CN105903007A - 一种新型肝片吸虫多表位疫苗的设计、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型肝片吸虫多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白‑2 Th和B细胞抗原表位的多拷贝体以及黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基构成。本发明主要通过基因合成技术合成一个人工基因，其包含有鞘脂激活蛋白样蛋白‑2的Th和B细胞抗原表位多拷贝体的基因序列，然后将该人工基因与霍乱毒素B亚基的基因序列相偶联，形成一个融合基因。利用大肠杆菌原核表达系统表达该融合基因，经蛋白纯化后，获得肝片吸虫多表位疫苗。该肝片吸虫多表位疫苗能够诱发机体产生针对鞘脂激活蛋白T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，可用于预防和治疗肝片吸虫感染相关性疾病。

Description

一种新型肝片吸虫多表位疫苗的设计、制备方法和应用

技术领域

本发明属于畜牧医药领域，具体涉及到一种肝片吸虫多表位疫苗的设计、制备方法和应用。

背景技术

肝片吸虫（Fasciola hepatica）隶属于复殖目（Digenea）片形科（Fasciolidae）的片形属（Fasciola），主要寄生于哺乳动物尤其是反刍类动物，其发病范围广、致死率高是制约当今畜牧业发展的重要传染疾病之一。牛羊的肝脏胆管中如被肝片吸虫寄生，肝组织被破坏引起肝炎及胆管变硬，同时虫体在胆管内生长发育并产卵，造成胆管的堵塞，影响消化和食欲；虫体分泌的毒素渗入血液中，溶解红细胞，使家畜发生贫血、消瘦及浮肿等中毒现象；虫体刺激使胆管壁增生，可造成胆管阻塞、肝实质变性、黄痘等。肝片吸虫是我国危害最重，覆盖面最广的牲畜寄生虫病之一。每年均有爆发性流行，给我国畜牧业造成巨大的损失。国内外均有报道肝片吸虫病出现人畜共患，特别是在贫困的农村地区流行。有估计表明在60多个国家大约有240万人感染肝片吸虫，并且有超过1.8亿人住在肝片吸虫感染区，严重危害人类健康。

研制肝片吸虫疫苗是控制肝片吸虫疾病的一种切实有效的方法。治疗性肝片吸虫疫苗具有广阔的应用前景，有望代替传统的化学药物疗法，成为预防及治疗肝片吸虫的新方法。目前治疗肝片吸虫感染主要是化学药物法，大部分使用广谱驱虫药物，其中三氯苯达唑（TCBZ）是治疗肝片吸虫感染有效的药物，但是有研究表明肝片吸虫已经出现了耐药性，所以TCBZ不是治疗肝片吸虫的一种长期有效的药物。采用药物法存在诸多弊端：（1）广谱驱虫药的使用导致肝片吸虫耐药虫体日益增多，药物疗效每况日下。（2）治疗药物在动物体内是否残留，是否通过食用肉进一步危害人类健康还不得而知。（3）药物治疗难以避免反复治疗。（4）药物不能达到完全驱虫的效果。因此，传统化学药物治疗不宜在肝片吸虫感染动物中大规模推广使用，研发肝片吸虫疫苗是一种预防和治疗肝片吸虫感染、更实际和更有前景的方法。

寄生虫疫苗分为弱毒疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、表位疫苗。目前使用的寄生虫疫苗一般是弱毒疫苗，其保护机制主要是模拟自然感染，刺激机体产生免疫应答主要采取以下几种途径筛选：(1)通过特殊动物传代或在体外培养使毒力降低，如牛巴贝斯致弱苗就是通过在切除脾脏牛体内反复传代获得的。(2)筛选缺少某一生活阶段的虫株，如刚地弓形虫S48株就不能形成包囊。(3)筛选生活周期缩短的虫株，如早熟艾美尔球虫苗。弱毒疫苗应用不广泛的几个因素是：(1)安全性问题。目前的寄生虫疫苗主要为活苗，虽然可以产生一定的免疫保护，但毕竟是活的虫体，在特定的情况下，仍有致病的可能。(2)免疫保护效果。有些寄生虫可以感染多种动物，其疫苗往往对某种动物保护效果较好，对另种动物效果较差，或者对不同年龄的动物保护效果不一致等缺点。(3)经济效益。尽管有些疫苗免疫保护性好，但生产成本高、免疫方法复杂、与抗寄生虫药的广谱性相比具有较窄的保护范围均限制了疫苗在生产中的应用。正是由于上述问题的存在，在一定程度上制约了寄生虫疫苗的使用，同时，促使人们去研究和开发新的疫苗。

DNA疫苗是近几年发展起来的一种新型疫苗。因其操作简便， 既具有重组亚单位疫苗的安全性，又具有减毒活疫苗高效、持续诱导全方位免疫应答的优点，该疫苗问世以来，引起了全世界的研究热潮。DNA疫苗研究已展开了积极的探索。在日本分体吸虫、绦虫、疟原虫、利什曼原虫、隐孢子虫、弓形虫、锥虫、球虫等疾病中，DNA疫苗研究中取得了较好的结果，其中疟疾DNA疫苗已获准生产。

表位疫苗基于抗原表位而制备，具有独特的疫苗设计思路，是研制预防和治疗感染性疾病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向。表位疫苗与全菌疫苗、基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗相比，具有以下优点：（1）表位疫苗一般稳定、无毒，具有更高的安全性。（2）抗原表位肽的分子结构小而简单，不会引起免疫抑制或者自身免疫性疾病。（3）表位疫苗可对抗原表位进行精确定位，具有更高的免疫针对性和特异性。（4）表位疫苗具有十分灵活的设计性，可组合不同Th、B细胞抗原表位，制成针对多种病原体的疫苗。（5）表位疫苗选用高保守性的抗原表位肽，可有效防止病原体快速基因突变所形成的免疫逃避机制。

目前，研究人员已经对肝片吸虫抗原蛋白进行了大量研究，并获得了多个肝片吸虫抗原蛋白，如脂肪酸结合蛋白（FABP）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、组织蛋白酶（CatL）类蛋白酶和血红蛋白（Hb）均能诱导宿主产生部分保护作用，可作为抗原用于反刍动物中，但是其效果都不是很理想。鞘脂激活蛋白样蛋白（SAP）是一大类蛋白家族，广泛存在于从原生动物直至哺乳动物的生物体内，并发挥着各种生物学作用。有实验表明，SAPs参与裂解宿主细胞用于进一步酶处理为寄生虫提供营养。近年来发现该家族中SAP-2具有很强的细胞溶解酶活性，结构类似于NK细胞溶解酶，杀伤动物红细胞和外周单核细胞。最近发现FhSAP-2是一个很好的抗原，它会刺激特定的细胞和体液免疫反应。小鼠接种FhSAP-2 DNA疫苗产生Th1/Th2混合反应，因此认为FhSAP-2含有T细胞抗原，其中一些可能引起免疫保护反应。

目前治疗肝片吸虫病的方法，主要采用广谱驱虫法，存在诸多弊端：如药物在动物体内残留、肝片吸虫耐药虫体增多等。因此，研制肝片吸虫疫苗是控制肝片吸虫感染的一种切实有效的方法。FhSAP-2是公认的疫苗的理想抗原；FhSAP-2具有很强的细胞溶解酶活性，在其寄生过程中起重要作用；在肝片吸虫疫苗免疫保护性机制中，抗体体液免疫应答起重要作用，而Th细胞免疫应答起关键作用。本发明合理选择FhSAP-2的Th和B细胞抗原表位，激发有效抑制FhSAP-2的活性和激发特异性细胞免疫应答，为研制针对FhSAP-2的新型治疗性多表位疫苗奠定实验基础。

发明内容

本发明的第一个方面是提供了一种新型肝片吸虫多表位疫苗

本发明的第二个方面是提供了该肝片吸虫多表位疫苗的制备方法。

本发明的第三个方面是公布了该肝片吸虫多表位疫苗的用途。

本发明的第一个方面是提供了一种肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE。该肝片吸虫多表位疫苗主要由来自鞘脂激活蛋白样蛋白FhSAP-2的B细胞表位（分别是FhSAP_21-30，FhSAP_76-85）和T细胞抗原表位（分别是FhSAP_71-80，FhSAP_81-90）和霍乱毒素B亚基构成，具有以下优点：（1）肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE含有来自鞘脂激活蛋白样蛋白FhSAP-2的B细胞表位和T细胞抗原表位，能够激发针对FhSAP-2表位特异性抗体。（2）本发明的肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE可激发有效抑制FhSAP-2活性的表位特异性抗体。（3）选择“FhSAP-2的B细胞表位和T细胞抗原表位”来代替FhSAP-2大分子抗原研制表位疫苗，可有效避免FhSAP-2的生物学毒性和一些免疫交叉性病理性伤害。

本发明的第二个方面是提供了肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的制备方法，其技术路线简述如下：

（1）肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE抗原分子的结构设计

通过生物信息学软件对霍乱毒素B亚基（CTB）和肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白FhSAP-2的B细胞表位和T细胞抗原表位的连接顺序和间隔序列，加以分析和确定，设计一个具有科学合理结构的肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE。

（2）重组表达质粒pETCTB-SAPE（含有融合基因CTB-SAPE）的构建

通过基因合成技术合成一个SAPE的核苷酸序列，将其插入含有霍乱毒素B亚基（CTB）基因的重组表达载体pETC中，构建重组表达载体pETCTB-SAPE。

（3）融合蛋白CTB- SAPE的原核表达及纯化

将重组表达载体CTB-SAPE转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组基因工程菌株BL21(DE3)/pETCTB-SAPE。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-NTP镍离子亲和层析能够获得电泳纯度的融合蛋白CTB-SAPE，即为肝片吸虫多表位疫苗。

本发明的第三个方面是提供了肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的用途。肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE可用于预防和治疗肝片吸虫感染相关性疾病。

附图说明

图1：新型肝片吸虫多表位疫苗的分子结构设计特点。

图2：重组表达载体pETCTB-SAPE的双酶切鉴定。

泳道1：DNA Marker 2000bp；泳道2：DNA Marker 1kd；泳道3：pETCTB- SAPE /KpnI /Xho I；泳道4：pETCTB- SAPE /Nco I /Xho I

图3：重组表达载体pETCTB- SAPE质粒图谱。

Nco I和Xho I之间为插入的融合基因CTB-SAPE

图4：肝片吸虫多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的原核表达。

泳道1：蛋白质Marker；泳道2：CTB-SAPE包涵体蛋白；泳道3：CTB-SAPE可溶蛋白。

图5：肝片吸虫多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的Ni-NTA亲和层析纯化。

泳道1：蛋白质Marker；泳道2：CTB-SAPE包涵体蛋白；泳道3：纯化后的CTB-SAPE蛋白样品。

图6：肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE诱发抗鞘脂激活蛋白样蛋白2（FhSAP-2）IgG抗体的检测。

肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE都能诱发产生一定滴度抗鞘脂激活蛋白样蛋白2（FhSAP-2）抗体。

图7：肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE诱发抗肝片吸虫总蛋白IgG抗体的检测。

肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE都能诱发产生一定滴度抗肝片吸虫总蛋白的抗体。

图8:肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE诱发FhSAP-2_21-30表位特异性抗体的检测。

肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE能够产生较高滴度的FhSAP-2_21-30表位特异性抗体。

图9：肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE诱发FhSAP-2_76-85表位特异性抗体的检测。

肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE能够产生较高滴度的FhSAP-2_76-85表位特异性抗体。

图10：肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE致敏小鼠脾脏淋巴细胞对抗原刺激的增殖反应。

图11：肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE与神经节苷脂GM1的结合活性检测。

具体实施方式

材料

1. IPTG溶液：称取1.2g IPTG置于50ml离心管中，加入40ml 无菌水，充分混匀溶解后，定容至50ml。用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

2. 卡那青霉素（Kana）贮液（100 mg/mL）：称取100mg卡那青霉素（Kana）溶于1mL无菌水，制得浓度为100mg/mL 的贮存液，通过0.22µm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

3. 培养基：（1）LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。（2）LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100ml LB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。

4. DNA电泳缓冲液（50 x TAE）：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA·2H₂O和57.1ml冰乙酸，加水至1000ml，使用时稀释50倍。

5. SDS-PAGE电泳缓冲液（5X）：称取Tris粉末15.1g、 甘氨酸 94g、SDS 5.0g；加入约800ml的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。

6. 考马斯亮蓝蛋白染色试剂：（1）考马斯亮蓝G-250染液（蛋白质定量用）：考马斯亮蓝G-250 100mg溶解在50ml 95%乙醇中，然后加入86%磷酸100ml，用蒸馏水稀释至1000ml。（2）脱色液：250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。

8. 实验动物： BALB/c小鼠： 为SPF级，雄性，8～10周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。

9. ELISA试剂：（1）包被液：1.6g Na₂CO₃，2.9g NaHCO₃，0.2g NaN₃，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。（2）洗涤液：分别称取0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄∙12H₂O，8.0g NaCl，0.2gKCl，0.5ml Tween-20，加入ddH₂O定容至1000 ml（PBST）。（3）封闭液：称取3.0g BSA溶解于100ml 洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。（4）底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。（5）终止液：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml（1M H₂SO₄）。

10. 淋巴细胞增殖实验主要试剂（1）小鼠脾脏淋巴细胞分离液（达科为生物技术有限公司）（2）RPMI-1640完全培养液：在RPMI-1640基础培养液加入10% 胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。（3）RPMI-1640不完全培养液：称取10.4g RPMI-1640干粉、2.4gHEPES、0.75g NaHCO₃，加去离子水至1000ml，pH 7.4，超滤除菌，分装。

实例1：肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的分子结构设计

根据“机体对肝片吸虫的免疫保护性机制”和“鞘脂激活蛋白样蛋白抗原表位的免疫学性质”，选择鞘脂激活蛋白样蛋白Th和B细胞表位FhSAP_21-30、FhSAP_76-85、FhSAP_71-80和FhSAP_81-90用于新型肝片吸虫多表位疫苗的构建。在新型肝片吸虫多表位疫苗的设计中，本课题组将Th细胞表位放在B细胞表位的前端，有助于B细胞表位的有效递呈，再经过生物信息学DNAstar和RANKPEP软件的分析和评价，抗原表位顺序确定为FhSAP_71-80- FhSAP_81-90-FhSAP_21-30- FhSAP_81-90；选择KK作为相邻Th抗原表位的间隔序列，选择GS作为相邻B抗原表位的间隔序列；将尿素酶抗原表位FhSAP_21-30、FhSAP_76-85、FhSAP_71-80和FhSAP_81-90分别拷贝两次；选择霍乱毒素B亚基（CTB）作为分子内免疫佐剂，融合在FhSAP多表位肽（SAPE）的N端，增强FhSAP多表位肽（SAPE）的免疫原性。

结果：肝片吸虫多表位疫苗CTB- SAPE的分子结构设计特点和思路如（图1）所示。

实例2：重组表达载体pETCTB- SAPE（含有融合基因CTB- SAPE）的构建

（1）多表位肽SAPE核苷酸序列的基因合成

将前期设计的多表位肽SAPE的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则转化成相应的核苷酸序列，委托南京金斯瑞生物科技公司进行基因合成。

（2）多表位肽SAPE基因与pETC表达载体的连接

通过质粒小量提取试剂盒（天根）提取重组质粒pUCSAPE和pETCTB（郭乐博士惠赠），用Kpn I/Xho I分别进行双酶切，双酶切反应体系如下：

pUCAPE/pETCTB	15 µL
		10×M Buffer	5 µL
Kpn I（15U/µL）	2 µL
		Xho I（15U/µL）	2 µL
ddH2O	26 µL
		Total	50 µL

37℃ 酶切反应2 h，然后用1% 琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。分别利用琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒回收多表位肽SAPE基因和pETCTB表达载体双酶切产物。将回收的pETCTB线性化载体和SAPE基因通过互补的粘性末端，在T4 DNA 连接酶的作用下（4℃过夜）连接成闭合环状的DNA分子，即形成重组表达质粒pETCTB-SAPE。T4 DNA 连接酶连接体系如下：

pETCTB线性化载体	1.5 µL
		SAPE基因	4.5 µL
10×T4 DNA 连接酶 Buffer	1 µL
		T4-DNA 连接酶(3U/µL)	1 µL
ddH2O	2 µL
		Total	10 µL

结果：利用Nco I/Xho I双酶切待检重组质粒pETCTB-SAPE， 37℃反应2h，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，发现双酶切的DNA片段为620bp，与融合基因CTB-SAPE的理论大小一致，如（图2）所示。再将pETCTB-SAPE送交南京金斯瑞生物科技公司，采用T7启动子和终止子通用引物进行基因测序，证明pETCTB-SAPE中融合基因CTB-SAPE的核苷酸序列完全正确，且无移码突变。重组表达载体pETCTB-SAPE的质粒图谱如（图3）所示。

实例3：多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的原核表达

将验证正确的重组表达质粒pETCTB-SAPE转化进E.coli BL21(DE3) 菌株中。在预先制备好的含50μg/mL Kana的LB平板上，接种环划线基因工程菌株pETCTB-SAPE/BL21(DE3)，倒置于37℃培养箱，过夜培养12～16h 后，挑取单个菌落，接种于含50µg/mL Amp 的LB培养基中，37℃，180rpm，培养12～16h。以2%接种量分别接种重组菌于含50µg/mL Kana LB培养基中，37℃，180rpm振荡过夜，次日晨再将该菌液以1%接种量接种于含50µg/mL Kana的LB液体培养基中，37℃，180rpm摇瓶3h后，加入IPTG使终浓度达到1mmol/L，37℃，180rpm诱导表达，以空载体菌pET28a/BL21(DE3)作为阴性对照。

结果：将基因工程重组菌株pETCTB-SAPE/BL21(DE3)在PH值为7、IPTG浓度为1mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间为6h的情况下进行诱导表达。与对照菌株对比，基因工程重组菌株pETCTB-SAPE/BL21(DE3)在约26KD处出现目的蛋白条带，与肝片吸虫多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的理论大小相符合（图4）。多表位肽融合蛋白CTB-SAPE在包涵体蛋白中存在。

实例4：多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的纯化

Ni-NTA镍离子亲和层析柱的纯化

将Ni-NTA填料充分混匀后加入层析柱中，溶液可通过重力作用缓慢流出，待完全加入后，将上层筛板平放入柱中；向装填好的柱中加入适量的去离子水将乙醇冲洗干净后，加入8倍柱体积的Binding buffer平衡，平衡结束后即可上样；收集菌体后，每100mg菌体加入1-5ml Binding Buffer，超声裂解菌体；12000rpm离心，弃上清；将沉淀重悬于含8M尿素的Binding Buffer中，冰浴1h，使包涵体溶解；将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时；使用15倍柱体积的Wash buffer冲洗柱子，收集流穿峰；使用5倍柱体积的ElutionBuffer洗脱，收集洗脱峰；依次使用3倍柱体积的Binding Buffer 和5 倍柱体积的去离子水洗涤后，用3倍柱体积的20%乙醇平衡，4℃保存。

结果：经Ni-NTA镍离子亲和层析柱的纯化后，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分析，可以发现目的蛋白集中在250mM咪唑洗脱产生的蛋白峰。通过凝胶成像检测仪分析在250mM咪唑洗脱的目的蛋白纯度可达电泳纯（图5）。

实施例5：多表位疫苗CTB-SAPE的免疫原性和免疫特异性研究

（1）BALB/c小鼠的免疫

实验分组：将SPF级BALB/c小鼠随机分为3组，分别为新型多表位融合蛋白CTB-SAPE免疫组、重组霍乱毒素B亚基（rCTB）免疫组和PBS免疫组。每组6只BALB/c小鼠，共18只，详细分组如下图所示：

表1：SPF级BALB/c小鼠分组及免疫方案

实验组	数目	免疫方式	免疫次数	免疫剂量	免疫佐剂
						CTB-SAPE	6	腹腔注射	3次	100μg/只	弗氏佐剂
rCTB	6	腹腔注射	3次	100μg/只	弗氏佐剂
						PBS	6	腹腔注射	3次	100μg/只	弗氏佐剂

免疫方式：用75% 酒精对小鼠腹部消毒，然后腹部多点皮下注射表位融合蛋白CTB-SAPE和弗氏完全佐剂的混合乳化剂；每隔一周加强免疫一次，第2、3周加弗氏不完全佐剂，第4周直接注射表位融合蛋白溶液加强免疫。

抗血清的采集：在末次免疫后第五天，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完全分离，3000rpm离心5分钟分装血清，－80℃冻存备用。

（2）抗血清中特异性抗体的ELISA检测

将抗原（FhSAP-2、肝片吸虫总蛋白、FhSAP-2_21-30和FhSAP-2_76-85）用包被液稀释成5μg/ml或者10μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清（鼠抗CTB-SAPE抗血清和鼠抗rCTB抗血清）和小鼠阴性血清倍比稀释后加入ELISA板，100μl/孔，在37℃下孵育60min。用洗涤液洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1:10000），100μl/孔，在37℃下孵育1h。用洗涤液洗4次后，加入TMB底物显色液，室温避光反应15min，加50μl终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD₄₅₀值。

结果：FhSAP-2的包被浓度为10μg/ml，通过ELISA检测，肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE能够产生针对FhSAP-2的特异性IgG抗体，而PBS免疫组不能产生抗FhSAP-2抗体（图6）；肝片吸虫总蛋白的包被浓度为10μg/ml，通过ELISA检测，多表位疫苗CTB-SAPE能够产生抗肝片吸虫总蛋白的抗体，而PBS免疫组不能产生抗肝片吸虫总蛋白的特异性抗体（图7）；FhSAP-2抗原表位FhSAP-2_21-30和FhSAP-2_76-85的包被浓度为10μg/ml，通过ELISA检测，多表位疫苗CTB-SAPE能够产生较高水平的FhSAP-2_21-30和FhSAP-2_76-85特异性抗体， PBS免疫组不能产生针对FhSAP-2表位特异性的抗体（图8和图9）。 上述结果说明新型肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE能够刺激机体产生针对FhSAP-2的高滴度表位特异性抗体，具有很好的免疫原性。

（3）小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验

将经抗原免疫的小鼠脱臼处死，泡75%酒精5min后，移入超净工作台。用剪刀小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏（暗红色）。在小平皿中放入2～3ml Lympholyte ®-M 淋巴细胞分离液；用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约1ml的1640培养基；1000g～1500g离心20min。离心结束后淋巴细胞会在1640培养基下层悬浮。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基制备成一定浓度的细胞悬液（5 x 10⁴/ml）。在96孔平底培养板中，每孔加入50μl细胞，同时加入CTB-SAPE和FhSAP-2各40μg/ml、FhSAP-2 Th细胞抗原表位肽（FhSAP-2_71-80和FhSAP-2_81-90）和生理盐水各50μl，终体积为100μl/孔，每组做3个平行孔。将加好的96孔平底培养板放置37℃ 5% CO₂培养箱中培养60h后，向各孔中加入MTS溶液20μl，继续培养4h后用酶标仪读取OD₄₉₀值。刺激指数（SI）≥ 2时，判断为阳性；刺激指数计算公式如下：

结果：多表位疫苗CTB-SAPE致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞经FhSAP-2及CTB-SAPE刺激均能够发生明显的淋巴细胞增殖反应，而PBS免疫组的小鼠脾脏淋巴细胞接受上述抗原刺激时均未发生淋巴细胞增殖反应，说明肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE中FhSAP-2的Th抗原表位（FhSAP-2_71-80、FhSAP-2_81-90）均保持有其免疫学特性，能够刺激机体产生针对各自Th抗原表位的细胞免疫应答（图10）。

实例5：GM1-ELISA检测多表位疫苗CTB-SAPE中CTB组分的分子免疫佐剂活性

将神经节苷脂GM1或者牛血清白蛋白（BSA）用包被液稀释至10μg/ml，100μl/孔，包被ELISA板，4 ℃过夜。用PBST洗涤4次；每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h；用洗涤液PBST洗4次后，4℃保存。将多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和重组霍乱毒素B亚基（rCTB）按照一定比例稀释（100μg/ml到0.78μg/ml），加入100μl/孔，37℃放置60min。用洗涤液PBST洗4次，加入鼠抗CTB多克隆抗体（1:1000），100μl/孔，37℃温育60min。洗涤4次；加入HRP标记羊抗鼠IgG（1:10000），100μl/孔，37℃放置30min。洗涤4次后，加入TMB底物显色液，37℃孵育10min，50μl终止液终止反应。用酶标仪检测各孔OD₄₅₀值。

结果：通过GM1-ELISA检测多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和rCTB是否具有形成五聚体和神经节苷脂GM1结合的活性。多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和rCTB的OD₄₅₀都显著高于阴性对照组（包被BSA），证明多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和rCTB均具有形成五聚体和神经节苷脂GM1结合的活性，也说明新型多表位疫苗CTB-SAPE中CTB组分具有较好的分子免疫佐剂活性（图11）。

Claims (9)

1.一种新型肝片吸虫多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由霍乱毒素B亚基（CTB）和鞘脂激活蛋白样蛋白-2多表位肽SAPE构成，其氨基酸序列如序列1所示。

2.如权利要求1所述，一种新型肝片吸虫多表位疫苗，其核苷酸序列如序列2所示。

3.如权利要求1所述，鞘脂激活蛋白样蛋白-2多表位肽SAPE主要由鞘脂激活蛋白样蛋白-2的Th和B细胞抗原表位的多拷贝体构成，其氨基酸序列如序列3所示。

4.如权利要求3所述，鞘脂激活蛋白样蛋白-2多表位肽SAPE的核苷酸序列如序列4所示。

5.包含权利要求2和4中所述的核苷酸序列的表达载体，转基因细胞系及宿主菌。

6.如权利要求1所述，霍乱毒素B亚基（CTB）和鞘脂激活蛋白样蛋白-2多表位肽SAPE之间的间隔序列为DPRVPSS。

7.一种新型肝片吸虫多表位疫苗的制备方法，通过基因合成技术合成鞘脂激活蛋白样蛋白-2多表位肽SAPE的核苷酸序列，将其融合在霍乱毒素B亚基（CTB）基因的下游，构建含有融合基因CTB-SAPE的重组表达载体pETCTB-SAPE及其重组基因工程菌，重组基因工程菌株发酵后，经Ni-NTA镍离子交换层析，获得该疫苗的融合蛋白CTB-SAPE。

8.按照权利要求1和7所述的肝片吸虫多表位疫苗，其特征在于能够激发机体产生针对肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白-2 T细胞免疫应答和有效抑制肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白-2活性的高滴度表位特异性抗体。

9.按照权利要求1和8所述的肝片吸虫多表位疫苗，其特征是可以用作预防和治疗肝片吸虫感染的药物组合。