囊5万每羽。35日龄剖杀所有鸡只，并用SPSS统计分析软件分析计算各组的增重率(表2)、OPG和盲肠病变计分(表3)、抗球虫指数(ACI)(表4)。同时以重组蛋白SAG2和SAG7(采用常规方法制备)为对照。
表1动物实验分组及免疫程序
组别 首免剂量(14日龄) 二免剂量(21日龄) 攻虫
重组蛋白SAG6免疫组 100ug/羽 100ug/羽 5×104
重组蛋白SAG2免疫组 100ug/羽 100ug/羽 5×104
重组蛋白SAG7免疫组 100ug/羽 100ug/羽 5×104
感染未免疫(红对照) PBS PBS 5×104
未感染未免疫(白对照) PBS PBS PBS
表2免疫保护性实验的增重率结果
表3免疫保护性实验的OPG和盲肠病变计分结果
组别 OPG值(×105) 盲肠病变计分
重组蛋白SAG6免疫组 0.72 2.33±0.10a
重组蛋白SAG2免疫组 0.73 2.61±0.14b
重组蛋白SAG7免疫组 0.87 2.74±0.17b
感染未免疫组(红对照) 2.38 3.36±0.15e
未感染未免疫组(白对照) 0 0.00±0.00f
表4免疫保护性实验的抗球虫指数结果。
组别 存活率(％) 相对增重率 病变值 卵囊值 抗球虫指数
重组蛋白SAG6免疫组 100 75.91 23.3 0 149.81
重组蛋白SAG2免疫组 100 68.00 26.1 0 144.70
重组蛋白SAG7免疫组 100 60.15 27.4 0 132.75
感染未免疫组(红对照) 100 58.16 33.6 1 123.56
未感染未免疫组(白对照) 100 100.00 0 0 200
从以上试验数据可以看出，SAG6基因编码的重组蛋白对柔嫩艾美耳球虫具有较强的免疫保护力，且在提高鸡相对增重、抗球虫指数和降低感染鸡的盲肠病变方面均优于其它SAG基因，有望成为防治鸡球虫病的新药物疫苗靶标。
<110>华中农业大学
<120>柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6所编码的重组蛋白及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 771
<212> DNA
<213>柔嫩艾美尔球虫（Eimeria tenella）
<400> 1
ATGCTGCCTC TGCGTATACC ATCTGTTTTC AGCGCCTCGA TCTTTCTGCT GAGTGTCTCA 60
TACCTGGGAA CCTCACAACA AAGTGCACCA ACAATCAAGT ACACTGCTTC TCTCGGTGGA 120
GGTGCCAAAT GCCTCAGCGA GGTCAACGCT GCCCGTGGGG CAGCTGGGTT GAAGAATTTT 180
GCAGAGGCCA CAAACGACAA AAAATTAAGT GCTCCTTCAG ATGACCTAGA AAACGACACC 240
GAGTGGAAAA AAGTTTGCGA GCACCTGATC CCAACGCAAA AAGAACCCGT AGAGGCGACA 300
AGTGGAACAA ATCCCTTTGA GAAAGGAACA TACGCTTTCA AGTCCCTAAC TACTGCGGAA 360
CCAAACTGCA AGGAAATAGT GAATTACTGG AAGGCAGCCT TCAAGAATTT CACTGGACTG 420
CCGCCGTCAG AGAGTCAAGC TGGAGATCTC TACAAGAGCT ATAACAATGT CTCTTTTGTA 480
GCCCTTTACA ACACATCATC TAATGCCACT GCAGATTGTC AAGTCGTCAC TTGCACTAAA 540
ACTACTACTC CTGGCGATTC ATCGATTCGC GACAGTCCAA GCGGAAGCCA AGAATATGGA 600
TACGCAATGA TTTGCAAAAC AATGCCCGCT GCCTTTGCAG ACAAAAATTC TGCTCCATTC 660
ACGCAGGATC AATGGGACAG GATCATATCC TCCCTTACAG GGTCAGCGTC AGCCGCCATC 720
CCAGGTTTCG GTGCATTCTT TATCGTAGTC TTAAGTATGG CAGTATTGTG A 771

Claims (2)

1.柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因SAG6所编码的重组蛋白。
2.权利要求1所述的重组蛋白在制备抗鸡球虫病疫苗中的应用。
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